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방법 논문

비동맥화 쥐 간 이식 모델에서의 장기 생존 경험 공유

114 조회수

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DOI:

10.3791/71650

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2026년 5월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Organ Transplantation Center, the Affiliated Hospital of Qingdao University, 2Institute of Organ Donation and Transplantation, Medical College of Qingdao University, 3Organ Transplant Center, Fujian Medical University Union Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜의 목표는 비동맥화 쥐 간 이식 모델을 구축하기 위한 최적화된 수술 경험을 공유하는 것이며, 특히 100일 이상의 장기 동물 생존을 보장하는 기술적 개선에 중점을 둡니다.

초록

실험적 간 이식에서 쥐 모델은 이식 면역학과 대사 과정을 연구하는 데 있어 금본위입니다; 그러나 매우 미세한 간동맥(~0.5 mm)을 재건하는 것은 매우 어려운 기술적 도전입니다. 이를 우회하기 위해 단순화된 비동맥화 쥐 간 이식(NArLT) 모델이 널리 사용되고 있습니다. 안타깝게도, 동맥 박탈로 인한 담즙 누출과 허혈성 담관염과 같은 심각한 담도 합병증은 수혜자의 장기 생존을 자주 제한합니다. 이 장애물은 장기 숙주-이식편 면역 적합성 및 만성 거부 반응 등 주요 주제에 대한 연구를 크게 제한합니다. 여기서는 이러한 허혈성 담도 손상을 성공적으로 극복하기 위한 중요한 기술적 개선을 포함한 NArLT 모델에 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 주요 개선점으로는 상당히 단축된 무간기 위기, '비접촉' 담도 박리 기법, 철저한 담도 세척, 최적화된 내부 담도 스텐트 시술법이 있습니다. 이 개선된 절차를 시행한 후, 100일 관찰 기간 동안 수혜자의 생존율은 94%를 초과했습니다. 궁극적으로 이 최적화된 프로토콜은 장기 이식 내성의 기전을 탐구할 수 있는 매우 재현 가능하고 견고한 플랫폼을 제공하여 이식 의학에서 새로운 치료 전략 개발을 지원합니다.

서론

쥐 간 이식 모델은 기초 이식 연구를 위한 가장 널리 활용되는 실험 플랫폼입니다. 그러나 광범위한 적용은 악명 높은 가파른 학습 곡선으로 인해 종종 방해받으며, 이는 후속 실험 연구의 진행을 크게 저해할 수 있습니다 1,2. 더욱이, 기존 쥐 간 이식 모델은 종종 최적이 아닌 수술 성공률과 낮은 장기 생존율을 겪습니다. 수술 절차를 비판적으로 간소화하고, 수술 세부 사항을 세밀하게 다듬으며, 혈관 및 담도 재건을 직접 시각화하에 수행함으로써, 이 복잡한 미세수술 모델의 학습 곡선은 크게 단축될 수 있습니다. 3,4. 간 이식은 말기 간 질환에 대한 유일한 치료 치료법으로 남아 있어, 쥐 간 이식 모델의 확립은 과학 연구에 매우 중요한 의미를 가집니다 5,6.

비동맥화 쥐 간 이식(NArLT) 모델은 실험적 수술에서 큰 장점을 제공합니다: 미세혈관 동맥 문합이라는 어려운 문제를 우회하고, 전체 수술 시간을 단축하며, 쥐의 마취 시간을 단축합니다. 동맥 혈류 공급이 차단되었음에도 불구하고, 이 모델에서 발생하는 담도 반응은 허혈성 담도 손상 연구에 독특한 관점을 제공합니다. 그러나 기존 NArLT 모델은 수술 후 담도 합병증 발생률이 최대 30%에 달하는 것과 연관되어 있어 장기 생존율을 심각하게 저하시킵니다. 전통적인 고전적 쥐 간 이식 모델에서는 수혜자의 장기 생존율이 70%–85% 미만입니다8. 이를 해결하기 위해 본 연구는 헤파린 처리된 연담도 스텐트를 활용한 최적화된 프로토콜을 도입하였습니다. "노터치" 담도 박리 기법을 사용하여 주변 미세혈관망 보존을 극대화하고, 냉관류를 통한 철저한 담도 세척을 함께, 이 접근법은 물리적 지지와 허혈 보호를 통해 담도 합병증을 근본적으로 완화하고, 궁극적으로 장기 면역학적 모니터링을 위한 견고하고 안정적인 기반을 제공하는 것을 목표로 합니다.

따라서 쥐 간 이식 기술적 혁신의 주요 목표는 시술 성공률 극대화와 수혜자의 생존 연장입니다. 이러한 목표를 달성하는 것은 하위실험 연구의 시기적절하고 중단 없는 진행을 보장하는 데 필수적인 전제 조건입니다.

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프로토콜

본 연구의 모든 동물 실험 및 수술은 칭다오대학교 실험동물윤리위원회(번호 20260301SD5020260401065)의 승인을 받았습니다. 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울이세요.

1. 수술 전 준비

  1. 실험 동물
    1. 8주에서 10주 된 성체 수컷 Sprague–Dawley(SD) 쥐를 기증자로 사용하세요. 수혜자의 체중이 기증자의 체중보다 약간 더 높게 50g 이내로 가도록 하세요.
    2. 쥐를 병원체가 없는 특정 조건에서 22°C ± 2°C의 조절된 온도와 50% ± 10%의 상대습도에서 키웁니다.
    3. 12시간의 밝고 어두운 주기를 유지하며, 한 우리당 2–3마리의 쥐 밀도를 둡니다.
    4. 표준 실험실 설치류 사료를 제공하세요. 수술 전 최소 1주일간 쥐가 실험실 환경에 적응할 시간을 주세요.
    5. 수술 전 12시간 동안 단식하는 동물들. 자유롭게 물 접근을 허용하세요.
      참고: 수술 전 금식은 마취 중 흡인 위험을 최소화하고, 호흡 기능을 저해하며 수술 노출을 방해할 수 있는 위 확장을 방지하는 데 도움이 됩니다.
  2. 수술 기구 및 재료
    1. 그림 1에 표시된 이식 수술에 필요한 기구를 사용하세요. 수술에 사용된 소모품의 세부 사항을 재료표에 나열하세요.
    2. 5F 및 6F 경막외 카테터 시스를 선택하는데, 수컷 SD 쥐(무게 220–250g)에서 카테터의 외경을 목표 혈관의 생리적 내경과 일치시킵니다.
    3. 문맥(PV)에는 5F 덮개(약 1.67mm)를 사용하세요. 하간하정맥(IHIVC)에는 6F 피(약 2.00mm)를 사용하세요.
      참고: 카테터 크기를 선택하려면 해부학적 기준과 수술 중 현미경 시각 추정을 결합하여 선택하세요. 카테터의 외경과 목표 혈관의 내부 내강을 실시간으로 비교합니다. 적절한 매칭은 카테터가 혈관 내강의 약 70%–80%를 차지할 때 이루어져, 혈관벽이 과도하게 늘어나거나 과도한 여유가 남지 않고 부드럽게 삽입할 수 있습니다. 지정된 체중 범위 내의 SD 쥐의 경우, 초기 크기 선택에 미리 정해진 해부학적 혈관 직경을 사용할 수 있으며, 이는 개별 변이에 따라 수술 중 조정해야 합니다. 수술자는 이전의 미세수술 교육을 통해 혈관-카테터 일치를 입증해야 합니다.
    4. 8주에서 10주 사이의 SD 쥐의 경우, PV와 IHIVC의 커프로 각각 5F와 6F 경막외 카테터 피를 선택하라(그림 2A).
    5. 총 기능성 길이(관 모양 몸체)가 2.0–2.5 mm인 커프를 준비하세요. 겸자로 다룰 때는 3.0–4.0 mm 간격의 연장 길이를 유지하세요.
    6. 모기 겸자 턱으로 커프 벽을 클램프하여 커프 근위 가장자리에서 약 0.5–1.0 mm 떨어진 곳에 원형 홈을 만듭니다(자세한 내용은 그림 2A 참조). 매듭 묶기 및 고정을 원활하게 하기 위해 약 0.1–0.2mm 정도의 홈 깊이를 유지하세요.
    7. 홈이 7-0 고정 결사가 단단한 카테터 표면에서 미끄러지지 않도록 반드시 확인하세요.
    8. 22G 정맥 주사 카테터를 다듬어 끝이 기울거나 경사진 담도 스텐트를 만듭니다. 길이는 5–7 mm로 유지하세요.
    9. 스텐트 길이는 7mm를 선호합니다. 오른쪽 위정맥의 수평 높이를 기준으로 해부학적 차이에 따라 길이를 조절하세요. 이 기준점에서 간구문까지의 거리를 추정하여 스텐트 길이 선택을 안내합니다.
    10. 예상 거리가 제한적이거나 삽입 중 저항이 발생하면 스텐트를 약 5–6 mm로 단축하세요. 스텐트의 약 2–3 mm가 구부러짐, 휘어짐, 돌출 없이 담관에 삽입될 수 있도록 하세요.
    11. 스텐트를 상온(23°C ± 2°C)에서 헤파린화된 식염수(100 IU/mL)에 담가둡니다. 스텐트를 사용 전 최소 30분간 침수하여 기증자의 담내강에 삽입할 때 내관 내 담즙 응고를 방지해야 합니다(그림 2A).
      참고: 수술 전에 커프를 준비하고, 성공적인 캐닐레이션 후 매듭과 고정을 용이하게 하기 위해 모기 겸자를 사용해 커프 벽에 홈을 만들어 주세요. 다듬은 담도 스텐트 끝이 지나치게 날카롭지 않게 하여 담관 천공을 방지하세요. 수술용 현미경(10×–16× 배율)으로 절단면이 깨끗하고 톱니 모양의 플라스틱 버가 없는지 확인; 끝이 바늘처럼 보인다면 마이크로 가위로 약간 무딘 상태로 만드세요. 조작 시에는 스텐트를 다루기 위해 가는 미세하고 이가 없는 마이크로 핀셋만 사용하세요. 스텐트 내관이 평평해지거나 타원화되거나 휘어지는 현상으로 과도한 외부 힘을 가하지 않도록 주의하세요; 변형된 스텐트는 폐기하고 교체하는데, 하강 협착은 수술 후 담도 합병증 위험을 높이기 때문입니다.

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그림 1. 이식 수술에 사용되는 수술 기구들. (A) 스테인리스 신장 대조. (B) 마이크로 바늘 홀더. (C) 마이크로 가위. (D) 마이크로 겸자(직선 및 곡선). (E) 미세혈관 클립과 작은 모기 스타일 불독 클램프. (F) 표준 바늘 홀더. (G) 직선 정혈 겸자(모기 겸자). (H) 혈관 클램프. (I) 표준 외과용 가위. (J) 고무줄(멸균된 수술용 장갑 소매로 만든 것). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2. 맞춤 제작된 수술용 커프, 담도 스텐트, 그리고 계획된 복부 절개. (A) 혈관 커프와 담도 스텐트를 밀리미터 자와 함께 준비합니다. 왼쪽부터 다음으로: 하간하정맥(IHIVC) 커프에 사용되는 6F 경막외 카테터 시스, 문맥(PV) 커프에 사용되는 5F 카테스 시스, 그리고 22G 정맥 카테터에서 절단한 5–7mm 담도 스텐트. (B) 기증자 쥐 복부에 십자 절개를 하여 수술적 노출을 극대화하는 경우. (C) 수혜자 쥐 복부에 표시된 표준 중간선 복강 절개. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 기증자 운영

  1. 초기 단계
    1. 유도 챔버에서 5% 이소플루란을 1L/min의 공기 흐름으로 마취합니다. 마취 깊이를 평가하여 자발적인 사지 움직임과 철회 반사가 없음을 확인하라.
      참고: 마취의 깊이는 자발적인 사지 움직임의 부재, 철단 반사 부재, 호흡 수를 관찰하여 평가합니다. 수술이 원활하고 안전하게 진행되도록 하기 위해, 이 지표들은 시술 전 과정에서 20분 간격으로 엄격히 재평가됩니다.
    2. 오른쪽 하복부에 복막 내 주사로 펜토바르비탈 1% (40–45 mg/kg), 중앙선 외측 약 1–2cm 지점(백선선), 오른쪽 서혜부 인대 두개골 1–2cm 지점에 투여합니다. 뒷발을 꼬집어 마취 상태를 확인하고, 금단 반사가 없는지 확인하세요.
    3. 기증 쥐를 37°C 온열 패드 위에 엎드린 자세로 놓아 수술 중 체온을 유지하세요.
    4. 복부 수술 부위를 면도하세요. 포비돈-요오드로 부위를 세 번 소독하세요.
  2. 간 관류 전 절차
    1. 십자 절개를 흉골돌기, 치골 결합부, 그리고 겨드랑이 정중선까지 측면으로 확장하여 수술 부위의 노출을 극대화합니다(그림 2B).
      참고: 복강 절개술은 두 겹으로 나누어 진행하세요. 먼저 피부와 피하 조직을 절개합니다. 그 후 겸자로 백선을 텐트처럼 감싸고 공기 유입을 허용하기 위해 작은 절개를 하여 내장이 떨어지게 합니다. 가위로 절개 부위를 확장하면서 하부 칼날이 복벽과 평행하게 유지되어 장기 손상을 방지하세요.
    2. 장을 식염수에 적신 거즈로 감싸세요. 수술 부위를 노출시키기 위해 복부 왼쪽의 멸균 수술 부위에 놓으세요.
      참고: 허혈성 건조와 저체온증을 예방하기 위해 내장이 적출된 장의 수분을 지속적으로 유지하는 것이 필수적입니다. 약 10–15분마다 또는 수술용 조명 아래에서 거즈가 마르기 시작하면 즉시 따뜻한 생리식염수 방울을 떨어뜨려 덮는 거즈를 주기적으로 재수화하세요.
    3. 연골 인대를 갈라놓으세요. 상골 돌기를 두개로 집고 수축하여 간상간내 IVC(SHIVC)와 왼쪽 하 횡단정맥을 노출시킵니다.
    4. 왼쪽 삼각인대를 갈라내세요. 7-0 또는 8-0 용접기를 사용해 SHIVC 근처의 왼쪽 횡격정맥을 결찰합니다 봉합선(그림 3A).
      참고: 왼쪽 하횡단정맥을 결찰할 때는 SHIVC 근처에 결찰을 위치시키세요. 봉합 바늘이 횡격막을 쉽게 찔러 기흉을 일으킬 수 있다는 점을 유의하세요; 혈관 가까이에 봉합.
    5. 혈관 분열에 전기소작술은 빠른 혈전을 달성하고 수술 시간을 단축하여 시술의 일관성과 재현성을 향상시키기 위해 권장됩니다.
      참고: 전기소작술은 지혈을 표준화하고, 수술 시간을 단축하며, 수술자 간 재현성을 향상시킵니다.
    6. 꼬리근과 유두엽을 동원합니다(그림 3B).
    7. 현미경 겸자를 사용해 IHIVC 표면의 지방과 결합 조직을 제거하세요.
      참고: 혈관 벽이 매끄럽고 투명해 보일 때까지 결합 조직을 제거하세요. 혈관 클램프를 방해 없이 적용할 수 있고, 커프나 봉합에 지장이 될 수 있는 잔여 조직이 없을 때 적절한 노출이 이루어집니다.
    8. 오른쪽 부신정맥을 IHIVC와 수평하게 연결하세요. 오른쪽 신정맥을 분리해서 IHIVC와 평평하게 결찰하세요.
    9. IHIVC를 좌측 신정맥 바로 위까지 계속 해부합니다(그림 3C).
      참고: 해리 시 IHIVC가 뼈대화되어 지방 결합 조직과 혈관을 최대한 분리하여 완전히 분리되도록 하세요. 이로 인해 이후 간 이식 및 커프 부착 절차가 용이해집니다.
    10. 면봉으로 간을 부드럽게 들어 올려 보세요. 오른쪽 하간엽과 후복막 사이의 인대 부착부를 박리합니다.
      참고: SHIVC는 간극 상부에 위치한 짧고 넓으며 벽이 얇은 푸른빛을 띠는 혈관으로 식별하세요. 앞쪽 표면이 제거되고 인접한 횡격막 섬유가 보이면 해부를 중단하세요.
    11. SHIVC에 도착하면 해부 중지.
      참고: 간을 다루면 실질질 손상을 예방할 수 있습니다. 두개골 후복막 박리 시 IVC를 보호하기 위해 주의하세요.
    12. PV와 적절한 HA 사이의 결합 조직을 해부하세요. PV를 분리하세요.
    13. 오른쪽 위정맥(유문정맥)을 PV와 수평하게 연결하세요. 비장 정맥 뿌리까지 계속 해부하세요.
    14. 포타 헤파티스를 노출시켜. 총담관(CBD)과 HA를 감싸고 있는 PV 왼쪽에 위치한 줄과 같은 지방 결합 조직을 확인하세요.
    15. CBD 전벽, 간관 분기점에서 3–5mm 떨어진 곳에 'V'자 모양의 절개를 하세요.
    16. 마이크로포스를 사용해 담도 스텐트를 고정하세요. 스텐트를 담도에 약 3mm 정도 삽입하면서 관과 평행하게 정렬을 유지하세요.
      참고: 저항 없이 부드럽게 스텐트를 전진하세요. 측면 돌출, 각도 조절, 덕트 벽 텐팅이 없는지 확인하세요. 저항이나 변형이 발생하면 다시 삽입하기 전에 빼내고 재정렬하세요.
    17. 스텐트를 7-0 실크 타이로 고정하세요. 절개 부위에서 HA를 결찰하고 근위부를 횡단하세요(그림 3D).
      참고: 기증자 CBD를 해부할 때 과도한 '골격화'는 엄격히 피해야 합니다. 회피 주변 결합 조직, 신경 신경총, 미세혈관망을 보존하여 조기 측부 순환과 수술 후 담도 치유를 촉진합니다. 기증관의 원위 끝이 가장 허혈성 있는 부위이므로, 문합 부위를 간문 가까이에 두어 허혈 부담을 최소화하세요.
  3. 간 관류
    1. 복부 대동맥을 노출하세요. 23게이지(23G) 두피 정맥 바늘(약 1cm)을 20mL 주사기에 연결하고, 4°C의 차가운 위스콘신 대학교(UW) 용액을 채우세요.
      참고: 바늘을 복부 대동맥에 얕은 각도(15°–20°)로 삽입하세요. 동맥 혈류 플래시백을 관찰하여 진입을 확인한 후 약간 앞으로 나아가 바늘을 혈관과 평행하게 정렬하여 후벽 천공을 방지하세요.
    2. 주입 전에 주사기에서 공기를 빼세요. 혈관 클램프로 복부 대동맥과 바늘을 고정하고 고정하세요.
      참고: 주사기 안의 모든 공기를 탭하여 기포를 제거하고 액체를 배출하여 바늘 끝에 연속적인 방울이 보일 때까지 제거하세요. 캐널레이션 전에 바늘 허브에 공기가 없는지 확인하세요.
    3. 주사기를 3–3.5 mL/분의 일정한 속도로 수동으로 눌러 천천히 관류를 시작하세요(그림 3E).
      참고: 혈관 내 혈액 회류를 관찰하여 올바른 혈관 내 삽입을 확인하세요.
    4. 횡격막을 절개하세요. 흉부 정맥부대동맥과 흉부 대동맥을 완전히 노출하세요.
    5. 흉부 IVC와 오른쪽 심방 접합부에서 혈관 클램프를 사용해 흉부 대동맥을 클램프로 고정합니다.
    6. 클램프 바로 아래의 흉부 IVC를 절단하여 관류액이 배출되도록 합니다.
      참고: 클램프를 가능한 두개골 쪽에 적용하고 혈관 길이를 보존하기 위해 그 아래를 횡단하세요. 즉시 관류를 시작하여 응고를 방지하고 이식편의 품질을 유지하세요.
    7. 3–3.5 mL/분의 일정한 속도로 관류를 계속하여 총 부피는 약 40 mL로 만듭니다.
    8. 간 실질이 완전히 창백해지면(노란빛 갈색) 관류를 중단하세요(그림 3F).
      참고: 간이 균일하게 창백해지고(황갈색), 절단된 IHIVC에서 나오는 배출물이 잔류 혈액 없이 맑게 흐를 때 충분한 관류가 확인됩니다.
    9. IHIVC를 왼쪽 신정맥과 평평하게 교차시키세요. 비장 정맥 수준에서 PV를 절단하세요.
      참고: 내피 및 실질 손상을 예방하기 위해 빠르고 강하게 관류제 주입을 피하십시오.
    10. 횡격막 절개를 확대하세요. 간이식편을 부착된 다이어프램과 함께 한 덩어리로 채취하세요.
    11. 이식편을 차가운 UW 보존 용액이 담긴 멸균 페트리 접시에 넣으세요.
    12. 접목을 4°C의 차가운 UW 용액에 보관하세요. 이식 후 2시간 이내에 완전 이식.

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그림 3. 기증자 간 이동 및 현장 관류 중 주요 수술 단계. (A) 왼쪽 하 횡단정맥의 노출 및 결찰. (B) 간-식도 통신 분기의 분리 및 분열. (C) IHIVC 박리, 오른쪽 부신 및 오른쪽 신장 정맥 결찰 시술. (D) '노터치' 기법을 사용하여 담관(CBD)에 맞춤형 담관 스텐트를 삽입하여 주변 담도 결합 조직을 보존하는 것. (E) 복부 대동맥 캐닐레이션을 통해 냉 현장 관류를 시작한다. (F) 완전히 관류된 기증자 간이 균일하게 창백한 모습을 보이며, 성공적인 혈액 세척을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 체외 이식 준비

참고: 모든 체외 이식 준비는 얼음 위에서 수행하세요(그림 4A). 접목을 UW 용액에서 4°C± 2°C로 유지하고 적절한 냉 보존을 위해 주기적으로 온도를 모니터링하세요.

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그림 4. 기증자 간 이식의 체외 준비. (A) 저체온증을 유지하기 위해 냉 UW 보존 용액이 담긴 멸균 배양 접시에 삽입하고, 저체온증을 유지하기 위해 부서진 얼음 위에 위치시키는 간이식편. (B) 기증자 PV를 맞춤 커프에 위하여 뒤집어 고정하고 원형 결찰로 고정하는 것. (C) PV 및 IHIVC를 위한 커프 준비를 완료하고, 담도 스텐트가 삽입됨. (D) 상간성 IVC(SHIVC) 준비, 이후 문합을 용이하게 하기 위해 양쪽 외측 모서리에 스테이 봉합사를 삽입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

  1. PV 커프 준비
    1. 모기 겸자로 PV 커프의 꼬리를 잡고, 페트리 접시 바닥에 수직으로 꼬리 끝이 아래로 향하도록 고정하세요.
    2. 커프의 내강을 통해 마이크로 핀셋을 통과시키세요. 버블 코프를 커프를 통해 당겨.
    3. PV의 앞벽을 조정하세요. 커프 테일의 퍼진 끝 위로 혈관 벽의 약 3mm 정도 노출시키세요.
    4. 뒤집힌 혈관을 커프의 바깥벽에 7-0 실크 타이로 고정합니다(그림 4B).
      참고: 혈관과 커프가 비틀림이나 각도 없이 정렬되어 있는지 확인하세요. 고정 후에는 약 1mL의 UW 용액으로 PV 커프를 세척하고, SHIVC에서 배출되는 것을 관찰하여 개개성을 확인합니다.
  2. IHIVC 커프 준비
    1. IHIVC의 준비 및 커핑은 3.1단계에서 PV에 대해 설명한 것과 정확히 동일한 절차를 사용하여 수행됩니다. 간단히 말해, 혈관 동원, 다듬기, 커프 고정을 포함하며, 동일한 표준화된 프로토콜을 따르며 실험적 일관성과 재현성을 보장합니다. (그림 4C).
      참고: 플러싱 후 SHIVC에서 막힘 없는 배출이 관찰되어 IHIVC 커프의 개폐 상태를 확인하세요.
  3. 담관 세척
    1. 1mL 주사기와 0.5mL UW 용액을 사용해 담관을 부드럽게 세척합니다.
    2. 플러싱 시 액체 누출이 발생하지 않도록 하세요.
      참고: 체액 누출이 없다는 것은 담관의 무결성을 확인시켜 줍니다.
  4. SHIVC 준비
    1. 간 이식편의 SHIVC를 남은 횡격막을 절단하여 절단하세요.
    2. Step 2.2.7에서 정의한 대로 SHIVC가 완전히 골격화되었는지 확인하세요.
  5. 스테이 봉합사 위치
    1. 7-0이나 8-0을 사용하세요 수술자의 선호도에 따라 봉합합니다.
      참고: 수술 결과(문합 개완성 및 수혜자 생존 포함)에서는 이 모델에서 두 봉합사 크기가 기능적으로 동일합니다. 두 가지 중 선택은 전적으로 운영자의 개인 선호나 실험실 가용성에 따라 결정할 수 있으며, 절차의 재현성에는 영향을 주지 않습니다.
    2. SHIVC 그루터기를 부드럽게 납작하게 펴세요. 바늘을 안쪽에서 바깥쪽으로, 가장자리에서 약 1mm 떨어진 곳에 바늘을 통과시켜 왼쪽과 오른쪽 측면 모서리에 봉합을 삽입합니다(그림 4D).

4. 수령 작전

  1. 초기 단계
    1. 기증자에게 설명된 동일한 프로토콜(2.1.1단계)으로 수혜자 쥐를 마취합니다.
    2. 수혜 쥐를 37°C로 유지되는 온도 조절 온열 패드 위에 올려놓습니다.
    3. 참고: 마취 전에 수혜자 쥐의 무게를 측정하세요. 몸무게가 기증자의 체중보다 약 50g 이상 무겁게 유지되도록 하세요.
  2. 수혜자 간의 동원
    1. 정중 복강 절개술을 하세요.
    2. 네 개의 탄성 견인기를 사용해 복벽을 옆으로 당깁니다. 두 개의 상부 견인기는 양측 늑변 가장자리 옆에, 두 개의 하부 견인기는 양측 서혜부 부위 옆에 위치하여 최적의 노출을 달성하세요.
      참고: 조직이 하얗거나 호흡을 방해할 수 있는 과도한 긴장을 피하되, 수술 부위를 노출시킬 만큼 충분한 후퇴를 적용하세요.
    3. 왼쪽 하횡격정맥(LIPV)을 기증 시술에서 설명한 것과 동일한 방식으로 결찰합니다(2.2.1 단계 참조).
    4. 왼쪽 간엽과 후복막 사이의 인대를 해리합니다. 꼬리근과 유두엽을 동원하세요.
    5. 전기소작술을 사용해 식도와 왼쪽 간엽 사이의 인대와 전달 가지를 나누세요.
      참고: 전기소작술은 빠른 지혈을 보장하고 수술 시간을 단축하며 시술 재현성을 높이기 위해 권장됩니다.
    6. IHIVC를 우측 신장 정맥 수준까지 직접적으로 해부하세요.
    7. 왼쪽 부신정맥을 IHIVC와 합류하는 지점에서 약 2mm 떨어진 곳에서 신중하게 분리하고 결찰하세요.
    8. 기증자 시술에 설명된 것과 동일한 방법으로 간 오른쪽 하엽을 관리하세요(2.2.4단계 참조).
    9. 고무줄(멸균 수술용 장갑 커프에서 만든 약 10cm 길이)을 SHIVC 뒤쪽으로 가로로 통과시킵니다.
      참고: 호흡 운동을 제한하지 않으면서 SHIVC를 부드럽게 노출시키세요.
    10. SHIVC 횡단 시 사용될 수 있도록 고무줄은 그대로 두세요.
    11. 간구문에서 유문 정맥 지점까지 PV를 해부하여 분리합니다.
      참고: PV 박리는 문합 부위로 제한하세요. 주변 지류를 보존하여 수술 외상을 줄이세요.
    12. 간폐문에서 HA를 분리하세요.
    13. HA를 폐문과 맞닿게 연결하고 근위부로 절단하세요.
    14. 간폐문(hepatic hilum) 아래에서 CBD를 형성하는 좌우간관의 합류점을 확인하세요. 이 부위의 CBD를 7-0 Prolene 봉합사로 결찰하고 횡단합니다(그림 5A).
      참고: 이 부위의 수술 외상을 최소화하세요. HA의 가능한 최대 길이와 주변 결합 조직, 신경 신경총, 미세혈관망을 보존하여 측부 순환의 조기 확립을 촉진합니다.
  3. 수혜자 간절제술
    1. 미세혈관 클램프를 적용하여 IHIVC를 즉시 오른쪽 신정맥에 막으세요.
    2. 유문 정맥과 유문 정맥 바로 위의 PV를 막기 위해 미세혈관 클램프를 적용하세요.
    3. 간 실질의 눈에 띄는 어두운 색을 관찰하여 혈관 폐색이 성공적으로 이루어졌음을 확인합니다.
      참고: 간의 균일한 어두움(청색증), 실질 팽도 상실, PV 붕괴로 인한 혈관 폐색을 확인하십시오.
    4. 5mL 주사기에 연결된 23G 두피 정맥 바늘을 PV에 삽입하세요.
    5. 약 30초에 걸쳐 5% 포도당 용액 2mL를 주입하여 간 내 혈액을 전신 순환으로 배출합니다.
      참고: 간구문 근처의 PV를 통해 천천히 주입하여 간내 혈액을 전신 순환계로 배출하세요.
    6. 고무줄에 아래로 당겨져 SHIVC를 노출시키세요.
    7. 혈관 클램프를 사용해 SHIVC를 교차 클램프합니다(그림 5B).
    8. 간실질과 수평된 IHIVC, PV, SHIVC를 절단하세요.
    9. 복강에서 천연 간을 완전히 제거하세요.
      참고: 간구기를 26분 이내(30분을 초과하지 않음) 유지하세요. 혈관은 간과 밀접하게 밀착하여 적절한 길이를 유지하고 혈관 절단선의 매끄러움을 보장합니다.
  4. 간 이식 이식
    1. SHIVC 재건
      1. 간 이식편을 정형적인 해부학적 위치로 위치시키세요.
      2. 왼쪽 모서리에 미리 놓인 7-0 봉합사를 사용해 오른쪽 모서리 쪽으로 후벽을 연속적으로 봉합하기 시작하세요.
      3. 봉합선을 오른쪽 모서리의 스테이 봉합선에 고정하세요.
      4. 문합을 완성하기 위해 앞벽을 따라 계속 주행 봉합을 이어가세요(그림 6A–6C).
      5. 혈관 가장자리에서 바늘 진입 거리를 0.5–1.0 mm 유지하세요.
      6. 봉합선 간격은 1.0–1.5mm로 유지하세요.
        참고: 안정적이고 긴장이 없는 문합을 위해 바늘 간격과 봉합선 각도를 일정하게 유지하세요.
      7. 각 코 후에 봉합사를 조여 죽은 공간을 제거하고 적절한 장력을 유지하세요.
        참고: 전벽 봉합을 완료하기 전에 잔류 바늘을 사용해 UW 용액으로 SHIVC를 세척하여 잔여 공기를 배출하고 공기 색전증을 예방하세요.
    2. 태양광 재구성
      1. 수령 측 PV 스텀프의 좌우 모서리에 7-0 스테이 봉합사를 설치하세요.
      2. 삼각형 개구부를 만들기 위해 3점 접지력을 적용하세요.
      3. 커프에 묶인 기증자 PV를 루멘에 삽입하세요.
      4. 7-0 결렬을 원형 홈에 묶어 고정합니다(그림 6D–6F).
    3. IHIVC 재건
      1. PV 재구성과 동일한 기법으로 IHIVC를 재구성합니다(4.4.2 단계 참조) (그림 6G–6I).
    4. 재관류
      1. SHIVC, PV, IHIVC에 혈관 클램프를 순차적으로 해제합니다.
      2. 응혈, 출혈, 누출 없이 균일한 색 회복을 관찰하여 성공적인 재관류를 확인한다(그림 7A).
        참고: 담관에서 활발히 생산되는 담즙은 간관류 및 초기 이식 기능 회복을 나타냅니다.
    5. 담도 재건
      1. 수혜자 CBD 절단기 앞벽에 관의 절반 직경으로 작은 횡절개를 하세요.
      2. 기증 담도 스텐트를 약 3mm 정도 CBD 내강에 삽입하세요.
      3. 스텐트를 7-0 원형 봉합사로 고정하세요(그림 7B).
        참고: 재건 완료 전에 기증자 스텐트 원위 끝에서 활동성 담즙 유출을 관찰하세요. 이는 개폐성과 초기 이식 기능을 확인시켜 줍니다.
  5. 수신자 재예열
    1. 복부 폐쇄 전에 37°C에서 150mL 생리식염수로 복강을 세척하세요.
      참고: 이 단계는 잔류 혈액을 제거하고 체온을 회복시키며, SHIVC, IHIVC, PV 문합에서 지혈 상태를 검사할 수 있게 합니다.
  6. 복부 봉합 및 수술 후 관리
    1. 근막층을 4-0 흡수성 실로 연속 주행 봉합을 하여 1cm 간격으로 5mm 간격으로 물어 봉합합니다.
    2. 4-0 실크실로 연속 러닝 봉합을 사용해 피부를 봉합합니다.
    3. 부프레노르핀(0.1 mg/kg)을 12시간마다 피하 투여하여 총 2회 투여합니다.
    4. 수령 쥐를 깨끗하고 온도 조절이 가능한 우리로 옮기세요.
    5. 마취에서 완전히 회복하고 정상적인 자발적 움직임이 재개될 때까지 지속적으로 모니터링하세요.

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그림 5. 수혜자 간 이동 및 간절제술 중 주요 수술 단계. (A) 융문 분기점 근처에서 수혜자 CBD의 식별 및 결찰. (B) SHIVC의 노출 및 교차 클램프. SHIVC 뒤에는 고무줄이 설치되어 클램핑 시 접지력을 제공하고 시야를 개선합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6. 간 이식 시 혈관 재건을 위한 주요 수술 단계. SHIVC 재구성: (A) 코너스테이 봉합사를 이용한 정렬, (B) 후벽 연속 봉합, (C) 전벽 봉합 완료. 커프 기법을 이용한 PV 재건: (D) 3점 견인, (E) 커프드 기증 PVC 삽입, (F) 커프를 고정하는 결찰. 동일한 커프 기법을 사용한 IHIVC 재건: (G) 노출, (H) 삽입, (I) 결찰. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 7. 이식편 기능 확인, 담도 재건 및 수술 후 회복. (A) 재관류 후 초기 이식편 기능 평가, 기증자 담도 스텐트에서 눈에 띄는 담즙 유출. PV와 IHIVC 재구성이 보입니다. (B) 기증자 담도 스텐트를 수혜자 CBD에 삽입 및 고정하는 담도 재건술을 완료함. (C) 수술 후 완전한 회복을 보이며 정상 자세와 자발적 활동을 보이는 대표적 수혜자 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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결과

NArLT 모델 전반에 걸쳐 일관된 수술적 품질과 재현성을 보장하기 위해 모든 시술은 동일한 경험 많은 미세외과 의사가 수행했습니다. 연구 기간 동안 총 50건의 쥐 간 이식이 완료되었습니다. 수술 절차의 평균 소요 시간은 다음과 같았습니다: 기증자 수술 평균 25.3분 ± 2.6분, 체외 이식편 준비 시간은 평균 13.1분± 2.1분, 수혜자 수술 평균 43.0분 ± 1.6분, 무간기 평균 15.7분± 1.2분이었습니다.

최적화된 NArLT 절차를 받은 수혜자는 100일 관찰 기간 동안 94%(47/50)의 생존율을 보였으며, 수술 전후 사망도 이 계산에 포함되었습니다. 세 마리의 수혜 쥐가 죽었습니다. 부검 결과 한 명은 유출 경로 폐쇄, 한 명은 SHIVC에서의 출혈, 그리고 한 명은 수술 후 회복 중 원인 없이 발생한 것으로 밝혀졌다. 모든 생존한 수혜자 쥐는 100일 동안 관찰되었고, 연구 종료 시 부검을 받았...

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토론

NArLT 모델은 복잡한 미세혈관 동맥 문합을 피함으로써 실험적 이식 연구의 초석입니다. 그러나 기존 NArLT 방법은 역사적으로 최대 30%에 달하는 높은 담도 합병증 발생률로 인해 장기 생존율이 심각하게 제한되고 만성 면역학 연구에도 어려움을 겪어왔습니다2. 제안된 방법의 중요성은 이러한 허혈성 담도 손상을 우회할 수 있다는 점에 있습니다. 이 연구에서 100일 생존율은 94%에 달했으며, 이는 이전 쥐 간이식 연구에서 보고된 단기 생존율보다 높은 수치입니다.

이 프로토콜 내에서 이식편의 생존성과 수혜자의 생존을 보장하는 데 필수적인 여러 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 것은 기증자 준비 시 사용하는 '노터치' 담도 박리 기법입니다. CBD의 과도한 골격화를 엄격히 피함으로써, 회피 ...

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국국가자연과학기금(번호 82370666), 중국 산둥성 중점연구개발 프로그램(번호 2025KJHZ016), 푸젠성 보건기술프로젝트(번호 2023CXA014)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-0 흡수성 봉합사에티콘W9109H근막층(백선)의 폐쇄에 사용됩니다.
4-0 실크 스튜어에티콘VCP304H피부 닫힘에 사용
7-0 또는 8-0 봉합 / 실크 타이에티콘Z1711E혈관 결찰(예: 좌측 횡격정맥) 결찰에 사용됨
22G 정맥 카테터B. 브라운4252098B5&ndash로 다듬어졌고; 담도 스텐트 준비를 위해 7mm 끝이 기울어진 상태에서
23G 두피 정맥 바늘산둥 친카이 의료공업 유한회사.MDLSSVS간 관류를 위해 복대동맥에 삽입하는 데 사용됩니다
부프레노르핀톈진 제약연구소 제약유한회사.H12020275수술 후 피하 진통으로 투여
면봉Aoocn216-236해리 시 간을 부드럽게 올릴 때 사용했습니다
부서진 얼음해당 없음해당 없음체외 준비 중 이식 체온 유지 용도로 사용됩니다
탄성 견인기해당 없음해당 없음복강 절개 수술 중 복벽을 후퇴시키는 데 사용되었습니다
경막외 카테터 시스장쑤 마이창 의료기기 유한회사.20173084015사이즈는 5F와 6F; PV와 IHIVC의 수갑으로 사용됨
거즈중앙의료기술유한회사.CH-1001식염수에 젖은 상태; 장을 덮고 보호하기 위해 사용됩니다
포도당 용액 (5%)쓰촨 커룬 제약유한회사.H20044307수혜자 간절제술 시 간내 혈액을 세척하는 데 사용되었습니다
헤파린 생리식염수선전 생명 생명공학 유한회사.H2012003100 IU/mL; 담도 스텐트를 담그는 데 사용되었습니다
인데링 니들B. 브라운4254074B문합이 완료되기 전에 SHIVC를 세척하여 공기를 제거했습니다
이소플루란진남광성위안 생명공학 유한회사.153107015농도 5%; 마취 유도에 사용됨  
미세혈관 클램프상하이 의료기기 유한회사.JCZ200수술 중 혈관 폐색에 사용됨
모기 겸자상하이 의료기기 유한회사.J31010미세 조작과 커프 준비에 사용됩니다
생리식염수 (0.9%)쓰촨 커룬 제약유한회사.H20044304관개 및 거즈 담임에 사용됨(37° C)
펜토바르비탈 (1%)상하이 위안스테크놀로지 유한회사.P050000040– 45 mg/kg; 외과적 마취에 사용됨
말초 삽입 정맥 카테터(PIVC)코비디엔8888145015커프드 PV를 세척하고 개성 확인에 사용했습니다.
포비돈-요오드산시 트린다 생명공학 유한회사.41836054수술 부위 소독에 사용됩니다
러버밴드 (서저컬 글러브에서)앤셀해당 없음수혜자 수술 중 SHIVC 견인에 사용됨
스프래그와 대시; 도울리 래츠화푸캉(베이징) 생명공학 유한회사.22001A성체 수컷 쥐, 8과 ndash; 10주, 220달러 이상; 250g
멸균 페트리 접시 (10cm)산둥 엔요 생명공학 유한회사.H905001체외 준비 중 UW 용액에 이식편을 유지하는 데 사용됨
주사기 (20 mL)산둥 웨이가오 그룹 의료용 폴리머 제품 유한회사.20163141593조절된 간 관류에 사용됨(3– 3.5 mL/분) 
UW 보존 솔루션생명으로 가는 다리BTL-UW-1L4도; C; 기증자 간 관류 및 이식 보존에 사용

참고문헌

  1. Hirata, M., et al. Stepwise approach for acquisition of microsurgical skills through rat orthotopic liver transplantation experiments. Eur Surg Res. , (2023).
  2. Zhao, H., et al. Revisiting orthotopic rat liver transplant. Exp Clin Transplant. , (2021).
  3. Wu, W., et al. Research progress on anatomy reconstruction of rat orthotopic liver transplantation. Transplant Rev (Orlando). , (2024).
  4. Shi, J. H., Line, P. D., Zhang, S. J., Guo, W. Z. Experimental liver surgery for liver research: update, choice and translation. J Inflamm Res. , (2025).
  5. Engel, B., et al. Molecular signatures discriminating different types of rejection in human liver transplants. J Hepatol. , (2025).
  6. Khatua, C. R., Anirvan, P., Panigrahi, M. K., Singh, S. P. Admission Albumin-Bilirubin Score Is Inferior to MELD, MELD-Na+ and Child-Turcotte-Pugh Score in Predicting Survival in Indian Patients with Alcohol-associated Liver Disease. J Transl Gastroenterol. , (2025).
  7. Yu, H., et al. Low hepatic artery blood flow mediates NET extravasation through the regulation of PIEZO1/SRC signaling to induce biliary complications after liver transplantation. Theranostics. , (2024).
  8. Yang, Z., et al. Prognosis analysis of rat liver transplantation under direct vision of single operator. Transplant Proc. , (2024).
  9. Wang, Z., et al. Liver cold storage and transplantation in the cold-adaptive Daurian ground squirrels. J Vis Exp. , (2025).
  10. Wang, X., MacParland, S. A., Perciani, C. T. Immunological determinants of liver transplant outcomes uncovered by the rat model. Transplantation. , (2021).
  11. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat: technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. , (1979).
  12. Yuan, Z., et al. The effect of microcirculation disturbance of peribiliary vascular plexus on hepatic bile duct epithelial cells in rats undergoing liver transplantation and postoperative rejection reduction by nanocarrier mediation. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). , (2022).
  13. Zhao, D., et al. Regression of bile duct damage and bile duct proliferation in the non-rearterialized transplanted rat liver is associated with spontaneous graft rearterialization. Hepatology. , (1995).

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