이 연구는 신뢰할 수 있는 주간 생체 위상 이동을 가능하게 하는 화학유전학 및 보라색 빛 기반 전략을 도입합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류에서는 낮 동안의 일주기 위상 이동이 시상상핵(SCN)의 광 반응성 감소로 제한되며, 이 단계에서 생체 리듬을 실험적으로 조작하는 능력이 제한됩니다. 따라서 일주기 가소성과 광 동열의 메커니즘을 연구하는 데 있어 주간 위상 이동을 유도하는 신뢰할 수 있는 방법이 필수적입니다. 상호 보완적인 유전적 및 스펙트럼 전략을 설명하여 낮 동안 생체 리듬을 견고하고 시간적으로 정확하게 조작할 수 있게 합니다. 첫 번째 접근법은 현재 마우스에 한정되어 있으며, 설계 약물에 의해 독점적으로 활성화된 디자이너 수용체(DREADDs)를 유리체내 전달하여 내성 광감성 망막 신경절 세포(ipRGCs)를 선택적으로 활성화하는 화학유전학적 전략을 사용합니다. 이 접근법은 망막시상하부 경로를 제어하여 활성화할 수 있게 하며, 주변 조명 조건과 무관하게 반복 가능한 주간 위상 이동을 유도합니다. 두 번째 접근법은 비침습적 대안으로 파장 특이적 광학 자극을 활용합니다. 보라색 빛에 노출되면 ipRGC의 스펙트럼 민감도를 이용해 탈편광 차단을 줄이고 지속적인 활성화를 촉진하여 주관적 하루에 신뢰할 수 있는 위상 재설정을 가능하게 합니다. 이 방법은 포유류 시스템 전반에 걸쳐 널리 적용 가능하며 유전적 조작이나 약물학적 개입이 필요하지 않습니다. 실험 준비, 자극 시기, 운동 활동을 이용한 위상 이동 검증, c-Fos 면역조직화학을 통한 신경 활성화 평가에 대한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 일주기 타이밍, 자극 매개변수, 실험 대조군 등 주요 고려사항이 재현성을 높이기 위해 제시됩니다. 이 방법들은 함께 주간 생체 위상 이동을 유도하는 다재다능하고 실험적으로 다루기 쉬운 도구를 제공하며, 주간 생체 반응성의 기전을 직접 조사할 수 있게 합니다.
서론
시상핵(SCN)은 포유류 뇌의 주된 생체 리듬 시계로, 수면-각성 주기와 섭식 패턴 등 생리와 행동의 필수적인 일상 리듬을 조정합니다. 외부 환경과의 정렬을 유지하기 위해 SCN은 내재 광감성 망막 신경절 세포(ipRGCs)로부터 직접 광 입력을 받으며, ipRGCs는 망막 빛 정보를 전달하여 내부 생체 리듬을 태양일과 동기화합니다.
생물체 전반에 걸친 생체 시스템의 특징 중 하나는 위상 의존적 반응성입니다: 서로 다른 생체 기준 시간에 전달되는 동일한 자극이 현저히 다른 효과를 낼 수 있습니다. 포유류에서는 야간 빛이 SCN 시계의 위상 이동을 안정적으로 유도하는 반면, 주관적 낮에 노출되면 리셋이 거의 또는 전혀 발생하지 않습니다 3,4. 이러한 낮 무감감도는 생체 내와 시험관 내 준비 모두에서 일관되게 관찰되었으며, 광 입력을 모방하려 할 때 유의미한 위상 이동을 유도하지 못합니다 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16.
주간 무감각성은 적어도 부분적으로는 SCN 내의 생체 규칙 게이팅 메커니즘과 함께 위상 재설정 메커니즘을 작동시키기 위한 망막 구동 부족에 기인합니다. 이 생각과 일치하게, ipRGC는 광광 조건에서 균일하게 반응하지 않습니다; 한 부분이 탈분극 블록에 진입하여 지속 활동 전위17, 18, 19 발화를 제한합니다. 이러한 생리적 제약은 낮 동안 기존의 광 자극의 효과를 저하시킬 수 있습니다. 이 한계를 극복하면 전통적으로 광 재설정에 불응성으로 여겨졌던 주간 시계의 가소성을 직접 조사할 수 있게 되었습니다.
주관적인 하루 동안 생체 시계의 강력한 위상 이동을 가능하게 하는 두 가지 보완적인 방법론이 설명되어 있습니다. 첫 번째 접근법은 주변 조명 조건과 무관하게 ipRGCs를 선택적으로 활성화하는 화학유전학적 전략을 사용합니다. 구체적으로, Opn4Cre/+ 마우스는 흥분성 디자이너 수용체(DREADD)를 암호화하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 Cre-의존적으로 주사합니다. 클로자핀-N-옥사이드(CNO)를 일주기 4(CT4)에 투여하면 ipRGCs가 폭발적으로 발화되어 망막시상하부 경로의 지속적인 활성화를제공합니다. 위상 이동은 운동 활동 기록을 통해 정량화되며, SCN 내 분자 활성화는 c-Fos 면역조직화학으로 평가됩니다.
두 번째 접근법은 파장별 광학 자극을 비침습적 전략으로 사용하여 더 넓은 적용 가능성을 높입니다. 야생형 쥐는 주관적 낮 중간에 생체 시계 6(CT6)에 보라색 빛(385 nm)에 노출됩니다. 보라색 빛은 청색 또는 백색 빛에 비해 감소한 편광 차단을 제공하며, 지속적인 ipRGC 활성화를 지원합니다19. 위상 이동은 위에서 설명한 대로 정량화됩니다.
두 방법 모두 ipRGC 기반 신호 전달을 강화하여 주관적 하루의 빛 반응성 저하를 극복하는 것을 목표로 합니다. 이 방법론들은 전통적으로 광 재설정에 저항하는 단계에서 일주기 시계를 조작하는 견고하고 실험적으로 다루기 쉬운 전략을 제공합니다.
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프로토콜
모든 동물 시술은 미국 국립정신건강연구소(NIMH) 동물 관리 및 사용 위원회(ASP-SLCR-01)의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 통증을 최소화하고 동물 수를 줄이기 위해 모든 노력이 기울여졌습니다. 사용되는 연구 도구들은 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 화학유전 전략
- Opn4Cre/+ 마우스에 대한 아데노 관련 바이러스의 유리체 주사
- 입체성 단계와 모든 수술 기구를 적절한 멸균 절차로 청소하고 소독하십시오. 주입 장치를 설치하고 유리 모세관 주입 바늘을 부착하세요.
- 이소플루란으로 쥐를 마취하세요. 산소 유량을 약 1.5 L/min으로 설정하세요. 유도 시에는 이소플루란을 3%–5%로 조절하고, 유지 시술 기간 동안에는 1–3%로 줄이세요.
- 발가락 집기로 적절한 마취를 확인하세요. 철회나 움찔하는 반사가 관찰되지 않을 때는 동물이 완전히 마취된 것으로 간주합니다.
- 시술 내내 체온을 유지하기 위해 쥐를 온열 패드 위에 올려놓으세요.
- 유리 모세혈관 바늘을 뽑아. 바늘은 입체현미경 아래 미세한 마커를 사용해 끝에서 ~1.5mm 떨어진 곳에 표시하여 일정한 관통 깊이 전달을 보장했습니다.
- 무딘 끝의 겸자로 하눈꺼풀에 부드럽게 압력을 가해 눈알을 약간 돌출시키고 등쪽 림부스를 드러냅니다. 배측 접근법을 사용하여 바늘을 눈 표면에 접선으로 삽입하고, 변두막 뒤쪽 0.5–1mm 지점을 관통하며, 혈관 형성된 림부는 피합니다.
- 바늘을 미리 정해진 깊이로 유리체실에 삽입합니다. 안압을 완화하고 조직에 의해 바늘 끝이 막히는 것을 방지하기 위해 약간 빼세요.
- 총 부피 1.5 μL AAV 용액(2.4 x 1013 GC/ml)을 5회 연속 주입(각각 300 nL, 50nl/s)으로 투여합니다. 주사 사이에 5초간 휴식을 취해 확산을 허용하고 역류를 최소화하세요. 최종 주사 후에는 30초간 기다렸다가 천천히 바늘을 빼세요. 동일한 매개변수를 사용하여 반대쪽 눈에서도 같은 절차를 반복하며, 외상과 역류를 최소화하는 데 주의하세요.
- 수술 직후 케토프로펜(10 mg/kg, 피하 투여)을 투여하세요.
- 마우스를 최소 2주간 회복시켜 적절한 바이러스 발현을 확인한 후 행동 치료 시설로 옮기세요.
- 휠러닝 활동 및 CNO 행정 (그림 1A)
- 집쥐는 달리는 바퀴가 달린 우리에 개별적으로 가둬야 합니다. 자동 데이터 수집 시스템을 사용하여 바퀴 주행 활동을 기록하세요.
- 4일에서 7일간 12시간 12분의 밝고 어두운 주기로 동기화했습니다. 안정적인 동조를 확인한 후 동물들을 지속적인 어둠(DD)으로 전환시킨다.
- 분석 소프트웨어를 사용해 활동 시작 여부를 파악하세요. 야행성 설치류에서 활동 시작을 CT12로 정의합니다. CT4를 그에 맞게 계산하세요.
- DD 8일째에는 쥐들이 CT4에서 어두운 빨간 조명 아래에서 CNO(1 mg/kg) 또는 생리식염수 복강내 주사를 받습니다.
- 동물을 집 우리로 돌려보내고 지속적인 어둠 속에 두세요. 8일간 연속 운동 활동을 기록하세요.
- 활동 시작 시기를 파악하고 주사 전후 기간에 대한 회귀분석을 수행합니다. 위상 이동을 예상 활동 시작과 관측 활동 시작 시점의 차이로 계산하세요.
- 화학유전학적 활성화 후 SCN c-Fos 면역조직화학
- 쥐를 12시간 12분의 밝고 어둠 주기로 묶어 지속적인 어둠 속으로 풀어줍니다. DD 둘째 날에는 CT6에서 CNO를 투여합니다. 주사 후 30분 후에 동물을 관류하세요.
참고: CT4는 CNO가 몇 시간 동안 활성 상태를 유지할 수 있기 때문에 주관적 밤까지 효과가 확장될 가능성을 최소화하기 위해 행동 실험에 사용되었습니다. 반면, CT6는 CNO가 생체 시계에 미치는 급성 효과를 평가하기 위한 면역염색 실험에 사용되었으며, 주사 후 30분 후에 동물을 관류했습니다. - 뇌를 해부하고 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 하룻밤 고정 후 투여합니다. 조직이 가라앉을 때까지 30% 자당에 크라이오프로텍트를 넣으세요. 40 μm 기준으로 코로나를 절단합니다.
- 차단 용액에서 절편을 배양한 후 4°C에서 1차 항체 배양을 하룻밤 진행합니다. 세척하고 2차 항체와 함께 1시간 배양하세요. DAPI와 마운트 섹션으로 카운터 스테인을 하세요.
- 일관된 현미경 설정을 사용해 이미지를 획득하세요. 분석 소프트웨어를 사용해 이미지를 처리합니다. mCherry 양성 세포로 AAV 감염 부위를 식별합니다.
- 쥐를 12시간 12분의 밝고 어둠 주기로 묶어 지속적인 어둠 속으로 풀어줍니다. DD 둘째 날에는 CT6에서 CNO를 투여합니다. 주사 후 30분 후에 동물을 관류하세요.
2. 스펙트럼 전략
- 야생형 쥐는 행동 치료 시설로 옮겨 위에서 설명한 대로 주행 바퀴가 달린 우리에 개별적으로 수용하세요. 동물을 지속적인 어둠 속에 두어 자유롭게 움직이는 일주기 활동을 모니터링하세요.
- DD 8일째, 일주기 6(CT6)에 케이지를 빛이 차단된 캐비닛에서 꺼내고 쥐를 15분간 빛 펄스에 노출시킵니다.
- 쥐에게는 청색광 펄스(λmax = 470 nm; 1.8 × 1014–2.2 × 1014 광자/cm2/s) 또는 보라색 빛 펄스(λmax = 385 nm; 1.45 × 1014–3.3 × 1014 광자/cm 2/s)에 노출시키고, 세기는 동물의 눈높이 중앙과 네 모서리에서 측정합니다.
- 두 파장 조건 모두 쥐를 우리 뚜껑을 제거한 채 집 우리에 두세요. 고정된 광원 바로 아래에 케이지를 배치하여 빛의 중심이 케이지 중심과 정렬되도록 하여 균일한 조명을 보장합니다.
- 빛에 노출되면 즉시 우리를 원래의 위치로 돌려놓으세요. 위상 이동 분석을 위해 중단 없이 바퀴 주행 활동을 계속 기록하세요.
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결과
OPN4Cre/+ 마우스에서 CT4에서 식염수를 투여한 AAV-DREADD 발현 쥐는 휠 러닝 활동에서 유의미한 위상 이동을 보이지 않았습니다(n = 5; 그림 1B). 반면, CT4 시점의 CNO 투여는 활성 시작 단계에서 유의미한 단계 지연을 보였다(SEM 평균 ± 5.03 ± 0.48시간; n = 5; 그림 1C, D)에서 이 일주기 시간의 DREADD 활성화가 운동 활동 리듬을 이동시킨다는 것을 보여줍니다. 실험 설계의 회로도는 그림 2A에 나와 있습니다. 동일한 마우스에서 CNO 투여 시 주사 후 30분 후 SCN 내 c-Fos 발현이 식염수 대조군(그림 2C
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토론
결과는 주관적 낮 동안 ipRGCs가 활성화되면 쥐에서 일주기 위상 이동을 유도할 수 있음을 보여주는데, 이 시기는 일반적으로 광 자극에 대한 민감도가 감소하는 것으로 특징지어집니다. 화학유전학적 접근법은 외부 빛과 무관하게 ipRGCs의 선택적 활성화를 가능하게 했고, 휠 러닝 행동에서 강력한 위상 지연을 발생시켰습니다. 이 활성화는 SCN에서 급성 c-Fos 발현을 유도하여 중심 생체 박동 조율기의 활성화를 확인시켰습니다. 이 결과는 ipRGC 주도의 망막시상하부 경로에 대한 강한 자극이 일주기 시스템의 낮 반응성 저하를 극복하기에 충분함을 시사합니다.
파장 특이적 광학 자극은 낮 시간 위상 재설정을 달성하기 위한 보완적이고 비침습적인 전략을 제공합니다. 짧은 보라색 빛의 펄스는 상당한 위상 지연을 유발한 반면, 비슷한 강도와 비교 시간 동안의 청색광 펄스는 그렇지 않았다. 이 발견들은 빛의 스펙트럼 특성이 주관적인...
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공개 사항
저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
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재료
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Cre-dependent viral vector encoding excitatory DREADD (hM3Dq) fused to mCherry for selective ipRGC activation |
| Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 2250S | Primary antibody used to detect c-Fos as a marker of neuronal activation |
| Anti-tdTomato antibody (goat) | LSBio | LS-C340696 | Primary antibody used to detect mCherry/tdTomato reporter expression |
| Blue LED driver | Thorlabs | LEDD1B | Power supply for controlling intensity and output of blue LED |
| Blue LED light source | Thorlabs | M470L5 | LED source emitting blue light (λmax ≈ 470 nm) for photic stimulation |
| ClockLab software | Actimetrics | Version 6.0.53 | Software for acquisition and analysis of circadian locomotor activity data |
| Clozapine-N-oxide (CNO) | Sigma-Aldrich | C0832-5MG | Ligand used to activate hM3Dq DREADD receptors in vivo |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | Fluorescent nuclear stain for labeling cell nuclei |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21432 | Fluorescent secondary antibody for detection of goat primary antibodies |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Fluorescent secondary antibody for detection of rabbit primary antibodies |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | Mounting medium used to preserve fluorescence in tissue sections |
| ImageJ (Fiji) software | NIH | Version 2.16.0/1.54g | Open-source software for image processing and quantitative analysis |
| Opn4cre Mice | The Jackson Laboratry | RRID:IMSR_JAX:035925 | Mice used for chemogenetic activation |
| Violet LED driver | Mightex | SLA-1000-2 | Power supply for controlling violet LED output |
| Violet LED light source | Mightex | BLS-LCS-0385-04-22 | LED source emitting violet light (λmax ≈ 385 nm) for wavelength-specific stimulation |
| Wild-type mice | The Jackson Laboratry | Jackson strain #101043 | Mice used for violet light experiment |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
