mtDNA 환자 혈소판을 통한 트랜스-미토콘드리아 사이브리드 생성: 콜로니 선택 및 기능 검증을 최적화하는 효율적인 프로토콜

요약

우리는 mtDNA 환자 혈소판으로부터 성장 매개변수와 집락 분리를 강조하는 최적화된 트랜스-미토콘드리아 사이브리드 생성 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 공통 핵 배경에서 다양한 이형질 수준에서 미토콘드리아 DNA 변이체를 연구하여 전자 전달 사슬 효소 활동과 통합 호흡 능력에 미치는 기능적 중요성을 정량화할 수 있게 합니다.

초록

트랜스미토콘드리아 사이브리드 세포주 생성은 동일한 mtDNA와 핵 게놈 배경 내에서 관심 있는 특정 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 변이체를 고퍼센트 및 저비율(이형질) 수준으로 생화학적 분석할 수 있게 하여 병원성을 결정하는 골드 스탠다드를 의미합니다. 역사적으로 사이브리드 생성 과정은 번거롭고 비효율적이었습니다. 여기서는 인간 혈소판과 표준 골육종 143B 세포주를 융합하여 mtDNA가 고갈된 동유원 핵 배경(Rho⁰ 세포)을 제공하는 매우 효율적이고 효과적인 프로토콜을 설명합니다. 세포 분리는 관심 있는 mtDNA 게놈을 포착하여 다양한 정도의 이형질을 가진 안정적인 세포주를 형성하거나, 서로 다른 미토콘드리아 하플로그룹의 발달 효과를 비교합니다. 미토콘드리아 환자의 사이브리드는 표준 프로토콜로 확립하기 더 어려울 수 있으므로, 현재 방법론은 전자 전달 사슬 활동에 영향을 받는 mtDNA 변이체를 분리하는 데 중점을 두고 있습니다. 우리는 콜로니 선택 기법이 고수준 이형질질 mtDNA 돌연변이 사이브리드 계통을 생성하는 데 시간을 줄이고 생산성을 높인다는 것을 입증합니다. MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K)에서 의미가 알려지지 않은 변이의 사이브리드 생성 사례 연구가 제시되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 사이브리드 생성 과정의 효율성을 분석하고, 고해상도 호흡계를 이용한 기능적 연구를 수행합니다. 이 프로토콜로 생성된 고준도 이형질체 MT-ND1 m.3985G>A 사이브리드 돌연변이체는 야생형 조절에 비해 복잡한 I 의존성 미토콘드리아 호흡에 장애를 보이는 것으로 나타났으며, m.3985G>A가 병원성일 가능성이 높음을 보여준다.

서론

미토콘드리아 DNA(mtDNA) 돌연변이의 병원성 규명은 희귀성, 다양한 조직에서 다양한 수준의 돌연변이 및 야생형 mtDNA 게놈이 포함된 이형질, 다양한 병태생리학적 기전, 그리고 핵 게놈 배경과의 복잡한 상호작용 때문에 어렵습니다 1,2,3,4 . 이러한 이유로 트랜스-미토콘드리아 사이브리드 세포주는 mtDNA 변이의 병원성을 입증하는 데 있어 금본위로 남아 있으며, 여기서 '사이브리드'는 한 세포의 핵과 다른 세포의 미토콘드리아 5,6,7,8,9,10 의 융합을 나타냅니다(그림 1)). 사이브리드 세포주는 연구 중인 mtDNA 변이체^11,12에 대해 특정 비율의 이형질을 가진 동유전자 핵 배경과 미토콘드리아를 포함합니다. 이렇게 하여, 호흡계(편광학)나 전자전달효소 활성(분광광도계) 같은 기능적 분석법을 0%에서 100% 이형질질 사이의 사이브리드 계통에서 수행하여 특정 mtDNA 변이체의 잠재적 병원성 영향과 사이브리드 계통 간 차이가 있을 수 있는 미토콘드리아 하플로그룹의 상대적 영향을 확인할 수 있습니다¹. 다른 세포 유형은 병원성 연구에 사용될 수 있으며, 사이브리드 생성과 기능 분석을 보완하는 데 가장 적합합니다. 각 세포 유형마다 장단점이 있기 때문입니다. 환자의 섬유아세포는 환자로부터 직접 기원하지만, 유전된 이형형질에 제한적이고 핵유전자 효과를 제거할 수 있는 등유학적 핵 조절이 없습니다. mtDNA 편집이 점점 인기를 얻고 있지만, mtDNA¹³에서 오타겟 편집과 편집 가능한 부위가 제한적이라는 점이 문제입니다. 유도 다능성 줄기세포(iPSCs)는 돌연변이가 뉴런과 망막 신경절 세포 등 다양한 세포 유형에 미치는 영향을 연구하기 위해 분화될 수 있으나, 다능성 유도는 관심 있는 mtDNA 변이의 상실을 초래하거나 추가적인 신발 변이(de novo variant)를 초래할 수 있습니다¹⁴. 사이브리드 연구는 암 세포주(전형적으로 143B 골육종) 핵 배경을 기반으로 한 보다 인공적인 시스템을 생성하는 것을 포함하며, 고전적으로 잘 성장하여 후보 중재의 고처리량 선별 연구에 적합하게 만듭니다. 고이형질체 수준의 사이브리드 생성에 대한 제한 요인으로는 혈소판 품질, 시작 이형질, 돌연변이 미토콘드리아의 선택적 단점이 있으며, 이는 본 프로토콜에서 자세히 논의됩니다.

사이브리드 생성은 mtDNA 변이 병인성의 기능적 결정에 있어 금본위이지만, 미토콘드리아 질환 연구를 위해 사이브리드를 생성하는 연구실은 드물다 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26, 27}. 오히려 더 많은 사이브리드가 암과 노화를 연구하기 위해 생성됩니다^28,29. 여기서는 미토콘드리아 질환 환자 사례 연구를 통해 mtDNA 환자 혈소판에서 사이브리드 생성을 촉진하기 위해 개발된 최적화 전략을 시연하며, 표적 mtDNA 변이에서 높은 이형질과 낮은 이형질 사이브리드 세포주를 확립하는 데 필요한 선택 과정과 세포 준비를 포함합니다. 구체적으로, 복합체 I(CI) 소단위체 MT-ND1 변이 m.3985G>A의 사이브리드 세포주를 생성하는 방법론을 시연하며, 이 변이의 병인성을 입증하는 생화학적 연구를 수행했습니다. 그림 2는 사이브리드 생성의 타임라인을 보여주며, 주요 방법론적 단계로는 융합, 선택, 분리 방법이 포함되어 뚜렷한 군집을 생성합니다.

프로토콜

혈액 혈소판은 필라델피아 아동병원(CHOP)의 IRB 연구 08-6177에 따라 채취되었습니다.

1. 혈소판 제조

1. 1일차: 혈액을 채취할 때 산-시트레이트-덱스트로스 튜브에 혈액을 채취하세요.
   참고: 혈액은 즉시 회전근에 투여해야 합니다. 혈소판은 이상적으로 혈액 채취 후 최대 4시간 이내에 채취됩니다.
2. 혈액량을 기록하세요. 혈액 양은 5–6mL가 권장됩니다.
3. 200 × g 에서 12°C에서 20분간 원심분리기 혈액을 채취합니다.
   참고: 12 °C에서의 원심분리는 샘플의 무결성을 유지하고 혈소판 활성화를 방지합니다.
4. 상청액(혈장)을 새로운 원심분리관으로 옮깁니다.
5. 플라즈마 양을 기록해.
6. 혈장을 1500 g × 12°C에서 20분간 원심분리합니다.
7. 추정된 혈소판 펠릿 부피를 기록하세요.
   참고: 이 프로토콜에서는 혈소판이 너무 많으면 번거로울 수 있습니다. 융합 후 Rho⁰ 세포와 혈소판을 도금할 때 과도한 혈소판이 플라스크 바닥에 달라붙어 Rho⁰ 세포 부착을 방해할 수 있습니다. 융합 시에는 혈소판 펠릿 부피의 50 μL 미만을 사용하는 것이 권장됩니다. 초과 혈소판은 다음 단계에서 혈소판을 분리하여 냉동할 수 있습니다.
8. 상정액을 제거하세요.
   참고: 펠릿이 크면 흡인으로 제거할 수 있습니다. 환자의 혈소판 수는 때때로 급격히 줄어들며 끈적하지 않습니다. 이럴 경우 피펫을 사용해 혈장을 천천히 제거하세요.
9. 신선한 혈소판을 계속 사용할 경우, 펠릿을 최소 필수 독수리 배지(SMEM) 스피너 변형 1mL에 재현탁한 후 마이크로 원심분리관으로 옮기십시오.
10. 냉동 시에는 1.05 mL의 SMEM과 450 μL 혈소판 냉동액(태아 소 혈청 [FBS] 350 μL + 디메틸설폭사이드 [DMSO]) 100 μL에 재현탁합니다.
    참고: 일부 환자 혈소판은 냉동 과정에서 안정적이지 않으며, 냉동 후에는 고돌연변이 사이브리드를 얻을 수 없습니다. 신선한 조리법을 사용하는 것이 권장됩니다.
11. Rho⁰ 세포가 제때 준비되지 않으면 37°C에 60rpm에서 가볍게 흔들며 소판을 보관합니다.
    참고: 궁극적으로는 혈소판과 Rho⁰ 세포가 동시에 준비되도록 타이밍을 맞추는 것이 가장 좋습니다. 2시간 이상 기다리는 것은 권장되지 않습니다.

2. Rho 0 셀 준비

1. 갓 해동된 143B 골육종 Rho⁰ 세포나 거의 합류 지점까지 자라고 있던 Rho⁰ 세포를 사용하세요.
   참고: 인큐베이터 내에서 거의 합류할 때까지 성장 중이던 Rho⁰ 세포를 사용하는 것이 권장됩니다. 갓 해동된 Rho⁰ 세포를 사용할 수 있으며, 세포 밀도가 높은 냉동 바이알을 사용하는 것이 권장됩니다. 융합 전에 세포가 2시간 이상 부착되도록 두세요.
2. T75 플라스크를 5mL PBS로 세척하세요.
3. Rho⁰ 세포를 덮기 위해 1mL의 트립신-EDTA 0.25%를 추가하세요.
4. 37°C에서 5분간 배양하세요.
5. 플라스크를 흔든 후에는 5mL의 SMEM으로 플라스크 바닥을 씻어주세요.
6. Rho⁰ 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 모으세요.
7. 세포 수 측정을 위해 200 × g 에서 5분간 원심분리기를 사용해 농축합니다.
8. 상정액을 제거하고 1mL의 SMEM에 재현탁합니다.
9. 셀 수를 세어.
   참고: 이상적으로는 각 융합마다 150만 개의 세포가 있어야 합니다; 하지만 3만 개의 세포로도 성공적인 융합이 이루어진 사례가 있습니다.
10. 150만 개의 세포를 1.5개의 마이크로 원심분리관에 넣고 부피를 1mL로 만듭니다.
    참고: 여분의 '모의 융합' 튜브를 꼭 준비하세요. 이 튜브는 Rho⁰ 세포만 포함하며, 선발 과정을 안내하는 데 사용됩니다.
11. 혈소판을 1700 × g 에서 실온에서 15분간 원심분리합니다.
    참고: Rho⁰ 셀은 차가운 온도에 민감합니다.
12. 혈소판에서 상원액을 제거하세요.
13. 혈소판 펠릿 위에 1mL의 Rho⁰ 세포를 추가하세요.
14. Rho⁰ 세포와 혈소판을 200 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.

3. 융합

1. Rho⁰ 세포와 혈소판 펠릿에서 상정액을 제거하세요.
2. 융합 완충제(50% 폴리에틸렌글리콜 [PEG]/10%DMSO)를 150μL에 추가하고 90초간 분쇄하여 재현탁합니다.
   참고: 일부 펠릿은 꽤 끈적거려서 피펫 위아래로 움직이는 것 외에도 수동으로 저어주고 부숴야 합니다. 펠릿이 끈적했는지 기록하세요.
3. T75 플라스크에 사이브리드 배지(DMEM) 12mL + FBS 10% + 50 μg/mL 우리딘을 첨가합니다.
4. 플라스크에 1mL의 융합된 혈소판과 Rho⁰ 세포를 추가하세요.
5. 세포는 37°C에서 5%_CO2 를 고습도로 배양합니다.
   참고: 모든 세포 성장 단계는 이러한 조건 하에서 진행됩니다.

4. 성장

1. 2일차: 사이브리드 배지를 제거하고 신선한 사이브리드 배지 12mL + 10% FBS + 50 μg/mL 우리딘을 추가합니다.
   참고: Rho⁰ 세포는 mtDNA를 포함시키는 데 약 일주일이 걸립니다.
2. 5일차: 사이브리드 배지를 제거하고 신선한 사이브리드 배지 12mL + 10% FBS + 50 μg/mL 우리딘을 추가합니다.
   참고: Rho⁰ 셀이 80% 합류율이라면, 셀을 두 개의 플라스크로 나누세요.

5. 선발

1. 8일차: 배지를 제거하고 5mL PBS로 세포를 세척합니다.
2. PBS를 제거하고 1mL의 트립신을 추가하세요.
3. 플라스크 바닥에 트립신을 묻히고 37°C에서 5분간 배양합니다.
4. 사이브리드 배지 5mL + FBS 10% + 우리딘 50 μg/mL를 추가합니다.
5. 셀 수를 세어.
   참고: 선발은 10% 합수점부터 시작해야 하며, 이는 T75 또는 조직 배양 처리된 페트리 접시 내 125,000개의 세포입니다. 군체 채취 방식을 선호한다면 페트리 접시 사용을 권장합니다. 희석 방법을 쓴다면 T75를 사용하세요.
6. 적절한 용기에 125,000개의 세포를 추가하고, 나머지 부피는 선택 배지(DMEM)로 최대 12 mL까지 추가합니다.
   참고: 선택 배지는 융합된 143B 세포와 미토콘드리아를 Rho⁰ 세포에서 분리하도록 설계되었습니다. Rho⁰ 세포는 생존을 위해 피루베이트와 우리딘이 필요합니다. 투석 FBS에는 피루베이트와 우리딘이 포함되어 있지 않으며, 선택을 위해서만 사용해야 합니다. 가능하다면 두 가지 다른 선택 매체를 사용하세요. 하나는 10% 투석 FBS여야 하고, 다른 하나는 성장 제한이 덜한 것으로, 예를 들어 20% 투석 FBS + 50 μg/mL 우리딘이어야 합니다. 중성 돌연변이에는 덜 제한적인 선택 배지를 병행하여 제안합니다.
7. 남은 세포를 두 개의 크라이오비아에 각각 1mL 냉동 용액과 함께 냉동합니다.
   참고: 이들은 사전 선택 셀이며, 이후 다양한 선택을 시도할 수 있습니다.
8. 약 1주일 동안 매체를 격일로 바꿔요.
   참고: Rho⁰ 셀은 죽으면 떠다니다가 배질 교체 후에는 씻겨 내려갑니다. "모형" 융합 세포를 사용해 선택이 완료되었는지 확인하세요(플라스크에 더 이상 세포가 없는). 이 플라스크는 모든 Rho⁰ 셀이 씻겨 내려가서 완전히 비어 있을 거예요. 모의 플라스크가 비어 있어도 하루 더 기다리는 것이 좋습니다. 융합된 세포는 배지 내 영양분을 제공하여 다른 Rho⁰ 세포가 플라스크 내에 남아 있도록 돕기 때문입니다. 세포가 20% 이상 합류할 정도로 성장하면 분할하고 재판을 하세요. 더 많은 성장이 선발을 가릴 것입니다.

6. 군체 선택 성장법

1. 사이브리드 배지 + 20% FBS + 50 μg/mL 우리딘으로 군락을 육안으로 키우세요.
   참고: 접시를 기울이고 빛에 비추세요. 군체는 구름 낀 원처럼 보입니다. 현미경으로 보면 집락 사이에 배경 세포가 많지 않을 것입니다.
2. 플라스크 바닥에 마커를 붙여 독립적이고 겹치지 않는 군집을 원을 그리고, 빛에 비추어 들고 있습니다.
3. P20을 사용해 플라스크 바닥에 부착된 기계적으로 교란된 세포를 긁어내고 동시에 20 μL를 흡입하여 선택한 콜로니의 세포를 P20 끝에 배치합니다.
   참고: 수작업으로 긁으면 세포가 분리되고, 20 μL을 끌어올리면 피펫 팁에 세포가 모이는 셈입니다.
4. 각 군집을 96웰 플레이트에 별도의 우물에 배팅하세요.
   참고: 이 방법의 장점은 143B 세포가 함께 잘 자라는 경향이 있어 성장에 문제가 없고 더 빠른 결과를 얻을 수 있다는 점입니다. 단점은 인구가 혼합될 수 있다는 점입니다.

7. 희석 성장법

1. 세포가 사이브리드 배지에서 75% 합류율 + 20% FBS + 50 μg/mL 우리딘에 도달하면, 세포를 5 mL의 PBS로 세척합니다.
2. PBS를 제거하고 1mL의 트립신을 추가하세요.
3. 플라스크 바닥에 트립신을 묻히고 37°C에서 5분간 배양합니다.
4. 사이브리드 배지 5mL + FBS 20% + 우리딘 50 μg/mL를 추가합니다.
5. 셀 수를 세어.
6. 5× 10개의⁵ 세포를 20mL 사이브리드 배지 + 20% FBS + 50 μg/mL 우리딘을 50 mL 원뿔형 튜브 1에 첨가합니다.
   참고: 이는 5000 세포/mL로, 96웰 플레이트에 플레이트링하면 100 μL 내 500 세포가 됩니다.
7. 50 mL 원뿔형 튜브를 100배 희석(튜브 1에서 200 μL in 사이브리드 배지 20 mL + 20% FBS + 50 μg/mL 우리딘)로 준비합니다.
   참고: 이는 우물당 약 5개의 셀입니다.
8. 50mL 원뿔형 튜브 3을 1:1 희석으로 준비합니다(튜브 2에서 10mL를 사이브리드 배지 10mL + FBS 20% + 우리딘 50 μg/mL).
   참고: 이는 우물당 약 2.5개의 셀입니다.
9. 50mL 원뿔형 튜브 4를 1:1 희석(튜브 3 10 mL에 사이브리드 배지 10 mL + FBS 20% + 우리딘 50 μg/mL)을 준비합니다.
   참고: 이는 우물당 약 1셀입니다.
10. 플레이트 튜브 2, 3, 4는 각각 100 μL의 96웰 플레이트에 배치됩니다.
    참고: 플레이트 전에 반드시 셀을 섞어야 합니다. 셀이 바닥에 가라앉아 붙어야 하기 때문에 각 웰에 셀이 하나씩 있는지 확인하는 날에 확인하기가 어렵습니다. 이 방법의 장점은 단일 세포가 집단으로 성장하여 혼합 배경이 없도록 보장한다는 점입니다. 단점은 심각한 돌연변이가 분리되면 생존하지 못할 수 있다는 점이다.
11. 다음 날, 한 웰에 셀이 여러 개 있는 우물을 교차 제거하세요.
12. 며칠 후, 다시 우물을 점검하세요.
    참고: 이제 집단이 있어야 하며, 웰 가장자리 근처에 단일 셀이 있으면 더 명확합니다. 만약 군체가 두 개 이상 있다면, 그 우물들을 제거하세요. 셀이 없다면 우물을 제거하세요.

8. 성장

1. 96웰 플레이트에서 시작해 필요에 따라 더 큰 플레이트로 셀을 단계적으로 옮깁니다.
   참고: 이 세포들은 높은 세포 밀도에서 가장 잘 자라며, 충분한 세포를 옮기지 않으면 죽을 수 있습니다. 항상 이전 플레이트와 셀을 보관하고, 어느 우물이 어디서 왔는지 표시해 두세요. 그래야 필요할 때 다시 돌아갈 수 있습니다. 중요한 점은, 143B 세포가 과도하게 결합되면 죽고 분리되기 때문에, 매일 이 세포들을 점검하세요.

9. 유전적 확인

1. 분리된 셀을 450×g 에서 5분간 원심분리합니다.
2. 미디어를 제거하세요.
3. DNA 추출 버퍼 50 mM NaOH를 5 μL 추가합니다.
   참고: 셀이 많으면 이 숫자가 변할 수 있습니다. 중요한 세포 펠릿은 10 μL 버퍼에 있을 수 있습니다.
4. 95°C에서 30분간 배양합니다.
5. 추출 버퍼에 동등량의 DNA 안정화 버퍼(0.1 M Tris-HCl; pH 8)를 추가합니다.
6. 효소의 지침에 따라 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하세요.
   참고: 일부 포인트 돌연변이는 제한효소를 사용해 대조군과 환자 세포를 구분할 수 있습니다. 다른 점 돌연변이는 구분할 수 없어 시퀀싱이 필요합니다. 이 경우에는 고품질 결과를 위해 염료 없이 PCR 혼합물을 사용하는 것이 중요합니다. Sanger 시퀀싱과 차세대 시퀀싱을 사용할 수 있습니다. 25 μL 반응에는 2.5 μL의 DNA가 충분합니다.
7. 이 돌연변이에 특이적인 PCR 증폭자를 사용해 생거 염기서열 분석에 사용하세요.
   참고: PCR 증폭자는 생거의 시서열 분석을 위해 보내졌습니다. 돌연변이 이형질체 수준은 클론 확장과 기능 분석 모두 확인되었습니다.

10. 고해상도 호흡계를 이용한 고해상도 호흡계

1. 호흡계(예: 오로보로스 인스트루먼트) 지침에 따라 공기 보정을 수행하세요.
2. 사이브리드를 PBS와 함께 T75 플라스크에 세척하세요.
   참고: 셀들이 과도하게 밀집되어서는 안 됩니다; 70%에서 80% 합류가 이상적입니다.
3. 트립신 1mL를 추가하고 4분간 배양합니다.
4. 사이브리드 배지 5mL를 추가하고 세포를 세세요.
5. 50만 개의 세포를 튜브에 넣어 450 × g 에서 5분간 원심분리합니다.
   참고: 호흡계의 세포 수와 부피는 0.5 mL 챔버에 해당합니다.
6. PBS로 재현탁액으로 세포를 세척하고 다시 원심분리기를 사용하세요.
7. 세포를 510 μL MiR05 버퍼에 재현탁한 후 빈 챔버에 추가합니다.
8. 안정화 후에는 디지토닌 0.65 μL(50 mg/mL), 말레이트 0.8 μL(2.5 M), 피루브산 2 μL(2.5 M)을 추가합니다.
   참고: 디토닌 첨가 전에는 기저호흡 측정이 이 지점에서 이루어집니다. 이후 모든 단계는 안정화 후에 해야 합니다.
9. 12 μL 아데노신 디포스페이트(ADP)(0.25 M)를 추가합니다.
10. 글루타메이트 4 μL(2.5 m)를 추가하세요.
11. 12 μL 석시네이트(1.25 M)를 추가합니다.
12. 올리고마이신 1 μL(1 mg/mL)을 추가합니다.
13. 카보닐 시안화물-p-트리플루오로메토시페닐하이드라존 [FCCP](0.2 mM) 1 μL 첨가.
    참고: 추가 증가가 관찰되지 않을 때까지(보통 3–5번) 여러 번 추가로 점진적으로 조절합니다.
14. 로테논 1μL(2 mM)을 추가하세요.
15. 1 μL 안티마이신 A(1 mg/mL)를 추가합니다.
16. 아스코르베이트 0.5 μL(0.8 M)과 테트라메틸페닐렌디아민 [TMPD] 0.5 μL (0.2 M)을 추가합니다.
17. 스페이서를 달아 챔버를 20분간 열어보세요.
18. 챔버를 닫고 5분간 안정화하세요.
19. 아지드 22.5 μL(4 m)을 추가합니다.
20. 비신코닉산(BCA) 분석 키트를 사용하여 단백질 정량을 위해 세포를 수집하세요.
21. 산소 소비량이 안정화된 후 단백질로 정규화하여 계산을 수행하세요. 기저호흡은 세포가 체내에 추가된 후 안정화된 산소 소비량입니다.
    참고: 기타 모든 측정은 기질이나 억제제 후에 수행됩니다.
22. OXPHOS_CI: (글루타메이트-안티마이신 A) /(FCCP-안티마이신 A) 계산.
23. OXPHOS_CI+CII: (서시네이트-안티마이신 A)/(FCCP-안티마이신 A)를 계산합니다.
24. ETS_CI+CII: (FCCP-안티마이신 A) 계산.
25. ETS_CII 계산: (로테논-안티마이신 A) /(FCCP-안티마이신 A).
26. LEAK_CI+CII: (올리고마이신-안티마이신 A)/(FCCP-안티마이신 A)를 계산합니다.
27. OXPHOS_CIV 계산: (TMPD/ASC-아지드)/(FCCP-안티마이신 A).
28. 호흡 측정을 위해 최소 4–6개의 생물학적 복제체를 사용하세요.

결과

방법론적 차이와 프로토콜 최적화 경로를 입증하기 위해, 우리는 전자 전달 사슬의 복합체 I(CI)의 MT-ND1 에서 미지의 의미 없는 변이(VUS)를 보유한 미토콘드리아 질환 의심 환자 한 명으로부터 사이브리드 생성 결과를 제시합니다. 두 개의 CLIA 승인 임상 진단 실험실에서 다중 조직에서 임상 mtDNA 게놈 차세대 시퀀싱을 수행한 결과, 병원성이 의심된 유일한 변이는 MT-ND1 m.3985G>A였습니다. 환자의 혈액에서 MT-ND1 m.3985G>A (p.E227K) 돌연변이의 이형질은 50%였다. 이 개인을 위해 사이브리드를 생성함으로써 여러 프로토콜 최적화 통찰이 입증되었습니다(표 1). 냉동 혈소판에서 사이브리드를 생성하려는 이전 시도들은 실패했거나 야생형(0% 이형질) 사이브리드만 얻었다(표 1). 반면, 신선하게 분리한 혈소판을 사용하는 것이...

토론

여기서는 mtDNA 환자 혈소판으로부터 미토콘드리아 사이브리드 세포주를 생성하는 매우 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 우리는 중요성이 불확실한 MT-ND1 변이의 사례 연구를 통해 그 적용 가능성과 성장 및 선택 매개변수를 신중히 고려하는 것의 중요성을 보여줍니다. 이러한 주요 문제들이 최적화되면, 호흡 사슬 기능을 저해할 수 있는 mtDNA 변이를 가진 사이브리드를 성공적으로 선정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 mtDNA 돌연변이를 가진 사이브리드 생성에 사용할 수 있습니다.

우리 사례 연구의 타임라인은 사이브리드 생성이 혈소판 분리 시점부터 약 2.5개월이 걸린다는 것을 보여줍니다(그림 2). 활동 시간 측면에서 보면, 1일차와 20일차가 가장 시간이 많이 걸립니다. 96웰 플레이트에서 더 큰 웰로 세포를 이동시키는 데 걸리는 시간이 가변적이며, ...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbate	Sigma Aldrich	11140-250G
Azide	Sigma Aldrich	S2002-100G
Dialyzed FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonin	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Cybrid media
DMEM	Corning	10-017-CM	Selection media
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamate	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	fusion buffer
Malate	Sigma Aldrich	M1000-100G
MiR05 buffer	Oroboros Instruments	60101-01
O2K respirometor	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomycin	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pyruvate	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinate	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsin-EDTA 0.25%	Thermo Scientific	25200056
Uridine	Sigma Aldrich	U3750-25G

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