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방법 논문

수산화나트륨과 데옥시콜산나트륨을 이용한 탈세포화 인간 말초신경 이식편의 제작

165 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71578

⸱

2026년 9월 1일

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 수산화나트륨 처리와 연동 펌프 구동 용액 교환 시스템을 결합한 표준화된 알칼리 보조 탈세포화 방법을 설명하며, 이를 통해 세포를 효과적으로 제거하고 천연 세포외 기질 구조를 보존한 탈세포화 인간 말초 신경 이식편을 제작합니다.

초록

말초 신경 손상은 흔히 축삭 재생을 위한 구조적 안내를 제공하는 이식재를 필요로 합니다. 자가 신경 이식이 여전히 임상적 표준으로 남아 있지만, 공여 부위의 이환율과 제한된 조직 가용성으로 인해 그 사용이 제한적입니다. 이러한 한계로 인해 신경 재생을 위한 대체 생체 재료로서 탈세포화된 인간 말초 신경 이식재에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 그러나 일반적으로 사용되는 세제 기반의 탈세포화 프로토콜은 세포외 기질(ECM) 구조를 파괴하고 세포 독성 잔류물을 남겨 이식재의 품질을 저하시킬 수 있습니다. 본 논문에서는 알칼리 보조 탈세포화 방식을 이용한 탈세포화 인간 말초 신경 이식재 준비를 위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 효율적인 세포 파괴를 촉진하기 위한 수산화나트륨(NaOH) 처리로 시작하며, 이후 온화한 소듐 데옥시콜레이트(SDC) 단계를 통해 천연 ECM 조직을 보존하면서 남은 세포 및 면역원성 성분을 제거합니다. 이러한 전략은 세제 노출을 제한하는 동시에 천연 ECM 구조의 보존을 지원합니다. 워크플로우에는 공여 신경 준비, 제어된 NaOH 처리, 후속 온화한 SDC 처리, 그리고 잔류 처리제의 제거를 용이하게 하기 위해 연동 펌프 구동 시스템을 이용한 지속적인 용액 교체 하의 광범위한 세척 과정이 포함됩니다. 구조적 무결성을 유지하고 최종 포장 및 멸균을 위해 이식재를 준비하는 추가적인 후처리 단계가 수행됩니다. 탈세포화 효율은 조직학적 분석과 잔류 DNA 정량을 통해 평가하며, ECM 구조의 보존 여부는 주사 전자 현미경을 사용하여 검사합니다. 잔류 SDC의 부재와 처리된 이식재의 생체 적합성은 세포 독성 시험을 통해 확인되었습니다. 본 프로토콜은 말초 신경 재생 연구 및 중개 응용을 위한 탈세포화 인간 말초 신경 이식재를 생산하는 실용적인 방법을 제공합니다.

서론

말초 신경 손상은 심각한 기능 장애를 초래할 수 있으며, 재생 의학과 재건 외과 분야에서 여전히 중요한 임상적 과제로 남아 있습니다. 분절성 신경 결손의 재생을 위해서는 손상된 간극을 연결할 뿐만 아니라 축삭 재생과 신경 재지배를 지원하는 구조적 유도 및 생화학적 신호를 제공하는 이식 재료가 필요합니다. 자가 신경 이식은 천연 세포외 기질(ECM) 구조를 보존하고 신경 재생을 위한 지지적 미세환경을 제공하기 때문에 임상적 표준 치료법(gold standard)으로 널리 간주됩니다1,2. 하지만 공여 조직의 제한된 가용성, 추가적인 수술 절차의 필요성 및 공여 부위의 이환율로 인해 임상적 사용에 제한이 있습니다3,4. 이러한 한계로 인해 대체 이식 재료의 개발, 특히 면역원성 세포 성분은 최소화하면서 천연 ECM 구조는 유지하는 탈세포화 말초 신경 이식재의 개발이 추진되어 왔습니다5,6,7,8.

탈세포화된 신경 이식편의 성능은 탈세포화 과정에 크게 의존합니다. 기존 방법은 일반적으로 Triton X-100 및 sodium deoxycholate (SDC)와 같은 계면활성제 기반 시약에 의존하며, 이는 지질 막을 가용화하여 세포 성분을 제거합니다9,10,11. 그러나 이러한 계면활성제에 장기간 노출되면 ECM 미세구조가 파괴될 수 있으며, 세포 생존력과 재생 결과에 부정적인 영향을 미치는 잔류 세포독성 물질이 남을 수 있습니다12,13. 이에 따라, ECM의 무결성을 유지하면서 효율적인 세포 제거가 가능한 대체 탈세포화 전략이 활발히 연구되고 있습니다14. 수산화나트륨 (NaOH)을 이용한 알칼리 탈세포화는 극한의 pH 조건이 세포 성분, 핵산 및 지질을 효율적으로 분해할 수 있기 때문에 잠재적인 대안적 접근법으로 등장했습니다15,16,17. 그럼에도 불구하고, 강알칼리 조건에 무분별하게 노출되면 ECM의 무결성이 손상될 수 있으며, 이는 정밀하게 제어된 처리 조건의 중요성을 강조합니다16,18.

본 연구에서는 연동 펌프 구동식 연속 용액 교환 시스템을 통합한 인간 말초 신경 이식편을 위한 표준화된 알칼리 보조 탈세포화 프로토콜을 제시합니다. 기존의 정적 침지 방법과 비교하여, 이러한 동적 공정은 연속적인 용액 교환을 가능하게 하여 세포 잔해와 잔류 처리제의 제거를 촉진합니다. 본 논문은 공여 신경 준비, 제어된 알칼리 보조 탈세포화, 연동 펌프 구동 시스템을 이용한 연속 용액 교환을 포함한 전체 워크플로우의 단계별 시각적 시연을 제공합니다. 결과물인 이식편은 조직학적 분석, 잔류 DNA 정량화 및 주사 전자 현미경(SEM)을 통해 평가되어, 효율적인 탈세포화와 ECM 초미세 구조의 보존을 확인하였습니다. 주요 기술적 단계의 명확한 시각화를 통해, 본 논문은 탈세포화된 신경 이식편 준비 및 향후 공정 규모 확장을 위한 명확하게 정의된 프레임워크를 제공합니다.

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프로토콜

기증된 인간 말초 신경은 L&C BIO와의 독점 계약에 따라 미국 조직 은행으로부터 제공되었으며, 미국 조직 은행 협회(AATB) 및 미국 식품의약국(FDA)의 규정을 준수하였습니다. 연령, 성별, 병력 및 혈청학적 검사 결과를 포함한 기증자 정보가 조직과 함께 제공되었으며, 인증된 의료 책임자의 검토 및 승인을 거쳤습니다. 조직 수령 시, 기증자 스크리닝, 혈청학적 검사 및 관련 병원체 검사를 포함한 입고 검사를 수행하였으며, 미리 정의된 수락 기준을 충족하는 조직만을 본 연구에 사용하였습니다. 인간 시료와 관련된 모든 절차는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었습니다. 본 연구에서는 인간 피험자를 직접 모집하거나 참여시키지 않았으므로, 별도의 기관생명윤리위원회(IRB) 승인 번호는 발급되지 않았습니다.

1. 용액 준비 (1일차)

  1. 자기 교반을 통해 1 L의 증류수에 10 g의 NaOH를 녹여 0.25 N 수산화나트륨(NaOH) 용액을 준비합니다.
  2. 자기 교반을 통해 1 L의 증류수에 40 g의 SDC를 녹여 4% 데옥시콜산나트륨(SDC) 용액을 준비합니다.
  3. 준비된 각 용액을 멸균된 유리병에 옮깁니다.
    주의: 데옥시콜산나트륨(SDC)은 화학 흄후드 내에서 취급하십시오. 흡입 및 피부 접촉을 방지하기 위해 장갑, 실험복, 보호안경을 포함한 적절한 개인 보호 장구를 착용하십시오.

2. 탈세포화를 위한 말초 신경 분절 준비

  1. 포장된 말초신경 원료의 겉면을 소독하고 무균적으로 포장을 개봉합니다.
  2. 멸균 증류수로 말초신경을 여러 번 헹굽니다.
  3. 멸균 가위와 포셉을 사용하여 잔여 지방 조직, 결합 조직, 불필요한 분지 및 손상된 신경 조직을 제거합니다. 말초신경을 멸균 증류수로 다시 헹굽니다.
  4. 말초신경을 2–5 cm 길이의 분절로 절단합니다. 준비된 분절을 2–3 cm, >3–4 cm, >4–5 cm의 세 가지 길이 그룹으로 분류합니다.
    참고: 표 1에 요약된 바와 같이, 신경 분절 길이에 따라 IPA, NaOH 및 SDC 처리 시간이 다르므로 각 길이 그룹을 별도로 처리하십시오.

3. 연동 펌프 시스템 설정

  1. 충분한 길이의 화학적 내성이 있는 실리콘 튜브를 크로마토그래피 컬럼의 양 끝에 연결합니다.
  2. 튜브의 한쪽 끝을 연동 펌프에 연결합니다.
  3. 펌프 튜브를 사용하여 튜브의 나머지 끝을 isopropyl alcohol (IPA)가 들어 있는 1 L 유리병에 연결하여 밀폐 루프 순환 시스템을 구축합니다.
    참고: 연동 펌프의 압력과 진동으로 인해 튜브가 컬럼이나 병에서 분리될 수 있으므로 모든 튜브 연결 부위를 단단히 고정하십시오.

4. 말초신경의 탈지질화

참고: 별도의 지시가 없는 한, 모든 용액 교환 단계는 튜브 구성에 따라 90–186 mL/min으로 설정된 연동 펌프를 사용하여 실온(20–25 °C)에서 수행하십시오. 각 처리 과정 전반에 걸쳐 선택한 유속을 일정하게 유지하십시오.

  1. 크로마토그래피 컬럼의 한쪽 끝을 열고, 삽입 직후에 신경 조직이 계속 잠겨 있을 수 있도록 IPA 용액을 컬럼에 부분적으로 채웁니다.
  2. 멸균 핀셋을 사용하여 준비된 단일 말초 신경 분절의 한쪽 끝에 있는 외부 조직을 부드럽게 잡습니다. 신경의 본체를 직접 압착하거나 잡지 않도록 주의하십시오. 신경 분절을 컬럼 내의 용액 속으로 조심스럽게 내립니다.
  3. 핀셋을 사용하여 신경 분절을 부드럽게 펴고, 유체 흐름 방향과 평행하게 세로로 배치합니다. 분절이 접히거나 말리지 않도록 하고, 컬럼의 내벽이나 배출 필터에 밀착되지 않도록 합니다.
  4. 컬럼을 닫고 배출구가 입구보다 약간 높게 위치하도록 배출구 쪽으로 약간 경사지게 배치합니다. 이러한 방향 설정은 신경 분절이 양 끝의 필터, 특히 배출 필터에 가라앉는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
    참고: 절차당 컬럼 하나에 말초 신경 분절 하나만 처리하십시오. 추가적인 물리적 고정 장치는 필요하지 않습니다. 신경 조직의 자연적인 부력과 상대적으로 완만한 유체 흐름 덕분에 분절이 부유 및 신장된 상태를 유지할 수 있습니다. 처리 과정 중 조직의 위치를 점검하고, 컬럼 벽, 필터 또는 조직 자체에 달라붙은 경우 멸균 핀셋으로 부드럽게 위치를 조정하십시오.
  5. IPA 용액을 연동 펌프 시스템에 연결합니다. 신경 분절의 길이가 2–3 cm인 경우 1.5 h, >3–4 cm인 경우 2 h, >4–5 cm인 경우 2.5 h 동안 컬럼을 통해 지속적으로 용액 교환을 수행합니다.
  6. 컬럼에서 용액을 배출합니다.
  7. 멸균 증류수 40 mL를 컬럼에 추가합니다. 컬럼을 부드럽게 뒤집거나 흔들어 말초 신경을 5회 세척합니다.
  8. 단계 4.6과 4.7을 반복하여 총 5회 세척합니다.
  9. 멸균 증류수 5 L가 담긴 저장조를 연동 펌프 시스템에 연결합니다. 밤새도록 컬럼을 통해 지속적으로 용액 교환을 수행합니다.
    일시 중지 지점: 밤샘 세척을 완료한 후 절차를 일시 중지할 수 있습니다. 연동 펌프를 멈추고, 단계 5.1로 진행하기 전까지 말초 신경을 멸균 증류수에 완전히 담근 상태로 4 °C에서 최대 24 h 동안 보관하십시오.
    참고: 효율적인 용액 교환을 위해 컬럼 내부의 기포를 최소화하십시오. 말초 신경 분절이 용액 속에 부유 상태를 유지하고 컬럼 내벽이나 필터에 달라붙지 않도록 필요에 따라 조정하십시오.

5. 1차 탈세포화 수행 (2일차)

  1. 0.25 N NaOH 용액을 연동 펌프 시스템에 연결하십시오. 신경 분절의 길이가 2~3 cm인 경우에는 6시간 동안, 분절의 길이가 >3~4cm이거나, 해당 측정값의 분절인 경우 10시간 동안 >4–5 cm.
  2. 컬럼에서 용액을 배출하십시오.
  3. 단계 4.6~4.8에서 설명한 대로 말초 신경을 세척하십시오.
  4. 멸균 증류수 5 L가 담긴 저장조를 연동 펌프 시스템에 연결하십시오. 밤새도록 컬럼을 통해 용액을 지속적으로 교환하십시오.
    일시 중지 지점: 밤샘 세척을 완료한 후, 절차를 일시 중지할 수 있습니다. 연동 펌프를 정지하고 말초 신경을 멸균 증류수에 완전히 잠긴 상태로 다음 온도에서 보관하십시오. 4 °C 단계 6.1로 넘어가기 전까지 최대 24시간 동안 유지하십시오.

6. 2차 탈세포화 수행 (3일 차)

  1. 4% (w/v) SDC 용액을 연동 펌프 시스템에 연결합니다. 신경 분절의 길이에 따라 2–3 cm인 경우 6시간, >3–4 cm인 경우 8시간, 또는 >4–5 cm인 경우 10시간 동안 컬럼을 통해 용액을 지속적으로 교체합니다.
  2. 컬럼에서 용액을 배출합니다.
  3. 단계 4.6–4.8에서 설명한 대로 말초 신경을 세척합니다.
  4. 5 L의 멸균 증류수가 담긴 저장조를 연동 펌프 시스템에 연결합니다. 밤새도록 컬럼을 통해 용액을 지속적으로 교체합니다.
    일시 중단 지점: 밤샘 세척을 완료한 후, 절차를 일시 중단할 수 있습니다. 연동 펌프를 멈추고 말초 신경을 멸균 증류수에 완전히 잠긴 상태로 4 °C에서 최대 24시간 동안 보관한 후 단계 7.1로 진행하십시오.

7. 탈세포화된 말초 신경 멸균 (4일 차)

  1. 컬럼에서 소량의 증류수를 제거합니다. 남은 액체에 신경이 잠긴 상태를 유지하면서 탈세포화된 말초 신경을 조심스럽게 회수합니다.
  2. 말초 신경을 멸균 증류수와 함께 포장합니다.
  3. 포장된 말초 신경을 25 kGy 선량으로 감마선 조사하여 멸균합니다.
    참고: 컬럼에서 증류수를 완전히 배출하지 마십시오. 신경 분절이 컬럼 내벽에 달라붙는 것을 방지하고, 액체가 넘치지 않는 범위 내에서 조심스럽게 다룰 수 있도록 충분한 양의 액체에 잠긴 상태로 유지하십시오.

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결과

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

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토론

본 연구는 말초 신경 재생을 위한 탈세포화된 인간 말초 신경 이식편 제작을 위한 표준화된 알칼리 보조 탈세포화 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 공여 신경 전처리, 제어된 화학적 탈세포화, 연동 펌프 구동 용액 교환 시스템을 명확하게 정의된 워크플로우로 통합하여, 천연 ECM 구조를 보존하면서 세포 및 면역원성 성분을 효율적으로 제거할 수 있게 합니다.

이 방법의 핵심 특징은 알칼리 처리와 계면활성제 노출 감소의 통합입니다. Sondell(3% Triton X-100 및 4% SDC) 및 Hudson 방법(sulfobetaine-10, sulfobetaine-16, Triton X-200)과 같은 기존의 계면활성제 기반 프로토콜은 효과적인 탈세포화를 달성하기 위해 장시간의 다단계 계면활성제 처리에 의존합니다9,10. 이러한 접근 방식은 세포 성분을 효과적으로 제거하지만, ...

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공개 사항

저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 밝힙니다.

감사의 글

이 연구는 한국 정부(산업통상자원부)의 지원으로 한국산업기술진흥원(KIAT)이 제공하는 과제(P0011947, 한-체코 양자 공동자금 R&D 프로젝트)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BT100-1L 다채널 연동 펌프Longer PumpBT100-1L지질 제거, 탈세포화 및 세척 과정 동안 지속적인 순환과 용액 교환을 제공하는 데 사용됨.
Econo-Column 크로마토그래피 컬럼, 2.5 × 10 cmBio-Rad737-2512지속적인 용액 교환 동안 말초신경 분절을 고정하는 데 사용됨.
이소프로필 알코올 (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410말초신경 조직의 지질 제거에 사용됨.
Masterflex Tygon E-LFL 펌프 튜브Thermo Scientific06440-16지속적인 용액 순환을 위해 연동 펌프, 크로마토그래피 컬럼 및 용액 저장조를 연결하는 데 사용됨.
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma-Aldrich30970-100G잔류 세포 성분을 제거하기 위한 2차 탈세포화 단계의 계면활성제로 사용됨.
수산화나트륨, NaOHDuksan1636세포 파괴용.

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