터널링 나노튜브와 미토콘드리아 이동의 표준화 면역형광 영상 및 성상교세포와 뉴런 간 미토콘드리아 전달

요약

이 프로토콜은 터널링 나노튜브와 성상세포와 뉴런 간 미토콘드리아 전달을 시험관 내에서 시각화하기 위한 고정, 염색, 공초점 영상 방법을 표준화합니다.

초록

미토콘드리아는 신경세포에서 에너지 생산, 세포 신호 전달, 대사 항상성을 조절하는 필수 소기관입니다. 터널링 나노튜브(TNT)는 장거리 세포 간 통신을 매개하고 연결된 세포 간 미토콘드리아를 포함한 세포 구성 요소의 전달을 촉진하는 얇은 막 구조입니다. TNT와 미토콘드리아 전달의 신뢰성 있는 시각화는 샘플 취급이 매우 취약하고 고정, 세척, 영상 조건에 민감하기 때문에 신중한 샘플 취급이 필요합니다. 이 프로토콜은 성상교세포 및 성상교세포-뉴런 공형성 시스템에서 TNT의 고정, 염색 및 공초점 영상을 위한 표준화된 절차를 설명합니다. 워크플로우에는 TNT 시각화를 위한 막 및 세포골격 염색, 미토콘드리아 위치 추적을 위한 미토콘드리아 표지, Miro1 공동위치 분석을 위한 면역형광 염색이 포함됩니다. TNT 형태를 보존하기 위한 중요한 단계인 부드러운 세척과 빛 차단 처리가 절차 전반에 걸쳐 강조됩니다. 프로토콜은 고정세포 제제 내 TNT와 미토콘드리아의 특성 분석에 관한 영상 접근법도 개략적으로 제시합니다. 이 방법들은 시험관 내 신경세포 간 TNT 형성과 미토콘드리아 전달을 연구하는 재현 가능한 실험적 틀을 제공합니다.

서론

미토콘드리아는 세포의 에너지 공장 역할을 하며, 아데노신 삼인산 생성을 통해 세포 활동에 필요한 에너지를 제공하며, 세포 신호 전달과 산화환원 균형에도 중요한 역할을 합니다^. 신경계에서 미토콘드리아 대사산물은 신경 과정의 복잡성과 흥분성을 증가시켜 신경 성장과 발달을 지원할 수 있습니다². 미토콘드리아는 정적인 소기관이 아닙니다; 이들은 다양한 세포 내 및 세포 외 스트레스와 대사 요구에 적응하기 위해 형태, 위치, 분포를 지속적으로 변화^{시킵니다.} 세포 간 미토콘드리아 이식은 조직 항상성 유지에 기여하고 생리학적 조건에서 발달을 촉진하며, 병리적 조건에서는 손상 수리, 면역 조절, 질병 진행에 참여합니다 ^4,5.

물질과 에너지의 세포 간 소통은 세포 항상성, 조직 복구, 신경망 조절 등 다양한 생물학적 과정에 필수적입니다. 현재 연구들은 여러 세포 간 통신 방식을 밝혀냈으며, 그중 터널링 나노튜브(TNT)는 세포^{간 미토}콘드리아 전달과 관련된 가장 광범위하게 연구된 메커니즘 중 하나입니다. TNT는 F-악틴 기반의 다리 모양 막 구조로, 직경 50에서 200 nm에 이르고 길이⁷에 달하는 관 형태를 가지고 있습니다. 연구에 따르면 TNT는 신경세포 간의 물리적 연결 역할을 할 수 있으며, 신경퇴행성 질환, 뇌암 및 기타 질환의 발병 및 진행과 밀접한 관련이 있습니다. 예를 들어, 미세교세포에서 뉴런으로의 미토콘드리아 이동이 TNT를 통해 신경세포를 구출하는 것으로 보고된 바 있습니다 ^8,9.

현재 TNT 연구는 구조적 취약성을 포함하여 여러 도전에 직면해 있으며, 이는 손상에 취약하고 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다; TNT와 섬유족부 또는 다른 막 돌출부를 구분하기 어렵음; 그리고 세포 간 TNT의 정확한 정량화와 관련된 도전 과제들. TNT 관련 연구의 재현성과 일관성을 높이기 위해, TNT의 세척, 고정, 염색, 영상 검사에 대한 표준화된 방법이 필요하며, 이를 통해 실험적 변동성을 최소화하면서 구조와 분포를 정확히 평가할 수 있습니다. 고정 전 세포 밀도, 빛에 대한 보호, 세척 강도, 고정 지속 시간, 고정 후 염색 조건 등이 TNT의 구조와 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 본 연구에서는 성상교세포 및 성상교세포-뉴런 배양 시스템에서 TNT 및 미토콘드리아 관련 TNT 구조의 전처리, 염색 및 공초점 영상 검사 절차를 설명합니다.

이 연구 프로토콜은 대부분의 실험실 환경에 일반적으로 적용할 수 있습니다. 1차 성상교세포와 마우스 해마 신경세포주에서의 검증 결과, 이 프로토콜이 1차 신경세포와 불멸화 세포주 모두에 적합하다는 것이 확인되었습니다. 하지만 이 프로토콜에는 여전히 몇 가지 한계가 있습니다. 공초점 현미경은 TNT 시각화에 있어 초해상도 영상 접근법보다 공간 해상도가 낮으며, MitoTracker 기반 미토콘드리아 전달 평가는 염료 누출과 비미토콘드리아 신호 간섭에 의해 영향을 받을 수 있습니다¹⁰.

프로토콜

이 연구는 인간 대상이나 살아있는 척추동물을 포함하지 않았으며; 상업적으로 획득되었거나 확립된 세포주만 사용되었으며, 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다.

1. 성상교세포에서 TNT의 염색

1. 세포 시딩
   1. 씨앗으로 3번 통과(P3)에서 1차 쥐 성상교세포를 분리하여 35mm 유리바닥 배양 접시에 접시당 5× 10^{4개의 세포} 밀도로 투여했습니다. Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12) 완전 배지를 2mL에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 3중 항생제 혼합물(페니실린 G, 스트렙토마이신, 암포테리신 B)을 보충합니다. 세포를 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
   2. 세포를 약 24시간 동안 부양하여 부착이 이루어집니다.
2. 전처리 및 고정
   1. 세포 부착 후에는 배양 접시를 빛이 차단된 깨끗한 작업대로 옮기세요.
      참고: TNT의 무결성을 유지하기 위해 취급 중 불필요한 움직임과 진동을 최소화하세요.
   2. 배양지를 어두운 환경에서 조심스럽게 제거하세요.
      참고: 배양지 제거 시 세포 표면을 완전히 건조시키지 마세요. TNT가 붕괴되어 배양 기질에 부착될 수 있기 때문입니다.
   3. 칼슘과 마그네슘 이온(pH 7.3–7.5)이 없는 500 μL 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 한 번 세척합니다. 세척 중 세포간 TNT가 손상되지 않도록 배양 접시 벽을 따라 PBS를 천천히 추가하고 제거하세요.
   4. PBS를 조심스럽게 제거하세요.
   5. 세포를 상온(RT; 20°C–25°C)에서 어두운 조명 조건에서 30분간 파라포름알데히드(pH 7.2–7.4)가 포함된 상업용 4% 조직 세포 고정액으로 고정합니다.
      주의: 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 고정액을 다루고, 모든 절차를 기관의 화학 안전 지침에 따라 수행하세요.
   6. 고정액을 제거하세요.
   7. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
3. 세포 투과화 및 형광 염색
   1. 즉시 사용 가능한 Triton X-100 투과화 용액 500 μL로 세포를 20분간 RT에서 투과시킵니다.
      주의: Triton X-100은 취약한 TNT 구조를 방해할 수 있습니다. 투과성 과정에서 과도한 교란을 최소화하세요.
   2. 투과성 용액을 제거하세요.
   3. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
   4. 착색 용액은 사용 직전에 즉시 준비하세요. PBS에서 F-악틴 염색 염료를 최종 농도인 1 μM까지 희석한 후 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 즉시 사용할 수 있는 핵 염색제로 사용합니다. 사용 전에 두 가지 염색액을 충분히 섞으세요.
      참고: 팔로이딘 기반 염색 시약은 F-액틴 시각화의 대체 수단으로 사용될 수 있습니다.
   5. F-액틴과 핵 염색액을 1:1 비율(같은 부피)으로 빛이 차단된 조건에서 혼합합니다.
   6. 준비된 염색액을 배양 요리에 추가하세요.
   7. 세포를 어두운 환경에서 37°C에서 30분간 배양합니다.
   8. 염색 용액을 제거하세요.
   9. 세포를 PBS로 세 번 세척하고, 각 세척당 500 μL을 1분씩 사용하세요.
   10. 영상 준비 중 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 PBS 1mL를 추가하세요.
4. 공초점 영상
   1. ×20 대물렌즈가 장착된 니콘 역방향 공초점 현미경으로 이미지를 획득하세요. DAPI에는 405nm 여기, F-액틴 염색에는 488nm 여기를 사용하세요. RT에서 빛 차단 조건에서 1024 × 1024 픽셀 해상도로 이미지를 촬영하세요.
   2. 표본당 최소 5개 무작위로 선정된 시야를 사용하여 정성적 평가와 수동 정량화를 수행합니다. 각 시야각에 하나 이상의 TNT를 포함한 TNT 양성 세포의 수와 TNT 양성 셀의 수를 정량화합니다(그림 1A 및 1B).
      참고: 염색 직후 이미지를 획득하여 형광 손실과 TNT의 구조적 파괴를 최소화하세요.

그림 1: 성상교세포에서 터널링 나노튜브(TNT)의 형광 염색. (A) 유리 바닥 배양 배양 배양된 성상교세포에서 핵 및 F-액틴 염색을 보여주는 대표적인 공초점 현미경 이미지. (B) 패널 A의 박스형 영역 확대 시야. 흰색 화살표는 인접 세포 사이에 TNT와 유사한 구조가 있음을 나타냅니다. (C) 부적절한 샘플 취급 후 파괴된 TNT 유사 구조를 보여주는 대표적인 이미지. (D) 패널 C의 박스 구역 확대 시야. 노란 화살표는 파괴된 TNT 유사 구조를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. TNT를 통한 성상교세포에서 뉴런으로의 미토콘드리아 전달을 위한 염색

1. 성상교세포 씨앗 및 미토콘드리아 표지
   1. 씨앗으로 3번 통로(P3)에서 1차 쥐 성상교세포를 분리하여 35mm 유리바닥 배양 접시에 3× 10^{4 세포 밀도} 로 투여했습니다. DMEM/F-12 완전 배양지 2mL에 10% FBS와 1% 3중 항생제 혼합물(페니실린 G, 스트렙토마이신, 암포테리신 B)을 보충합니다. 세포를 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
   2. 세포를 약 24시간 동안 부양하여 부착이 이루어집니다.
   3. 세포 부착 후에는 배양 접시를 어두운 조명 환경에서 깨끗한 작업대로 옮기세요.
      참고: TNT의 무결성을 유지하기 위해 취급 중 불필요한 움직임과 진동을 최소화하세요.
   4. 배양지를 빛이 차단된 환경에서 조심스럽게 제거하세요. 미디엄 제거 시 TNT를 방해하지 마세요.
      참고: 배양지 제거 시 세포 표면을 완전히 건조시키지 마세요. TNT가 붕괴되어 배양 기질에 부착될 수 있기 때문입니다.
   5. 디메틸설폭화물(DMSO)에서 50 μg의 동간 미토트래커 염료를 재구성하여 1 mM 스톡 용액을 준비하고 스톡 용액을 −20°C에 보관합니다. 사용 전, 기본 용액을 400 μL 완전 DMEM/F-12 배지에 10% FBS 및 1% 삼중 항생제 혼합물을 보충하여 최종 50 μM의 MitoTracker 농도를 얻습니다.
      주의: 형광 염료는 준비 및 배양 과정에서 직사광선으로부터 보호하세요.
   6. 미토콘드리아 염색 작업 용액을 배양 접시에 추가하세요.
   7. 세포를 37°C에서 5% CO₂가 포함된 가습 인큐베이터에서 30분간 빛이 차단된 조건 하에서 배양합니다.
   8. 미토콘드리아 염색 용액은 빛이 차단된 환경에서 제거하세요.
   9. 칼슘과 마그네슘 이온이 없는 500 μL PBS(pH 7.3–7.5)로 세포를 부드럽게 한 번 세척합니다. 세척 중 세포간 TNT가 손상되지 않도록 배양 접시 벽을 따라 PBS를 천천히 추가하고 제거하세요.
   10. PBS를 조심스럽게 제거하세요.
2. 성상교세포-뉴런 공배양
   1. 씨앗으로 생쥐 해마 신경세포를 3번 통과(P3)에서 성상교세포 함유 배양 접시에 불멸화했으며, 한 접시당 3× 10^{4개의 세포} 밀도를 보였습니다. 총 2mL의 세포를 추가하는데, DMEM과 DMEM/F-12 완전배지를 1:1 혼합물에 10% FBS와 1% 삼중 항생제 혼합물을 보충합니다. Transwell 삽입물 없이 직접 접촉 방식으로 공화를 확립하세요. 세포를 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
      참고: 기존 TNT 구조의 교란을 최소화하기 위해 신경세포를 부드럽게 추가하세요.
   2. 표준 인큐베이터 조건에서 24시간 동안 공동 배양을 유지하며, 취급 과정에서 샘플을 불필요한 빛 노출로부터 보호합니다.
3. 고정 및 투과화
   1. 배양지는 빛이 차단된 환경에서 제거하세요.
   2. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
   3. 세포를 4% 조직 세포 고정액에 파라포름알데히드가 포함된 용액으로 30분간 RT에서 어두운 조명 조건에서 고정합니다.
      주의: 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 고정액을 다루고, 모든 절차를 기관의 화학 안전 지침에 따라 수행하세요.
   4. 고정액을 제거하세요.
   5. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
   6. 500 μL 즉시 사용 가능한 Triton X-100 투과화 용액으로 20분간 어두운 조명 조건에서 RT 상태에서 투과시킵니다.
      주의: Triton X-100은 취약한 TNT 구조를 방해할 수 있습니다. 투과성 과정에서 과도한 교란을 최소화하세요.
   7. 투과성 용액을 제거하세요.
   8. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
4. 형광 염색 및 영상
   1. 착색 용액은 사용 직전에 즉시 준비하세요. F-액틴 염색 염료를 PBS에 최종 농도인 1 μM까지 희석한 후 DAPI를 즉시 사용할 수 있는 핵 염색제로 사용합니다. 사용 전에 염색 용액을 충분히 섞으세요.
      참고: 팔로이딘 기반 염색 시약은 F-액틴 시각화의 대체 수단으로 사용될 수 있습니다.
   2. 사용 직전에 빛이 차단된 조건에서 F-액틴과 핵 염색액을 1:1 비율(같은 부피)으로 혼합하세요.
   3. 준비된 염색액을 배양 요리에 추가하세요.
   4. 세포를 어두운 환경에서 37°C에서 30분간 배양합니다.
   5. 염색 용액을 제거하세요.
   6. 세포를 PBS로 세 번 세척하고, 각 세척당 500 μL을 1분씩 사용하세요.
   7. 영상 준비 중 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 PBS 1mL를 추가하세요.
   8. ×20 대물렌즈가 장착된 니콘 역방향 공초점 현미경으로 이미지를 획득하세요. DAPI에는 405nm 여기, F-액틴 염색에는 488nm, MitoTracker 염색에는 665nm 여기를 사용하세요. RT에서 빛 차단 조건에서 1024 × 1024 픽셀 해상도로 이미지를 촬영하세요.
   9. 표본당 최소 5개 무작위로 선정된 시야를 사용하여 정성적 평가를 수행하세요. 세포 간 막 연결 내에서 TNT 유사 구조와 미토콘드리아 관련 형광 신호의 존재를 평가합니다(그림 2A 및 2B).
      참고: 염색 직후 이미지를 획득하여 형광 손실과 TNT의 구조적 파괴를 최소화하세요.

그림 2: 성상교세포-뉴런 공동 배양 시스템에서 미토콘드리아와 TNT의 형광 염색. (A) 유리 바닥 배양 배양 접시에서 배양된 성상교세포와 뉴런에서 핵, 미토콘드리아, F-액틴 염색을 보여주는 대표적인 공초점 현미경 이미지. 성상교세포는 불규칙한 별 모양 또는 다각형 형태를 보이며 세포 돌기가 확장된 반면, 신경세포는 둥글거나 타원형이며 가느다란 신경돌 유사 연장을 보였다. (B) 패널 A의 박스형 영역 확대 시야. 흰색 화살표는 세포 간 미토콘드리아 관련 TNT 유사 구조를 나타냅니다. 두 세포 집단은 주로 고유한 세포 형태학에 따라 구분되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. TNT에서 미토콘드리아와 Miro1의 면역형광 공동위치 염색

1. 성상교세포 씨앗 및 미토콘드리아 표지
   1. 씨앗으로 3번 통로(P3)에서 1차 쥐 성상교세포를 분리하여 35mm 유리바닥 배양 접시에 3× 10^{4 세포 밀도} 로 투여했습니다. DMEM/F-12 완전 배양지 2mL에 10% FBS와 1% 3중 항생제 혼합물(페니실린 G, 스트렙토마이신, 암포테리신 B)을 보충합니다. 세포를 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
   2. 세포를 약 24시간 동안 부양하여 부착이 이루어집니다.
   3. 세포 부착 후에는 배양 접시를 어두운 조명 환경에서 깨끗한 작업대로 옮기세요.
      참고: TNT의 무결성을 유지하기 위해 취급 중 불필요한 움직임과 진동을 최소화하세요.
   4. 배양지를 빛이 차단된 환경에서 조심스럽게 제거하세요. 미디엄 제거 시 TNT를 방해하지 마세요.
      참고: 배양지 제거 시 세포 표면을 완전히 건조시키지 마세요. TNT가 붕괴되어 배양 기질에 부착될 수 있기 때문입니다.
   5. DMSO에서 50 μg의 동사성 미토트래커 염료를 재구성하여 1 mM 스톡 용액을 준비하고 이를 −20°C에서 보관합니다. 사용 전, 기본 용액을 400 μL 완전 DMEM/F-12 배지에 10% FBS 및 1% 삼중 항생제 혼합물을 보충하여 최종 50 μM의 MitoTracker 농도를 얻습니다.
      주의: 형광 염료는 준비 및 배양 과정에서 직사광선으로부터 보호하세요.
   6. 미토콘드리아 염색 작업 용액을 배양 접시에 추가하세요.
   7. 세포를 37°C에서 5% CO₂가 포함된 가습 인큐베이터에서 30분간 빛이 차단된 조건 하에서 배양합니다.
   8. 미토콘드리아 염색 용액은 빛이 차단된 환경에서 제거하세요.
   9. 칼슘과 마그네슘 이온이 없는 500 μL PBS(pH 7.3–7.5)로 세포를 부드럽게 한 번 세척합니다. 세척 중 세포간 TNT가 손상되지 않도록 배양 접시 벽을 따라 PBS를 천천히 추가하고 제거하세요.
   10. PBS를 조심스럽게 제거하세요.
2. 성상교세포-뉴런 공배양
   1. 씨앗으로 생쥐 해마 신경세포를 3번 통과(P3)에서 성상교세포 함유 배양 접시에 불멸화했으며, 한 접시당 3× 10^{4개의 세포} 밀도를 보였습니다. 총 2mL의 세포를 추가하는데, DMEM과 DMEM/F-12 완전배지를 1:1 혼합물에 10% FBS와 1% 삼중 항생제 혼합물을 보충합니다. Transwell 삽입물 없이 직접 접촉 방식으로 공화를 확립하세요. 세포를 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
      참고: 기존 TNT 구조의 교란을 최소화하기 위해 신경세포를 부드럽게 추가하세요.
   2. 표준 인큐베이터 조건에서 24시간 동안 공동 배양을 유지하며, 취급 과정에서 샘플을 불필요한 빛 노출로부터 보호합니다.
3. 고정 및 투과화
   1. 배양지는 빛이 차단된 환경에서 제거하세요.
   2. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
   3. 파라포름알데히드(pH 7.2–7.4)가 포함된 상업용 4% 조직 세포 고정액으로 30분간 RT 환경, 어두운 조명 조건에서 세포를 고정합니다.
      주의: 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 고정액을 다루고, 모든 절차를 기관의 화학 안전 지침에 따라 수행하세요.
   4. 고정액을 제거하세요.
   5. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
   6. 500 μL 즉시 사용 가능한 Triton X-100 투과화 용액으로 20분간 어두운 조명 조건에서 RT 상태에서 투과시킵니다.
      주의: Triton X-100은 취약한 TNT 구조를 방해할 수 있습니다. 투과성 과정에서 과도한 교란을 최소화하세요.
   7. 투과성 용액을 제거하세요.
   8. 세포를 PBS로 한 번 세척하세요.
4. 차단 및 면역형광 염색
   1. 5% 염소 혈청으로 1시간 동안 어두운 조명 환경에서 RT에서 세포를 차단하세요. 염소 혈청을 PBS에 1:20 희석하여 차단액을 준비합니다.
   2. 차단액을 제거하세요.
   3. PBS에 희석된 토끼 단클론 항-Miro1 항체를 1:100 희석 비율로 사용. 희석된 1차 항체 용액을 배양 배양 접시에 넣고 4°C에서 하룻밤(12–16시간) 배양합니다.
      참고: 염색 과정 내내 형광 표지된 샘플을 직사광선으로부터 보호하세요.
   4. 1차 항체 용액을 제거하세요.
   5. 세포를 PBS로 세 번 세척하고, 각 세척당 500 μL을 1분씩 사용하세요.
   6. 형광 염소 항토끼 2차 항체를 1:100 희석 비율로 PBS에 희석합니다. 각 배양 접시에 희석된 2차 항체 용액 500 μL을 추가하고 빛 보호 조건에서 1시간 배양합니다.
      참고: 본 연구에는 1차 항체 없는 대조군이 포함되지 않았습니다. 향후 실험에서는 염색 특이성을 더욱 검증하기 위해 적절한 면역형광 대조군을 포함해야 합니다.
   7. 형광 2차 항체 용액을 제거하세요.
5. 형광 염색 및 영상
   1. 착색 용액은 사용 직전에 즉시 준비하세요. F-액틴 염색 염료를 PBS에 최종 농도인 1 μM까지 희석한 후 DAPI를 즉시 사용할 수 있는 핵 염색제로 사용합니다. 사용 전에 염색 용액을 충분히 섞으세요.
      참고: 팔로이딘 기반 염색 시약은 F-액틴 시각화의 대체 수단으로 사용될 수 있습니다.
   2. 염색액을 배양 요리에 추가하세요.
   3. 세포를 어두운 환경에서 37°C에서 30분간 배양합니다.
   4. 염색 용액을 제거하세요.
   5. 세포를 PBS로 세 번 세척하고, 각 세척당 500 μL을 1분씩 사용하세요.
   6. 영상 준비 중 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 PBS 1mL를 추가하세요.
   7. ×20 대물렌즈가 장착된 니콘 역방향 공초점 현미경으로 이미지를 획득하세요. 총 40 μm(8개의 광학 단면) 동안 5 μm 스텝 크기를 사용하여 Z-스택 이미지를 수집합니다. DAPI에는 405nm 여기, F-액틴 염색에는 488nm, Miro1 면역염색에는 594nm, MitoTracker 염색에는 665nm 여기를 사용합니다. RT에서 빛 차단 조건에서 1024 × 1024 픽셀 해상도로 이미지를 촬영하세요.
   8. 표본당 최소 5개 무작위로 선정된 시야를 사용하여 정성적 평가를 수행하세요. TNT 유사 구조, 미토콘드리아 관련 형광 신호, 그리고 세포 간 막 연결 내 Miro1과 미토콘드리아 관련 염색 간의 명백한 공존 위치를 평가합니다(그림 3A–3C).
      참고: 염색 직후 이미지를 획득하여 형광 손실과 TNT의 구조적 파괴를 최소화하세요.

그림 3: 성상교세포-뉴런 공동 배양 시스템에서 TNT에서 미토콘드리아와 Miro1의 공동위치 염색 . (A) 유리 바닥 배양 접시에서 배양된 성상교세포 및 뉴런에서 핵, 미토콘드리아, Miro1, F-액틴 염색을 보여주는 대표적인 공초점 현미경 이미지. 흰색 화살표는 TNT 유사 구조 내에서 미토콘드리아 관련 신호와 Miro1 사이의 명백한 공존 위치 영역을 나타냅니다. (B) 인접한 셀 사이에 형성된 TNT 유사 구조를 보여주는 3차원 재구성 Z-스택 이미지. (C) 인접 셀 사이에 TNT와 유사한 구조가 확장된 동일한 Z-스택 이미지의 측면 뷰 재구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

성상교세포 단일배양 제제에서는 F-액틴과 핵 염색 후 인접 세포를 연결하는 얇은 막 돌출부가 관찰되었습니다(그림 1A 및 1B). 인접한 성상교구 사이에 여러 개의 TNT 유사 구조가 발견되었고, 개별 성상교세포는 여러 주변 세포와 자주 연결되었다. TNT와 유사한 구조물의 성공적인 보존은 세척 및 고정 절차 중 부드러운 다루기와 관련이 있었습니다. 배지 제거 또는 세척 시 과도한 기계적 교란으로 인해 검출 가능성이 감소하고 이 막 연결부의 구조적 파손이 발생했으며, 이는 부적절한 시료 취급 후 TNT와 유사한 구조가 파손된 것으로 나타난다(그림 1C 및 1D).

성상교세포-뉴런 공동 배양 제제에서, MitoTracker 염색과 공초점 영상 이후 인접 세포를 연결하는 TNT 유사 구조 내에서 미토콘드리아 관련 형광 신호가 관찰되었습니다(그림 2A 및 2B). 이 구조들은 F-액틴 및 핵 염색과 함께 시각화되어 TNT 유사 연결의 형태학적 평가를 지원하였다. 적절한 광 보호와 세척 강도 최소화는 영상 준비 중 형광 신호와 TNT 형태의 보존을 개선했습니다.

면역형광 동위치화 실험에서, 성상교세포-뉴런 공동 배양 제제의 TNT 유사 구조 내에서 미토콘드리아 관련 염색과 Miro1 면역염색에 해당하는 중복 형광 신호가 관찰되었습니다(그림 3A). 이러한 관찰은 Miro1과 TNT 유사 구조 내에 국한된 미토콘드리아 간의 잠재적 연관성을 시사합니다. 3차원 재구성된 Z-스택 영상은 인접 세포 사이에 TNT 유사 구조가 존재함을 더욱 뒷받침했다(그림 3B 및 3C). TNT 보존, 형광 신호 강도, 영상 품질은 고정, 투과, 영상 조건에 의해 영향을 받았습니다.

토론

위에서 설명한 실험 프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 고정 전 광 보호 전처리입니다. TNT 유사 구조는 매우 취약하며, 인큐베이터에서 제거한 후에도 빛 차단 상태를 유지하는 것이 시료 준비 중 형광 신호 강도와 구조적 완전성을 유지하는 데 중요합니다. 두 번째 중요한 단계는 유체 흐름에 의해 발생하는 TNT 유사 구조의 교란을 최소화하기 위해 부드러운 조작과 함께 PBS 세척을 수행하는 것입니다. 이러한 핵심 처리 절차를 준수하면 TNT 유사 구조의 형태와 안정성을 유지하고 이후 영상 결과의 일관성을 향상시킵니다. 과도한 흡인, 장기간 세척, 강한 유체 교반은 샘플 처리 중 TNT 유사 구조의 붕괴나 파편화를 초래할 수 있습니다. TNT는 매우 역동적인 특성 때문에 빛에 민감합니다. 빛 노출에 의해 유도되는 광독성은 TNT 파괴를 일으켜 이러한 구조를 시각화하기 어렵게^{만듭니다.} 따라서 TNT 관련 실험 중에는 빛이 차단된 조건을 유지해야 합니다.

세포 내 미토콘드리아 운동은 특히 뉴런에서 세포 에너지 분포에 기여합니다. 연구에 따르면 미토콘드리아는 액틴 필라멘트와 미세소관을 따라 이동할 수 있습니다^. 최근 연구들은 또한 TNT가 신경세포 간 미토콘드리아 전달과 관련된 장거리 세포간 통신 구조로 기능할 수 있음을 입증했습니다¹³. 본 연구에서 설명된 방법론적 접근법은 신경세포 배양 시스템에서 TNT 유사 구조와 미토콘드리아 관련 형광 신호의 시각화를 가능하게 합니다. 이전 연구들은 신경세포 간 미토콘드리아 전달이 파킨슨병 및 뇌 허혈 손상과 같은 신경학적 질환에서 조직 수리와 신경보호 과정에 기여할 수 있음을 보여주었습니다^14,15. 이 연구에서 설명한 방법을 사용하여 성상교세포 간, 그리고 성상교세포와 뉴런 사이에 TNT 유사 구조가 관찰되었으며, 이 구조들 내에 국한된 미토콘드리아 관련 형광 신호도 함께 관찰되었습니다.

이전 연구¹⁰에서 언급했듯이, MitoTracker 염색은 염료 누출과 비미토콘드리아 신호 전달의 영향을 받아 데이터 신뢰성을 떨어뜨릴 수 있습니다. 이 한계를 해결하기 위해 향후 연구에서는 유전적으로 암호화된 미토콘드리아 표지와 같은 보다 견고한 방법을 사용하여 더 확실한 결과를 얻을 수 있어야 합니다. 현재의 실험 조건에서는 두 세포 유형이 주로 세포 형태학에 따라 구분되었는데, 이는 세포 유형 식별의 특이성을 저하시킬 수 있는 접근법입니다. 향후 연구에서는 세포 유형별 형광 표지를 도입하여 공동 배양 분석의 정확성을 높이야 합니다. Miro1은 미토콘드리아 막 외관에 국한된 어댑터 단백질로, 뉴런에서 미토콘드리아 수송 과정에 관여하는 것으로 알려져 있습니다^16,17. 본 연구에서 설명한 면역형광 공동위치 프로토콜을 사용하여, TNT 유사 구조 내에서 미토콘드리아 관련 염색과 Miro1 면역염색에 해당하는 중첩 형광 신호가 관찰되었습니다. 이러한 관찰은 Miro1과 TNT 유사 구조 내에 국한된 미토콘드리아 간의 잠재적 연관성을 시사합니다. 그러나 기존 공초점 현미경의 공간적 해상도는 얇은 막 돌출부 내 분자 공위치의 명확한 평가를 제한할 수 있습니다.

우리는 세포 간 TNT 유사 구조의 존재를 확인하기 위해 Z-스택 이미징을 수행했으며, 이를 통해 이러한 막 연결의 구조적 검증을 지원하였습니다. 현재 프로토콜은 대부분의 실험 환경에 적합하지만, 고정 세포의 공초점 이미징은 샘플 처리 중 살아있는 세포 이미징에 비해 연약한 TNT 유사 구조를 손실시킬 수 있어 정확한 TNT 정량이 제한될 수 있습니다¹⁸. 더불어, 고정 세포의 영상 촬영은 미토콘드리아 전달 방향성을 명확하게 결정할 수 없으므로 향후 연구에서 추가 연구가 필요합니다. 이 프로토콜은 신경세포 배양 시스템에서 TNT 유사 구조, 미토콘드리아 관련 신호 및 관련 단백질을 염색하기 위한 표준화된 실험 워크플로우를 제공합니다. 통제되지 않은 세척 및 고정 절차와 비교할 때, 이 프로토콜은 영상 준비 중 부드러운 샘플 취급과 형광 보존을 강조합니다. 이러한 방법들은 TNT 관련 영상 연구에서 실험적 일관성과 재현성을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

요약하자면, 본 연구는 TNT의 질적 평가와 TNT 유사 구조를 통한 미토콘드리아 수송 연구를 위한 실용적이고 폭넓게 적용 가능한 실험실 프로토콜을 제공합니다. 그러나 고정 및 세척과 같은 샘플 처리 단계는 라이브 셀 영상 접근법에 비해 정량 변동성을 초래할 수 있습니다. 더불어, 공초점 현미경은 초해상도 현미경보다 공간 해상도가 낮아 TNT의 상세한 구조적 특성 분석이 제한됩니다. 또한 MitoTracker 기반 미토콘드리아 염색은 염료 누출과 비특이적 신호 전달에 의해 영향을 받으며, 향후 연구에서 이 문제를 다루어 실험 정확도를 높이는 것이 필요합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1% triple antibiotic mixture	바이오샤프	BL142A	세포 배양 중 박테리아 및 곰팡이 오염 방지
4% 조직 세포 고정제	솔라비오	P1110	세포 고정 시약
Anti-Miro1 항체	앱캠	AB319154	Miro1에 대한 1차 항체
성상교세포	실험실에서 분리한 1차 세포	NA	신생아 SD 흰쥐 1~3일의 뇌 피질에서 분리한 성상교세포. 분리된 세포의 순도는 GFAP 염색으로 95% 이상임이 확인되었으며, 모든 실험에는 3번째 세대(P3) 세포가 사용되었습니다.
성상교세포 배양 배지 매체 (DMEM/F-12)	기브코	6125011	DMEM과 F-12을 1:1 비율(v/v)로 혼합하고, 10% 태아 우 혈청(FBS)과 1% 삼중 항생제를 보충
콘포컬 현미경	니콘 AX	ECLIPSE TI2-E	니콘 AX 콘포컬 현미경(니콘 코퍼레이션, 일본)을 사용하여 NIS-Elements(버전 5.4)로 제어하여 이미지를 얻었습니다.
DAPI	서비스바이오	G1012-100ML	핵 염색 염료
DMSO	바이오프록스	1084ML100	형광 염료 스톡 용액 제조에 사용되는 용매
F-액틴 염색 염료	써모 피셔 과학	A57243	세포 골격 구조 및 터널링 나노튜브의 시각화를 위한 F-액틴 염색 시약
태아 우 혈청	엑셀 바이오	FSD500	세포 배양에 필수 영양소 제공
형광 2차 항체 (Goat Anti-Rabbit IgG)	ABclonal	AS039	면역형광 염색을 위한 2차 항체
유리 바닥 세포 배양 접시	네스트	801001	콘포컬 현미경용 이미지 접시
염소 혈청	솔라비오	210C051	면역형광 염색을 위한 차단 시약
미토트래커 딥 레드	써모 피셔 과학	M22426	미토콘드리아 염색 염료
뉴런	CAS 세포 은행	HT22-GNM47	불멸화된 마우스 해마 뉴런은 DMEM 완전 배지에서 유지되었습니다. 3번째 세대(P3)의 세포를 수집하여 후속 실험에 사용했습니다.
뉴런 배양 배지 매체 (DMEM)	서비스바이오	G4511-500ML	GlutaPlus와 나트륨 피루브산으로 보충된 DMEM, HEPES 미포함, 10% 태아 우 혈청(FBS)과 1% 삼중 항생제 보충
인산염 완충 생리 식염수 (PBS)	서비스바이오	G4203-500ML	고정 및 염색 중 사용되는 세척 완충액
트라이톤 X-100	솔라비오	P1080	세포 투과성 시약