방법 논문

유방종양 함유 면역유능 마우스에서의 안트라사이클린 유도 심독성 심장종양학적 마우스 모델

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DOI:

10.3791/71633

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2026년 10월 1일

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1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

안트라사이클린으로 유도된 심독성의 임상적으로 유의미한 마우스 모델은 매우 드뭅니다. 본 연구에서는 암 환자의 임상 프로토콜을 모방하여, 항암 치료를 받는 종양 보유 면역 competent 마우스를 이용한 모델을 제안합니다.

초록

암 치료 관련 심장 기능 장애의 전임상 모델에 관한 유럽심장학회의 최신 업데이트는 더욱 대표성 있고 중개 가능한 모델에 대한 절실한 필요성을 강조합니다. 생체 내(in vivo) 모델들입니다. 이는 임상 집단에서 관찰되는 이질성을 더욱 정확하게 재현하기 위해, 다양한 계통과 암수 모두를 포함하며 면역 기능이 온전한 종양 모델 동물을 사용하는 모델 개발의 필요성을 강조합니다. 따라서 유방종양 모델 동물에서 안트라사이클린 유발 심독성(AIC)의 임상적 관련 모델을 구축하였습니다. 마우스의 유전적 배경에 따라, Balb/c 마우스 또는 C57Bl/6J 마우스의 암수 하부 유선에 4T1Luc 세포(20만 개) 또는 PY8119 세포(20만 개)를 각각 피하 주사하였습니다. 종양 성장은 생체 발광 및 촉진으로 모니터링하였습니다. 종양 세포 주입 2주 후, 촉진으로 종양 덩어리가 감지되면 동물에게 항암제 독소루비신 처치를 시행하였습니다. 독소루비신에 대한 마우스의 내성은 계통에 따라 차이가 있었습니다. 심장 기능은 프로토콜 시작 전(기초선)과 이후 매주 케타민으로 마취된 마우스의 심장 초음파를 통해 평가하였습니다. 심독성은 좌심실 분획 단축률이 기초선 대비 최소 10% 이상 감소한 절대값으로 정의되었습니다. <50% 및 심박수 >300 BPM. 해당 프로토콜은 99%의 종양 형성 성공률로 재현 가능했으며, >마우스 생존율 80%. 심장 독성이 관찰되었다. >종양과 독소루비신(Doxorubicin)을 처리한 마우스의 90%.

서론

심혈관종양학(Cardio-oncology)은 화학요법 전, 중, 후의 암 환자에서 심혈관 결과(cardiovascular outcomes)를 개선하는 것을 목표로 합니다. 전임상 모델은 이 두 질환 사이의 상호작용을 더 잘 이해하는 데 큰 역할을 해왔습니다. 최근 한 패러다임 전환적 연구에서 자발적 장 폴립이 발생하기 쉬운 마우스가 심근경색과 심부전(HF) 기간을 거친 후 이러한 종양이 더 많이 발생했음을 관찰함으로써, 심혈관 사건이 종양 성장에 직접적인 영향을 미친다는 것을 입증했습니다1. 이후 수많은 연구에서 다양한 종양 유형과 마우스 계통에 걸쳐 일관된 결과가 보고되었으며, 특정 분자 경로 또는 단백질이 빈번하게 관여함으로써 암 진행이 심혈관 질환(CVDs)에 의해 촉발된다는 개념을 강화했습니다2,3,4,5.

반대로, 암이 심혈관계 질환(CVD) 발생 위험에 미치는 영향은 수십 년 동안 연구되어 왔습니다. 역학 데이터에 따르면 암 생존자들은 이 두 질환의 공통된 위험 요인과 항암 치료6,7,8,9,10의 알려진 다양한 독성으로 인해 더 많은 CVD를 겪는 것으로 나타났습니다. 전임상 연구에서는 인간의 장기적인 심혈관 결과를 개선하기 위해 조절 가능한 특정 표적을 식별하고자 암 유발 악액질 모델을 흔히 사용해 왔습니다11,12,13,14. 하지만 환자들이 이러한 진행성 암 증후군에 도달하기 전에 치료를 받는 경우가 많기 때문에 이러한 모델들이 일반적인 임상 상황을 거의 반영하지 못한다는 주장이 있을 수 있으나, 전신 악액질은 여전히 전체 암 사망의 상당 부분에 기여하는 것으로 추정됩니다15.

유럽심장학회(ESC)의 첫 번째 심장종양학 가이드라인에서는 암과 심혈관 질환(CVD) 사이의 관계를 더 잘 이해하기 위해 추가적인 연구가 필요하다고 결론지었습니다16. 보다 구체적으로, 최근 ESC 심장종양학 워킹 그룹의 업데이트에서는 이러한 지식 격차를 해소하는 데 있어 전임상 연구, 특히 종양 이식 동물 모델을 이용한 연구가 매우 중요하다고 명시했습니다17. 또한, 현재 대부분의 임상 연구가 전임상 단계에서 충분히 연구되지 않은 항암 치료제를 대상으로 수행되고 있기 때문에, 전임상 연구와 임상 연구 간의 더 나은 상관관계 정립이 필요합니다18.

Doxorubicin (Dox)과 같은 안트라사이클린(Anthracyclines, ACs)은 수많은 고형암 및 혈액암의 화학요법에 흔히 사용됩니다. 오늘날 더 현대적인 치료법들이 이용 가능함에도 불구하고, 저렴한 비용, 잘 문서화된 부작용, 그리고 분명한 효능으로 인해 이러한 약물들은 앞으로도 수년 동안 계속 사용될 것입니다19,20. 방대한 양의 증거들은 ACs가 용량 의존적 심독성을 유발하며, 이는 주로 좌심실 기능 부전으로 나타난다는 것을 시사합니다. 이는 오늘날 임상 사용의 주요 제한 요인 중 하나이며, 심장 종양 전문의에게 종종 우려스러운 요인이 됩니다21,22. 이러한 문헌들은 주로 인간에서의 높은 발생률로 인해 유방암 연구에서 기인했으나, 림프종, 폐암 및 백혈병에 대한 임상 연구에서도 유사한 관찰 결과가 보고되었습니다23. 따라서 AC 유발 심독성(AC-induced cardiotoxicity, AIC)의 근저에 있는 병태생리학적 기전을 이해하기 위해 수십 년 동안 전임상 연구가 수행되어 왔으며, 이를 통해 산화 스트레스, 직접 및 간접적 DNA 손상, 페로토시스(ferroptosis) 및 미토콘드리아 손상이 공통적으로 관여한다는 것이 입증되었습니다23,24.

그럼에도 불구하고, AIC를 예방하거나 치료하는 방법에 대한 증거는 실제로 제한적입니다. 일반적인 HF 약물들이 임상 시험에서 테스트되었으나 결과가 엇갈렸으며, 몇 가지 잠재적 후보 약물들의 사용 시점을 결정하는 것 또한 어려웠습니다21,23,25,26,27,28. 철 조절 약물인 Dexrazoxane은 AIC 예방에 유망한 결과를 보여주었으나, 현재 체계적으로 사용되고 있지는 않습니다21. AC를 혈액 내 자유 형태가 아닌 다른 형태, 예를 들어 리포좀에 캡슐화하여 전달하는 방식 또한 유망한 결과를 보여주었으나, 부분적으로 비용 문제로 인해 기존의 AC를 대체하는 데 여전히 어려움이 있습니다21.

이러한 상황에 대한 한 가지 설명은 AIC 연구를 위한 임상적으로 유의미한 동물 모델이 부족하다는 점입니다.17인간의 경우, Dox는 일정 기간에 걸쳐 투여됩니다. ~을 통해 반복적인 주입이 수행되며, AIC의 대부분은 치료 후 첫 1년 동안 관찰됩니다. 하지만 최근 발표된 리뷰 논문에서 나타난 바와 같이, 문헌 전반에 걸쳐 동물 실험 프로토콜의 큰 편차가 관찰됩니다.29급성 심독성 모델의 전형적인 예시는 종양이 없는 생쥐에 Dox 20 mg/kg을 단회 투여하는 것입니다.30전형적인 만성 심독성 모델에서, 많은 연구들은 종양이 없는 마우스에 독소루비신(Doxorubicin) 5 mg/kg을 주 1회 투여하여 총 누적 용량이 20 mg/kg이 되도록 하는 방식을 설명하고 있습니다.29,31이러한 만성 심장독성 모델은 동일한 Dox 용량을 투여한 종양 보유 동물에서도 관찰될 수 있으나, 문헌상으로는 매우 드문 사례입니다.29,32.

이러한 지식 격차를 줄이는 데 기여하기 위해, AIC를 연구하기 위한 실용적이고 임상적으로 유의미한 면역 정상 유방암 마우스 모델을 4T1 종양 이식 Balb/c 마우스로 구축하였으며, PY8119 종양 이식 C57Bl/6J 마우스에서 그 견고함을 확인하였습니다. 저자들이 알기로 후자의 경우 C57Bl/6J 계통의 삼중음성 유방암을 이용해 심장종양학 모델을 구축한 첫 사례입니다. 종양 성장을 적절히 포착하여 ~을 통해 / ~을 경유하여 심장 독성을 나타내는 Dox를 동물에게 투여하기 전에 생물발광 정량을 수행하였으며, 심혈관 종양학 실험과 동시에 종양 미세환경을 연구하기 위해 장기 수집 프로토콜을 시행하였습니다. 또한, 계통 및 성별 민감도와 관련하여 문헌에 기술된 것과 유사한 결과가 관찰되었습니다. C57Bl/6J 마우스는 AIC 실험에서 생존율이 매우 높기 때문에 가치가 크므로, 본 연구는 향후 심혈관 종양학 연구에서 동물 프로토콜의 표준화 및 개선에 기여할 것으로 기대됩니다.29.

제안된 방법의 장점은 유전공학적 조작이 용이하고, 게놈 특성이 잘 규명되어 있으며, 획득 비용이 저렴하고, 고용량의 누적 AC 투여를 견딜 수 있는 C57Bl/6J 계통을 사용한다는 점입니다29,33,34. AC를 이용한 특정 연구를 위해 유전자 녹아웃이 필요한 경우, 이 모델이 해당 목적에 매우 적합합니다. 또한, 이 계통에서 유래한 삼중음성 유방암을 사용하는 것은 중개 연구 측면에서 의미가 있는데, 이는 삼중음성 유방암 환 여성들이 AC 치료를 받을 가능성이 매우 높으며 예후가 가장 좋지 않은 환자군이기 때문입니다35. 이 모델을 사용함으로써 특히 이러한 환자들에 대한 AIC 지식을 향상시킬 수 있을 것입니다.

이 모델의 강점은 또한 마우스에 종양을 미리 형성시켜 심혈관계 리모델링에 실제로 영향을 줄 수 있다는 점에 있습니다36,37. 또한, 이 모델은 급성 및 완전 만성 AIC 모델의 중간 단계에 해당하며, 높은 생존율 덕분에 동물 모니터링 기간을 연장할 수 있어 다른 AC-주기를 고려할 때 매우 가치 있게 활용될 수 있습니다.

하지만 이 모델은 종양 접종 방식이 실용적인 접근법을 따르기 때문에, 프로토콜 마지막 단계에서 특정 종양 특성을 규명하는 데에는 가장 적합하지 않을 수 있습니다. 만약 이것이 과학적 가설의 핵심이라면, 조정된 종양 주입 방식을 수행해야 합니다. 또한, Balb/c 마우스에 4T1 세포를 주입하는 것은 예를 들어 본 문서에서는 설명하지 않은 전이를 연구하는 것과 같은 보다 종양학적인 접근을 위한 잘 확립된 모델이며, 전이가 과학적 질문에 필수적이라면 이를 고려해야 합니다38. 이 모델은 성체 마우스를 대상으로 수행됩니다. 그러나 소아 환경에서의 AIC를 연구하는 것이 목적이라면 더 어린 마우스를 고려해야 하며, 이에 대한 프로토콜 반응은 여기에서 연구되지 않았습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 현지 동물 윤리 위원회(Lariboisière-Villemin)의 규정을 준수하였으며, 프랑스 고등교육연구부(MESRI)의 승인(프로토콜 번호 APAFIS 46086) 하에 수행되었습니다. 프로토콜 설계 시 3R 원칙을 고려하였습니다. Balb/c 및 C57Bl/6J 마우스는 Janvier Labs 또는 Envigo와 같은 동물 공급업체로부터 구매하였습니다. 본 프로토콜에서는 삼중음성 유방암 환자인 여성과 유사한 청년기에 해당하도록, 포함 당시 연령이 10주에서 18주 사이인 마우스를 사용하였습니다. 동물은 12시간 명/암 주기가 유지되고 실온이 다음 범위인 방에서 2~5마리씩 그룹으로 사육되었습니다. 20 °C 그리고 24 °C, 습도는 30%에서 70% 사이로 유지하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 제공하였다. 자유 섭취프로토콜 진행 과정에서, 다음의 내용에 기술된 바와 같이 프로토콜 시작 전 미리 정의된 인도적 종료 시점을 준수하기 위해 주의를 기울였습니다. 보충 표 1이소플루레인 사용자의 안전을 위해 이소플루레인 필터를 사용하여 폐가스를 수집하십시오. 본 프로토콜의 모든 단계에서 장갑과 보안경을 착용하고 동물을 주의해서 다루십시오. 모든 유해 물질은 현지 기관의 규정을 따라야 하며, 본 실험에서는 모든 오염된 시료(혈액, 바늘, 독소 함유 바이알 등)를 생물학적 위험 의료 폐기물함에 폐기하였습니다. 프로토콜 개요는 다음에 나타나 있습니다. 그림 1A사용된 시약 및 장비 목록은 다음의 표에 제시되어 있습니다. 재료 목록.

1. 0주차: 세포 준비 및 동물 주입

참고: 다음 단계들은 4T1Luc 세포를 기준으로 설명되었으며, PY8119 세포를 사용할 때도 동일하게 적용되었습니다. 다만, 이는 제조사의 권장 사항에 따라 각 세포주에 맞게 조정되어야 합니다. 프로토콜을 최적화하기 위해, 한 사람은 세포 준비를 담당하고 다른 한 사람은 동물 준비를 담당하는 것이 좋습니다.

  1. 세포 배양 플라스크의 세포가 합류(80%–90% confluence)되면, 37 °C 및 5% CO2 조건에서 3 mL의 trypsin을 처리하여 5분 동안 둡니다.
  2. 플라스크를 가볍게 두드려 모든 세포를 분리하고, 세포 덩어리가 생기지 않도록 하며 세포 배양 배지로 재현탁합니다.
  3. Malassez 챔버(또는 사용 가능한 다른 기술)를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
  4. 세포를 300 × g에서 5분 동안 원심 분리한 후, 동일한 부피의 PBS로 재현탁하여 100 µL에 200,000개의 세포를 주입할 수 있도록 준비합니다.
    참고: 세포 수는 문헌 검토 후 결정되었습니다(부록 표 2 참조).
  5. 26 G 주사기를 사용하여 세포 현탁액 500 µL를 조심스럽게 흡입합니다. 주사기 내에 세포 현탁액이 머무는 시간이 너무 길어지는 것을 방지하기 위해, 동물 5마리에게 필요한 양보다 적은 부피로 주사기를 채우는 것을 권장합니다.
  6. 가능하다면 동시에 생쥐를 isoflurane 챔버에 넣고, 주변 공기 흐름 1 L/min에서 3% isoflurane으로 빠르게 마취를 유도합니다. 동물이 잠들면 즉시 1% isoflurane이 포함된 콘에 코를 맞춘 채로 동물을 앙와위(supine position)로 눕힙니다.
  7. 면봉을 사용하여 동물의 흉부와 왼쪽 하복부에 저자극 제모 크림을 1분 동안 도포합니다. 물로 털과 크림을 제거한 후 티슈로 피부를 건조시킵니다.
  8. 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 마취가 충분히 되었는지 확인합니다.
  9. 상복부의 왼쪽 유두를 확인합니다. 핀셋으로 유두를 가볍게 잡아 위로 들어 올립니다(그림 1B 참조).
  10. 주사기 바늘을 피하로 삽입하여 바늘이 유선 아래에 위치할 때까지 넣습니다.
  11. 세포 현탁액 100 µL를 주입합니다. 유두 아래에 피하 기포가 형성되어야 합니다(그림 1C 참조). 대조군 동물에게는 PBS를 주입합니다. 무작위 배정은 무작위 배정 소프트웨어(무료 온라인 도구인 RandoMice 등)를 사용하거나, 미리 정의된 1:1 또는 2:2(혹은 그 이상)의 비율로 처리를 할당하여 수행할 수 있습니다.
  12. 바늘을 조심스럽게 제거하고, 핀셋으로 잡고 있던 유두를 놓습니다.
  13. 동물의 무게를 측정하여 프로토콜의 기준 체중을 확보합니다.
  14. 동물을 케이지로 되돌려 보내기 전, 주변 공기 중에서 깨어나도록 둡니다.

2. 1주차: 생물 발광을 이용한 종양 성장 제어

참고: 이는 성장을 조절하기 위해 주사 후 어느 날이든 수행할 수 있습니다. 또한, 종양 성장 속도에 관심이 있는 경우 여러 시점에서 수행할 수 있습니다. 하지만 10–14일 후에는 암 성장 과정 중의 자연스러운 종양 세포 선택으로 인해 신호가 사라질 수 있습니다. 또한, 프로토콜이 시작 단계에서 정확하게 수행되었다면 털의 재성장이 적절한 광자 포착에 문제가 되지 않아야 합니다. 종양 주사 후 2, 5, 8, 11일에 정량화한 생물 발광의 대표적 결과는 그림 2A,B를 참조하십시오.

  1. 동물을 isoflurane 챔버에 넣고 3% isoflurane으로 빠르게 마취를 유도합니다.
  2. 동물이 잠들면 26-G 주사기를 사용하여 루시페린을 체중 1g당 10 µL씩 복강 내(IP)로 주입합니다. 며칠 후면 이미 촉진될 수 있는 종양이 존재하므로, 좌측에는 루시페린을 주입하지 않도록 주의하십시오.
  3. 종양이 복부에 있으므로 광자 포착을 최적화하기 위해 마우스를 광자 이미저 내에 앙와위로 배치합니다. 코 부분을 노즈콘에 맞추고 isoflurane 농도를 1%로 낮춥니다.
    참고: 5마리의 동물을 광자 포착기에 정확하게 배치하는 데 시간이 소요되므로, 획득 시작 예정 시간보다 최소 2분 전에 배치를 시작하십시오.
  4. 루시페린 주입 10분 후에 발광 활성 획득을 시작하고 5분 동안 실행합니다 (그림 2A 참조). 본 실험에 사용된 장치의 획득 모드는 프레임당 89 ms의 BLI였으며, 이미지 크기는 220 mm x 165 mm, BVR 픽셀 크기는 153 µm였습니다.
  5. 획득이 완료되면 동물을 케이지로 돌려보내기 전 상온의 공기 중에서 깨어나도록 둡니다.
  6. 제조사의 권장 사항에 따라 광자 이미저용 정량 분석 소프트웨어를 사용합니다.

3. 2주 차: Doxorubicin 처리

참고: 심장 초음파 평가는 Dox 주입을 시작하기 전에 수행해야 합니다. 따라서 첫 번째 Dox 주입으로 인한 스트레스를 최소화하기 위해, 심장 초음파 검사 후 유도된 마취 상태에서 동물이 잠든 동안 주사를 투여하십시오. 또한, 누적 용량은 각 마우스 계통에 맞게 조정해야 합니다. 본 실험에서는 이전의 내부 데이터 및 문헌29을 근거로 Balb/c 마우스에는 16 mg/kg, C57Bl/6J 마우스에는 24 mg/kg을 사용하였습니다(그림 3A–C 참조).

  1. doxorubicin 분말을 생리식염수로 재현탁하여 희석한다. Dox 4 mg/kg이 240–360 µL의 부피에 해당하도록 희석액을 준비해야 한다. 따라서 2 mg/mL 농도의 용액을 준비한 후, 생리식염수로 6배 희석(최종 농도 0.33 mg/mL)하는 방법을 권장한다.
  2. 종양 주입 2주 후, 복부 왼쪽 하단에서 종양이 만져지지만 크기가 1 cm 미만인지 확인한다.
  3. Dox 처리 후 체중 감소를 관리하기 위해 동물의 체중을 측정한다.
  4. 26 G 주사기를 사용하여 복부 오른쪽 하단에 4 mg/kg IP 용량에 해당하는 부피를 주입한다. 대조군 동물에는 생리식염수를 투여한다. 무작위 배정은 단계 1.11과 동일하게 수행할 수 있다.
  5. 누적 용량 16 mg/kg에 도달할 때까지 이 과정을 4일 동안 매일 반복한다(C57Bl/6J 마우스의 경우 24 mg/kg에 도달하기 위해 2일을 추가한다).

4. 2~5주 차: 심독성 모니터링

참고: 이 과정은 매주 수행할 수 있습니다. 다만, 프로토콜의 3~4주 차에 동물들이 가장 취약해지는 경우가 많고, 일부 마우스 계통은 전신 마취에 민감하여 사망률이 증가할 수 있으므로 더 빈번하게 평가할 때는 주의가 필요합니다. 이소플루란(isoflurane)은 심근 억제를 유발하므로, 심기능 저하 기록 가능성을 최적화하기 위해 케타민 마취 하에 심초음파 검사를 수행하며, Balb/c 마우스에는 40 mg/kg, C57Bl/6J 마우스에는 80 mg/kg을 사용합니다39. 화학요법 시작 전, 종양 성장이 심장 기능에 미칠 수 있는 잠재적 영향을 정량화하기 위해 종양 주입 전에 초음파 검사를 한 번 수행하는 것을 권장합니다.

  1. 동물의 무게를 측정하십시오. 상당한 체중 감소가 관찰될 경우, 다음 절차를 따르십시오. 보충 표 1.
  2. 26 G 주사기를 사용하여 Balb/c 마우스에는 40 mg/kg, C57Bl/6J 마우스에는 80 mg/kg의 케타민을 복강 내(IP) 주사하여 가벼운 마취 상태가 되도록 마취합니다.
  3. 저체온증을 방지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 올립니다.
  4. 동물이 잠들면, 1.7에서 설명한 대로 동물의 털을 깎아 흉부 부위를 제모합니다.
  5. 케타민 주사 10분 후, 최대 5분 동안 심초음파 검사를 수행하십시오. 예열된 초음파 젤을 사용하십시오. 사용하는 기기에 따라 M-모드에 집중하거나 스트레인 정량화를 수행하십시오.
  6. M-모드를 사용하는 경우, 흉골 옆 장축 단면도(parasternal long-axis view)에서 심실 중간 단면을 4초 이상 박동하는 상태로 최소 3회 기록하여 생쥐 심장 기능의 대표 평균값을 얻습니다(참조 그림 4A,B). 여기서 프레임 속도는 100 frames/s, 송신 주파수는 100% 출력에서 38.4 MHz, 수신 주파수는 96 MHz, 음속은 1538 ms, 스윕 속도는 1200 Hz로 설정하였다.
  7. 약 5분 후면 동물이 너무 깨어나 심초음파 검사가 불가능해집니다. 초음파에 사용한 젤을 닦아낸 후 동물을 다시 케이지에 넣으십시오.
  8. 심장 기능을 맹검법으로 정량화하십시오.39,40이 모델에서 관련 기능 장애는 기저치보다 10% 낮은 값 및 절대값으로 정의됩니다. <심박수는 유지되는 동안 좌심실 분획 단축률(FS)의 50% >300 BPM. 전처치 전 FS 값이 너무 낮을 경우, 해당 동물을 분석에서 제외하는 것을 고려하십시오.
    참고: 4초 길이의 짧은 영상에서 각 정량 분석을 수행하려면 최소 3회의 심장 주기가 필요하며, 가능한 경우 더 많은 주기를 사용할 수 있습니다. 분석의 맹검화를 위해 모든 심초음파 검사는 동일한 실험자가 수행하고, 정량 분석은 다른 사람이 수행하는 것을 권장합니다. 심초음파의 품질 관리에 관한 권장 사항은 다른 문헌에 게시되어 있습니다.40.
  9. 통계 분석을 수행하십시오(단계 6 참조). 두 가지 요인인 시간과 처치(treatment)를 비교하므로, 전체 프로토콜에 걸쳐 두 그룹을 분석하기 위해 권장되는 검정 방법은 이원 분산 분석(two-way ANOVA)입니다.
  10. 이 작업을 매주 수행하십시오. 기능 장애는 doxorubicin 처리 후 단 1주일 만에 나타납니다.
    참고: 예를 들어 심장 바이오마커 측정을 위해 Dox 투여 후 특정 시점에 혈액 샘플링이 필요한 경우, 추가적인 마취제 주입을 방지하고 동물의 스트레스를 최소화하며 시간을 최적화하기 위해 심초음파 검사 직후에 혈액을 채취하십시오.

5. 5주 차: 희생 절차

참고: 이상적으로 이 장기 수집 프로토콜은 두 명의 인원이 함께 수행해야 합니다.

  1. 5주 차의 마지막 심초음파 검사 후, 동물에게 100 mg/kg의 케타민을 IP(복강 내)로 재투여한다. 채혈에 사용할 눈에 1% Tetracaïne 한 방울을 떨어뜨려 국소 마취를 실시한다.
  2. 헤파린 모세관을 사용하여 안와하 정맥 채혈을 수행하고, 헤파린 튜브(또는 EDTA 튜브에 EDTA 모세관 사용)에 가능한 한 많은 양의 혈액을 수집한다.
  3. 더 이상 혈액을 얻을 수 없을 때, 기관 승인 프로토콜에 따라 경추 탈구를 수행한다. 수집한 혈액은 5.5단계의 희생 프로토콜을 진행하는 동안 추가 처리 전까지 즉시 얼음에 보관한다.
  4. 혈액을 4 °C에서 2000 x g로 10분 동안 원심분리하여 혈구와 혈장을 분리한다. 혈장 튜브를 액체 질소로 급속 냉동하고 추가 분석 시까지 -80 °C에 보관한다.
  5. 흡수지가 덮인 폴리스티렌 폼 뚜껑 위에 동물을 놓은 후, 핀으로 네 다리를 고정한다.
  6. 종양은 상당한 크기(최소 2 cm)여야 한다. 종양 주변을 충분한 여유를 두고 절개하여 분리한다. 추가 절제는 5.15단계에 기술된 나머지 장기 수집 후에 수행할 수 있다.
  7. 별도의 구역에서 핀셋으로 종양을 잡고 작고 날카로운 가위로 조심스럽게 절제한다. 종양을 손상시키지 않으면서 장력을 높이려면 남은 피부를 뚜껑에 핀으로 고정한다. 이렇게 하면 절제가 더 쉬워진다.
  8. 종양이 잘 절제되면 PBS로 조심스럽게 세척하여 혈액, 털 및 기타 부착되지 않은 잔해물을 제거한다. 종양의 무게를 측정한다.
  9. 5 mL 원심분리 튜브에 22 µm 나이론 메쉬를 넣고 그 위에 종양을 조심스럽게 올린 후, 원심분리 전까지 얼음에 보관한다.
  10. 튜브를 4 °C에서 100 x g로 10분 동안 원심분리하여 간질액을 수집한다(그림 5A 참조). 얻어지는 부피는 1에서 20 µL 범위이며, 대개 붉은색을 띤다(그림 5B). 이를 200 µL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 추가 분석 시까지 -80 °C에 보관한다.
    참고: 나머지 종양은 더 작은 조각으로 잘라 보관 튜브에 넣고, 액체 질소로 급속 냉동하여 추가 분석 시까지 -80 °C에 보관할 수 있다.
  11. 골수를 수집하기 위해 가위로 오른쪽 다리를 자르고, 메스와 핀셋으로 대퇴골과 경골을 절개하여 모든 근육, 결합 조직 및 지방을 제거한다. 두 뼈의 양쪽 골단(epiphysis)을 메스로 자른다. 5.15단계에 기술된 쥐의 장기 수집을 마무리하는 동안, 세척된 뼈를 PBS가 담긴 12-웰 배양 플레이트에 넣는다.
    참고: 골수 분리에 대한 더 자세한 내용은 다른 문헌41에 게시되어 있다.
  12. 18 G 바늘로 500 µL 마이크로 원심분리 튜브 바닥을 뚫고 두 개의 뼈를 넣은 뒤, 400 µL의 PBS가 채워진 1.5 mL 원심분리 튜브 안에 해당 튜브를 넣는다.
  13. 튜브를 4 °C에서 10,000 x g로 1분 동안 원심분리한다. 1.5 mL 튜브 바닥에 세포 펠렛이 관찰되며, 이는 모두 골수 세포이고 골수 기질은 PBS에 섞여 있다. 모든 상층액(골수 기질)을 별도의 보관 튜브로 흡입하고, 재료를 액체 질소로 급속 냉동하여 -80 °C에 보관한다.
  14. 가위로 횡격막 높이의 흉부 아래를 횡단 절개하고, 흉골을 종축을 따라 절개하여 폐와 심장을 노출시킨다.
    참고: 추가 분석에 필요한 경우, 여기서 식염수를 이용한 전혈 제거를 수행할 수 있다.
  15. 생분자 및 조직학적 분석에 필요한 모든 장기를 수집한다. 장기의 무게를 측정하고 더 작은 조각으로 잘라 향후 생분자 분석이 용이하도록 한다. 장기를 작은 조각으로 자르는 즉시 모든 튜브를 액체 질소로 급속 냉동한 후 -80 °C에 보관한다.
  16. 심장의 경우, 심첨부를 심장의 윗부분과 분리하여 OCT가 채워진 플라스틱 몰드에 놓는다. OCT에 넣은 후, 액체 질소로 급속 냉동하여 -80 °C에 보관하기 전에 차가운 이소펜테인(isopentane)에 넣는다.

6. 통계 분석

참고: 모든 통계 분석 및 그래프 작성은 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며, 통계 가이드 권장 사항42을 따랐습니다.

  1. 제시된 데이터는 평균 ± SEM으로 나타낸다.
  2. 분획 단축률(fractional shortening)의 모든 그래프에 동일한 척도를 사용한다.
  3. 모든 그래프에 각 개별 실험 단위(마우스)를 표시한다.
  4. 유의 수준 alpha를 p = 0.05로 설정하여, 각 실험군의 분포 정규성을 평가하기 위해 Shapiro-Wilk 검정을 수행한다.
  5. 두 그룹 간의 비교를 위해, 분포의 정규성에 따라 Welch 검정 또는 Mann-Whitney 검정을 사용한다(두 그룹 모두 정규 분포인 경우 Welch 검정, 하나 또는 두 그룹 모두 비정규 분포인 경우 Mann-Whitney 검정). 신뢰 수준을 95%로 설정하고 양측 검정 옵션을 선택한다.
  6. 특정 시점에서 세 그룹 이상의 비교를 위해, 다시 6.4단계와 같이 그룹 분포의 정규성을 결정한다. 분포가 정규 분포인 경우, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 수행한 후 다중 비교를 위해 Holm-Sidak 보정을 실시한다.
    참고: 분포가 정규 분포가 아닌 경우, 대신 Dunn 보정을 적용한 Kruskal-Wallis 검정을 수행해야 한다. 유의성을 결정하기 위한 가족별 alpha 임계값은 0.05로 설정한다.
  7. 종단적 데이터의 경우, 특정 시점에서의 그룹 간 차이를 조사하기 위해 반복 측정 이원 분산 분석(repeated-measure two-way ANOVA)을 수행한 후 다중 비교를 위해 Sidak 보정을 사용하였다. 유의성을 결정하기 위한 가족별 alpha 임계값은 0.05로 설정한다.

결과

본 프로토콜은 다음에서 보여지는 바와 같이 그림 1A이 절차는 5주간의 프로토콜로, 결과적으로 비종양 보유 독소(dox) 미처리 마우스, 비종양 보유 독소 처리 마우스, 종양 보유 독소 미처리 마우스, 그리고 종양 보유 독소 처리 마우스의 실험군으로 나뉩니다. 양쪽 성별을 모두 사용하는지 여부에 따라 이 그룹들은 두 배로 늘어날 수 있습니다. 독소 처리를 시작하기 전, 종양 성장 초기 2주는 200,000개의 세포를 4군데에 주입한 후 종양이 성장하기에 충분한 시간입니다.th 동물의 왼쪽 유선(그림 1B종양 세포 현탁액을 조심스럽게 주입할 때 유두 아래에 기포가 나타나는 것을 확인하여 피하 주입되었음을 확인해야 합니다.그림 1C). 표 1 각 마우스 계통별 프로토콜의 주요 파라미터와 아래에서 논의할 주요 결과들을 간략히 요약합니다.

그림 2A 종양이 없는 마우스 한 마리(왼쪽)와 종양이 있는 마우스 한 마리(오른쪽)에 루시페린을 주입하고 5분 동안 광자를 수집하여 얻은 생물발광 신호의 대표 이미지입니다. 이 분석에서는 루시페린 주입 시 광자를 생성하기 위해 루시페라제 유전자를 발현하는 종양이 필요합니다. 총 33마리의 4T1Luc 세포가 주입된 Balb/c 마우스를 대상으로 11일 동안 생물발광을 관찰하였으며, 9마리를 대조군으로 사용하였습니다. 그림 2B 종양이 빠르게 성장하지만 8일 이후부터 신호 강도가 정체되기 시작함을 확인하며, 그림에 나타난 바와 같이 수컷 Balb/c 생쥐에 비해 암컷에서 종양이 초기에 더 빠르게 성장하는 것으로 보입니다. 그림 2C. Balb/c 마우스 45마리 중 단 1마리만이 5주 후 종양이 형성되지 않은 반면, C57Bl/6J 마우스는 5주 후 모두 종양이 형성되었다.그림 2D).

그림 3A  및 그림 3B Dox의 누적 용량 감소가 Dox 투여 시작 3주 후의 생존율 개선으로 이어진다는 것을 입증한다. 종양을 가진 Balb/c 마우스의 경우 24 mg/kg에서는 생존한 개체가 없었으나, 16 mg/kg에서는 50%가 생존하였다. 반면, 종양을 가진 C57Bl/6J 마우스는 Dox 24 mg/kg 투여 시에도 더 강한 저항성을 보였는데, 이는 >그들 중 80%가 화학요법 시작 3주 후까지 생존합니다 (그림 3D). 성별은 결과에 중요한 영향을 미쳤습니다. Balb/c 생쥐의 경우 암컷이 수컷보다 훨씬 더 높은 생존율을 보였습니다(암컷 29마리 중 16마리가 생존한 반면, 수컷은 16마리 중 3마리만 생존함). 그림 3C Dox 16 mg/kg을 투여받은 Balb/c 생쥐의 성별 차이를 보여줍니다(수컷의 개체 수가 적어 통계적 검정을 수행하지 않았습니다). C57Bl/6J 생쥐의 경우, 두 성별 간의 생존율에 통계적으로 유의미한 차이가 없었습니다(참조 그림 3E).

Dox 처리 전 심초음파로 평가한 건강한 마우스의 심장 기능 대표 이미지는 그림 4A에, Dox 처리 후 심기능 장애가 있는 마우스의 이미지는 그림 4B에 나타나 있다. 24 mg/kg의 Dox를 처리한 종양 보유 C57Bl/6J 마우스 17마리에서 M-모드로 정량화한 FS는 2주 후 유의미한 감소를 보였다(Dox 처리 전 59.3% vs 처리 후 44.3%, p < 0.0001, 그림 4C). 생존한 마우스 12마리 중 단 1마리(8%)만이 사전 정의된 심독성 기준을 충족하지 않았다. 심박수는 Dox 처리 전 623 BPM에서 처리 후 569 BPM으로 약간이지만 유의미하게 감소했다(p < 0.05, 그림 4D). M-모드로 정량화한 모든 파라미터는 보충 표 3에서 확인할 수 있다.

Doxorubicin의 심독성 효과 확인은 거시적 및 미세적 분석을 통해 이루어집니다. 그림 6A,B는 종양을 가진 소수의 생존한 암컷 Balb/c 마우스에서 Dox 처리 후 절대 심장 무게가 유의하게 감소했음을 보여주나, 총 체중 대비 심장 무게를 정규화했을 때는 경향성만 나타납니다. 종양이 없는 C57Bl/6 마우스를 대상으로 한 실험에서, Dox 투여 시작 1주 후 24 mg/kg의 Dox는 다음과 같은 유전자들의 심장 mRNA에서 예상되는 변화를 유도했습니다: 위축을 유도하는 Atrogin과 Murf1의 증가, 산화적 스트레스를 유도하는 NQO1의 증가, 그리고 세포사멸 촉진 상황을 유도하는 Bax의 증가가 나타났습니다(그림 6C–F).

그림 5A는 종양 간질액 프로토콜의 모식도입니다. 수집된 액체의 대표 이미지는 그림 5B에 나와 있으며, 얻어진 부피는 매우 적습니다.

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그림 1: 실험 프로토콜의 대표 예시도. (A) 실험 프로토콜의 개략도. BioRender(라이선스 번호 JE29USE7LU)로 제작됨. (B) 피하 종양 접종의 개략도. BioRender(라이선스 번호 SO29JHW7R6)로 제작됨. (C) 성공적인 피하 종양 이식의 개략도. BioRender(라이선스 번호 SO29JHW7R6)로 제작됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 생물 발광 영상 및 종양 이식률. (A) 대조군 마우스(왼쪽)와 종양 유도 마우스(오른쪽)의 대표적인 생물 발광 영상. (B) 시간에 따른 생물 발광 신호(평균 ± SEM; 반복 측정 이원 분산 분석 [ANOVA]; *P < 0.05). (C) 수컷 및 암컷 Balb/c 마우스 간의 생물 발광 신호 비교(평균 ± SEM). (D) 두 마우스 계통의 종양 이식 성공률. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 종양 이식 마우스의 생존 분석. (A) 24 mg/kg doxorubicin (Dox)을 투여한 Balb/c 마우스의 Kaplan–Meier 생존 곡선. (B) 16 mg/kg Dox를 투여한 Balb/c 마우스의 Kaplan–Meier 생존 곡선. (C) 16 mg/kg Dox를 투여한 수컷 및 암컷 Balb/c 마우스의 Kaplan–Meier 생존 곡선 비교. 수컷 마우스의 수가 제한적이었으므로 통계 분석은 수행되지 않았다. (D) 24 mg/kg Dox를 투여한 C57BL/6J 마우스의 Kaplan–Meier 생존 곡선. (E) 24 mg/kg Dox를 투여한 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스의 Kaplan–Meier 생존 곡선 비교 (log-rank test, P = 0.86). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 독소루비신 유발 심독성의 심초음파 평가. (A) 건강한 마우스의 대표적인 M-모드 심초음파 영상. (B) 독소루비신으로 유발된 심독성이 있는 마우스의 대표적인 M-모드 심초음파 영상. (C) 독소루비신 처리 전과 처리 14일 후 C57BL/6J 마우스의 분획 단축률(FS). (D) 독소루비신 처리 전과 처리 14일 후 C57BL/6J 마우스의 심박수(HR). 데이터는 n = 17 마우스를 대상으로 나타냈다. 통계적 비교는 Welch's t-test를 사용하여 수행되었다. *P < 0.05; ****P ≤ 0.0001. 약어: FS, 분획 단축률; HR, 심박수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 장기 샘플링 프로토콜. (A) 종양 간질액 수집 프로토콜의 모식도. BioRender(라이선스 번호 HV29USD91R)로 제작됨. (B) 장기 샘플링 중 종양 간질액 수집 과정을 보여주는 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: Doxorubicin으로 유도된 심장 독성. (A) 종양을 가진 Balb/c 마우스에 16 mg/kg의 doxorubicin 투여를 시작한 3주 후 측정한 심장 무게. (B) 종양을 가진 Balb/c 마우스에 16 mg/kg의 doxorubicin 투여를 시작한 3주 후 측정한 전체 체중 대비 표준화된 심장 무게. (C) 24 mg/kg의 doxorubicin 투여를 시작한 1주 후 C57BL/6J 마우스 심근의 Atrogin mRNA 발현. (D) 24 mg/kg의 doxorubicin 투여를 시작한 1주 후 C57BL/6J 마우스 심근의 Murf1 mRNA 발현. (E) 24 mg/kg의 doxorubicin 투여를 시작한 1주 후 C57BL/6J 마우스 심근의 NQO1 mRNA 발현. (F) 24 mg/kg의 doxorubicin 투여를 시작한 1주 후 C57BL/6J 마우스 심근의 BAX mRNA 발현. 통계 분석은 데이터 분포에 따라 Welch's t-test 또는 Mann–Whitney U test를 사용하여 수행되었다. ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

마우스 계통Balb/cC57Bl/6J
사용된 세포주4T1LucPY8119
주입된 세포 수200 000200 000
사용된 성별수컷 및 암컷수컷 및 암컷
주입 일수46
일일 용량4 mg/kg4 mg/kg
Doxorubicin 누적 용량16 mg/kg24 mg/kg
Ketamine 용량40 mg/kg80 mg/kg
심독성 발생률>90%>90%
생존율19/4516/19

표 1: 각 마우스 계통별 주요 프로토콜 매개변수. Balb/c 및 C57BL/6J 마우스 프로토콜에 사용된 주요 실험 변수 및 시약 농도의 비교.

보충 표 1: 동물 복지 종료점. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 4T1 실험 프로토콜의 문헌 개요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 3: 24 mg/kg의 doxorubicin을 투여한 종양 이식 C57BL/6J 생쥐 17마리에서 M-mode로 측정한 심초음파 파라미터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구에서는 유방암 모델 마우스에서 doxorubicin으로 유도된 심독성 모델을 개발하였으며, 이는 향후 심장종양학(cardio-oncology) 연구에 있어 임상적 관련성이 매우 높을 것으로 판단됩니다. 본 모델의 목적은 암 진단 후 병원에 내원하여 심독성 가능성이 있는 화학요법 치료를 받기까지의 환자 경로라는 임상적 상황을 모사하는 것이었습니다. 해당 프로토콜은 실용적인 설계를 따르며 전 세계적으로 입수가 가능한 면역 유능 마우스를 사용하므로, 다른 연구팀이 다른 실험실에서도 이를 재현할 수 있습니다. 또한, 종양 이식 성공률이 높아 향후 심장종양 독성 연구의 강력한 후보 모델이 될 것입니다.

이 프로토콜의 일반적인 주의사항으로는 심박수가 낮은 마우스에게 심초음파 검사를 수행하는 것이 있으며, 이는 분획 단축률(FS)을 인위적으로 낮게 측정하는 결과로 이어질 수 있습니다. 심초음파 평가 전, 마취제로 인한 초기 음성 변시 효과(negative chronotropic effects)로부터 마우스가 회복되도록 기다리면 정확한 FS 측정을 보장하는 데 도움이 됩니다. Balb/c 마우스의 경우, 사망률이 계속 높게 나타난다면 마취제 용량을 추가로 줄여야 할 수 있습니다. 관찰자 간 편차가 클 수 있으므로, 연구 전 기간 동안 동일한 실험자가 모든 심초음파 평가를 수행해야 합니다43. 종양 이식 시, 주입 중 주사기를 너무 빨리 빼면 선형 모양의 종양이 형성될 수 있으며, 이는 적절한 주입으로 생성된 종양보다 더 크게 자랄 수 있습니다. 또한, 상복부 유두에 배치할 경우 종양 발달 후기 단계에서 심초음파 평가를 방해할 수 있으므로 정확한 유두에 주입하는 것이 매우 중요합니다. 각 마우스가 유사한 수의 세포를 전달받아 프로토콜 종료 시 종양 크기의 편차를 최소화하기 위해서는, 현탁액 내 세포 수를 수동으로 계수하고 주입 전 충분히 혼합하는 것이 권장됩니다. 매주 혈액 샘플링이 필요한 경우, doxorubicin 처리 후 마우스의 상태가 더 취약해지므로 채혈량을 신중하게 조절해야 합니다. 더 많은 양의 혈액을 채취하면 프로토콜 진행 중 사망률이 증가할 수 있으므로, 각 샘플링 시점당 최대 총 혈액량을 50 µL로 유지하는 것이 권장됩니다. 혈액 채취 빈도와 양은 지역 동물 윤리 요건 및 기관 동물 시설 가이드라인을 준수해야 합니다. 채혈 후 체액 손실을 보완하기 위해 채취한 혈액량과 동일한 양의 식염수를 피하 주사하여 보충하는 것이 도움이 될 수 있습니다.

이 dox-절차를 비교하기 위해, AIC 동물 모델에 관한 최근 발표된 리뷰에서는 대부분의 전임상 모델(88%)이 Dox의 반복 투여를 사용하고 몇 주 후(주로 심초음파를 통해) 결과 측정물을 관찰했음을 확인하였다29. 대부분의 논문은 아마도 내구성이 강하고 비용이 저렴하다는 점 때문에 C57Bl/6J 계통(73.8%)을 사용했다고 보고하였다29. 안타깝게도 상당수의 연구가 ACs를 투여하기 전 종양이 동물의 생물학적 특성에 미치는 영향을 간과하였다17,29. 736개의 연구 중 단 46개만이 종양 유발 모델을 보고하였으며, 그중 12개는 Balb/c 마우스에서 4T1 세포주(삼중음성 유사 유방암)를 사용하였고, 단 하나만이 C57Bl/6J 마우스의 유방암 모델(구체적으로 EGFR2 양성 유사 유방암)이었다29. 또 다른 연구에서는 EGFR-2 양성 유사 유방암이 있는 C57Bl/6J를 사용하였으나, 화학요법 시작 전 종양 성장을 유도하지 않아 이 모델의 중개 연구적 측면이 제한되었다32.

면역결핍 마우스를 이용한 이종이식 모델은 인간 종양 세포주의 사용이 가능하지만, 기능적인 면역 체계가 부족하여 면역 매개 심독성 기전 연구에 제한이 있으며, 이는 면역 관문 억제제 관련 심독성의 중요성이 증가하고 있는 상황에서 주요한 한계점이 됩니다. 심장종양학 분야에서 대동물 모델이 등장하고 있으나, 높은 비용과 제한적인 유전자 조작 능력이라는 단점이 항상 수반됩니다44. In vitro 및 2D/3D 인간 세포 기반 시스템(예: 인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 오가노이드)은 고속 기전 및 독성 스크리닝을 가능하게 하지만, in vivo 모델에서 구현되는 통합적인 전신 생리학적 특성(혈역학, 신경호르몬 조절, 면역 상호작용)을 재현할 수 없습니다. 이러한 접근 방식들과 비교하여, 본 동종, 면역능이 있는 종양 보유 모델은 생물학적 변동성이 더 크고 일부 계통에서 사망률이 높으며, 단순한 in vitro 또는 비종양 보유 in vivo 모델보다 처리량이 낮다는 단점이 있으나, 종양 부담과 화학요법 유도 심독성 사이의 상호작용을 연구하는 데 있어 보다 임상적으로 유의미한 맥락을 제공합니다.

지금까지 주로 사용된 비종양 보유 AC 심독성 모델은 재현성이 높고 비용이 저렴하며, 심초음파 및 생존율 평가가 용이하다는 장점이 있습니다. 하지만 환자의 심독성 평가에서 점차 중요한 혼란 변수로 인식되고 있는 종양 부담, 암 관련 염증 및 악액질이 심장에 미치는 전신적 영향을 포착하지 못한다는 한계가 있습니다17,45. 더욱이, 심장의 대사 재프로그래밍과 그에 따른 수축 기능은 D-2-hydroxyglutarate 또는 succinate와 같은 분비성 온코메타볼라이트(oncometabolites)에 의해 변화될 수 있습니다14. 따라서 다양한 오믹스(예: 단백질체학 및 대사체학)를 이용한 심장 생화학 분석을 위해 심장 종양학 모델을 구축하려면 화학요법 전 종양의 존재가 필수적입니다. 또한 종양 자체가 뚜렷한 심기능 장애를 유발할 수 있다는 일부 증거가 있으나, 이는 문헌마다 일관되지 않습니다. 일부 모델에서는 종양 접종이 FS 또는 전기 전도 파라미터에 해로운 영향을 미치는 것으로 나타났지만, 다른 모델에서는 종양의 존재가 횡대동맥 협착으로 유도된 리모델링으로부터 마우스를 보호한다는 결과가 보고되었습니다11,13,46. 한편, 사전 가설에 따라 비종양 보유 동물 또한 필요합니다. 이러한 모델은 화학요법제의 직접적인 심독성 효과를 종양 자체의 혼란스러운 영향으로부터 분리할 수 있는 유일한 설정이며, 이는 인과 관계를 설정하고 약물 특이적인 작용 기전을 규명하는 데 필수적인 전제 조건입니다. 이 동물들은 항암 치료 효과 및 그것이 종양과 상호작용하여 나타내는 심독성에 대한 대조군 역할을 하게 됩니다. 이러한 비교군이 없다면, 관찰된 심장 표현형의 어떤 성분이 약물, 종양 또는 이들의 상호작용에 의한 것인지 구분하는 것이 불가능할 것입니다. 이러한 구분은 기전적 이해뿐만 아니라 합리적인 심장 보호 전략을 설계하는 데에도 매우 중요합니다. 따라서 이러한 각각의 모델이 서로 다르고 상호 보완적인 과학적 질문을 다루고 있으며, 어느 한 모델만으로는 임상 심장 종양학의 복잡성을 완전히 재현하기에 충분하지 않다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 견고한 기전적 및 중개적 결론을 도출하기 위해서는 종종 두 모델의 병용 또는 순차적 사용이 요구됩니다.

본 프로토콜에서 심독성은 2022 ESC 심혈관 종양학 가이드라인(2022 ESC Guidelines in Cardio-oncology)에 따라 정의하였으며, 해당 가이드라인에서는 중등도의 무증상 암 치료 관련 심기능 저하를 좌심실 박출률(LVEF)의 감소로 정의합니다. >LVEF가 40%에서 49% 사이인 10%16하지만 정확한 LVEF 정량화를 위해서는 초음파 장비의 3D 모듈이 필요합니다.39수축기 심장 기능의 잘못된 평가를 방지하고, 구형 초음파 기기를 사용하는 실험실에서도 적용 가능한 간단한 프로토콜을 유지하기 위해, 심기능 장애의 지표로 FS(단축 단축률)를 사용하는 것이 선호되었습니다. FS는 ESC(유럽심장학회)에서 규정한 것과 동일한 기준을 적용하여 생쥐의 M-모드 분석을 통해 정확하고 쉽게 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 생존한 생쥐의 90%가 심독성 기준을 충족하므로, 향후 중개 연구를 위한 강력한 후보 모델이 될 수 있습니다. Dox의 심독성 효과는 Balb/c 생쥐의 육안적 평가(심장 무게 감소)를 통해 확인되었습니다. 여기에는 C57Bl/6 생쥐의 종양 단독 투여군이 포함되지 않았으며, 따라서 해당 계통에서의 비교 결과는 아직 제공되지 않습니다. 또한, 종양을 이식하지 않은 C57Bl/6 생쥐에서 Dox 용량은 위축 증가, 산화 스트레스 및 세포 사멸과 같이 안트라사이클린 심독성 기전에 관한 기존 문헌과 일치하는 변화를 유도했습니다.19,20.

하지만 speckle-tracking global longitudinal strain (GLS)과 같이 환자에게 사용되는 더 현대적인 변수들은 기술적인 이유로 여기에서 정량화되지 않았습니다. GLS는 일반적으로 초기 심장 손상을 감지하는 데 더 민감한 것으로 간주되므로, 지역적으로 실행 가능하다면 이를 정량화하는 것이 추가적인 가치가 있을 것입니다23. 심장 독성 검출의 확실성을 높이기 위해 troponin과 같은 순환 심장 바이오마커를 평가할 수도 있지만, 마우스의 낮은 총 혈액량으로 인해 이러한 분석에 전통적으로 요구되는 혈장 양이 제한 요인이 될 수 있습니다. 또한, Dox 처리 후 이 동물들의 쇠약함으로 인해 혈액 채취 중 또는 후에 사망률이 증가할 수 있습니다. 마지막 제한 요인은 이러한 바이오마커에 대한 분석법의 민감도로, 이는 종종 해석을 어렵게 만들 수 있습니다.

숙련된 동일한 실험자가 모든 초음파 획득을 수행했음에도 불구하고, 처리를 하지 않은 동일한 Balb/c 마우스에서 주 단위의 높은 변동성이 관찰되었습니다. 이는 해당 계통의 케타민 마취에 대한 민감성으로 설명될 수 있습니다47. 실제로 마취 하에 진행되는 시술 중 높은 사망률이 나타나 프로토콜 종료 시점까지 도달하는 동물 수가 적은 것이 초기에 관찰되었으며, 이에 따라 Balb/c 마우스에 사용되는 케타민 용량을 80 mg/kg에서 40 mg/kg로 줄였습니다. Dox를 투여한 Balb/c의 생존 그래프를 살펴보면, 마취 시점(주간 심초음파 검사)에서 일부 사망이 발생하지만, 대부분의 사망은 활성 시술 없이 동물 사육 시설에서 발생하며, 이는 Dox가 해당 마우스 사망의 주된 요인임을 강조합니다. 그럼에도 불구하고, 두 가지 이상의 계통을 비교할 때 이 모델의 생존 그래프를 해석하면서 마취 관련 사망을 염두에 두는 것이 중요합니다. 마취 관련 치사 위험을 줄이기 위해 의식 상태의 마우스에서 심초음파 검사를 수행할 수도 있지만, 이는 마우스를 프로토콜에 포함시키기 전의 훈련과 순화 과정이 필요합니다. Dox의 경우, 감량된 용량에서도 Balb/c 마우스의 거의 절반이 프로토콜 종료 시점까지 도달하지 못했습니다. 더 낮은 용량의 Dox로 심독성 유도를 시도할 수 있으나, 이 경우 심독성 기준을 충족하는 동물의 수가 줄어들 위험이 있습니다. 또 다른 전략으로는 각 Dox 주사 후 동물이 회복할 수 있는 시간을 더 많이 부여하는 방법이 있으며, 본 연구에서는 수행되지 않았으나 문헌상에서 생존율 개선의 근거가 보고된 바 있습니다29.

이 모델을 구축하면서 관찰된 결과, 즉 Balb/c 마우스가 C57Bl/6J 마우스보다 Dox에 더 민감하고 암컷이 수컷보다 Dox에 더 저항성이 있다는 점은 이전 문헌29과 일치합니다. 또한, 두 마우스 계통 모두에서 얻은 유사하고 재현 가능한 결과는 제안된 이 모델의 견고함을 더욱 입증합니다. 짧은 기간 동안 적당히 높은 일일 용량을 통해 높은 누적 용량에 도달함으로써, 높은 생존율과 함께 높은 심장 독성률을 얻었습니다. C57Bl/6J에서 유방암 모델(PY8119는 삼중음성 유사 유방암임)을 구축하는 것은 이 마우스들이 형질전환 모델의 주요 유전적 배경 중 하나를 대표하므로34 향후 연구에 매우 유용할 것입니다. 선택한 주입 방법의 효율성을 뒷받침하는 종양 접종의 높은 성공률 또한 이 모델의 유망한 점입니다. 또한, 이 마우스들의 높은 Dox 내성은 이차암 또는 전이라는 빈번한 임상 상황을 모방하기 위해 Dox 재투여를 통한 더 장기적인 연구의 가능성을 열어줍니다. 마지막으로, 장기 샘플링 프로토콜을 통해 모든 고형 장기, 종양 및 그 간질액, 그리고 골수와 그 기질을 수집할 수 있어 매우 철저한 모델 분석이 가능합니다.

이 모델에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 실용적인 설계와 침습적 수술을 피하기 위해 피하 주사를 사용하므로, 종양의 정확한 위치(즉, 피하 지방이 아닌 정확한 유선)를 정밀하게 제어할 수 없으며, 이는 연구되는 과학적 질문에 따라 매우 중요할 수 있습니다48. 정확한 암 부위 주사가 필요한 경우, 정위 주사를 수행하기 위해 더 광범위한 수술이 더 적합할 수 있습니다. 다만 주사 방법과 관계없이 부피, 잠복기 및 발생률 결과가 비슷하므로, 이는 주로 종양 생화학 분석이 계획된 경우에만 진정으로 중요할 것으로 보입니다48. 또한 AC 단독 사용이 환자들이 종종 cyclophosphamide 또는 cisplatin과 같은 병용 요법을 받는 임상 상황과 완벽하게 일치하지 않는다는 주장이 있을 수 있습니다. 이는 실제로 이 프로토콜의 다음 설계 방향이 될 수 있으나, 사용되는 각 화학요법 제제에 대한 용량 조절이 신중하게 이루어져야 합니다. 더욱이, Dox 처리 시작 3주 후 Balb/c 마우스에서 50% 이상의 사망률이 나타나는 것은 여전히 매우 높은 수치입니다. 용량을 줄이면 생존율을 높일 수 있으나, 심독성이 덜 뚜렷해지는 대가가 따를 수 있습니다. 또한, 이 모델에서 사용된 용량은 오늘날 인간에게 일반적으로 사용되는 용량보다 높다는 점에 유의해야 하며, 이는 이 모델의 중개 연구 잠재력을 제한할 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 본 원고와 관련하여 이해 상충이 없음을 밝힙니다.

감사의 글

동물의 복지를 매일 모니터링하는 데 도움을 주신 동물실 팀에 감사드립니다. 동물 실험 프로토콜 구축을 도와주신 Léanne Borges, Elias Ait Assa, Clémence Chabaud 씨에게 감사드립니다. PY8119 세포를 제공해주신 INSERM Unit 932의 Dr Julie Helft께 감사드립니다. 생물 발광 연구에 도움을 주신 Dr Sylvain Provost와 그의 학생 Mel Gavens 씨에게 특별한 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4T1Luc 세포ATCCCRL-2539
Doxorubicin 분말Cliniscience23214-92-8
심초음파 측정기Visual SonicsVEVO LT-200
LuciferinPerkin Elmer E1605
나일론 메쉬MerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
PY8119 세포Dr Julie Helft 제공

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