미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS): 정량적 미세교교세포 형태학 분석을 위한 오픈 소스 사용자 친화적 도구입니다

요약

미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS)는 코딩 전문 지식이 필요 없는 사용자 친화적인 분석 파이프라인으로, 면역형광 이미지로부터 단일 세포 미세아교 형태학 분석을 반자동으로 수행합니다. 설치류 지다당류 유도 신경염증 모델에서 검증된 MMPS는 활성화 관련 형태학적 변화를 재현 가능하게 감지하고 표준화되고 확장 가능한 미세아교세포 표현형을 가능하게 합니다.

초록

미세아교세포는 중추신경계의 골수계 유래 면역 세포로, 신경학적 손상 후 조직 열화와 재형성을 매개하며, 여러 신경퇴행성 질환에서 유망한 치료 표적으로 떠올랐습니다. 미세아교세포 형태학의 정량적 분석은 중요한 현장 정보를 보존하면서도 미세한 미세한 차이를 드러낼 수 있습니다. 하지만 현재 이용 가능한 많은 미소교세포 형태학 분석 플랫폼은 공개되지 않거나 전문적인 계산 전문 지식을 요구하여 널리 채택되는 데 제한이 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 Python 3.11을 사용하는 오픈 소스 미세교세포 형태학 분석 플랫폼인 Mapping Microglial Parameters Software(MMPS)가 개발되었습니다. MMPS는 면역형광 기반 워크플로우와 호환되며, 설치 또는 운영에 코딩 전문 지식이 필요하지 않습니다. 이 소프트웨어는 접근 가능한 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 단일 세포 미세아교세포 형태학 분석을 반자동으로 수행하며, 맞춤형 이미지 처리 및 마스크 생성 워크플로우를 통합합니다. 이 연구는 설치류 지당류(LPS) 유도 신경염증 모델을 사용하여 MMPS를 검증하는 내용을 포함합니다. 정량적 동물 수준 분석은 LPS 처리 동물의 미세아교세포가 유의미하게 증가한 소마 면적(p < 0.01)과 세포 둘레 감소(p < 0.05)를 보였으며, 이는 미세아교세포 활성화와 신경염증과 관련된 형태학적 특징과 일치함을 보였습니다. 전반적으로 MMPS는 실험실 간 미세아교세포 형태학의 정량적 분석을 위한 표준화되고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

미세아교세포는 중추신경계(CNS)의 선천 면역 세포로, 병원체와^{조직 손상을} 지속적으로 조사합니다. 활성화 시 미세아교세포는 돌기를 후퇴시키고 항상성 분열형 형태에서 아메바형 표현형으로 전환합니다 ^2,3. 허혈성 뇌졸중 ^4,5, 알츠하이^{머병 6,7}과 같은 신경퇴행성 질환에서 미세아교세포는 지속적인 사이토카인 생성, 광범위한 조직 분해, 식세포작용을 통해 신경염증을 지속시키는 경우가 많습니다^. 이러한 과정들은 신경혈관 부위의 교란에 기여하여 미세아교세포 활성화와 중추신경계 손상을 더욱 악화^시키며, 이로 인해 미세아교세포는 치료 표적으로 유망합니다 ^9,10.

신경퇴행성 질환에서 미세아교세포 아집단 간의 미묘한 차이를 식별하는 한 가지 방법은 형태학적 분석을 통해 이루어집니다. 이는 일반적으로 Cx3CR1-GFP 동물을 이용한 생체 내 2광자 현미경 검사¹¹ 또는 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자-1(Iba1) 또는 P2Y 퓨리노수용체¹²와 같은 확립된 미세아교세포 표지(IF) 표지를 통해 수행됩니다. 미세아교세포는 손상 후 자주 항상성 형태와 아메바 형태 사이를 오가지만, 이전 연구들은 미세아교세포가 과분기 미세아교세포 ^3,13, 벌집 미세아교세포 ^3,14, 반응성 미세아세포¹⁵, 간상세포 미세아세포 ^3,16 등 추가적인 표현형도 채택할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 미소아교세포 형태학 연구는 종종 항상성 및 아메바 표현형의 수동 분류에 의존합니다. 이러한 접근법은 실험실 간 표준화가 부족한 특수 분석 파이프라인을 필요로 하며, 항상성 표현형과 과분열형 표현형과 같은 유사한 형태를 구분하는 것이 훈련된 인력조차도 어렵게 만듭니다¹⁷. 더불어, 미묘한 형태학적 변화에 대한 IF 기반 분석은 고해상도 영상이 필요하며, 이는 추가적인 기술적 도전을 초래할 수 있습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해,¹¹ 또는¹⁸이 미세아교세포를 반자동으로 감지하고, 사용자 정의 목표 영역(예: 200–800 μm²)에서 '마스크'라 불리는 여러 이진 세포 표현을 생성하는 여러 분석 플랫폼이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 사용자 편향을 줄이고 재현성을 높이며 분석 효율성을 높입니다. 이러한 발전에도 불구하고, 현재 사용 가능한 많은 소프트웨어 플랫폼은 오픈 소스 접근성 부족¹⁷, 코딩 전문성 요구^{사항 11, 19, 20}, 생체 내 2광자 현미경 시스템 의존^{11, 19}, 직관적인 그래픽 사용자 인터페이스 부재^{11, 21, 22}, 느림 등 광범위한 채택을 제한하는 한계가 있습니다 처리 속도¹¹, 또는 상용 소프트웨어 플랫폼 의존도^{12, 19, 21}. 최근 연구들이 이러한 문제들을 다루기 시작했지만, 많은 기존 플랫폼은 여전히 미세아교세포 형태학 연구에 널리 사용되는 IF 기반 워크플로우에 적합하지 않습니다.

여기서는 사용자 지향의 미세아교세포 형태학 분석 플랫폼인 Mapping Microglial Parameters Software(MMPS)를 소개합니다. MMPS는 코딩 전문 지식이 필요 없으며, 기존 ImageJ 기반 워크플로우와 통합되어 IF 이미지 사용을 위해 특별히 설계되었습니다. 이 소프트웨어는 Python 3.11로 개발되었으며, 이전에 공개된 오픈 소스 형태학 플랫폼의 개념들을 통합하고 있습니다^. MMPS는 직관적인 그래픽 사용자 인터페이스를 제공하여 사용자가 여러 맞춤형 이미지 처리 옵션을 사용하여 대량의 IF 이미지를 가져오고 처리할 수 있도록 합니다. 또한 IF 영상 중 발생하는 과도한 샘플링 아티팩트를 최소화하기 위해 수동 셀 선택과 세포 과정이 측정에 포함되지 않도록 수동 소마 개요 처리도 포함하고 있습니다. 또한 MMPS는 마스크 정확도를 향상시키기 위한 맞춤형 마스크 생성 매개변수와 다중 품질 보증 기능을 포함하고 있습니다. 이 소프트웨어는 둘레, 평균 중심점 거리, 마스크 면적, 이심도, 둥근성, 소마 면적 등 여러 일반적으로 사용되는 형태학적 매개변수를 계산합니다. 더 고급 연구를 위해 MMPS 생성 출력은 여러 ImageJ 플러그인과 호환되며, 프랙탈, 골격, 선체 분석을 위한 동반 플러그인을 통해 추가 분석이 가능합니다.

MMPS는 설치류 지다당(LPS) 유도 신경염증 모델을 사용하여 피질 IV 내 미세교세포 변형을 조사하여 검증되었습니다. 정량적 분석 결과, LPS 투여는 차량 처리 대조군에 비해 미세아교세포 영역을 유의미하게 증가시키고 세포 경계를 감소시켜, MMPS가 미세아교세포 활성화와 관련된 미묘한 형태학적 변화를 정확히 감지함을 시사합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 웨스트버지니아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 #2109047180)와 국립보건원(NIH)이 지원하는 실험동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 이 방법에 사용되는 장비, 시약 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 동물

1. 2-3개월 된 수컷 스프래그-도울리 쥐 10마리를 구하세요. 쥐가 동물 시설에 도착하면 12시간 빛과 어둠 주기 하에 그룹으로 수용하며 자유롭게 음식과 물을 사용할 수 있습니다. 도착 후 쥐는 사용 전 3일간 적응시킵니다.
2. 쥐를 무작위로 차량 또는 LPS 처리 그룹(n=5마리/그룹)에 배정합니다.
   참고: 사용할 쥐 수가 적기 때문에, 컴퓨터가 생성한 무작위 수를 이용해 쥐를 처리군에 배정하는 간단한 무작위화 전략을 사용할 수 있습니다.
3. 치료 후 쥐를 관찰하여 '질병 행동': 체중 감소(>15%), 포르피린 분비, 호흡기 이상, 활동 감소.
   참고: 질병 행동 증상은 투여 후 첫 12시간 이내에 자주 나타나므로, 이른 아침(오전 6-8시)에 주사제를 투여하고, 하루 종일 행동을 관찰하며, 오후 5시-7시에는 쥐를 시설로 돌려보내세요.

2. 신경염증 모델

1. 50 mg LPS를 5 mL 인산염 완충 식염수에 용해하여 LPS(O111:B4) 정액(10 mg/mL)을 준비합니다.
   참고: LPS는 내독소입니다. 연구자들은 소속 기관의 취급 및 폐기에 관한 표준 절차(SOP)를 따라야 합니다.
2. 쥐를 체중 재고 LPS(10 mg/kg) 또는 PBS(비체)를 복강 내 주사하세요.
3. 쥐의 무게를 기준으로 주입량은 150–300 μL 사이로 예상됩니다.
4. 주사 후 24시간 후에 심장 관류로 쥐를 안락사시키고, 그 후 참수합니다.
5. 흡입한 이소플루란_{(산소 5}%)으로 쥐를 5–10분간 마취합니다. 페달 철회 반사가 없으면 마취를 확실히 하세요.
6. 마취 상태에서 횡격막과 흉골을 노출시키기 위해 중앙 흉부 절개를 만드세요. 치혈기로 흉골 돌기를 고정해 흉강을 드러내세요.
7. 횡격막과 갈비뼈를 앞다리 쪽으로 잘라 심장을 노출시킵니다.
8. 하행 대동맥과 하대정맥을 지혈기로 압박하세요. 25게이지 윙드 바늘을 좌심실에 삽입합니다.
9. 연동 펌프를 이용해 얼음처럼 차가운 PBS(25 mL, 분당 30 mL)를 쥐에게 관류합니다. 관류 시작 후 몇 초 이내에 좌심방을 절개하여 관류액 배출을 가능하게 합니다.
10. 4% 파라포름알데히드(25 mL, 30 mL/분)를 투여한 관류 쥐.
    주의: 적절한 개인 보호 장비와 잘 통풍되는 환경에서 파라포름알데히드를 다루세요. 파라포름알데히드 폐기물은 기관 및 지역 규정에 따라 처리해야 합니다.
11. 관류 후 단두대로 쥐의 목을 베어라.
    참고: 참수 기록과 칼날 연마에 관한 기관의 지침을 준수하세요.
12. 두피를 핀로 당겨 두개골을 노출시킵니다.
13. 안와 소켓에 삽입한 지혈기나 롱저를 사용해 전두골을 부러뜨립니다.
14. 겸자를 대공에 삽입하고 두정골을 떼어내세요.
15. 미세한 겸자로 뇌를 적출하고 4% 파라포름알데히드에 하룻밤 배양하세요.
16. 뇌를 차례로 20% 자당과 30% 자당으로 하룻밤 사이에 이식하여 냉동 보호를 합니다.

3. 면역형광

1. Tissue Tek O.C.T. 컴파운드에 크라이오프로티브된 뇌를 드라이아이스 위에 냉동합니다.
2. 30 μm 크기에서 크라이오스탯을 사용해 뇌를 절개합니다.
3. PBS에서 단면을 채취하여 12웰 플레이트에 삽입된 넷 웰로 옮깁니다.
4. 쥐 한 마리당 앞쪽 등쪽 해마를 포함하는 최소 두 개의 구역을 선택하세요.
5. 흔들면서 PBS에서 5분간 두 번 세척하세요.
6. 흔들면서 0.3% Triton X-100/PBS로 45분간 절간을 투과하세요.
   참고: 별도 명시가 없는 한 세척 또는 배양 단계당 3mL 용액을 사용하세요.
7. PBS에서 5분간 두 번 세척하세요.
8. 항원 회재액을 PBS의 1배로 희석하고 웰당 2mL를 추가합니다.
9. 80°C에서 물욕을 사용해 20분간 부위를 배양합니다.
10. 구역을 실온까지 식힌 후 진행하세요.
11. PBS에서 5분간 두 번 세척하세요.
12. 블록 섹션을 10% 당나귀 혈청/0.05% Triton X-100/PBS로 37°C에서 2시간 동안 75rpm으로 흔들며 투여합니다.
13. 1% 당키 세럼/0.05% Triton X-100/PBS로 5분간 세 번 세척하세요.
14. 넷웰 없이 새로운 12웰 플레이트로 절편을 옮기며, 1% 당나귀 혈청/0.05% Triton X-100/PBS로 500 μL 1차 항-Iba1 항체 용액을 준비합니다.
15. 1차 항체를 배양액에서 생략하여 음성 대조군을 준비합니다.
16. 모든 구역을 4°C에서 하룻밤 동안 궤도 로커에서 부양하세요
17. 구간을 네트 웰로 되돌려 넣으세요.
18. 1% 당키 세럼/0.05% Triton X-100/PBS로 10분간 세 번 세척하세요.
19. 항토끼 2차 항체(1:1000 희석)를 1% 당나귀 혈청/0.05% Triton X-100/PBS에 실온에서 1.5시간 인큐베이팅합니다.
    참고: 이후 모든 시술 시 빛 노출을 최소화하고, 형광체 분해를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플레이트를 감싸세요.
20. PBS에서 5분간 두 번 세척하세요.
21. 절편을 현미경 슬라이드에 장착하세요.
22. 어둠 속에서 >2시간 동안 자연 건조 슬라이드.
23. 수용성 화합물을 사용한 커버슬립 절면.
24. 마운팅 매체를 사용해 네거티브 컨트롤 슬라이드를 준비하세요.
25. 슬라이드는 실온의 어두운 환경에서 슬라이드 박스에 보관하세요.

4. 영상

1. 40배 배율로 영상 시스템의 픽셀 크기를 식별하세요. 스케일을 찾지 못하면 각 이미지에 스케일 바를 추가하세요.
2. DAPI 염색을 사용하여 저배율로 피질 핵의 밀집된 띠를 식별하는데, 이는 피질층 IV에 해당합니다.
3. 이미지를 식별된 피질 영역에 초점을 맞추세요.
4. 40배 배율로 바꿔보세요.
5. DAPI와 Iba1 신호가 배경 형광으로부터 최대한 분리되도록 채널 노출 설정을 조정하세요.
6. 미세아교세포 전체 깊이를 아우르는 Z-스택 이미지(> 30단계)를 획득합니다.
7. 두 스테인의 Z-스택에서 합성 최대 강도 투사 이미지를 생성하여 저장합니다.
   참고: 각 이미지의 노출 및 Z-스택 설정을 최적화하여 DAPI/Iba1과 배경 형광 간의 신호 분리를 극대화합니다. 신호 분리가 불량하면 마스크 생성 정확도가 떨어집니다.

5. 미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS)

1. 모든 합성 이미지를 하나의 이미지 디렉터리에 저장하세요.
2. MMPS 생성 결과에 대한 별도의 출력 디렉터리를 만드세요.
3. GitHub 저장소에서 MMPS 독립 실행형 패키지나 MMPS.py 스크립트를 다운로드하세요.
4. MMPS.py 를 통해 MMPS를 실행할 때는 requirements.txt 파일에 나열된 모든 의존성을 설치하세요.
5. MMPS 패키지를 열거나 스크립트 MMPS.py 실행하세요.
6. "이미지 폴더 선택"을 선택하고 이미지 디렉터리를 선택하세요.
7. "출력 폴더 선택"을 선택하고 출력 디렉터리를 선택하세요.
8. 운영체제에서 요청할 경우 폴더 접근 권한을 부여하세요.
   참고: 추가 설치 지침, 문제 해결 안내, 사용 사례는 보조 문서와 GitHub 저장소에 제공됩니다.
9. "이미지 라벨링"을 선택하고 각 이미지에 동물 식별자와 처리 그룹을 할당하세요.
   참고: 이미지 라벨링이 생략될 경우, MMPS는 데이터 내보내기 전에 처리군과 동물 식별자를 입력하도록 안내합니다.
10. "Parameters" 탭에서 픽셀 크기를 입력하세요.
11. 픽셀 크기가 모르면 "스케일 바에서 보정하기"를 선택하세요. 스케일 바의 시작점과 끝점을 선택하세요. 여기서 알려진 스케일-바 거리(마이크로미터)가 등장합니다.
12. 미세아교세포 신호가 포함된 형광 채널을 선택하세요.
13. 각 이미지 이름 옆에 있는 박스를 체크하여 처리할 이미지를 선택하세요. 배경 형광이 이미지마다 크게 다를 경우 개별 이미지를 처리합니다.
14. "원본", "미리보기", "처리됨", "마스크" 탭을 검토하여 이미지 처리 단계를 비교해 보세요.
15. "현재 이미지 미리보기"를 선택하여 이미지 처리 설정을 평가하세요.
16. 롤링 볼 배경 감산, 노이즈 제거, 선명도 설정을 필요에 따라 조정하세요.
17. 배경 감산에는 5–150 픽셀 사이의 롤링 볼 값을 사용하세요.
18. 3에서 7픽셀 사이의 노이징 제거 값을 사용하여 불균일한 조명 인티팩트를 줄이세요.
19. 날카롭게 1에서 2 사이의 샤프닝 값을 사용하여 가장자리 선명도를 개선하세요.
20. 이미지 처리 설정을 최적화한 후 "선택한 이미지 처리"를 선택하세요.
    참고: 이미지 처리 시간은 이미지 수와 선택된 매개변수에 따라 달라집니다.
21. "Soma (모든 이미지)를 선택하세요."
22. RGB 합성 이미지를 보여주려면 "색상 (C)" 표시를 선택하세요. "채널..."을 선택하세요 이미지 색상이 왜곡된 경우 사용하지 않는 채널을 선택 해제합니다.
23. DAPI와 Iba1 공존 위치를 보이는 미세아교세포를 선택한다. 이미지 경계에 닿는 셀을 선택하지 마세요. 잘못 선택된 소마 마커는 "백스페이스" 또는 "삭제" 키를 사용해 제거하세요.
24. "Enter" 또는 "Return" 버튼을 눌러 다음 이미지로 넘어가세요.
25. 소마 선택이 완료된 후 "Soma (전체) 개요"를 선택하세요.
26. 선택된 각 미세교세포의 소마 경계를 개요로 작성하세요. 세포 과정은 소마 윤곽선에서 제외하고, 소마당 최소 여덟 개의 윤곽점을 사용하세요. 잘못된 윤곽선을 "마지막 지점 되돌리기", "삭제하기", 또는 "백스페이스"를 사용해 제거하세요.
27. 언론 "enter", "Return", 더블 클릭, 우클릭으로 각 소마 개요를 최종 확정할 수 있습니다.
28. 필요하면 이전 Soma 개요를 반복하려면 "마지막 개요 다시 만들기"를 선택하세요.
29. 소마 아웃라인을 완료한 후 "모든 마스크 생성"을 선택하세요.
30. 마스크에 저강도 배경 픽셀의 삽입을 제한하기 위해 최소 임계값을 적용합니다.
    참고: 높은 값은 분기를 희생하면서도 소마의 정확도를 유지하고, 낮은 값은 분기 정확도를 보존하지만 소마를 희생합니다. 10%에서 30% 사이의 임계값은 일반적으로 균형 잡힌 배경 억제와 가지 보존을 제공합니다.
    참고: 마스크 생성 시간은 선택된 셀 수에 따라 달라집니다.
31. 마스크 품질 보증을 시작하려면 "QA All Masks"를 선택하세요.
32. 가장 큰 (800 μm²)에서 가장 작은 (200 μm²)까지 제시된 마스크를 검토합니다.
33. 각 마스크를 "처리됨" 및 "마스크" 탭을 사용해 해당 미세아교세포와 비교하세요.
34. "A" 키보드 단축키를 사용해 마스크를 받으세요. "R" 키보드 단축키를 사용해 마스크를 거부하세요. "B"를 누르면 수락 또는 거절을 되돌리세요. 키보드 화살표 키를 사용해 마스크 크기를 탐색하세요.
35. 미세아교세포 분기를 정확히 포착하는 가장 큰 허용 가능한 마스크를 선택하세요. 이웃 세포, 과도한 배경, 이미지 경계, 또는 스케일 바를 포함하지 않습니다.
    참고: 정확성에 불확실성이 있다면 마스크를 거부하세요.
    참고: "모든 마스크 제거"를 선택한 후, 대부분 부정확하면 다른 임계값으로 마스크를 다시 생성하세요.
36. 마스크 품질 보증이 완료된 후 "간단한 특성 계산"을 선택하십시오.
    허용된 마스크와 소마 윤곽선을 사용하여 평균 중심 거리, 마스크 면적, 둘레, 이심도, 둥근성, 소마 크기를 계산합니다.
37. 신경염증의 매개변수 정의와 미소아교세포 경향은 표 1 을 참조하십시오.
38. 다운로드 추가 분석을 위해 "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py", "SkeletonAnalysisImageJ.py"을 사용했습니다.
39. "FractalAnalysis_ImageJ.py"을 프랙탈 및 선체 분석을 위한 피지 플러그인으로 열어보세요.
40. 출력 디렉터리 위치와 픽셀 크기를 입력하면 됩니다. 가장 큰 허용 마스크만 분석하고 싶다면 "가장 큰 마스크만" 옵션을 선택하세요.
41. Sholl 분석을 위한 피지 플러그인으로 "Sholl.py"를 열어보세요.
42. 출력 디렉터리 위치와 픽셀 크기를 입력하면 됩니다.
43. 원하는 숄 분석 단계 크기를 입력합니다. "시작 반경으로 소마 반경을 사용하기"를 선택해 MMPS 파생 소마 반경을 시작 반경으로 사용하세요. MMPS 유도 소마 반경을 사용하지 않을 경우 고정된 소마 반경 값을 입력합니다.
44. 골격 분석을 위한 피지 플러그인으로 "SkeletonAnalysisImageJ.py"를 열어보세요.
45. 출력 디렉터리 위치, 픽셀 크기, 마스크 폴더 위치를 입력하면 됩니다.
46. 완료 후에는 플러그인에서 생성된 모든 결과를 CSV 파일로 출력 디렉터리에 내보내세요.

6. 미세교세포 형태 계산을 위한 MMPS에서 사용되는 공식

참고: "Calculate Simple Characteristics"를 누르면 모든 계산은 MMPS에 의해 자동으로 수행됩니다. 매개변수 계산은 아래에 나와 있습니다.

1. 주변
   1. 다음 식으로 둘레를 계산합니다:
      
   2. 가장자리를 정의하고, 가장자리 픽셀 수로, 픽셀 크기를 μm 단위로 정의합니다.
2. 평균 중심체 거리
   참고: 평균 중심체 거리는 세포 확산¹¹번이라고도 불립니다.
   1. 셀 좌표를 기준으로 네 개의 분기 끝점을 식별합니다:
      상단 분기: 최소 y-좌표,
      하단 분기: 최대 y-좌표,
      왼쪽 가지: 최소 x-좌표,
      오른쪽 분기: 최대 x좌표.
   2. 다음 식을 사용하여 중심 좌표를 계산합니다:
      
      
   3. c_x와 _{c y}를 중심좌표로, x_i와 y_i를 픽셀 좌표로, 총 픽셀 수로 정의합니다.
   4. 다음 식으로 분기 거리를 계산합니다:
      
   5. d를 분기 거리로, x_i와 y_i를 분기 끝 좌표로, c_x와 _{c y}를 중심 좌표로 정의합니다.
   6. 다음 식을 사용하여 평균 중심점 거리를 계산합니다:
      
   7. 평균적인 중심체 거리를 정의하고, 분기 거리 d,_i , 픽셀 크기 μm 단위로 정의합니다.
3. 마스크 구역
   1. 다음 식을 사용하여 마스크 면적을 계산합니다:
      
   2. 마스크 면적을 μm² 단위로 정의하고, 마스크 내 픽셀 수로, 그리고 픽셀 크기를 μm 단위로 정의합니다.
4. 특이성
   1. 다음 식을 사용하여 제2중심 모멘트를 계산합니다:
      
      
      
   2. μ₂₀, μ₀₂, μ₁₁ 을 두 번째 중심 모멘트로, x_i 와 y_i 를 픽셀 좌표로, c_x 와 c_y 를 중심 좌표로, N을 총 픽셀 수로 정의합니다.
   3. 다음 식을 사용하여 공분산 행렬 고유값을 계산합니다:
      
   4. λ₁ 을 λ₂≥ 정의하라.
   5. 다음 식을 사용하여 장축과 단축 길이를 계산합니다:
      
   6. a를 장축 길이로, b를 단축 길이로 정의합니다.
   7. 이심률을 다음 식으로 계산합니다:
      
   8. 특이함을 정의하자면,
5. 둥근
   1. 둥근 정도는 다음 식으로 계산합니다:
      
   2. 원형을 정의하고, 장축 길이로, 단축 길이를 정의합니다.
6. 소마 크기
   1. 다음 식으로 소마 면적을 계산합니다:
      
   2. Sa를 소마 면적(μm²)으로 정의하는데, 이는 소마 마스크 내 픽셀 수로, S는 μm 단위의 픽셀 크기입니다.

7. 통계 분석

1. 모든 통계 분석을 R 버전 4.3.2를 사용하여 수행하세요.
2. 각 셀에 대해 가장 큰 허용 마스크를 사용하는 필터 데이터셋.
3. 통계 분석 전 동물 수준의 평균 세포 매개변수.
4. 샤피로-윌크와 레벤 검정을 사용하여 정규성과 분산을 평가합니다.
5. 데이터셋이 모수적 가정을 만족할 경우, 사후 Holm 보정 쌍 t-검정을 사용하여 학생 t-검정 또는 반복평균 ANOVA를 수행하세요.
6. 데이터셋이 모수학적 가정을 만족하지 않을 경우, Wilcoxon 랭크합 또는 Holm 보정 쌍 Wilcoxon 부호 랭크 검정을 사용하여 Wilcoxon 랭크합 검정 또는 Friedman 검정을 수행하십시오.
7. 통계적 유의성을 p < 0.05로 정의합니다.

결과

IF 기반 미세아교세포 형태 분석을 위한 접근 가능하고 표준화된 워크플로우를 제공하기 위해 개발된 오픈 소스 독립형 미세아교세포 형태학 소프트웨어(MMPS)가 개발되었습니다. 이 플랫폼은 이전의 형태학 분석 방법론을 기반으로 하며, 코딩 전문성이 필요 없고 접근 가능한 그래픽 사용자 인터페이스를 통합합니다. MMPS는 미세한 미세아교세포 분기의 탐지를 향상시키는 동시에 미세아교세포 마스크의 과대평가를 최소화하기 위한 여러 안전장치를 포함하도록 설계되었습니다.

MMPS는 LPS 유도 설치류 신경염증 모델을 사용하여 검증되었습니다. 조직 처리 및 영상 획득(그림 1) 후, 1차 항체 염색이 없는 음성 대조 절편을 사용하여 IF 특이성이 확인되었습니다(보완 그림 1). MMPS 처리는 IF 이미지를 소프트웨어 인터페이스로 가져오는 것부터 시작합니다(그림 2A). 이 소프트웨어는 미세교질 신호 탐지와 배경 분리를 향상시키기 위해 다양한 이미지 처리 옵션을 제공합니다. 필수적인 배경 감산은 Scikit-image 패키지에 구현된 롤링 볼 알고리즘을 사용하며, 선택적 노이즈 제거 및 선명한 필터는 SciPy 기반 가우시안 필터링을 통해 제공됩니다. 이미지 처리 후에는 미세아교세포를 수동으로 선별하고 빨간색 선택 마커로 식별합니다(그림 2B). 이후 소마 경계는 하위 형태학적 계산을 위해 수작업으로 그려집니다(그림 2C).

그림 1: 신경염증 모델과 처리의 그래픽 개요. 쥐들은 LPS 또는 PBS를 주입하고 심장 관류와 참수 치료를 통해 24시간 동안 수집했습니다. 뇌를 추출하여 30 μm 조각으로 절단하여 미세아교세포 마커 Iba1의 IF에 사용하고, 이를 MMPS로 처리했습니다. 바이오렌더로 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: MMPS 사용 개요. (A) MMPS로 참조할 세포핵(파란색, DAPI)을 가진 피질 미세교세포(빨간색, Iba1) 이미지 예시(스케일 바 = 75 μm, 40x). MMPS를 이용한 이미지 처리 후 배경을 줄이고 정확한 형태를 평가합니다 (B). MMPS에서 이미지를 처리한 후, 소모는 이후 방법에서 자세히 설명한 단계(스케일 바 = 75 μm, 40배)에서 사용할 빨간 원을 그려 수동으로 선택합니다. (C) 두 개의 대표적인 미세아교세포를 수동으로 윤곽선으로 작성했으며, 저장된 소마 윤곽선 이미지는 아래에 제시되어 있습니다. (D) 선택된 세포의 마스크 생성은 최대 800^{μm 2}의 미세 아교세포 가지를 자동으로 추적하지만, 수작업의 품질 보증이 필요합니다. 여기서는 부정확한 800 μm² 마스크를 표시하고, 그 뒤에 더 정확한 700 μm² 마스크를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

소마 개요 작성 후, MMPS는 사용자가 정의한 최소 강도 임계값에 의해 제약된 적응형 임계값을 사용하여 200–800 μm² 크기 범위에서 반복적으로 마스크를 생성합니다. 작은 마스크는 사용자가 정의한 임계값을 더 잘 따르는 반면, 더 큰 마스크는 지점 통합을 극대화하기 위해 점진적으로 임계값 제한을 완화합니다. 생성된 마스크는 인접 셀의 포함, 과도한 배경 통합, 이미지 테두리 또는 스케일 바에 의한 절단을 방지하기 위해 수동 품질 보증 검토를 거칩니다. 그림 2D에서 보듯, 대표성 미세아교세포의 800 μm² 마스크가 인접한 세포로 확장되었습니다. 800 μm² 마스크를 거부하고 700^{μm 2} 마스크를 선택함으로써 분절 오류를 보정하면서도 목표 미세아교세포의 정확한 경계를 유지했습니다.

MMPS 처리 후, 각 세포에 가장 큰 마스크를 사용해 미세아교 활성화를 평가하였는데, 이 마스크들은 배경 통합을 최소화하면서 원위 분기를 가장 정확하게 포착했습니다. 계산된 형태학적 매개변수는 표 1에 요약되어 있으며 그림 3에 표현되어 있습니다. LPS 투여는 차량 처리 대조군에 비해 평균 중심체 거리와 세포 경계를 유의하게 감소시켰습니다(p < 0.05; 그림 3A, B)는 활성화 중 미소교세포 돌기의 후퇴와 일치합니다. 이전 보고서들이 활성화된 미소교세포^표현형과 연관되었음에도 불구하고, 처리 그룹 간 마스크 면적, 둥근성, 이심률에서는 유의한 차이가 관찰되지 ^{않았습니다(}그림 3C–E). 본 연구는 소마 모양이나 마스크 면적의 미묘한 차이를 통계적으로 탐지하지 못했으며, 미세아교세포 하위 집단은 이러한 경향을 균일하게 따르지 않는 이질적인 염증 형태를 채택할 수 있습니다³. 반면, LPS 처리된 동물에서는 유체체 대조군에 비해 소마 면적이 유의미하게 증가했습니다(p < 0.01; 그림 3F), 활성화 관련 형태학적 재형성을 더욱 뒷받침합니다²².

그림 3: 미소교세포 형태학적 매개변수 비교. 모든 패널에 대해 정상성 검정(Shapiro-Wilk와 Levene)을 수행했으며, 모든 경우에서 유의치 없음(p>0.05)으로 학생 t 검정이 사용되었습니다. 점은 개별 동물을 나타냅니다 (n=5개당 처리) (A) 평균 중심점 거리는 차량군에서 LPS 처리군보다 유의하게 더 컸습니다. (B) 미세아교세포 둘레는 차량군에서 LPS 처리군에 비해 유의하게 더 컸다. (C) 치료 그룹 간 마스크 면적에 유의한 차이가 없었다. (D) 그룹 간 소마 이심률에 유의한 차이가 없었다. (E) 처리군 간 소마 둥근 정도에 유의미한 차이가 없음. (F) LPS 그룹 에서 소마 면적이 유의미하게 증가했다 * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

매개변수	정의	미세아교세포 활성화와의 관계
평균 중심체 거리	위, 오른쪽, 아래, 왼쪽 위치에서 가장 먼 가지의 평균 거리	감소
주변	셀 둘레 측정	감소
마스크 구역	셀의 실제 면적이지, 타겟 마스크 면적이 아닙니다	감소
특이성	세포 소마의 대략적인 신장 측정 (0: 원형, 1: 매우 길쭉함)	감소
둥근	세포 소마의 대략적인 원형(0: 길쭉, 1: 원형) 측정	증가
소마 크기	세포 소마의 면적	증가

표 1: MMPS에서 계산된 매개변수와 미세아교세포 활성화에 따른 반응 예측 변화. 표는 Mapping Microglial Parameters Software(MMPS)가 계산한 형태학적 매개변수를 요약하는데, 여기에는 주변 거리, 평균 중심체 거리, 마스크 면적, 이심률, 둥근성, 소마 면적이 포함됩니다.

이후 동일한 이미지를 블라인드 상태에서 이전에 훈련받지 않은 사용자에게 제공하여 독립적인 분석을 수행함으로써 사용자 간 재현성을 평가했습니다(보충 그림 2). 사용자 간 통계적으로 유의한 차이는 발견되지 않았으며, 모든 사용자는 LPS 처리 동물에서 미세교교세포 활성화와 일치하는 형태학적 경향을 재현하였습니다.

MMPS는 또한 하위 고급 형태학적 분석을 지원합니다. 그림 3 에서 생성된 매개변수의 상관 분석을 통해 서로 다른 형태학적 특징 간의 관계가 입증되었습니다. 차량 처리 쥐는 미세아교세포 둥근 성과 둘레 사이에 약한 상관관계만 보인 반면(R² = 0.17), LPS 처리 쥐는 더 강한 상관관계를 보였으며(R² = 0.64), 미세아교세포 활성화 증가가 둥글음과 둘레 감소와 동시에 연관됨을 시사한다(그림 4A). 또한, 마스크 영역은 차량 및 LPS 처리군 모두에서 평균 중심 거리와 강한 양상관관계를 보였으며(각각 R² = 0.71 및 0.88), 이는 미세 아교세포 활성화 상태와 관련된 분기 복잡도 변화와 일치한다(그림 4B).

그림 4: 미소교세포 매개변수의 고급 분석. 모든 패널은 일반 최소제곱법으로 계산된 동물 수준의 최적 적합선으로, 결정 계수(R²)와 함께 표시하고 95% 신뢰구간으로 음영 처리합니다. (A) 미세아교세포 소마의 둥근 성향과 전체 둘레 길이는 차량군을 형성하는 약한 경향을 보이지만(R² = 0.17), LPS 노출 후에는 더 강한 상관관계를 보인다(R² = 0.64). (B) 평균 중심체 거리는 차량 그룹(R² = 0.71) 및 LPS(R² = 0.88) 그룹의 미세아교세포 면적과 상관관계가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 부정적 통제를 통한 IF 프로토콜 검증. 각 쥐의 동일한 영역의 뇌 절편 한 개를 1차 항체 첨가 없이 IF 프로토콜을 수행하여 자가형광 결여를 확인했습니다(스케일바 = 75 μm) (A) DAPI의 차량 염색 조직 대표 이미지(파란색). (B) Iba1의 차량 염색 조직 대표 이미지(빨간색). (C) DAPI(파란색)와 Iba1(빨간색)의 차량 염색 조직의 대표 이미지. (D) DAPI LPS 염색 조직의 대표 이미지(파란색). (E) Iba1의 LPS 염색 조직의 대표 이미지(빨간색). (F) DAPI(파란색)와 Iba1(빨간색)의 LPS 염색 조직의 대표적 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 2: MMPS 사용자 간 변동 평가. 여러 명의 블라인드 사용자가 그림 3 의 동일한 샘플에 대해 MMPS를 사용했고, 동물 수준의 결과를 비교했습니다. 모든 검사에서 정상성 검정(Shapiro-Wilk와 Levene)은 유의하지 않았다(p>0.05), 반복평균 ANOVA와 사후 Holm 보정 쌍 t검정(p>0.05)을 사용했다. (A) 각 그룹 간 평균 중심체 거리(p>0.05)에서 유의한 차이가 없었다. (B) 각 그룹에서 경계 검사 (p>0.05) 사용자별로 유의한 차이가 없었다. (C) 각 그룹에서 마스크 면적에 대해 유의한 차이가 없었다 (p>0.05). (D) 각 그룹에서 이심률에 대해 유의한 차이가 없었다 (p>0.05). (E) 각 그룹에서 둥근 정도는 유의한 차이가 없었다(p>0.05). (F) 각 그룹에서 소마 영역에 대해 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 방법론의 주요 목표는 기존의 형태학적 평가 접근법의 강점을 유지하면서 공통적인 기술적 장벽을 줄여 미세아교세포 형태학 분석의 접근성을 확장하는 것입니다. MMPS는 미세한 미세아교세포 형태학적 변화를 감지할 수 있게 하면서도 프랙탈, 골격, 선체, 숄 분석 등 고급 분석과의 호환성을 유지할 수 있습니다. 이전에 발표된 접근법과 비교할 때, MMPS는 접근 가능한 그래픽 사용자 인터페이스, 일반적으로 사용되는 형태학적 매개변수에 대한 통합 계산, 코딩 요구사항 제거 및 고급 하위 분석과의 호환성을 유지할 수 있는 기능을 제공합니다.

여러 중요한 방법론적 단계가 분석의 정확성과 재현성에 큰 영향을 미칩니다. 고품질 면역형광(IF) 영상은 신뢰할 수 있는 마스크 생성 및 형태 계산에 필수적입니다. 항체 특이성은 영상 품질의 주요 결정 요인으로, 비특이적 표지는 배경 형광을 증가시키고 미세아교세포와 주변 조직 간의 신호 분리를 감소시킵니다. 마찬가지로, 최적의 항체 농도가 낮으면 형광 강도가 감소하고 영상 해상도가 저하될 수 있습니다. Z-스택 이미지 획득도 매우 중요한데, Z-스택 영상의 누락은 미세 분기의 복잡성과 과정 확산을 인위적으로 변화시켜 형태학적 계산에 편향을 줄 수 있기 때문입니다.

MMPS 처리 시 몇 가지 추가적인 고려사항이 필요합니다. MMPS는 배치 이미지 처리를 지원하지만, 배경 특성과 염색 품질이 이미지마다 크게 달라질 수 있으므로 개별 이미지 최적화가 종종 선호됩니다. 이미지 품질은 마스크 생성 정확도에 직접적인 영향을 미칩니다; 따라서 이미지 전처리 중 최적화는 하위 분석의 재현성과 견고성을 크게 향상시킵니다. 미소아교세포의 신중한 선택도 중요하며, 특히 세포가 영상 경계에 닿지 않도록 해야 합니다. 부분 세포 선택은 신체 측정을 인위적으로 감소시키고 마스크 생성을 왜곡시킬 수 있기 때문입니다. 마스크 품질 보증 검토 과정에서, 인접 셀, 과도한 배경 또는 이미지 경계가 포함된 마스크는 거부되어야 합니다. 반대로, 모든 원거리 과정을 포착하지 못한다는 이유만으로 작은 마스크를 거부해서는 안 되며, 반복 마스크 생성 알고리즘은 마스크 크기와 지역 픽셀 강도에 따라 국소 임계값 매개변수를 의도적으로 조정합니다.

이 방법론은 매우 유연하며 특정 실험 요구사항에 맞게 수정할 수 있습니다. MMPS는 오픈 소스이기 때문에, 개별 Z-스택 프레임을 분석하거나 자동 셀 탐지 알고리즘을 통합하여 완전 자동화된 형태학 분석 파이프라인을 생성할 수 있습니다. 또한, 생성된 마스크와 소마 아웃라인은 프랙탈, 헐, 스켈레톤, 숄 분석을 위한 ImageJ 기반 워크플로우와 호환됩니다. MMPS는 Python 3.11에서 개발되었기 때문에, 외부 소프트웨어 플랫폼 없이도 일반적으로 제공되는 과학적 Python 패키지를 사용해 추가 분석도 소프트웨어에 직접 통합할 수 있습니다.

이러한 장점에도 불구하고 여러 가지 제한점이 고려해야 합니다. MMPS는 수컷 스프래그-도울리 쥐의 특정 뇌 영역에서 신경염증 모델을 사용하여 검증되었으며, 다양한 뇌 영역, 질병 모델, 종 또는 생물학적 성별이 형태학적 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 MMPS의 대안적 실험 패러다임 적용 가능성은 파일럿 연구를 통해 검증되거나 이전 문헌 비교를 통해 뒷받침되어야 합니다. 또한, IF 기반 영상은 초점면 위나 아래로 뻗은 과정이 최대 투영 이미지에서 감지되지 않을 수 있어 3차원 분기 구조를 불완전하게 포착합니다. 분석 세포 수를 늘리면 이 한계를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. MMPS는 또한 이미지 획득 품질에 의존하기 때문에 개별 영상 시스템, 염색 프로토콜, 항체 준비에 대한 최적화가 필요합니다. 저해상도 이미지는 소모스 주변 경계가 흐릿하고 가지가 빽빽하게 빽빽이 쌓여 있어 마스크 크기를 인위적으로 부풀릴 수 있습니다. 이러한 이유로 본 프로토콜은 자유 부동 IF 방법과 다양한 이미지 처리 옵션을 포함하여 이미지 품질을 극대화합니다.

MMPS는 사용자가 수동으로 셀을 선택하고 소마를 구분하기 때문에 사용자 의존적 변동성의 가능성을 유지합니다. 그러나 DAPI와 Iba1 공동 위치의 사용은 세포 선택 시 모호성을 크게 줄여줍니다. 더불어, 블라인드 간 사용자 간 분석은 이전에 훈련되지 않은 사용자 간 변동성이 최소화되어 분석 워크플로우의 재현성을 뒷받침했습니다.

이전에 발표된 여러 미세교세포 형태학 플랫폼과 달리, MMPS는 완전 자동화되어 있지 않습니다. 하지만 이 설계는 세분화 정확성과 마스크 품질 보증을 우선시하기 위해 선택되었습니다. 파이썬 소스 코드 수정을 통해 자동화된 워크플로우를 통합하여 DAPI/Iba1 공동위치 탐지, 윤곽선 기반 소마 아웃라인, 머신러닝 기반 마스크 수용 또는 거부를 가능하게 할 수 있습니다. 또한, 생성된 마스크와 Soma 개요가 자동으로 .tiff 파일로 저장되어 하위 분석 및 품질 보증을 위해 MMPS가 상당한 디스크 저장 용량을 요구합니다. 저장 요구량은 소프트웨어를 수정하여 셀별로 순차적으로 마스크를 생성한 후 즉시 품질 평가와 매개변수 추출을 통해 줄일 수 있습니다.

결론적으로, MMPS는 코딩 전문성이나 생체 내 영상 능력이 필요 없는 표준화된 오픈소스 플랫폼을 제공함으로써 미세아교 형태학의 정량적 분석 접근성을 확장합니다. 이 플랫폼은 IF 기반 미세아교 형태의 재현 가능한 분석을 가능하게 하면서도 고급 하위 분석 접근법과의 호환성을 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	조직 섹션의 배양 및 세척에 사용되는 플레이트.
알루미늄 호일	Fisher Scientific	01-213-101	형광 샘플을 광 노출로부터 보호하는 데 사용됩니다.
항원 회수 버퍼(10배)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	면역형광 염색 중 항원 접근성을 개선하는 데 사용됩니다.
항-Iba1 일차 항체	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	미세아교 세포의 면역형광 표지에 사용되는 일차 항체.
동결 미세 절편기	Fisher Scientific	95-710-0L	정의된 두께로 냉동된 뇌 조직을 절편하는 데 사용되는 기기.
토끼 항-동물 IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	토끼 일차 항체의 시각화에 사용되는 형광 이차 항체.
동물 혈청	Fisher Scientific	50-413-115	비특이적 항체 결합을 줄이는 데 사용되는 차단 시약.
EVOS FL Auto 2 이미징 시스템	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	이미지 획득에 사용되는 형광 현미경.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	다운스트림 형태학 분석 및 플러그인에 사용되는 이미지 처리 플랫폼.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	형광을 보존하고 커버슬립을 고정하는 데 사용되는 실란트.
이소플루란	EntirelyPets 약국	MWI502017	동물 절차 중 사용되는 흡입 마취제.
리포폴리사카라이드	Millipore Sigma	L2630	설치류의 전신 신경염 및 미세아교 세포 활성화를 유도하는 데 사용됩니다.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		데이터 시각화 및 그림 생성에 사용되는 Python 플로팅 라이브러리.
MMPS(Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	본 연구	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	미세아교 형태학 분석을 위해 개발된 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼.
넷 웰	Millipore Sigma	CLS3477	염색 절차 중 자유 부유 조직 섹션을 고정하는 데 사용되는 인서트.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		MMPS 내에서 수치 계산에 사용되는 Python 라이브러리.
목적 렌즈(4배)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	해부학적 방향 및 영역 식별에 사용되는 저배율 목적 렌즈.
목적 렌즈(40배)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	미세아교 세포 형태 이미징에 사용되는 고배율 목적 렌즈.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		MMPS 내 이미지 처리 기능에 사용되는 컴퓨터 비전 라이브러리.
파라포르말데하이드	ThermoFisher Scientific	169650025	절편화 전 조직 퍼윤 및 보존에 사용되는 고정제.
퍼마운트	Fisher Scientific	SP15-100	슬라이드 보존에 사용되는 영구 실란트.
인산 완충 식염수	Fisher Scientific	BP3991	조직 세척 및 시약 준비에 사용되는 버퍼 용액.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		이미지 처리 작업에 사용되는 Python 이미징 라이브러리.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		MMPS 그래픽 사용자 인터페이스를 생성하는 데 사용되는 Python GUI 프레임워크.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	MMPS를 개발하고 실행하는 데 사용되는 프로그래밍 언어 환경.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	데이터 분석 및 그래프 생성에 사용되는 통계 소프트웨어.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		이미지 처리 및 분할에 사용되는 Python 이미지 분석 라이브러리.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		필터링 및 이미지 처리 작업에 사용되는 Python 과학 계산 패키지.
Sprague-Dawley 쥐	Evingo	002	신경염 모델의 검증에 사용되는 실험 동물.
수크로오스	Fisher Scientific	S5-3	뇌 조직을