방법 논문

용해성 폴리히스티딘 태그 단백질 복합체의 냉동 전자기(Cryo-EM) 구조 분석을 위한 Ni-NTA 지질 단일층 친화도 그리드의 상세 준비

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DOI:

10.3791/71598

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2026년 8월 4일

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1Department of Biochemistry and Biophysics, UNC Chapel Hill School of Medicine, 2Department of Electrical and Computer Engineering, North Carolina State University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Division of Physical and Biological Sciences, University of California Santa Cruz, 4UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center, UNC Chapel Hill School of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 극저온 전자현미경(cryo-EM)을 위한 Ni-NTA 지질 단일층 친화도 그리드의 벤치 준비를 설명합니다. 이 투과 전자현미경(TEM) 격자 표면 변형은 용해성 폴리히스티딘 표지 단백질 복합체를 선택적으로 포착하여, 희석 샘플을 농축하고 입자를 공기-물 경계면에서 멀리 묶어 구조 결정을 향상시킵니다.

초록

냉동 시료 준비는 단백질 복합체의 고해상도 구조 결정에 있어 여전히 주요 기술적 과제로 남아 있습니다. 공기-물 경계면에서의 상호작용은 단백질의 변성이나 선호 방향을 유도하여 달성 가능한 해상도를 제한할 수 있습니다. 또한, 희석된 샘플이나 저함량 표적은 입자 밀도가 부족한 경우가 많아 효율적인 데이터 수집을 방해합니다. 지질 기반 친화력 격자는 이러한 한계를 해결하는 효과적인 전략을 제공합니다. 이 글은 용해성 폴리히스티딘 표지 단백질 복합체의 구조 분석을 위한 Ni-NTA 지질 단일층 친화도 격자를 준비하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜의 주요 단계는 지질 혼합물을 준비하고, 지질 혼합물을 저장소 완충기 표면에 주조하며, 생성된 지질 단일층을 TEM 그리드에 전달하고, 선택적으로 지질 그리드를 최대 1주일간 건조 및 저장하며, 샘플과 함께 지질 그리드를 냉동 침입하는 것입니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현은 지질 단일층 없이 준비된 격자에 비해 입자 밀도가 향상된 단일 층의 잘 분산된 입자를 포함하는 크라이오 그리드를 생성합니다. 이 절차는 냉동 플런저, 화학 연기 후드, 그리고 냉동 시료 준비에 흔히 사용되는 표준 도구들이 갖춰진 실험실에서 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다. 상세한 서면 설명서와 영상 시연을 결합함으로써, 이 연구는 냉동 전자기(cryo-em) 커뮤니티 내에서 Ni-NTA 지질 단층 친화력 격자의 접근성, 재현성 및 광범위한 채택을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

서론

단백질 구조 결정을 위한 실험 기법인 X선 결정학, 핵자기공명(NMR), 극저온 전자현미경(cryo-em) 등은 모두 신중한 샘플 준비에 의존합니다. 단일 입자 분석(SPA) 극저온 전자기(cryo-em)에서는 시료 품질이 최종 재구성 해상도를 제한하는 주요 요인인 경우가 많습니다. 크라이오투과 전자현미경(cryo-TEM)과 직접 전자 검출기의 기술 발전으로 데이터 수집 효율성과 달성 가능한 해상도가 계속 향상됨에 따라, 고해상도 크라이오-전자기의 주요 과제는 점점 이미지 획득에서 시료 준비 및 품질 1,2,3,4,5,6,7로 이동하고 있습니다.

전통적인 크라이오 그리드 준비는 일반적으로 몇 마이크로리터의 샘플을 투과 전자현미경(TEM) 그리드 표면에 적용하고, 필터 페이퍼로 그리드를 얼룩지고, 이를 일반적으로 액체 에탄 또는 프로판-에탄 혼합물인 극저온 물질에 빠르게 담그는 과정을 포함합니다. 이상적으로는 생성된 크라이오 그리드에 단일 분산 입자가 있는 얇은 유리 얼음이 포함되어야 합니다. 실제로 이 결과를 달성하는 것은 종종 어렵고, 고해상도 구조 결정에 적합한 격자를 생성하기 위해 여러 차례의 최적화가 필요할 수 있습니다. 일반적인 문제로는 공기-물 경계면(AWI)8,9에서의 단백질 변성, 선호 방향10, 얼음층 내 낮은 입자 밀도 11,12가 있습니다. 후자의 문제는 특히 매우 동적이고 수명이 짧거나 미세몰 농도에서 분리하기 어려운 단백질 복합체에서 매우 중요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 그래핀 옥사이드13 연속 초박막 탄소14와 스트렙타비딘 코팅 나노비즈 등 비오티닐화 표적을 포획하는 여러 전략이 개발되었습니다.

대안으로는 표적 분자를 선택적으로 결합하도록 설계된 친화성 표면으로 TEM 그리드를 수정하는 방법이 있습니다. 이러한 친화력 그리드는 입자를 그리드 표면에 집중시키면서 AWI 노출을 줄여 입자 분포를 개선하고 구조적 완전성을 유지할 수 있습니다. 또한, 농도 효과는 희석되거나 이질적인 샘플에서 저점유 고분자 복합물을 풍부하게 만들 수 있습니다.

지난 10년간 SPA 극저온 전자기(cryo-em)를 위한 여러 친화력 그리드 전략이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 TEM 그리드 표면 수정과 이에 대응하는 기능화 전략으로 분류할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 표면에는 초박형 비정질 탄소14, 그래핀 또는 그래핀 산화물, 13,16 지질 단일층 또는 지질 나노튜브 17,18, 그리고 지질 단층 19,20 위에 성장하는 2차원 스트렙타비딘 결정이 있습니다. 이러한 접근법 중에서, 2차원 스트렙타비딘 친화력 그리드는 고해상도 단백질 구조 결정에 특히 성공적이었습니다. 21,22,23,24,25,26,27,28,29. 관련 방법론으로는 단분산 단일 입자 스트렙타비딘을 지질 단일층에 결합한 사용이 있으며, 이는 최근 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 결합된 미니 염색체 유지 복합체의 구조를 규명하는 데 적용되었습니다30.

이러한 발전에도 불구하고, 친화력 그리드 준비를 위한 접근성 있고 재현 가능한 방법은 여전히 제한적입니다. 각 기법은 선택적 표적 결합을 위한 고유한 샘플 요구사항을 가지고 있으며, 상업적으로는 제공되지 않아 전문적인 제조 프로토콜과 화학적 변형이 필요합니다. 이러한 추가 단계들은 SPA 냉동 전자기(cryo-em) 워크플로우의 기술적 복잡성을 크게 증가시킬 수 있습니다. 따라서 본 글은 여기서 설명하는 친화력 그리드 기술 준비를 용이하게 하기 위한 상세하고 단계별 프로토콜을 제시합니다. Ni-NTA 지질 단일층 친화도 그리드 프로토콜은 이전에17 년부터 일상적으로 구현되어 왔으며, 넓은 분자량 범위(97–470 kDa)에 걸친 용해성 폴리히스티딘 표지 단백질 복합체의 냉동 전자기(cryo-em) 구조 연구에 쉽게 채택될 수 있습니다(그림 1). 이 방법은 세제 없는 완충제에서 0.05에서 0.2 mg/mL 사이의 단백질 농도에 적합하다.

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그림 1: Ni-NTA 지질 친화도 그리드 설계 개요. (A) 20% Ni-NTA 지질 냉동 그리드의 설계도. 왼쪽에 크라이오 그리드가 표시되어 있으며, 탄소 단층, 지질 단층, 유리 얼음, 부착 입자의 크기를 보여주는 단면도가 있습니다(중앙). 히스티딘 측쇄와 Ni-NTA 지질 간의 상호작용은 오른쪽에 묘사되어 있습니다. (B) 지질 친화도 격자를 이용해 해결한 폴리히스티딘 태그 단백질의 예시. 지도는 분자량, 크기, 해상도, EMDB 등록 번호가 표시된 서로 축척에 맞춰 그려집니다. (C) 2 mg/mL 비지질 냉동 격자를 사용해 조제한 폴리히스티딘 표지 뉴클레오솜의 대표적인 단층촬영 단층촬영 단층 절단(오른쪽)과 0.05 mg/mL Ni-NTA 지질 친화성 냉동 격자를 사용해 조제한 경우(왼쪽). (D) 비지질 크라이오 그리드의 평균 농도 인자와 Ni-NTA 지질 친화도 크라이오 그리드를 비교하여 지질 막이 폴리히스티딘 표지 단백질을 공기-물 경계면(AWI)에서 농축할 수 있음을 입증함. 이 도표의 일부는 Elsevier의 허가를 받아 Skrajna 등17 의 그림 1A, B, 2A, B에서 각색한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

이 연구는 인간 참가자, 임상 데이터, 또는 살아있는 동물을 포함하지 않았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

참고: DOPC는 18:1 (Δ9-cis) PC를 의미합니다. Ni-NTA 지질은 18:1 DGS-NTA(Ni)를 의미합니다. 저염 완충제는 10 mM HEPES(pH 7.4)에 50 mM NaCl을 의미합니다. 희석 버퍼는 20 mM HEPES(pH 7.4)에 150 mM NaCl을 의미합니다.

1. 재사용 유리 세척 (~30분)

  1. 작은 페트리 접시 두 개, 작은 페트리 접시 커버 두 개, 마개가 달린 25mL 부피 플라스크 하나, 마개가 달린 1mL 부피 플라스크 하나를 모으세요. 물건을 싱크대 근처에 두세요.
  2. 음이온 계면활성제 분말을 11.4L 플라스틱 통에 따뜻한 수돗물에 녹여 녹입니다.
  3. 유리 제품을 계면활성제 용액에 부드럽게 담가세요.
  4. 니트릴 장갑을 끼고 실험실 브러시로 모든 접근 가능한 유리 표면을 문질러 닦으세요. 초순수한 물로 깨끗이 헹구세요.
  5. 잔여물을 닦아내려면 유리 도구를 종이 타월에 부드럽게 두드려 제거하세요.
  6. 헤어드라이어로 유리 기구를 건조해 눈에 띄는 습기가 없을 때까지 하세요.
    참고: 세척된 유리 제품은 깨끗하고 먼지 없는 환경에 보관하세요.

2. 지질을 상온에 맞추기 (1–4시간)

참고: 지질 재고가 미리 준비되어 있다면 이 부분은 건너뛰세요.

  1. 25mg DOPC 분말이 담긴 밀봉된 앰플 한 잔과 Ni-NTA 지질 분말 1잔을 화학 훈기 후드에 넣습니다.
  2. 지질을 최소 1시간 이상 실온에 평형으로 맞추세요.

3. 용매 세척 스테이션 설치 (~10분)

주의: 클로로포름은 중추신경계 억제제이자 피부, 눈, 호흡기 자극제로 작용하는 위험하고 휘발성이 강한 액체입니다. 장갑, 실험복, 안구 보호 장비 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 채 화학 연기 후드에서 100μL 이상의 클로로포름을 사용하는 모든 절차를 수행하십시오. 오염된 니트릴 장갑은 노출 후 1분 이내에 제거하여 폐기하세요. 클로로포름은 니트릴에 빠르게 침투합니다. 클로로포름 폐기물을 다른 화학 폐기물과 결합하지 마십시오.

  1. 99.8% 클로로포름, 뚜껑이 있는 클로로포름 폐기물 병 1개, 에탄올 99.5%, 뚜껑이 있는 에탄올 폐기물 병 1개, 샤프스 용기 1개, 작은 페트리 접시 2개, 작은 페트리 접시 커버 2개, 1급 여과지가 들어있는 대형 페트리 접시 1개, 1–2cm 이상의 자기 밀봉 필름3 장 이상, 그리고 종이 타월을 수집하세요. 모든 재료를 화학 훈풍 후드에 배치하세요(그림 2).
  2. 페트리 접시를 20–30mL의 클로로포름으로 씻어내세요. 세척액은 적절한 폐기병에 버리세요. 에탄올로 반복합니다. 그릇을 자연 건조해.
  3. 작은 페트리 접시 하나에는 클로로포름을, 다른 하나는 에탄올로 채우세요. 두 접시 모두 덮어 증발을 최소화하세요.
  4. 실험 내내 페트리 접시를 다시 채우세요. 특히 클로로포름이 오염물질로 눈에 띄게 흐려질 때는 더욱 그렇습니다.

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그림 2: 지질 혼합물 준비를 위한 도구와 시약이 포함된 화학 연기 후드. 용매 세척 스테이션과 세척된 도구, 유리기구, TEM 그리드의 이미지. 왼쪽부터 오른쪽으로: 에탄올 폐기물, 에탄올, 클로로포름, 클로로포름 폐기물. 페트리 접시 왼쪽에서 오른쪽으로: 에탄올, 클로로포름, 그리고 필터 페이퍼 위에 붙인 TEM 그리드. 추가로 튜브 랙에 배양관, 지질 조절기, 마개가 달린 부피 플라스크, 저장 TEM 격자, 구근이 달린 유리 피펫, 미세한 핀셋, 유리 주사기, 스페이서(연필 스툁)가 삽입된 모세관 방지 핀셋 등이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 세척 도구, 유리기구, 용매가 포함된 TEM 격자 (~20분)

  1. 고운 핀셋 1쌍, 자가 닫히는 모세관 방지 핀셋 12쌍, 유리 피펫 3개, 25 μL 유리 주사기 1개, 2.5 μL 유리 주사기 1개, 튜브 거치대에 유리 배양관 3개, 마개 있는 25 mL 부피 플라스크 1개, 마개 있는 1 mL 부피 플라스크 1개, 페놀 캡이 달린 3.7 mL 나사산 유리 바이알 20개에서 25개, 그리고 12개의 금메시 구멍 탄소 TEM 격자입니다. 재료를 화학 연기 후드의 용매 세척 스테이션 근처에 배치하세요.
    참고: 사용하지 않을 때는 각 쌍의 모세혈관 핀셋에 연필 스텁과 같은 스페이서를 끼워 팁 기형과 정렬 이상을 예방하세요. 구부러진 핀셋은 버리세요.
  2. 핀셋 끝을 클로로포름에 여러 번 담가 청소하세요. 에탄올로 반복합니다. 자연 건조.
  3. 유리 피펫을 흡인하여 클로로포름을 여러 번 투여해 청소하세요. 에탄올로 반복합니다. 자연 건조.
  4. 플런저가 부드럽게 움직일 때까지 흡입 후 클로로포름을 투여해 주사기를 청소하세요. 에탄올로 반복합니다. 플런저를 주사기 통에서 분리하고 자연 건조하세요.
  5. 유리 피펫으로 클로로포름을 여러 번 추가하고 제거하여 배양관을 청소하세요. 에탄올로 반복합니다. 튜브를 뒤집어 종이 타월에 부드럽게 두드려 잔여액을 제거하세요. 자연 건조.
  6. 유리 피펫으로 클로로포름을 넣고 플라스크를 마개로 막은 뒤, 내부 표면을 부드럽게 흔들어 세척하세요. 용제를 폐기병에 버리세요. 에탄올로 반복합니다. 플라스크는 마개를 닫지 않고 자연 건조시키세요.
  7. 유리 피펫으로 클로로포름을 넣고 뚜껑을 닫은 후 내부 표면을 부드럽게 헹군 바이알을 세척하세요. 용제는 버리세요. 에탄올로 반복합니다. 바이알은 뚜껑을 닫지 않고 자연 건조시키세요.
  8. 탄소 필름 손상을 피하면서 강화된 외곽 가장자리를 가는 핀셋으로 잡아 TEM 그리드를 청소하세요. 그리드를 수직으로 클로로포름에 세 번, 에탄올에 세 번 담가.
  9. TEM 그리드의 탄소 면을 위로 향하게 하여 필터 종이에 올려놓고 자연 건조시키세요.

5. 캐스팅 버퍼 냉각 (>20분)

  1. 최소 50mL의 저염 완충제를 얼음 위에 올려놓으세요.
  2. 버퍼를 최소 20분 정도 냉각하세요.

6. DOPC 및 Ni-NTA 지질의 1 mg/mL 클로로포름 스톡 용액을 별도로 제제하기 (~20분)

참고: 지질 재고가 이전에 준비된 경우, 8절 "80% DOPC/20% Ni-NTA 지질 혼합물 준비"로 건너뛰십시오.

  1. DOPC와 Ni-NTA 지질 분말이 상온에 평형이 되었는지 확인하세요.
    주의: 면도날과 깨진 유리는 날카로운 위험 요소입니다. 면도기를 사용할 때는 유리 앰플을 깨뜨릴 때 주의하세요.
  2. DOPC 분말의 가시성을 높이기 위해 면도기로 앰플 라벨을 잘라서 떼어내세요. Ni-NTA 지질 암플에 대해서도 반복합니다.
  3. 양손으로 날카로운 용기를 다듬어 25mg DOC가 든 앰플을 조심스럽게 뜯으세요. 앰플 목은 샤프스 용기에 버리세요. 앰플 본체를 클로로포름 접시 근처에 놓으세요. 1mg Ni-NTA 지질 증폭제도 반복합니다.
  4. 장갑과 작업면에서 유리 조각을 조심스럽게 빗질해 날카로운 용기에 넣으세요. 손상된 장갑은 즉시 교체하세요.
  5. 클로로포름용 유리 피펫 하나, DOPC 하나, Ni-NTA 지질 하나 라벨을 붙이세요.
  6. 작은 용제로 세척한 페트리 접시에 클로로포름을 채우세요.
  7. DOPC 피펫을 사용해 2–5 mL의 클로로포름을 DOPC 앰플에 옮깁니다. 흡입하여 바닥과 옆면의 지질이 완전히 녹을 때까지 혼합물을 분사하세요.
  8. DOPC 피펫을 사용해 DOPC 용액을 25mL 부피 플라스크에 옮깁니다. 클로로포름 피펫을 사용해 플라스크를 최종 25mL로 채우세요.
  9. DOPC 앰플은 샤프스 용기에 버리세요.
  10. 클로로포름 피펫을 사용해 1 mL 부피 플라스크에 1 mL 미만의 클로로포름을 옮깁니다.
  11. Ni-NTA 지질 피펫을 사용해 1 mL 부피메틱 플라스크에서 Ni-NTA 지질 앰플로 클로로포름을 옮깁니다. 흡입하여 바닥과 옆면의 지질이 완전히 녹을 때까지 혼합물을 분사하세요.
  12. Ni-NTA 지질 용액을 Ni-NTA 지질 피펫을 사용해 1mL 부피메틱 플라스크에 옮깁니다. 클로로포름 피펫을 사용해 플라스크를 최종 1mL로 채우세요.
  13. Ni-NTA 지질 압박제는 샤프 용기에 버려.

7. 장기 보관을 위한 소량의 지질 알리코트 준비 (~15분)

  1. DOPC 피펫을 사용해 1–2mL의 DOPC 스톡을 여러 유리 바이알에 분담하세요. 병에 캡을 붙이고 라벨을 붙이세요.
  2. Ni-NTA 지질 피펫을 사용해 0.2–0.5 mL의 Ni-NTA 지질 스톡을 여러 유리 바이알에 분량으로 분출합니다. 병에 캡을 붙이고 라벨을 붙이세요.
    주의: 액체 질소(LN2)는 처음에는 잠시 라이덴프로스트 효과를 일으킨 극저온 물질로, 이후 극심한 통증, 무감각, 물집, 동상을 유발할 수 있습니다. 노출 기간이 길어질수록 부상의 심각도가 증가하며, 1도 화상에서 4도 화상까지 1분 이내에 진행될 수 있습니다. LN2로 냉각된 물체도 유사한 부상을 일으킬 수 있습니다. LN2에서 냉동 시료 도구를 다룰 때는 열전도에 주의하세요. 물 튀김으로부터 보호하기 위해 얼굴 보호대를 착용하세요. 냉동 보호 장갑을 착용한 상태에서도 손을 LN2에 담그지 마세요. 갇힌 LN2가 피부에 남아 있을 수 있기 때문입니다. 응축된 대기 중 수증기를 LN2 증기로 혼동하지 마세요. LN2는 보이지 않고 무취 기체 질식제로 전환될 때 약 700× 부피가 팽창합니다. 모든 LN2 탱크와 듀어가 적절히 환기되어 압력 축적을 방지하도록 하세요. LN2는 환기가 잘 되는 곳에만 사용하고, 사용하지 않은 LN2는 화학 훈기 후드에서 증발시킵니다.
  3. 작은 크라이오젠 듀어에 LN2를 채우세요.
  4. 한 개의 알리코트 바이알에서 뚜껑을 떼고, 질소 증기를 바이알에 부은 뒤 다시 캡을 채운 뒤 셀프 씰로 밀봉하세요. 모든 알리코트 바이알에 대해 반복합니다.
    참고: 지질 알리코트 재고는 −20 °C에서 최대 3개월간 보관하세요.

8. 80% DOPC/20% Ni-NTA 지질 혼합물 준비 (~15분)

  1. DOPC와 Ni-NTA 지질 재고가 상온에 균형을 이루었는지 확인하세요.
  2. DOPC(DOPC)용 유리 배양관 하나, Ni-NTA 지질용 튜브 하나, 지질 혼합물 용 유리 배양관 하나를 라벨링하세요.
  3. DOPC 피펫을 사용해 50–100 μL(2–3 방울 정도)의 DOPC 육즙을 DOPC 배양관에 옮깁니다. 튜브를 셀프 씰링 필름으로 밀봉하세요.
  4. Ni-NTA 지질 피펫을 사용해 Ni-NTA 지질 스톡 20–50 μL(1–2 방울)을 Ni-NTA 지질 배양관에 옮깁니다. 튜브를 셀프 씰링 필름으로 밀봉하세요.
  5. 25 μL 주사기를 사용해 20 μL DOPC 알리코트를 주사기 통에 빨아들입니다. 배럴에 기포가 없는지 확인하고 필요하면 샘플을 다시 채취하세요. 알리코트를 지질 혼합관에 분사하세요. 한 번 반복하면 총 부피가 40 μL가 됩니다.
  6. 주사기를 클로로포름으로 닦고 에탄올을 바르세요.
  7. 주사기를 사용해 10 μL Ni-NTA 지질 알리코트를 채취하세요. 배럴에 기포가 없는지 확인하고 필요하면 샘플을 다시 채취하세요. 알리코트를 지질 혼합관에 투여하여 최종 전체 부피를 50 μL로 만듭니다.
  8. 지질을 흡입하고 여러 번 분사하여 혼합하세요. 튜브를 셀프 씰링 필름으로 밀봉하세요.
  9. 주사기를 클로로포름으로 닦고 에탄올을 바르세요. 자연 건조.

9. 지질 단층 주조 및 TEM 격자에 전달 (~10분)

  1. 저염 완충제가 냉각되어 있는지 확인하세요.
  2. 작은 LED 램프 1개, 냉각된 저염 완충제, 뚜껑 있는 완충 폐기물 병 1개, 에탄올 시약, 에탄올 폐기병 1개, 스포이드가 달린 피마자유 1병, 지질 혼합물, 작은 페트리 접시 1개, 2.5 μL 주사기 1개, 모세관 방지 핀셋 12쌍, TEM 그리드 12개, 그리고 보풀이 적은 조직을 준비하세요. 재료를 잘 밝은 검은색 작업대 위에 배치하세요(그림 3).
  3. 각 쌍의 모세관 방지 핀셋의 평평한 팔을 TEM 그리드의 탄소 쪽에 맞춰 배치하세요. 보강된 바깥쪽 가장자리를 따라 격자를 고정하세요. 모든 그리드에 대해 반복합니다.
  4. 작은 페트리 접시에 차가운 저염 완충제를 가득 채우세요(그림 4A). 완충 표면 중앙에 피마자유 한 방울을 떨어뜨립니다(그림 4B, 4C).
    참고: 지질 단일층이 시간이 지남에 따라 피마자유 중심에서 점차 멀어지면서 전달 효율이 떨어지므로, 다음 단계를 빠르게 진행하세요. 온도 변화와 진동이 이 과정을 가속화합니다.
  5. 2.5 μL 주사기를 사용해 1 μL 지질 혼합물을 채취합니다. 주사기 바늘 끝을 피마자유 중앙으로 내립니다. 지질 혼합물을 바늘 베벨 표면 바로 위에 매달린 방울로 분사한 후, 피마자유에 부드럽게 닿게 합니다(그림 4D).
  6. LED 램프를 사용해 피마자유 고리로 둘러싸인 평평한 2–3cm 지질 원이 형성되었는지 확인하세요(그림 4E). 이 형태가 관찰되지 않으면, 버퍼를 버리고 시약인 에탄올로 접시를 헹구고, 보풀이 적은 조직으로 건조한 후 저염 완충제, 피마자유, 지질 혼합물을 다시 발라서 주조 접시를 재설정합니다.
    참고: 과도한 피마자유는 지질 단일층 형성을 방해하며, 부족한 피마자유는 단층을 포함하지 못합니다. 지질 유동성은 온도에 따라 달라집니다. 완충제가 너무 차가우면 지질이 단일층으로 퍼지지 않습니다. 완충제가 너무 따뜻하면 지질과 피마자유가 접시 가장자리로 이동해 붕괴됩니다. 최적의 지질 확산을 위해 냉각된 버퍼를 상온 페트리 접시에 부어줍니다. 각 그리드 전송 후에는 캐스팅 접시를 리셋하세요. 신선한 완충제를 넣기 전에 캐스팅 접시에 기름이 완전히 없는지 확인하세요.
  7. 지질 단일층을 TEM 격자에 옮기려면 클램프된 TEM 격자를 탄소 면이 아래를 향하게 하여 지질 주조물의 중심으로 내립니다. 그리드를 잠기거나 방출하지 않고 전체 탄소 표면을 지질 단일층에 부드럽게 닿게 합니다(그림 4F).
  8. 지질 격자를 점검하여 완전한 액체 덮개와 피마자유 부재를 확인하세요(그림 5). 기름진 격자는 버리세요.
  9. 모든 TEM 그리드에 대해 이 전송 절차를 반복합니다.
    참고: 클램프된 지질 격자는 5–10분 이내에 마를 수 있습니다. 지질 격자는 재수분 섭취 전에 하룻밤 동안 작업대 위에 고정되어 있을 수 있습니다. 또는 건조된 지질 격자를 그리드 박스에 넣어 상온에서 건조기에 최대 1주일간 보관한 후 재램프 및 재수분 공급을 할 수 있습니다.
    중요: 2시간 이내에 급강 냉동이 발생할 경우에만 진행하세요. 그렇지 않으면 남은 단계를 미루세요.

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그림 3: 지질 단층 주설 및 플런지 냉동 작업대. (A) 왼쪽에서 오른쪽, 위에서 아래로 표시된 항목으로는 피마자유 드로퍼 병, 버퍼 폐기물 병, LED 램프, 얼음 위에 차가운 저염 버퍼, 지질 알리코트와 지질 혼합물이 담긴 튜브 선반, 2.5 μL 유리 주사기, 빈 페트리 접시, 필터 종이에 TEM 그리드가 있는 페트리 접시, 미세 팁 핀셋, 스페이서가 삽입된 모세관 방지 핀셋이 포함됩니다. (B) 전시된 항목으로는 냉각되고 가습된 크라이오 플런저, 조립된 크라이오 플런저 냄비, 희석 버퍼와 샘플이 담긴 얼음통, 호일로 덮인 벤치 상판 습도 챔버, 희석 버퍼 방울 줄이 있는 밀봉 자가 밀봉 필름, 크라이오 플런저 핀셋, 마이크로피펫이 포함됩니다. (C) 얼음, 젖은 종이 타월, 자가 밀봉 필름, 벤치탑용 핀셋 홀더가 포함된 벤치탑 습도 챔버. (D) 상대 습도 챔버 내부에 모세혈관 핀셋으로 고정된 지질 격자. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 지질 단일층을 주조하여 TEM 격자에 전달하는 과정. (A) 저염 완충제로 채운 캐스팅 접시. (B) 캐스팅 접시에 피마자유 1방울을 투여하는 것. (C) 완충 표면에 떠 있는 피마자유 원; 검은 화살표는 피마자유 경계를 나타냅니다. (D) 피마자유 위에 중앙에 위치하고 베벨이 아래를 향하게 한 주사기 바늘; 바늘 끝에 1 μL 지질 혼합물 방울이 떠 있습니다. (E) 피마자유 링 안에 퍼진 지질 혼합물; 검은 화살표는 피마자유 경계를, 흰색 화살표는 지질 단층 경계를 나타냅니다. (F) 지질 단일층이 TEM 격자의 탄소 쪽으로 이동하는 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5: 지질 단일층 전달 후 TEM 격자의 예시. (A) 격자 표면 전체에 완충제가 분포된 성공적인 지질 전달. (B) 1시간 동안 자연 건조 후 지질 전달이 성공. (C) 피마자유에 오염된 지질 전달, 격자 중앙에 표시됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

10. 4°C, 100% 습도에서 크라이오플런저에 블롯 종이를 부양하기(>1시간)

  1. 크라이오 플런저 습도 챔버를 4°C, 습도 100%로 설정하세요.
  2. 블롯 패드에 블롯 페이퍼를 붙이세요. 블롯 페이퍼는 고습도에서 최소 1시간 정도 부화하세요.

11. 희석 버퍼 냉각 (~20분)

  1. 최소 20mL의 희석 버퍼를 얼음 위에 올려놓으세요.
  2. 버퍼를 최소 20분 정도 냉각하세요.

12. 지질 격자에 희석 완충제를 배양하기 (>15분)

  1. 베이킹 접시 1개, 3D 프린팅 핀셋 홀더 1개(보충 파일 1–3), 25–35cm 폭 10cm 자가봉 필름 한 개, 30.4cm 알루미늄 호일 35–45cm 스트립, 얼음, 종이 타월을 준비하세요. 재료를 극저온 플런저 근처에 배치하세요(그림 3).
  2. 베이킹 접시를 크라이오 플런저 옆에 세로로 배치하세요. 그릇에 얼음을 반쯤 채우고, 종이 타월로 덮으세요. 종이 타월을 수돗물로 살짝 적셔 주세요.
  3. 자기 밀봉 필름 스트립을 베이킹 그릇의 반대편에 세로로 놓고, 젖은 종이 타월 바로 위에 놓으세요.
  4. 3D 프린팅된 핀셋 홀더를 베이킹 접시 중앙에 세로로 놓고, 젖은 종이 타월과 셀프 씰링 필름 위에 직접 놓으세요.
  5. 베이킹 그릇을 알루미늄 호일로 덮으세요(그림 3).
  6. 실험 내내 녹은 얼음을 교체하세요.
  7. 클램프된 지질 격자를 자기 밀봉 필름 위에 올려놓고, 지질 면은 위를 향하게 합니다(그림 3).
    참고: 작업대의 습도 챔버를 움직이거나 피펫 팁으로 지질 격자를 만지는 것은 피하세요. 이런 행동이 격자를 떨어뜨릴 수 있습니다. 격자가 손상되지 않은 경우 자기 밀봉 막 위에 떨어진 격자를 회수하세요.
  8. 각 지질 표면에 샘플 희석 완충제를 2μL씩 도포합니다. 증발을 최소화하기 위해 챔버를 호일로 덮으세요.
  9. 각 지질 격자의 수분 유지는 그리드에 1 μL 미만의 액체가 있을 때마다 추가로 2 μL 희석 버퍼를 적용합니다.
  10. 냉각된 벤치 위 습도 챔버에서 수분 지질 격자를 최소 15분 이상 평형으로 유지하세요.

13. 샘플을 지질 격자에서 배양 (>15분)

  1. 지질 격자가 희석 완충제로 최소 15분 이상 지속적으로 수분을 공급되도록 하세요.
  2. 기본 희석 버퍼가 완전히 냉각되었는지 확인하세요.
  3. 각 수화 지질 격자에 폴리히스티딘 표지 샘플 3μL을 도포합니다. 증발을 최소화하기 위해 챔버를 호일로 덮으세요.
  4. 각 지질 격자의 수분 유지를 위해 격자에 2 μL 미만의 액체가 남을 때마다 추가로 2 μL 희석 완충제를 적용합니다.
  5. 그리드를 최소 15분 정도 부큐베이팅하세요.

14. 냉동 플런저 포트 준비 (>15분)

  1. 황동 컵의 간접 냉각을 위한 스핀들을 포함한 크라이오 플런저 포트를 조립하세요.
  2. 냉동 그리드 상자에 라벨을 붙이고 냉동 플런저 냄비 안에 넣으세요.
  3. 냉동 플런저 통에 LN2를 채우세요. 냄비를 덮어 얼음 오염을 최소화하세요.
  4. 주기적으로 LN2를 추가하여 냉동 그리드 박스 위에 LN2 수준을 유지하세요.
  5. 금속 부품과 크라이오 그리드 박스를 최소 10분 이상 LN2 온도로 냉각하세요.
    주의: 액체 프로판과 에탄은 LN2와 유사한 손상을 일으키지만 눈에 띄는 라이덴프로스트 효과가 없는 매우 가연성 극저온 물질입니다. 그 결과, 접촉은 즉각적이고 지속적인 부상을 일으킬 수 있습니다. 다룰 때 물 튀기는 것을 피하세요. 프로판-에탄이 LN2를 오염시킨다면, 액체 프로판과 에탄과 동일한 엄격한 주의 조치를 취하여 오염된 LN2를 처리해야 합니다. 사용 후에는 냉동 플런저 통을 화학 연기 후드에 넣어 냉동제가 안전하게 증발할 수 있도록 하세요.
  6. 황동 컵에 60:40 액상 프로판-에탄 혼합물을 채우세요.
  7. 프로판-에탄 혼합물을 LN2 온도에 최소 5분간 평형으로 유지하세요.

15. 지질 격자를 급속 냉동 (~1시간)

  1. 블롯 종이가 최소 1시간 동안 4°C, 100% 습도에서 평형이 되도록 하세요.
  2. 지질 격자가 폴리히스티딘 태그 샘플과 최소 15분 이상 배양되었는지 확인하세요.
  3. 프로판-에탄 온도가 −190 °C 이하임을 확인한 후 스핀들을 제거하세요.
  4. 50 μL 희석 버퍼 3방울을 고정된 10cm2 자기 밀봉 필름 위에 한 줄로 분사합니다(그림 3).
  5. 클램프된 지질 격자를 각 희석 완충 방울에 순차적으로 접촉시키고 마지막 방울에서 격자를 해제하여 세척합니다.
  6. 크라이오 플런저 핀셋을 사용해 떠다니는 지질 그리드를 집어내세요. 그리드를 냉동 플런저에 장착하세요.
  7. 사용한 버퍼 드롭을 보풀 없는 조직으로 흡수한 후 버리세요.
  8. 프로판-에탄 혼합물에 냉동하기 전에 지질 그리드에 다음 크라이오-플런저 설정을 적용하세요: 대기 시간, 0초; 총 얼룩 1개; 블롯 포스, −10; 블롯 타임, 4 S; 그리고 드레인 시간은 0초입니다.
  9. 프로판-에탄 컵에서 크라이오 그리드를 크라이오 그리드 박스의 빈 슬롯으로 옮깁니다.
  10. 모든 지질 그리드에 대해 플런지-프리징 과정을 반복하세요.

결과

이 프로토콜의 예상 결과를 설명하기 위해 일련의 실험이 수행되었습니다. 20% Ni-NTA 지질 단일층이 포함된 홀리 탄소 R1.2/1.3 TEM 그리드를 샘플과 함께 플런지 냉동하여 200 keV 냉동 TEM으로 영상화했습니다. 각 조건마다 3–9개의 격자 사각형이 촬영되었습니다. 얼음 두께는 개별 격자와 격자 정사각형에 따라 달랐으며, 최적 영역에는 얇은 유리 얼음과 잘 박혀 있는 입자가 포함되어 있었으며, 이는 고속 푸리에 변환(FFT)31의 특성적 톤링으로 검증되었다.

첫 번째 실험에서는 정제된 폴리히스티딘 표지된 황색포도상구균 글루타메이트 합성효소(saGS)를 사용하여 20% Ni-NTA 지질 단과층 친화력 그리드의 최적 준비와 기대 성능을 입증했습니다(그림 6). 지질 단일층은 금메시 TEM 격자에 전달되었습니다. 지질 격자는 건조된 후 1주일간 건조기에 보관된 후 재수화되었습니다. 완전한 재수화 후, 0.1 mg/mL의 saGS를 격자에서 15–30분간 배양하여 입자 결합을 허용했습니다. saGS 입자들은 현미경사진당 평균 입자 수가 274개(N = 7)로, 지질 단일층에 고르게 분포하여 중복이 거의 없거나 전혀 없었습니다.

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그림 6: 20% Ni-NTA 지질 친화도 그리드의 대표적인 냉동 TEM 이미지. 지질 단일층은 프로토콜에 명시된 대로 1주일간 건조된 후 저염 완충제로 재수화되었습니다. 대표적인 이미지는 저배율(A), 중간 배율(B), 고배율(C)로 수집되었으며, 해당 FFT는 (D)에 표시되었습니다. 입자들은 현미경경 사진당 평균 274개의 입자(N=7)로, 얇은 유리 얼음층 내에서 격자 표면에 고르게 분산되어 있습니다. 스케일 바: 10 μm, 500 nm, 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

두 번째 실험에서는 입자 적층을 보이는 saGS 샘플을 사용하여 지질 격자가 단백질 응집에 미치는 영향을 입증했습니다(그림 7). 네 가지 냉동 격자 조건을 조사하였다: 지질 없는 구리 메시 격자에서 1.0 mg/mL의 saGS, 지질 없는 구리 메쉬 격자에서 0.1 mg/mL의 saGS, 건조되지 않은 지질이 있는 금 메쉬 격자에서 0.1 mg/mL의 saGS, 그리고 지질 건조 후 1주일간 건조된 금메시 격자에서 0.1 mg/mL의 saGS. 지질 격자는 입자 밀도가 더 높았으며, 같은 단백질 농도에서 조제된 비지질 격자(N = 12)보다 평균 40개 또는 46개의 입자를 보였다(N = 12). 이 결과는 변형되지 않은 TEM 격자에 비해 명확한 농도 효과를 보여주었으며, 20% Ni-NTA 지질 단일층이 온전하게 유지되었음을 확인했습니다. 입자 스택은 여전히 관찰되었지만, 지질 격자 위의 입자들은 거의 겹치지 않고 유사한 초점면 내에 머물렀다. 반면, 비지질 격자 위의 입자들은 상당히 다른 초점 깊이에서 나타났으며, 응집된 입자는 1 mg/mL의 높은 농도로 관찰되었습니다.

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그림 7: 20% Ni-NTA 지질 및 비지질 격자에 쌓인 폴리히스티딘 태그 saGS의 Cryo-TEM 이미지. (A–D) 1.0 mg/mL 용량의 saGS로 준비된 비지질 격자, 낮은 배율(A), 중간 배율(B), 높은 배율(C)에서 표시되며, 이에 대응하는 FFT(D)가 적용되었습니다. (E–H) 0.1 mg/mL의 saGS로 준비된 비지질 격자. (I–L) 0.1 mg/mL의 saGS로 조제된 건조되지 않은 지질 격자.
(남성–남성) 0.1 mg/mL의 saGS로 재수화된 지질 격자를 준비했습니다. 비지질 격자의 입자 밀도는 해당 지질 친화도 격자보다 낮아, 현미경사진당 평균 2입자와 46개, 47개에 비해 각각 46개와 47개였다(N = 12). 검은 화살표는 심하게 초점이 흐려진 입자를 나타냅니다. 흰색 화살표는 초점에 가까운 입자를 나타냅니다. 스케일 바: 10 μm, 500 nm, 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

세 번째 실험에서는 지질 격자를 N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)에 노출시켰습니다. 샘플로 0.1 mg/mL의 정제된 saGS가 사용되었습니다. 세제가 지질 단일층을 방해했어요. 완충 내 0.05% DDM을 포함한 지질 크라이오 그리드(그림 8)는 지질 단일층, 그리드 표면의 지질 미셀, 그리고 제어 조건에 비해 입자 밀도가 감소하는 빈틈을 보였습니다.

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그림 8: 0.05% N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)에 노출된 20% Ni-NTA 지질 격자의 대표 이미지. 크라이오 그리드는 저배율, 중배율, 고배율로 촬영되었습니다. (A–C) 샘플 희석 버퍼로 재수화된 20% Ni-NTA 지질 친화성 그리드의 이미지. (민주당–자유당) 0.05% DDM을 포함한 샘플 희석 버퍼로 재수화된 20% Ni-NTA 지질 친화성 격자 이미지. 세제 처리 TEM 그리드에서는 saGS 입자 밀도가 더 낮았습니다. 패널 I의 화살표는 지질 단일층에 구멍이 있음을 나타냅니다. 패널 J와 K의 화살표는 동일한 지질 미셀을 나타냅니다. 스케일 바: 10 μm, 500 nm, 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

얼음 두께는 격자별로, 그리고 개별 격자 칸 내에서도 달랐습니다. 경우에 따라 얼음이 너무 얇거나 격자 정사각형 일부에서 빠져 있었거나(그림 9A), 분포가 고르지 않거나(그림 9B), 또는 영상 촬영에 과도하게 두꺼웠습니다(그림 9C). 일부 지역에서는 얼음 두께가 단백질 복합체의 직경보다 작았습니다. 건조한 지역이나 입자 직경보다 얇은 얼음이 있는 영역은 데이터 수집 시 피해야 하며, 이 영역의 단백질이 변성되었을 가능성이 높기 때문입니다. 이 프로토콜 사용 경험을 기준으로 약 25%에서 50%의 크라이오 그리드가 여러 격자 칸에 걸쳐 SPA 데이터 수집에 적합한 충분히 얇은 얼음을 포함할 것으로 예상됩니다. 얼음 두께는 블로팅 시간을 조정하거나 플런지 얼리기 전에 그리드의 최종 완충 부피를 변경하여 최적화할 수 있습니다.

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그림 9: 최적의 Ni-NTA 친화력 그리드의 예시. 최적이 아닌 20% Ni-NTA 친화성 극저온 그리드의 대표적인 크라이오-TEM 현미사진. (A) 격자 중앙에 지질막이 없으며, 빈 구멍을 둘러싼 흰색 점선 원으로 표시됨. (B) 고르지 않은 얼음이 포함된 격자 정사각형, 흰색 점선으로 표시된 영역 근처의 더 두꺼운 얼음. (C) 화살표로 표시되어 영상에 너무 두꺼운 얼음이 포함된 격자 사각형. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

적절히 준비되면 친화성 격자는 주로 단일 입자층이 필름에 흡착된 지질 단일층을 포함합니다. 입자 밀도는 유사한 시료 농도로 준비된 비지질 격자에서 관찰된 것보다 더 높을 것으로 예상됩니다. 지질 단일층을 TEM 그리드에 옮기지 못하면, 빈 구멍(그림 10A)이나 지질 막이 없고 입자가 거의 없거나 전혀 없는 유리체 얼음 구멍을 가진 냉동 격자가 만들어집니다(그림 10B, C).

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그림 10: 지질 단일층이 없는 TEM 격자의 예시. 지질 단일층이 TEM 격자 표면에 실패한 이동을 보여주는 크라이오-TEM 이미지. 폴리히스티딘 표지된 인간 뉴클레오좀이 탄소 막에 흡착됩니다. (A) 격자 정사각형에서 빈 구멍이 있는 영역. (B) 유리 얼음으로 채워진 구멍이 있지만 가시적인 입자나 지질 막이 없는 동일한 격자 내 서로 다른 영역. (C) 지질막이 없지만 유리 얼음이 포함된 구멍의 고배율 영상; 입자는 두꺼운 탄소 지지막 위에 보입니다. 스케일 바: 1 μm, 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 핀셋 홀더를 3D 프린팅하는 지침. 이 보조 파일은 지질 격자 수화 및 샘플 배양 중에 사용되는 맞춤형 핀셋 홀더에 대한 자세한 지침을 담고 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: 3D 프린팅 벤치탑 핀셋 홀더용 STL 파일. 이 보조 파일은 작업대 습도 챔버에서 수화 지질 격자를 배양하는 데 사용되는 핀셋 홀더 버전을 3D 프린팅하는 데 필요한 스테레오리소그래피(STL) 파일을 포함하고 있습니다(그림 3C, 3D).  이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 3: 3D 프린팅 냉동 플런저 핀셋 홀더용 STL 파일. 이 보조 파일은 크라이오플런저 습도에서 수화 지질 격자를 배양하는 데 사용되는 핀셋 홀더 버전을 3D 프린팅하는 데 필요한 스테레오리소그래피(STL) 파일을 포함하고 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구는 Ni-NTA 지질 단층 친화력 격자를 준비하는 상세한 단계별 프로토콜을 제시하며, 용해성 폴리히스티딘 표지 단백질 복합체의 일상적인 냉동 전자기(cryo-em) 구조 결정에 이 접근법의 중요한 실용적 고려사항과 장점을 강조합니다. 프로토콜의 여러 단계는 기술적으로 어렵고 특히 처음 사용하는 사용자에게 사용자 실수에 취약합니다.

지질 단일층 변형은 약 2시간 이내에 완료할 수 있으며, 생성된 지질 격자는 건조 후 보관되어 나중에 사용할 수 있습니다. 추가로 2시간 휴식과 냉동 플런저 접근이 가능하면, 이후 냉동 그리드를 준비할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 다중 사용자 시설과 냉동 전자기(cryo-em) 실험실에 적합합니다. 이 접근법을 통해 97에서 470 kDa 사이의 용해성 단백질 복합체 구조가 3 Å 이하 해상도17에서 결정되었습니다. Ni-NTA 지질 단일층에 효율적인 결합을 위해서는 유연한 링커를 포함한 폴리히스티딘 태그 성분이 필요합니다. 뉴클레오좀과 글루타메이트 합성효소 등 일부 샘플에서 단일층에 대한 어느 정도의 선호 방향성이 관찰되었으나, 이러한 방향성은 해상도를 제한하거나 최종 재구성에 늘어나는 인공물을 유발하지는 않았습니다. Ni-NTA 지질 단일층과 폴리히스티딘 표지 단백질 간의 상호작용은 TEM 격자 표면에서 효율적인 입자 포획을 촉진합니다. 따라서 구조 분석은 비교적 희석된 시료와 RELION, cryoSPARC와 같은 표준 극저온 EM 처리 파이프라인을 사용하여 추가 시료 준비 단계 없이 수행할 수 있습니다.

TEM 격자의 신중한 취급과 지질 혼합물의 준비는 재현 가능한 결과를 위해 필수적입니다. 지질 단일층은 잔류 세제, 오일, 먼지 등 오염물질에 매우 민감합니다. 따라서 모든 유리 제품의 철저한 세척이 매우 중요합니다. 음이온 계면활성제로 세척한 후 초순수수로 광범위한 세척 후 완전히 자연 건조한 후 사용 직전 클로로포름과 에탄올로 헹구는 것이 강력히 권장됩니다.

프로토콜은 다양한 시료 및 버퍼 조건에서 반응성이 없기 때문에 금메시 TEM 그리드를 사용합니다. 다양한 샘플에 맞게 지질 주조, 지질 격자 재수화, 샘플 배양, 세척 후 급강 냉동 시 사용되는 완충류는 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 글리세롤이나 기타 첨가물이 포함된 샘플 버퍼는 유리화 전 세척 단계에서 제거할 수 있습니다. 디티오트레이톨(DTT)이 포함된 완충제는 피해야 하는데, 이는 DTT가 니켈32 를 감소시키고 폴리히스티딘 표지 단백질과 Ni-NTA 지질 단일층 간의 결합을 방해하기 때문입니다. 세제도 권장되지 않는데, 0.05% N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)가 지질 단일층을 파괴하고, 막-단백질 구조 연구에 흔히 사용되는 다른 세제들도 유사한 효과를 낼 것으로 예상되기 때문입니다(그림 8D–L). 낮은 세제 농도나 저임계 미셀 농도의 세제가 단일층 무결성을 방해하는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.

프로토콜에서 가장 기술적으로 까다로운 부분은 지질 단층을 TEM 그리드에 주조하고 전달하는 것입니다. 이 단계는 온도, 진동, 취급 기술에 매우 민감합니다. 최적의 결과는 상온(~22 °C)에서 사전 냉각 완충을 사용하여 지질 필름을 주조함으로써 얻어졌습니다. 기계적 교란은 진동이 단층을 불안정하게 만들 수 있으므로 최소화해야 합니다. 따라서 지질 주전 후에는 페트리 접시가 고정되어 있어야 합니다. 이동 과정에서 피마자유와 지질 단일층이 완충 표면을 따라 점차 이동할 수 있어, 지질 단일층 대신 피마자유가 전달될 가능성이 높아집니다(그림 5C). 페트리 접시의 적절한 충전과 격자 방향의 세심한 제어가 완전하고 균일한 단일층 전달을 보장하는 데 필수적입니다. 지질 막을 TEM 격자 표면에 전달하지 못하면 소수성 격자 표면이 형성되어 완충제가 탄소 표면에 구슬이 형성됩니다.

본 연구에서는 양면 블롯팅을 이용한 크라이오플런저만 평가되었습니다. 그러나 수동이나 단면 블로팅 등 다른 블롯팅 방법도 지질 막이 손상되지 않은 한 유사한 결과를 낼 것으로 기대됩니다. 이 프로토콜을 적용할 때, 지질 그리드는 표준 TEM 그리드와 유사하게 처리되어야 하며, 몇 가지 중요한 고려사항이 있습니다. 혈장 세척은 피해야 하며, 샘플 도포 전 최소 15분 동안 지질 격자를 지속적으로 수분 상태로 유지해야 합니다. 샘플은 표면 흡착을 위해 최소 15분간 지질 격자에 배양해야 하며, 최종 완충 부피를 정규화하기 전에 최소 한 방울의 희석 버퍼를 격자에 접촉해야 합니다. 샘플 배양 기간 동안 Ni-NTA 지질 단일층의 수분 상태를 유지하는 것이 매우 중요하며, 증발은 국소 염분 농도를 증가시키고 단백질 구조나 복합체 조립을 변화시킬 수 있습니다. 더 긴 배양 시간(>30분)은 격자 내 입자 밀도를 증가시킬 수 있으나, 장기 배양은 샘플 열화 가능성에 균형을 맞춰야 합니다. 이 프로토콜에 설명된 60:40 액체 프로판-에탄 혼합물은 권장되지만 반드시 필수는 아닙니다. 대체 프로판-에탄 비율이나 순수 에탄은 실험 내내 냉동 물질을 액체 상태로 유지하기 위해 에탄컵 가열 시스템이 장착된 크라이오 플런저와 함께 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 입자 분포는 얼음 두께에 의해 영향을 받습니다. 경우에 따라 입자는 특히 얇은 얼음이 있는 지역, 특히 격자 정사각형 중심 근처에서 제외될 수 있습니다. 따라서 각 유리화 장치에 맞게 블로팅 조건을 최적화해야 할 수 있습니다. 전반적으로 Ni-NTA 지질 단일층 친화도 그리드는 용해성 폴리히스티딘 태그 단백질 복합체의 구조 결정에 견고하고 접근성 있는 전략을 제공합니다. 여기서 설명한 단계별 절차를 신중하게 구현하면, 이 방법은 표준 크라이오-EM 워크플로우에 쉽게 통합할 수 있습니다.

감사의 글

저자들은 이 실험에 사용된 완충제를 제공해 준 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 캠퍼스의 케일럽 피셔, 롭 맥긴티, 니콜라스 라이트, 블레이크 포다이스, 브라이언 로스에게 감사를 표합니다. UNC-채플힐 냉동 EM 핵심 시설과 UNC 핵심 시설 옹호 위원회는 기술 및 재정 지원에 대해 감사드립니다. 캘리포니아 대학교 산타크루즈 캠퍼스 화학 및 생화학과 내 생체분자 냉동전자현미경 시설(RRID: SCR_021755)은 기술 지원을 인정받고 있습니다. 이 연구는 국립보건원(NIH) 국립암연구소(NIH)의 지원으로 P30CA016086호 수여 및 국립보건원(NIH) 보조금R35GM150960 리처드 W. 베이커(Richard W. Baker)에게 수여되었습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL volumetric flask with stopperAvantor10124-382VWR Volumetric Flask, clear glass, Class A, serialized, with penny-head glass stopper, 1 mL
2.5 µL glass syringeHamilton7632-012.5 Microliter Syringe, removable needle (RN), no needle included
3.7 mL threaded glass vial with phenolic capFisher Scientific03338AFisherbrand Class B clear glass threaded vial with attached closure, 3.7 mL
4-slot cryo-grid boxMiTeGen71166-10Cryo Grid Box Round With Lid
11.4 L plastic tubSterilite 12 qt dishpan, multi-purpose plastic wash tub
25 µL glass syringeHamilton8043025 Microliter Syringe, removable needle (RN), includes 22s gauge, 52 mm curved beveled needle
25 mL volumetric flask with stopperAvantor10123-994VWR Volumetric Flask, clear glass, Class A, serialized, with penny-head glass stopper, 25 mL
99.5% pure ethanolThermo Fisher Scientific615090040Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof
99.8% pure chloroformFisher ScientificAA32614K2Chloroform, ACS, 99.8+%
Aluminum foilWalmartAluminum foil, 30.4 cm width
Anionic surfactant powderFisher Scientific50-997-492Electron Microscopy Sciences Alconox anionic powder detergent, 4 lb
Baking dishWalmartPyrex 232-D 3-quart deep glass baking dish
Blot paperTed Pella47000-100Standard Vitrobot filter paper, Ø55/20 mm, Grade 595
Bottle of castor oil with dropperWalmartOrganic castor oil with dropper, 1 fl oz
Cryo-plungerThermo Fisher Scientific1151972FEI Vitrobot Mark IV
DOPCAvanti Polar Lipids850375P-25mg18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine powder, 25 mg
Fine-tip tweezersTed Pella505DUMONT Biology Grade Tweezers, style 5, polished stainless steel
Glass culture tubeFisher Scientific14958AFisherbrand disposable flint glass tube with plain end, 1 mL
Glass pipetFisher Scientific13-678-20AFisherbrand disposable borosilicate glass Pasteur pipet, 14.6 cm
Gold-mesh holey-carbon TEM gridQuantifoilN1-C14nAu30-01QUANTIFOIL R 1.2/1.3 Au 300 mesh
Grade 1 filter paperSigma-AldrichWHA1001150Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 150 mm diameter
Large petri dish with coverFisher Scientific08747ECorning PYREX reusable petri dish with cover, 150 mm diameter, 15 mm height
Low-lint tissuesFisher Scientific06-666Kimtech Science Kimwipes delicate task wipers, 1-ply
Ni-NTA lipidAvanti Polar Lipids790404P-5mg18:1 DGS-NTA(Ni), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)
Pipet bulbFisher ScientificS32325Fisherbrand rubber bulb, natural, 2 mL
Reagent ethanolSigma-Aldrich362808-1LReagent alcohol ≥89% (GC), contains 5% isopropyl alcohol and 5% methyl alcohol
Self-closing anti-capillary tweezersTed Pella510-5DUMONT anti-capillary reverse tweezers, Biology Grade, style 5ACN, stainless steel
Self-sealing filmFisher ScientificS47529Parafilm M wrapping film, 10 cm
Small petri dish with coverFisher Scientific08747ACorning PYREX reusable petri dish with cover, 60 mm diameter, 15 mm height
Syringe needleHamilton7803-0127 gauge small-hub removable needle (RN), beveled, 75 mm length, 45° angle
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참고문헌

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