레이저 스펙클 대비 영상을 이용한 인간 피부 미세순환에서 전신 미세혈관 기능 평가 표준화 프로토콜

Summary

이 프로토콜은 임상 연구 환경에서 레이저 스펙클 대조 영상과 약리학적 이온토포레시스 및 생리학적 자극을 결합하여 인간 피부 미세혈관 기능의 전신 미세혈관 기능을 평가하는 표준화된 비침습적 방법을 설명합니다.

Abstract

레이저 스펙클 대비 영상(LSCI)은 미세혈관 혈액 관류의 실시간 전면 시각화를 가능하게 하는 고해상도 비침습적 광학 기법입니다. 이 프로토콜은 LSCI를 사용하여 인간 피부 미세순환에서 전신 미세혈관 기능을 평가하는 표준화된 방법론을 제시합니다. 이 기법으로 얻은 측정값은 환경 및 생리학적 교란 요인에 매우 민감하기 때문에, 프로토콜은 재현성과 실험 신뢰성을 높이기 위해 엄격한 표준화 절차를 강조합니다. 프로토콜은 23°C ± 1°C에서의 실내 온도 안정화, 참가자 위치 조정, 적응 절차, 이미지 획득 중 외부 간섭 최소화 등 필수 환경 제어 사항을 상세히 설명합니다. 이 방법론은 LSCI와 두 가지 상호 보완적인 자극적 기법을 결합하여 피부 미세혈관 반응성을 평가합니다. 폐쇄성 반응성 고혈증은 통합 미세혈관 반응성 평가에 사용되며, 이온토포레시스에 의해 촉진된 약리학적 도전은 내피 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 구체적으로, 내피 의존성 혈관 확장을 평가하기 위해 아세틸콜린을, 내피 독립적 혈관 확장을 평가하기 위해 나트륨 니트로프루사이드를 투여합니다. 이 단계별 시각화 프로토콜은 임상 및 중개 연구 환경에서 표준화된 LSCI 방법론 도입을 촉진하기 위해 설계되었습니다. 이 접근법은 저항성 고혈압, 당뇨병, 관상동맥 질환 등 여러 임상 상태에서 미세혈관 손상을 성공적으로 식별하는 데 적용되었습니다. 미세혈관 반응성의 재현 가능하고 비침습적인 평가를 가능하게 함으로써, 이 방법론은 전신 혈관 건강을 조사하고 질병 진행을 모니터링하며 미세혈관을 표적으로 한 중재의 효능을 평가하는 데 귀중한 도구를 제공합니다.

Introduction

이 프로토콜의 주요 목표는 레이저 스펙클 대비 영상(LSCI)과 생리학적 및 약리학적 자극 기법을 결합하여 전신 미세혈관 기능과 반응성을 평가하는 표준화되고 재현 가능한 방법론을 제공하는 것입니다. 미세순환은 직경이 약 100 μm 미만인 말단 혈관—동맥, 모세혈관, 정맥으로 구성되며,¹은 대사 교환의 주요 부위이자 말초 혈관 저항의 중요한 결정 요인입니다^. 이 작은 혈관의 내피 기능 장애는 종종 대혈관 변화에 앞서 나타나며, 고혈압, 당뇨병, 관상^{동맥 질환 등} 심혈관 질환의 초기 바이오마커 역할을 합니다. 중요하게도, 미세혈관 손상은 말단 장기 손상에 크게 기여하지만, 다인성 질환 과정 내에서 대혈관 죽상동맥경화증 및 전신 만성 염증과 함께 작용합니다. 따라서 미세혈관 반응성에 대한 비침습적 평가는 중^{개 연구에서} 조기 진단과 치료 효능 모니터링에 필수적입니다.

피부 미세순환을 전신 혈관 건강의 대리체로 사용하는 이유는 접근성이 높고 전신 내피 기능을 대표하는 창으로서의 역할 때문입니다 ^5,6. 전통적으로 레이저 도플러 유량계(LDF)는 비침습적 피부 평가의 금본위로 여겨져 왔습니다^. 그러나 LDF는 피부 관류의 고유한 이질성에 매우 민감한 점별 측정을 제공하기 때문에 공간 해상도가 낮아 한계가^{있습니다.} 반면, LSCI는 조직 관류의 전면, 실시간 시각화를 제공하며 높은 시간 및 공간 해상도를 제공합니다^. 레이저 광 산란에 의해 생성된 간섭 패턴을 분석함으로써, LSCI는 물리적 접촉이나 외부 염료 없이 여러 혈관 영역을 동시에 평가할 수 있게 합니다^10,11.

더 넓은 문헌 내에서, LSCI와 이온토포레시스 기반 약리학적 자극(예: 아세틸콜린(ACh)과 나트륨 니트로프루사이드(SNP)의 통합은 내피 의존성 및 내피 독립적 혈관 확장 경로를 평가하는 견고한 접근법으로 검증되었습니다^12,13. 더 나아가, 폐쇄성 반응성 고혈증(PORH)은 내피 매개체, 신경 발생성 감각 신경, 혈관 평활근 기능을 포함하는 미세혈관 반응성의 통합적 평가를 제공합니다¹². 장점에도 불구하고, LSCI는 환경 및 생리학적 변동성에 매우 민감하기 때문에 엄격한 표준화 절차가 필요합니다. 이 프로토콜은 23°C ± 1°C에서의 상온 안정화와 참가자 위치 표준화 등 중요한 환경 제어 조치를 상세히 설명하여 피험자 내 및 피험자 간 재현성을 개선합니다¹⁰. 이 방법론은 다양한 환자 집단에서 미세혈관 병태생리를 연구하기 위해 방법론적으로 기반을 두고 비침습적인 접근법을 찾는 임상 및 중개 연구자들에게 적합합니다.

Protocol

인간 참여자가 포함된 모든 절차는 브라질 보건부 산하 국립심장학연구소의 윤리 기준에 따라 수행되었으며, 국가 규정(국가 연구 윤리 위원회 – 2024년 5월 법률 제14,874호에 따른 법률 제14,874호 기준)과 헬싱키 선언(2024년 개정)을 준수하였습니다.

1. 참가자 준비 및 환경 관리

1. 검사 환경을 안정화하세요
   1. 전용 온도 조절기를 사용해 검사실 온도(RT; 23°C ± 1°C)를 안정화하여 안정적인 열 환경을 유지하세요.
   2. 보정된 디지털 체온계(정확도 ±0.1°C)를 사용해 10분마다 RT를 모니터링하세요.
      참고: 피부 미세혈관 기능은 온도 변화에 매우 민감합니다.
2. 평가 전에 참가자를 준비시키세요
   1. 평가 전 24시간 동안 흡연, 카페인 또는 알코올 섭취, 격렬한 운동을 자제할 것을 지시합니다.
   2. 평가 전 최소 2시간 동안 금식하며 물을 섭취할 수 있도록 지시하세요.
      참고: 카페인 섭취와 격렬한 운동 절제는 피부 혈관 긴장도에 대한 외부 간섭을 최소화합니다. 카페인은 아데노신 수용체 길항제로서, 운동은 교감신경 자극과 체온 조절에 영향을 미쳐 노출 후 몇 시간 동안 지속되는 미세혈관 반응성 변화를 유발할 수 있습니다 ^4,14.
3. 참가자를 이미지 획득을 위해 위치 조정하세요
   1. 참가자의 비우세 팔을 심장 높이에 위치시키고, 바디 쿠션을 사용해 팔뚝을 수평으로 안정적으로 유지하세요.
   2. 팔뚝 복측 면을 평가 부위로 사용하세요.
      참고: 비우세 팔뚝은 일상 활동과 관련된 측측화된 혈관 재형성의 영향을 최소화합니다. 복측 전완은 낮은 모발 밀도와 피부 두께 감소 등 광학 영상에 유리한 해부학적 특성을 제공하여 신호 인위를 최소화하고 이온토포레틱 약물 전달의 재현성을 향상시킵니다.
4. 심혈관 안정화 허용
   1. 미세혈관 기록을 시작하기 전에 최소 20분간 휴식 상태를 유지하세요.
   2. 휴식 시간 동안 참가자가 말하거나 평가된 팔다리를 움직이거나 전자기기 사용을 제한하세요.
      참고: 안정화 기간은 기저선 획득 전 자율신경 및 심혈관 변동을 최소화합니다.
5. 모션 아티팩트 최소화
   1. 참가자의 비우세 팔뚝을 진공 쿠션 시스템에 올려놓습니다.
   2. 이미지 획득 내내 복측 팔뚝 표면이 안정적인 수평 위치를 유지하도록 쿠션을 조절하세요.
6. 피부 표면을 준비하세요
   1. 모든 치수를 측정할 때 모발이 보이지 않는 피부 부위를 선택하세요.
   2. 필요하다면 평가 24시간 전에 수술용 클리퍼로 머리를 제거하세요.
      주의: 피부 자극이 미세혈관 측정에 방해가 될 수 있으므로 면도기를 제모에 사용하지 마세요.
7. 동맥 혈압 측정
   1. 참가자의 팔 둘레에 따라 커프 크기를 선택하세요.
   2. 보정된 자동 오실로미터 장치를 사용하여 측정 간격 1분을 두고 세 차례 연속 혈압 측정을 수행합니다.
   3. 첫 번째 측정값을 버리고 마지막 두 측정값의 평균을 계산하여 ESC/ESH 및 AHA 심혈관 가이드라인에 따라 평균 동맥압(MAP)을 산출합니다.

2. LSCI 시스템 설정 및 소프트웨어 구성

1. LSCI 시스템 준비
   1. 레이저 광원의 안정화를 위해 이미지 획득 최소 10분 전에 LSCI 시스템을 켜야 합니다.
   2. 녹화를 시작하기 전에 소프트웨어 상태 표시기로 레이저 안정화를 확인하세요.
2. 레이저 헤드 위치
   1. 레이저 헤드를 참가자의 팔뚝 바로 위에 위치시킵니다.
   2. 제조사에서 제공한 거리 측정 도구를 사용해 레이저 헤드를 피부 표면에서 정확히 15cm 거리로 조정하세요 (그림 1A)
      참고: 고정된 촬영 거리를 유지하면 최적의 이미지 초점과 참가자 간 일관된 시야각을 확보할 수 있습니다.
3. 획득 소프트웨어 구성
   1. 이미지 획득 소프트웨어를 실행하고 새로운 연구 파일을 생성하세요.
   2. 참가자의 인구통계 정보와 이전에 계산된 MAP를 입력하세요.
      참고: 필요한 경우 상세한 소프트웨어 작동 지침과 대표적인 스크린샷을 보조 자료로 포함하세요.
4. 획득 매개변수를 설정하세요
   1. 획득 샘플링 속도를 1 이미지/초(1 Hz)로 설정하세요.
   2. 목표 획득 영역의 공간 해상도를 약 0.1 mm/픽셀로 조정하세요.
      참고: 1 Hz의 샘플링 속도는 시간적 해상도와 신호 대 잡음비 사이의 적절한 균형을 제공하며, 초흡기 및 약리학적 반응 역학을 적절히 포착합니다.
5. 주변 광 간섭 최소화
   1. 이미지 획득 전에 시스템 요구사항에 따라 배경 잡음 검사 또는 다크 프레임 뺄셈을 수행합니다.
   2. 다크 프레임 뺄셈이 불가능할 때는 모든 녹화 시 방 조명을 어둡게 하고 암막 커튼을 사용해 외부 햇빛을 차단하세요.
      참고: 표준화된 주변 조명은 광학 간섭을 최소화하고 신호 재현성을 향상시킵니다.
6. 관심 영역(ROI) 정의
   1. 획득 소프트웨어 내 실시간 미리보기 화면에서 약 80 mm² 크기의 최소 세 개의 원형 ROI를 생성하세요.
   2. 이온토포레시스 전극 부위 위에 두 개의 ROI를, PORH 평가 부위에 한 개의 ROI를 배치합니다.
   3. 모든 ROI는 안두굴 전부 약 5cm 떨어진 복측 전완에 위치시키고, 겉으로 보이는 정맥은 피하세요.
      참고: ROI 영역을 표준화하면 피부 관류에서 공간적 이질성의 영향을 최소화하고 약물 전달 챔버와 관련된 가장자리 인공물을 줄입니다.
7. 기준선 관류 기록을 확보하세요
   1. 혈관 자극 전 5분 동안 안정 시 피부 혈류 기록을 계속 하세요.
   2. 실시간 관류 신호를 모니터링하고 기초 획득 시 운동에 의한 급증이 없음을 확인하세요.
   3. 기준선 안정성을 2분 간격 동안 관류 신호 변동이 <10%로 정의합니다.
8. 피부 혈관 전도도(CVC) 분석 가능
   1. 참가자의 MAP를 습득 소프트웨어에 입력하세요.
   2. 소프트웨어 설정에서 CVC 자동 계산을 활성화하세요.
9. 관류 및 전도 데이터를 기록하세요
   1. 소프트웨어를 설정하여 실시간 관류 값(APU)을 MAP로 나누어 CVC를 자동으로 계산하도록 설정하세요.
   2. 프로토콜 전반에 걸쳐 원시 관류 단위(PU)와 계산된 CVC 값을 동시에 기록하세요.
      
      참고: 미세혈관 관류를 CVC로 표현하면 전신 혈압 변동의 혼란 영향을 최소화하고, 서로 다른 혈역학적 프로필을 가진 참가자 간 비교가 더 신뢰할 수 있습니다.

그림 1. 레이저 스펙클 대비 영상(LSCI)과 이온토포레시스를 결합한 피부 미세혈관 관류 평가를 위한 실험적 설정. (A) 레이저 스펙클 조영 영상 및 혈관 확장제의 이온토포레시스를 이용한 피부 미세혈관 평가에 사용되는 대표적인 실험 장치. (B) 아세틸콜린(ACh)의 누적 용량을 경피 이온토오레틱으로 전달하는 동안의 대표적인 미세혈관 관류 반응. (C) ACh 이온토포레시스의 대표 이미지. (D) 차량 내 제어 전극의 대표 이미지. 라벨은 다음 부품을 나타냅니다: (1) 이미저 헤드; (2) 이온토포레시스 약물 전달 전극; 그리고 (3) 분산 전극. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 이온토포레시스 및 약리학적 유발

1. 피부를 이온토포레시스를 준비하세요
   1. 선택한 복측 팔뚝 피부 부위는 알코올 없는 식염수 용액이나 순한 피부 세정제로 세척하세요.
   2. 전극을 설치하기 전에 피부를 부드럽게 두드려 말리세요.
      참고: 피부 준비 중 과도한 기계적 자극은 기초 측정에 방해가 될 수 있으므로 피해야 합니다.
2. 약물 전달 전극 위치
   1. 양면 접착 디스크를 사용해 준비된 피부 부위에 두 개의 약물 전달 전극을 부착합니다(그림 1A).
   2. 전류 간결을 방지하기 위해 전극 간 거리를 약 5cm로 유지하세요.
3. ACh 용액을 준비하세요
   1. 첫 번째 전극 챔버에 0.9%^식염수에 200 μL 200% ACH 용액을 준비하여 채^웁니다.
   2. ACh 전극을 사용하여 내피 의존성 혈관 확장을 평가합니다.
      참고: 선택된 약물 농도는 비특이적 자극과 갈바닉 인위팩트를 최소화하면서 강력한 용량 의존적 미세혈관 반응을 유도하도록 최적화되었습니다.
4. SNP 해를 준비하세요
   1. 200 μL 2% SNP 용액을 0.9% 식염수에 준비하여 두 번째 전극 챔버를 채웁니다.
   2. SNP 전극을 사용해 내피 독립적 혈관 확장을 평가하세요.
      주의: SNP는 빛에 민감합니다. 알루미늄 호일을 사용해 용액을 빛 노출로부터 보호하고, 준비 후 4시간 이내에 사용하여 약리학적 안정성을 유지하세요.
      참고: 선택된 SNP 농도는 안정적인 평원 혈관 확장을 촉진하면서 비특이적 전기적 효과를 최소화합니다.
5. 갇힌 공기 방울을 제거하세요
   1. 피부 부착 전에 전극 챔버에 갇힌 기포가 있는지 점검하세요.
   2. 보이는 공기 방은 전극 챔버를 부드럽게 두드리거나 멸균 플라스틱 주사기 팁을 사용해 제거하세요.
      참고: 공기 방울은 전류 흐름을 방해하여 약물 전달이 불균질할 수 있습니다.
6. 기준 전극 위치
   1. 기준(중성) 전극을 약물 전달 전극에 약 15cm 근처에서 전도성 젤이나 접착제를 사용해 부착합니다(그림 1A).
   2. 전극 접촉이 안정적인지 확인한 후 이온토포레시스를 시작하세요.
      참고: 약리학적 평가 영역과 PORH 평가 영역 간의 공간적 분리는 교란 상호작용을 최소화하고, ACh에 의해 유발된 축삭 반사 플레어와 PORH 측정 영역의 중복을 방지합니다.
7. 이온토포레시스 시스템 연결
   1. 전류 적용 전에 모든 전극을 이온토포레시스 전달 장치에 연결하세요.
   2. 프로토콜 시작 전에 전극 극성을 확인하세요(ACh는 양극, SNP는 음극).
      주의: 잘못된 전극 극성은 약물 전달 효율을 저해하고 혈관 반응을 변화시킬 수 있습니다.
8. 이온토포레시스 현재 프로토콜을 투여하세요
   1. 두 약물 모두에 대해 30, 60, 90, 120, 150, 180 μA의 6회 추가 현재 용량을 투여합니다.
   2. 현재 투여 중인 각 용량을 10초씩 적용하세요.
      참고: 점진적 전류 프로토콜은 용량-반응 곡선 구축을 가능하게 하며, 미세혈관 민감도 및 평원 반응 평가를 용이하게 합니다¹¹. 낮은 전류 진폭과 짧은 자극 간격의 조합은 비특이적 갈바닉 혈관 확장을 최소화합니다.
9. 자극 간격을 유지하세요
   1. 연속된 전류 사용 간격을 60초 간격으로 유지하세요.
   2. 투여 사이 안정화 기간 동안 관류 신호를 모니터링하세요.
      참고: 선택된 간격은 미세혈관 반응을 안정화하면서도 국소 약물 전달을 유지하면서 전신 영향 없이 진행할 수 있도록 합니다.
10. 미세혈관 반응을 기록하세요
    1. 모든 이온토포레시스 자극 전반에 걸쳐 미세혈관 관류 신호를 연속적으로 기록하세요.
    2. 최종 전류 적용 후 최소 10분 이상 기록을 계속하여 최대 고원 반응을 포착하세요. 대표적인 용량 의존 반응은 그림 2A에 나타난다.

그림 2. 이온토포레시스 및 폐쇄성 반응성 고혈증(PORH) 중 피부 미세혈관 관류의 대표적인 기록. (A) 이온토포리시스 중 LSCI를 이용한 2% ACH 양극 전류의 대표성 기록, 10초 간격으로 10초 간격으로 증가하는 양극 전류를 투여함. (B) PORH 평가 중 얻은 대표적 기록. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 폐쇄성 후 반응성 고혈증(PORH)

1. 폐쇄 커프를 위치 잡으세요
   1. LSCI 기록에 사용되는 같은 사지의 상완에 표준 공기압 커프(폭 약 12cm)를 부착합니다.
   2. 커프를 선택한 미세혈관 평가 부위에 근처로 놓으세요.
2. PORH 평가 영역을 정의하세요
   1. 이온토포레시스 전극 부위 옆 복측 전완에 세 번째 ROI를 만듭니다.
   2. ROI를 치료가 없는 피부 부위에 위치시켜 약리학적 간섭을 피하세요.
      참고: 독립적인 혈관 반응을 유지하기 위해 약리학적 자극 부위와 PORH 평가 영역 간의 공간적 분리를 유지해야 합니다.
3. PORH 기준선 기록을 확보하세요
   1. 동맥 폐색 전 5분간 안정 시 피부 관류를 기록하세요.
   2. 커프가 부풀리기 전에 기준 관류 신호를 모니터링하여 신호 안정성을 확인하세요.
4. 동맥 폐색 유도
   1. 자동 인플레이터나 수동 팽창 전구를 사용해 < 5초 이내에 공압 커프를 빠르게 부풀립니다.
   2. 참가자의 이전에 측정한 수축기 혈압(SBP) 대비 커프 압력을 50 mmHg까지 증가시킵니다.
      주의: 폐쇄 기간을 시작하기 전에 완전한 동맥 폐색을 확인하시기 바랍니다. 불완전 폐색은 고풍기 반응을 저해할 수 있습니다.
5. 폐쇄 기간을 유지하세요
   1. 정확히 3분 동안 동맥 폐색을 지속적으로 유지하세요.
   2. LSCI 신호가 생물학적 제로 정체(< 10 APU)로 감소하는 것을 확인하여 완전한 폐색을 확인한다.
      참고: 생물학적 제로 신호는 혈류와 무관한 혈구 잔류 이동, 브라운 운동을 반영합니다.
6. 폐쇄 커프를 풀어주세요
   1. 급속 배기 밸브를 사용해 즉시 커프 압력을 해제하세요.
   2. 즉각적인 혈류 회복을 허용하여 반응성 고혈 반응을 시작하세요.
7. 풍혈 반응을 기록하세요
   1. 커프스 해제 후 최소 5분간 LSCI 녹음을 계속하세요.
   2. 관류 반응의 최고점과 이후 기준선 관류 수준으로의 회복 과정을 포착합니다. 대표적인 PORH 반응은 그림 2B에 나타난다.
8. PORH 반응을 정량화합니다
   1. 이미지 획득 소프트웨어에서 최대 CVC를 계산하세요.
   2. 분석 소프트웨어를 사용하여 고흡기 반응 신호의 곡선 아래 면적(AUC)을 계산합니다.

5. 데이터 추출 및 통계 분석

1. 기록된 데이터를 열고 확인해 보세요
   1. 영상 분석 소프트웨어를 사용해 녹화된 획득 파일을 열어보세요.
   2. 모든 미리 정의된 ROI가 해당 측정 지점 위에 올바르게 위치하는지 확인하세요.
      참고: 모션 아티팩트나 획득 드리프트로 인해 원래 배치가 손상될 때만 ROI를 재배치할 수 있습니다.
2. 분석 구간을 정의하세요
   1. 관류 및 CVC 추세 그래프에서 구체적인 분석 구간을 식별하세요.
   2. 첫 혈관 자극 직전 60초 연속 기준 간격을 선택하세요.
   3. 이온토포레시스 자극 후 각 60초 간격의 마지막 30초를 선택하여 고원 미세혈관 반응을 포착합니다.
      참고: 데이터 분석 전에 혈관운동 진동과 운동 아티팩트의 영향을 최소화하기 위해 관류 신호의 5%< 기초 안정성을 변동계수(CV)로 정의하세요.
3. PORH 응답 변수 식별
   1. PORH 프로토콜의 동맥 폐색 단계에서 생물학적 제로 신호를 식별합니다.
   2. 커프스 해제 직후 즉시 최고치의 CVC 값을 확인하세요.
4. 구간 평균 값을 계산하세요
   1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 사전 정의된 분석 구간의 평균 CVC 값을 계산합니다.
   2. 최종 계산 값을 확인하기 전에 움직임 아티팩트가 없는지 확인하세요.
5. 추출한 데이터를 정리하세요
   1. 평균 원시 PU와 평균 CVC 값을 구조화된 스프레드시트로 내보내거나 수동으로 전사하세요.
   2. 연구 그룹과 혈관 자극(아세틸콜린, 나트륨 니트로프루시드, PORH 반응 포함)에 따라 데이터셋을 조직합니다.
      참고: 데이터 처리 과정에서 파일 명칭과 참가자 식별 코드를 일관되게 유지하여 전사 오류를 최소화하세요.
6. 2차 혈관 결과 계산
   1. 혈관 반응성을 판단하기 위해 기준선 관류 또는 CVC 수치에서 증가한 비율을 계산합니다.
   2. 2차 평가 평가 분석에 필요할 때 AUC를 계산하세요.
7. 통계 분석 수행
   1. 통계 분석 소프트웨어를 사용해 데이터를 분석하세요.
      참고: 소프트웨어 기반 분석에 대한 대표적인 스크린샷이나 워크플로우 지침을 보조 자료로 포함하세요.
   2. 데이터 분포 평가
      1. 샤피로-윌크 검정을 사용하여 데이터 정규성을 평가합니다.
      2. 정규분포 데이터를 표준편차(SD)± 평균 분포로 표현합니다.
      3. 비정규 분포 데이터를 중앙값 및 4분위 범위(IQR)로 표현합니다.
   3. 미세혈관 반응 비교
      1. 정규성 가정이 충족되면 독립 t 검정을 사용하여 2그룹 데이터셋을 비교합니다.
      2. 여러 그룹을 일원 ANOVA와 Tukey의 사후 검정을 비교합니다.
   4. 통계적 유의성 기준을 정의합니다
      1. 통계적 유의성을 p < 0.05로 정의합니다.
      2. 영향을 받은 분석에서 쌍별 삭제 또는 제외하여 모션 아티팩트로 인한 누락 데이터를 처리합니다.
         참고: 분석적 무결성을 유지하기 위해 모든 연구 그룹에 동일한 데이터 누락 전략을 일관되게 적용하세요.

Results

이 프로토콜을 성공적으로 적용하면 안정적인 기준선이 형성되고, 각 혈관 자극에 대해 명확하고 구별되는 미세혈관 반응이 나타납니다. 기술적으로 성공적인 실험에서는 기준선 기록이 최소한의 변동을 가진 안정적인 관류 신호를 보여주며, 이는 평균 신호의 < 10%인 SD로 정의됩니다. AC와 SNP의 이온토포레시스 시에는 APU가 단계적으로 증가하는 것으로 예상되며, 이는 선량 의존적 혈관 확장을 반영합니다. 성공적인 PORH 반응은 동맥 폐색 시 관류량이 빠르게 감소하여 안정적인 생물학적 0점을 유지한 후, 커프 해제 직후 급격한 고풍혈 피크가 나타나는 것이 특징이며, 건강한 대상자에서는 보통 기준 수준보다 몇 배 이상 높은 수치에 도달합니다. 그림 1A 는 LSCI와 이온토포레시스를 이용한 피부 미세혈관 평가에 사용되는 실험 장치를 보여줍니다. 그림 1B–1D 는 대표적인 이온토포레시스 반응과 전극 위치를 보여줍니다. 그림 2A 는 ACh 이온토포레이시스 중 선량 의존적 미세혈관 반응을 대표하는 반면, 그림 2B 는 대표적인 PORH 반응을 보여줍니다.

비최적이거나 기술적으로 성공하지 못한 녹음은 일반적으로 신호 불안정성이나 움직임 관련 아티팩트로 특징지어집니다. 고주파 급증이나 급격한 기초 변동은 일반적으로 참가자의 움직임이나 진공 쿠션 지지 시스템의 안정화 부족을 나타냅니다. 건강한 참가자에서 이온토포레시스 중 혈관 확장 반응이 감소하거나 없으면 전극과 피부 접촉이 불안정하거나 전극 챔버 내에 공기 방이 갇혀 전류 전달이 저하되는 경우가 흔합니다. 그림 3 은 움직임과 관련된 신호 불안정성이 특징인 허용 불가능한 녹음의 대표적인 예를 보여줍니다.

그림 3. 이온토포레시스 중 허용되지 않는 미세혈관 관류 기록의 대표적인 예입니다. ACH 이온토포레이시스 중 LSCI를 이용해 얻은 피부 미세혈관 혈류 기록의 대표적인 기록으로, 신호 불안정성과 정량적 분석에 적합하지 않은 운동 관련 인공물을 입증하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

PORH 폐쇄 단계에서 안정적인 생물학적 제로를 달성하지 못하면 동맥 폐색이 불완전함을 나타내며, 이는 일반적으로 잘못된 커프 위치 또는 커프 팽창 압력 부족으로 인해 발생합니다. 이러한 조건에서는 이후의 풍혈 반응이 약해져 신뢰할 수 있는 해석이 불가능해집니다.

성공적으로 실행된 프로토콜은 재현 가능한 관류 및 CVC 곡선을 생성합니다. SNP 이온토포레이시스 중 관찰되는 최대 CVC 고원은 전체 혈관 확장 능력과 혈관 구조적 완전성을 반영하는 반면, ACh 매개 반응은 주로 내피 의존적 미세혈관 기능을 반영합니다. 이러한 혈관 반응의 표준화된 비교는 보존된 미세혈관 기능과 손상된 양상을 구분할 수 있게 합니다. 건강한 젊은 대상자와 저항성 동맥 고혈압 환자로부터 얻은 대표적인 정량적 미세혈관 지표가 표 1에 제시되어 있습니다.

미세혈관 매개변수	부대	건강한 젊은 대조군 (n = 25)	저항성 동맥 고혈압 환자 (n = 50)	p-값
기본 CVC	APU/mmHg	0.37 ± 0.13	0.29 ± 0.12	0.01
ACh 유발 피크 CVC	APU/mmHg	0.67 ± 0.23	0.51 ± 0.19	0.004
SNP 유발 피크 CVC	APU/mmHg	0.60 ± 0.21	0.41 ± 0.17	0.0003
PORH 피크 CVC	APU/mmHg	0.87 ± 0.18	0.60 ± 0.16	< 0.0001

표 1: 건강한 젊은 대상자 및 내성 동맥 고혈압 환자에서 대표적인 미세혈관 반응성 지표. 값은 평균 ± 표준편차(SD)로 표현됩니다. p 값은 그룹 간 비교를 위해 독립적인 t 검정을 사용하여 계산하였습니다. 약어: ACh, 아세틸콜린; SNP, 니트로프루사이드나트륨; PORH, 폐쇄성 후 반응성 고혈증; CVC, 피부 혈관 전도도; APU, 임의 관류 장치. 데이터는 저자들의 연구실에서 발표되지 않은 결과를 나타냅니다.

Discussion

LSCI는 전신 미세혈관 기능을 높은 공간적·시간적 해상도로 평가하기 위한 표준화되고 비침습적 접근법을 제공합니다. 단일 점 측정에 제한적이고 피부 관류의 공간적 이질성에 매우 민감한 LDF와 비교할 때, LSCI는 전면 영상 촬영과 다중 ROI의 동시 평가를 가능하게 합니다. 이 특성은 측정 재현성을 크게 향상시키고 임상 미세혈관 연구에서 변동 계수를 줄입니다. 더불어, LSCI의 비접촉 특성은 프로브 기반 기법에서 흔히 발생하는 국소 압력 인위를 최소화하여 중개 및 임상 연구 환경에서 반복 평가에 적합함을 높입니다.

이 프로토콜의 핵심 요소는 관류 데이터를 MAP로 정규화하여 CVC를 계산하는 것입니다. 피부 혈액 관류는 전신 관류압에 크게 영향을 받기 때문에, 원시 APU만 해석하는 것만으로는 특히 고혈압이나 지질이상과 같은 혈역학적 변화가 있는 집단에서 상당한 교란을 초래할 수 있습니다. 이러한 이유로, 프로토콜은 다양한 생리적 및 병리학적 조건에서 미세혈관 기능 해석을 개선하기 위해 원시 PU와 정규화된 CVC 값을 모두 보고할 것을 권장합니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 엄격한 환경 및 참가자 안정화로, 실내 온도 조절, 움직임 아티팩트 최소화, 표준화된 참가자 위치 지정이 포함되어 있으며, 이는 재현 가능한 기록을 달성하는 데 필수적입니다.

LSCI의 여러 한계점도 고려해야 합니다. 이 기법은 주로 약 0.5–1mm 깊이의 표재 피부 미세순환을 평가하므로 깊은 혈관층을 완전히 나타내지 못할 수 있습니다. 또한 피부 색소침착과 주변 광 간섭은 신호 대 잡음비에 영향을 줄 수 있어, 이 프로토콜에서 설명된 환경 제어의 중요성을 더욱 부각시킵니다. 또 다른 제한점은 절차 전반에 걸쳐 CVC 계산에 단일 기준선 MAP 측정을 사용하는 점입니다. 약 40분 동안 전신 혈압이 변동할 수 있으나, 반복적인 커프 팽창은 교감신경 활성화와 레이저 스펙클 신호에 간섭하는 움직임 아티팩트를 유발할 수 있어 의도적으로 피했습니다. 향후 연속 비침습적 혈역학 모니터링을 통합하는 연구는 미세혈관 전도도 측정의 생리학적 해석을 더욱 향상시킬 수 있습니다.

중요한 프로토콜 단계에는 환경 안정화, 운동 제어, 전극 위치 지정, 그리고 PORH 중 완전한 동맥 폐색이 포함됩니다. 불안정한 기초 기록은 주로 참가자의 움직임이나 충분한 휴식 기간이 부족하여 발생하며, 진공 쿠션 시스템을 재안정화하고 적응 기간을 연장함으로써 최소화할 수 있습니다. 둔화된 이온토포레틱 반응은 종종 전극과 피부의 접촉이 불안정하거나 전달실 내에 공기 방울이 갇혀 있음을 나타냅니다; 신중한 챔버 충전과 전극 재배치가 일반적으로 이러한 문제를 해결합니다. PORH 폐색 단계에서 생물학적 제로에 도달하지 못하는 것은 보통 커프의 부적절한 팽창 또는 잘못된 커프 위치로 인한 불완전한 동맥 폐색을 반영합니다. 이러한 조건에서는 결과적으로 발생하는 흡혈 반응이 약해져 신뢰할 수 있는 해석에 부적합해집니다.

생리학적 및 약리학적 자극의 통합은 이 프로토콜의 주요 강점으로, 이러한 접근법이 미세혈관 조절의 상호 보완적 측면을 평가하기 때문입니다. PORH는 일과성 허혈과 전단 스트레스에 의해 촉발되는 내피, 신경원성, 혈관 평활근 기전과 관련된 미세혈관 반응성에 대한 통합 생리학적 평가를 제공합니다¹⁶. 반면, 이온토포레시스는 내피 의존성 및 내피 독립적 혈관 확장 경로를 선택적으로 평가할 수 있게 한다¹⁵. ACh는 내피 의존성 일산화질소 매개 혈관 확장을 평가하는 반면, 직접 일산화질소 공여자인 SNP는 내피 신호와 독립적으로 혈관 평활근 반응성을 평가합니다¹⁵. 이러한 반응의 비교 해석을 통해 기능적 내피 장애와 구조적 미세혈관 재형성을 구분할 수 있습니다. 이 구분은 특히 노화, 저항성 고혈압, 당뇨병, 만성 대사 질환에서 관련이 깊으며, 이들 질환에서는 내피 신호 전달 장애와 미세혈관 희소가 공존할 수 있습니다^14,17.

요약하자면, 이 표준화된 LSCI 프로토콜은 인간 미세혈관 건강의 비침습적 평가를 위한 재현 가능하고 번역적으로 적합한 방법을 제공합니다. 약리학적 이온토포레시스와 생리학적 허혈-재관류 검사의 결합은 엄격한 환경 및 혈류역학 표준화를 통해 실험적 변동성을 최소화하면서 내피 및 구조적 혈관 기능의 상세한 특성 규격을 가능하게 합니다. 다양한 심혈관 및 대사 질환에서 조기 미세혈관 기능 장애를 감지하는 민감성을 고려할 때, 이 접근법은 임상 연구, 종단 모니터링 및 중개 혈관 의학 치료 평가에 귀중한 도구가 됩니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<스트롱>장비
자동 실로메트릭 혈압 모니터	옴론 헬스케어	HEM-7120	기준 평균 동맥압(MAP) 평가에 사용됨 (3가지 측정)
디지털 보정 온도계	델타 OHM	HD2301.0	정확도 및 플러스먼; 0.1° C는 상실 온도 모니터링을 의미합니다
분산(참조) 전극	페리메드 공군	PF 384	대표면적 중성 전극
약물 전달 전극	페리메드 공군	PF 383 / LI 611	비침습적 이온토포레시스 챔버(약 80mm²)
이온토포레시스 전력 컨트롤러	페리메드 공군	주위 미세혈관 진단 시스템	듀얼 채널 전류 컨트롤러(최대 200 및 마이크로; A)
레이저 스펙클 대비 영상(LSCI) 시스템	페리메드 공군	페리캠 PSI NR	고해상도 혈액 관류 영상기
의료용 진공 쿠션	AB 제르마	해당 없음	심장 높이에서 팔뚝 안정 위치를 잡기 위해 사용됩니다
한 손으로 작동하는 진공 펌프	AB 제르마	해당 없음	진공 쿠션 배출에 사용됨
래피드 커프 인플레이터	D.E. 호칸슨 주식회사	E20 래피드 커프 인플레이터	표준화된 3분 동맥 폐색에 사용됩니다
<강>시약 및 소모품
아세틸콜린 클로라이드 (ACh)	시그마-올드리치	A6625	내피 의존성 혈관 확장제를 2% 준비
알코올 준비 패드	벡턴 디킨슨	326895	피부 준비용 70% 이소프로필 알코올 패드
이온수	시그마-올드리치	38796	전극의 최종 세척에 사용됩니다
염화나트륨 (0.9% 식염수)	현지 공급업체	해당 없음	약물 준비 및 피부 세척용 용매
니트로프루사이드 나트륨 (SNP)	시그마-올드리치	S0501	내피 독립성 혈관 확장제를 2% 준비
멸균 거즈	현지 공급업체	해당 없음	세척 후 피부 표면을 건조시키는 데 사용함
Software
관류 분석 소프트웨어	페리메드 공군	PIMSoft	LSCI 데이터 수집 및 ROI 분석을 위한 소프트웨어
통계 분석 소프트웨어	그래프패드 소프트웨어	프리즘 10	선량-반응 곡선 적합 및 곡선 아래 면적(AUC) 계산에 사용