쥐 등근 신경절의 해리 및 분리

요약

등근 신경절(DRG)은 1차 감각 신경세포체를 포함하며 주변 감각 신호를 척수로 전달합니다. 이 프로토콜은 구조적으로 온전한 신경절의 표준화된 분리, 해부학적 분절 식별, 초보자를 위한 직관적 안내, 그리고 시술 조직 손상 감소를 지원하는 마우스 DRG 해리 방법을 설명합니다.

초록

1차 감각 신경세포체를 포함하는 등근신경절(DRG)은 말초 조직에서 척수로 감각 신호를 전달하는 중요한 중계 구조 역할을 합니다. 이들은 통증, 신경 손상, 신경퇴행성 질환 연구에서 중요한 역할을 합니다. 온전한 DRG 조직의 획득은 감각 뉴런의 기능적 특성, 분자 발현 및 병리학적 변화를 연구하는 데 매우 중요합니다. 그러나 DRG가 작고 척추관 깊숙이 위치해 있기 때문에 정확한 식별과 분리는 상당한 기술적 도전 과제를 제시합니다. 이 연구에서 우리는 마우스 DRG 분리를 위한 표준화된 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 DRG의 해부학적 위치, 척추관 노출, 그리고 신경절 분리에 관련된 주요 단계를 상세히 설명합니다. 전체 절차는 대표적인 이미지와 영상 녹화로 설명되어 있습니다. 이 접근법은 구조적으로 온전한 DRG 획득을 지원하며, 분절별 식별을 위한 해부학적 지침을 제공하며 H&E 염색 및 면역형광 분석에 적합합니다. 이전 DRG 해리 방법과 비교할 때, 이 방법은 분절별로 식별된 신경절의 표준화된 회수를 가능하게 하며, 초보자에게 직관적인 해부학적 지침을 제공하고, 시술적 조직 손상을 줄입니다.

서론

등근신경절(DRG)은 1차 감각 신경세포의 세포체를 포함하고 있으며, 기계적, 열적, 통각적 자극 등 말초 감각 신호를 척수로 전달하는 데 필수적인 구조입니다. ^1,2,3. 현재 DRG를 설명하는 고품질 자료가 제공되고 있지만, 단일 표본 내에서 흉부에서 천골 구간까지 DRG를 정확히 식별하고 분리하고, 조직 채취 중 DRG 손상 위험을 최소화하기 위해서는 상세한 절차적 지침이 여전히 필요합니다.

DRG 뉴런은 말초 감각 경로의 핵심 구성 요소입니다. 축삭은 분기하여 한 가지는 말초 조직으로, 다른 하나는 척수의 등쪽 뿔로 돌출되어 통증 전달, 신경 손상, 염증 반응, 다양한 신경 질환의 병인에 중요한 역할을 합니다. 또한 DRG는 신경 손상 수리, 만성 통증 기전, 감각 신경 가소성, 신경면역 조절 등 연구 분야에서 상당한 주목을 받고 있습니다 ^5,6. 면역조직화학 염색, RNA 시퀀싱 분석, 1차 신경 배양, 전기생리학적 연구 등 다양한 실험 연구에서 DRG 조직이 온전한 상태로 필요합니다^. 따라서 구조적으로 온전하고 정확히 분절이 식별된 DRG 조직의 획득은 감각 신경 회로, 신경 분자 특성, 병리학적 변화 연구에 근본적입니다.

DRG는 척추간공 근처에 위치하며 등쪽 루트를 통해 척수와 연결되어 있습니다. 크기가 작고, 뼈 구조 안에 갇혀 있으며, 주변 해부학적 구조가 복잡하기 때문에 온전한 격리 작업은 상당한 기술적 도전을 안겨줍니다. 또한, 명확한 해부학적 랜드마크와 표준화된 절차가 부족하면 조직 채취 시 구조적 손상이나 분절 오식별 위험이 증가합니다.

기존의 마우스 DRG 해부 방법과 비교할 때, 본 연구에서 확립된 방법은 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. 첫째, 이전에 보고된 마우스 DRG 분리 방법은 일반적으로 척추를 제거한 후 분리된 척추의 분절과 정중선 개방을 시행한 후, DRG를 추간공에서 박리하는 것을 요구합니다. 이 과정에서 척추 절단과 반복적인 절개는 DRG에 기계적 손상을 일으키기 쉽고, 특정 마디의 누락이나 명확한 분절 식별 불분명한 결과를 초래할 수^{있습니다.} 반면, 저희 방법은 척추 기둥의 사전 분리나 절단 없이 마우스 내에서 직접 현장에서 시행하여 조직 채취 시 DRG 손실 위험을 줄입니다. 시술 전반에 걸쳐 기구는 신경절 자체를 직접 잡거나 당기지 않고 주로 DRG를 둘러싼 뼈 구조와 결합 조직에 적용되어 신경절의 완전성을 유지합니다.

둘째, 기존 방법들은 서로 다른 DRG 구간을 식별할 명확하고 안정적인 해부학적 기준이 부족한 경우가 많습니다. DRG에 연결된 신경이 척추 제거 시 자주 단절되기 때문에, 신경 경로와 분기 패턴을 바탕으로 개별 DRG의 분절 기원을 정확히 판단하기 어렵습니다. 반면, 저희 방법은 마우스에서 직접 현장에서 수행되어 DRG, 연결된 신경, 주변 구조 간의 자연스러운 해부학적 관계를 보존하여 신경 연결과 국소 해부학적 랜드마크에 따라 서로 다른 DRG 구간을 식별할 수 있게 합니다. 우리는 L2와 L3의 형태학적 특성을 주요 해부학적 기준점으로 사용하고, L3–L5와 좌골신경 간의 해부학적 관계를 함께 고려하고, 앞쪽과 꼬리 방향 모두에서 인접 구절을 순차적으로 식별할 것을 제안합니다.

더 나아가, 이 방법은 척추 및 척추관 노출, 척추관 개방 및 척수 노출, DRG 노출, 입체현미경 유도 위치 및 해리 등 주요 단계를 비교적 체계적으로 설명합니다. 작업 흐름이 명확하고 해부학적 특징이 명확하게 정의되어 있어 특히 초보자에게 절차적 표준화와 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법으로 얻은 DRG는 조직 무결성을 잘 유지하여 면역형광 및 H&E 염색을 포함한 후속 분석에 적합합니다.

본 연구에서는 마우스 DRG에 대한 표준화된 해리 및 분리 방법을 확립하고, 해부학적 위치 파악을 위한 도식과 샘플링 절차의 대표적인 이미지 및 영상 문서화를 제공하였습니다. 이 방법은 단일 표본에서 흉부에서 천골 부위까지 DRG를 분리하는 것을 지원하며, 조직 채취 중 DRG 손상 위험을 줄여줍니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 상하이 동병원 기관 동물 관리 및 이용 위원회가 승인한 프로토콜에 엄격히 따라 수행되었습니다. 이 연구에서 설명된 해부 절차는 성체 C57BL/6 쥐(수컷 또는 암컷, 12주, 25–30g 포함)를 사용하여 수행되었습니다. 그림 1 은 이 프로토콜에서 사용되는 해부 기구를 보여줍니다.

1. 준비

참고: 관류 고정 시료의 경우, 고정제 노출을 피하기 위해 적절한 보호 조치를 취하세요. 해부는 연기통이나 통풍이 잘 되는 벤치에서 수행하며, 시술 내내 장갑, 보호복, 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.

1. 쥐를 약 24°C의 주변 온도와 55%의 상대 습도에서 12시간 빛/12시간 어둠 주기 내에 유지하며, 자유롭 게 먹이와 물을 섭취할 수 있도록 하세요.
2. 해부를 시작하기 전에, 호흡이 완전히 멈출 때까지 이산화탄소 챔버에서 쥐를 안락사시키세요. 사망을 확인한 후 동물을 해부판 위에 눕히고 핀으로 팔다리를 고정해 안정된 자세를 유지합니다.
3. 흉복부 털에 70% 에탄올을 뿌려 모발 오염을 줄이고 수술 부위를 깨끗하게 유지하세요.
4. 가위를 사용해 흉부와 복부 중앙선을 따라 피부를 열어보세요. 절개를 복측 중앙선을 따라 두개골 방향으로 확장하여 흉곽 케이지를 완전히 노출시킵니다. 흉골의 하쪽 끝을 들어 올리고 늑활 양쪽을 따라 흉벽을 절단하여 흉강을 열고 심장을 노출시킵니다. 심장을 명확히 보기 위해 필요하다면 흉골과 갈비뼈 일부를 제거하세요.
5. 가위로 오른쪽 심방에 작은 절개를 하여 혈액과 분수제가 배출되는 출구를 만드세요. 20mL 주사기에 미리 냉각된 PBS(4 °C)를 채우고, 심장 꼭대기 근처 좌심실에 천천히 바늘을 삽입합니다. 바늘을 안정시키고 심실벽을 뚫지 않도록 하세요.
6. 관류를 통해 PBS를 천천히 고르게 냉각시켜 간이 창백해지고, 배출구가 깨끗해지며, 대부분의 혈액이 씻겨 나갈 때까지 진행합니다. 그 후 PBS를 20mL의 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드(4 °C)로 교체하고, 천천히 일정한 속도로 관류를 계속하여 사지가 뻣뻣해지고 꼬리가 말려 들어가며 조직이 붉은색에서 연한 색으로 변할 때까지 이어집니다. 이는 고정이 거의 완료되었음을 나타냅니다.
7. 관류 후 바늘을 빼고 흉강 내 잔류액을 제거한 후 즉시 조직 채취를 진행합니다. 고정되지 않은 조직이 후속 분석에 필요한 경우, 4% 파라포름알데히드 고정 단계는 생략하고 미리 냉각된 PBS만 사용하세요.
   참고: 과도한 압력으로 인한 심장 파열이나 조직 부종을 방지하기 위해 시술 내내 천천히, 일정하며 균일한 관류 속도를 유지하세요. 위의 모든 시술은 상온에서 수행하세요.

2. DRG와 인접 신경 (그림 2)

1. 척추 및 척추관 노출 (3–5분)
   1. 쥐를 엎드린 자세로 놓고 해부 보드 위에 고정하세요. 가위로 등쪽 피부 중앙선을 따라 세로 절개를 하여 꼬리에서 목 쪽으로 절개를 확장합니다.
   2. 가위를 사용해 등쪽 피부를 아래 결합 조직에서 분리하고, 양쪽 피부를 측면으로 반사시켜 등쪽 근육을 완전히 노출시킵니다. 결합 조직 표면에 붙은 털을 흡수지로 닦아내거나, 수술 부위를 식염수로 헹구어 수술 부위를 깨끗하게 유지하세요.
   3. 척추 양쪽을 따라 등쪽 근육과 결합 조직을 세로 절개하여 척추 구조를 완전히 노출시킵니다.
      참고: 등쪽 조직 절개 시 가위가 흉강이나 복강 깊숙이 침투하지 않도록 주의하세요. 이는 이후 해리 시술에 영향을 줄 수 있습니다.
   4. 뼈 롱저로 척추를 덮고 있는 결합 조직과 잔여 근육을 조심스럽게 제거하세요. 잔여 조직이 시야에 방해가 될 경우, 척추뼈를 완전히 노출시키기 위해 가위로 다듬으세요. 다음으로, 가위로 등쪽에서 경추를 절단하여 척추의 두개골 끝을 머리에서 분리하고 다음 단계를 쉽게 진행할 수 있습니다.
2. 척추관을 열고 척수를 노출시킨다(그림 3; 8–10분).
   1. 경추관 부위에 미세 곡선 가위를 삽입하고, 후렴 양쪽을 따라 절단하여 척추관을 열어줍니다.
      참고: 시술 중 척수 손상을 피하기 위해 주의하세요.
   2. 척수의 등쪽 부분을 점차 노출시키기 위해 등쪽 층을 제거하세요.
   3. 척추의 종축을 따라 미세한 곡선 가위로 등쪽 층을 계속 절단하여 흉부에서 천골 부위까지 점진적으로 확장하여 척수의 등쪽 측면을 완전히 노출시킵니다.
3. DRG 노출 (그림 4; 8–10분)
   1. 척수의 등쪽 표면을 완전히 노출한 후, 뼈 롱저를 사용해 척추관 구조를 양쪽에서 부드럽게 열고 좌우 조작을 번갈아 가며 진행합니다.
   2. 척추관이 양쪽에서 완전히 분리되면, 입체현미경으로 추간공 내에 위치한 DRG를 관찰합니다.
4. DRG 식별 (그림 5; 8–10분)
   1. 척추관이 양측에서 완전히 반사되고 척수가 완전히 노출되면, 척수의 등쪽 표면에서 솟아나는 등근 신경다발을 입체현미경으로 관찰합니다. 등쪽 뿌리를 옆으로 따라가면 추간공 근처의 DRG가 타원형 또는 타원형 구조로 나타난 형태임을 확인하라.
   2. 식별 시 DRG가 척수신경의 등쪽 뿌리와 추간공의 경계면에 위치해 있음을 확인하고, 각 척수 마디에서 양측 쌍으로 배열되어 있음을 관찰하세요. DRG는 감각 신경세포체로 형성된 신경절로 식별하는데, 한쪽은 척수의 등쪽 뿔로, 반대쪽은 말초 조직으로 뻗어 나갑니다.
   3. 입체현미경을 사용해 DRG를 희미한 노란색 또는 회백색, 약간 부어오른 구조로 식별하면, 형태가 더 풍성하고 경계가 비교적 뚜렷합니다.
5. DRG의 세그먼트 식별 및 해부를 수행하세요 (그림 6; 8–10분)
   1. 입체현미경 아래 미세수술용 겸자를 사용해 등쪽 신경 다발을 부드럽게 올려 부착된 DRG를 완전히 노출시킵니다.
   2. 다음 특징을 사용하여 DRG의 분절적 동일성을 결정합니다: 다중분기된 신경섬유(>2가지)에 연결된 DRG는 L2 및 더 많은 두개내 DRG로, 분기된 신경섬유(두 가지만)에 연결된 DRG는 L3 및 더 많은 꼬리 DRG로 지정합니다. 다음으로, 추간공의 위치에 따라 위아래의 나머지 DRG 구간을 순차적으로 식별합니다.
      참고: L3–L5 DRG에서 발생한 신경 섬유가 합쳐져 좌골신경을 형성합니다.
   3. 미세수술용 곡선 가위나 미세수술 겸자를 사용해 DRG를 둘러싼 결합 조직과 신경 섬유를 조심스럽게 분리하고, 신경절을 추간공 주변 조직에 부착된 부분에서 점진적으로 분리합니다.
   4. DRG와 척수를 연결하는 등쪽 신경근 섬유를 절단하고, 동시에 말초 쪽으로 뻗은 신경다발을 절단하여 신경절을 분리합니다.
   5. 미세수술 겸자를 이용해 DRG를 신중하게 분리하세요. 장기 보존과 이후 면역형광 분석이 필요한 경우, 즉시 분리된 DRG를 4% 파라포름알데히드가 함유된 0.5mL 원심분리관에 넣고 조직을 3시간 고정합니다. 고정 후에는 0.1 M PBS(주요 성분: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4)로 3× 5분간 조직을 세척한 후, 조직을 30% 자당 용액에 옮겨 탈수하여 바닥으로 가라앉게 합니다. 마지막으로 조직을 OCT에 삽입하여 −80°C에 보관하여 장기 보존합니다.

3. 신경절 구성 요소를 확인한다.

1. H&E 염색 결과 (그림 7)
   1. 분리된 DRG를 즉시 4% 파라포름알데히드와 같은 기존 조직학적 고정제에 고정합니다. 고정 후에는 0.1 M 인산염 완충제에 조직을 세척하고, 표준 조직학적 절차에 따라 탈수, 투명화, 파라핀 임베딩을 수행하며, 4–6 μm 조직 절편을 준비하여 후속 염색 분석을 수행합니다.
   2. 절단부에 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 수행하여 DRG의 전체 구조와 세포 형태를 평가합니다. 염색된 절편을 사용해 신경절의 세포 구성 요소와 조직 조직을 식별하고, 채취한 DRG의 품질을 판단합니다.
   3. H&E 염색된 절편을 현미경으로 살펴보고, DRG가 주로 다수의 감각 신경세포체로 구성되어 있음을 확인하라. 크고 둥근 또는 타원형의 소마타를 가진 신경세포를 식별하고, 그 명확하게 보이는 핵과 일부 뉴런에 존재하는 두드러진 핵소굴을 관찰합니다. 또한 뉴런을 둘러싼 밀접한 위성 교세포가 특징적인 고리 형태로 존재함을 확인한다.
   4. 신경절 내부를 검사하여 신경섬유 다발과 결합 조직 중隔을 확인하여 전체 조직 구조가 온전하고 명확하게 정돈되어 있는지 확인하세요. 세포 경계가 명확히 정의되어 있고 명확한 조직 파괴나 구조적 무질서가 없는지 확인하세요.
   5. 전체 구조가 보존되어 있고, 세포 형태가 명확하며, 기계적 손상이 없음을 통해 H&E 염색에 대한 DRG 분리가 성공했음을 확인합니다. 해리 또는 처리 과정에서 발생하는 세포 구조 파괴, 불명확한 조직 경계 또는 국소적인 조직 파괴를 관찰하여 샘플 손상을 감지합니다. 이러한 H&E 결과를 실질적인 근거로 삼아 DRG 수집의 질과 조직의 무결성을 평가하세요.
2. TUBB3 면역형광 염색 결과 (그림 8)
   1. 분리된 DRG를 즉시 4% 파라포름알데히드에 3시간 고정하세요. 고정이 완료되면 조직을 0.1 M PBS로 세 번 헹구고, 각 세척마다 5분을 두세요. 다음으로 조직을 30% 자당 용액에 넣어 바닥에 가라앉게 한 후 OCT에 삽입하고, 8–12 μm 크기로 동결된 절편을 절단하여 하류 면역형광 염색을 합니다.
   2. 절편을 실온으로 데운 후 PBS에 3× 5분간 헹군 후 Tris-EDTA 항원 추출액으로 항원 추출을 수행합니다. 조각을 자연스럽게 실온까지 식힌 후 PBS로 3× 5분 정도 다시 세척한 뒤, 실온에서 30–60분 동안 5% BSA로 블로킹하세요. 차단 단계 후, 형광 표지된 TUBB3 1차 항체를 적용하고 4°C에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날, PBS로 절편을 세 번 세척하고, 핵을 DAPI로 염색한 뒤 절편을 장착한 뒤 형광 현미경으로 이미지를 촬영합니다.
   3. DRG 단면을 검사하여 잘 보존된 표본이 뚜렷한 신경절 윤곽, 온전한 조직 구조, 질서 정연한 세포 배열을 보인다는 것을 확인하십시오. TUBB3 면역형광을 주로 감각 신경세포체와 신경섬유에서 관찰하여 신경절 내 전체 신경 분포를 정의합니다. DAPI 카운터스틴을 사용하여 더 큰 TUBB3 양성 세포를 감각 뉴런으로 식별하며, 이 세포들 주변에 분포한 작은 DAPI 양성 핵은 위성 교세포 핵과 일치하는 형태학적 패턴을 보인다. 조직 연속성 교란, 불규칙한 TUBB3 신호 위치 지정, 불명확한 신경 형태, 배경 신호의 국소적 증가로 인한 박리 또는 처리 관련 손상을 식별합니다.
   4. DRG 조직 완전성을 보조적으로 평가하는 지표로 TUBB3 면역형광 염색을 적용합니다. 보존된 성절 윤곽, 감각 신경세포체 및 신경 섬유 내 뚜렷한 형광 신호, 명확한 세포 형태, 최소한의 배경 염색 등으로 성공적인 DRG 분리를 인식합니다.

결과

DRG 격리를 성공적으로 하려면 명백한 압박, 압박, 파열이 없는 신경절의 완전성을 보존해야 합니다. 측면 연결된 신경 섬유를 부드럽게 들어 올리고, 신경절을 주변 조직에서 점차 분리하며, 신경절이 완전히 동원된 후에야 신경 섬유를 절단하여 온전하게 제거할 수 있습니다. 시술 중에는 기구로 결절 몸체에 직접 견인을 주지 마세요. 분리 후에는 척추공 내에서 DRG의 원래 형태를 최대한 보존하세요. 주변 부착 조직을 제거한 후, 고립된 신경절은 납작하고 타원적이며 반투명한 모습이어야 합니다. 이러한 형태학적 특성을 가진 샘플은 성공적으로 채취된 것으로 간주될 수 있습니다.

반면, 실패한 격리는 보통 연결된 신경섬유의 견인으로 인한 파열이나 겸자나 가위로 부적절한 조작으로 인한 관상 등 신경절체의 구조적 손상으로 특징지어집니다. 또한, 원래의 평평한 타원형 형태의 파괴나 압박으로 인한 명백한 구조적 변형 및 조직 손상도 실패...

토론

DRG는 말초 감각 신경계의 핵심 구성 요소로서, 기계적, 열적, 통각적 감각 정보를 중추신경계에 전달하는 데 중요한 역할을 합니다 ^9,10,11. DRG 뉴런은 특징적인 의사 단극성 형태를 보이며, 한 돌기는 말초 조직으로, 다른 돌기는 척수의 등쪽 뿔로 투사되어 감각 신호 전달, 신경 손상 복구, 만성 통증에 생리적·병리적 조건 모두에서 중요한 역할을 합니다 12,13,14. 본 연구에서 확립된 해부 방법은 흉부에서 천골 부위까지 DRG의 노출, 식별 및 격리를 체계적으로 기술합니다. 다른 DRG 분리 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 mL 원심분리관	미지정	미지정	고정 DRG 저장에 사용
20 mL 주사기	미지정	미지정	심장 순환에 사용
30% 자당 용액	미지정	미지정	OCT 임베딩 전 조직 탈수에 사용
4% 파라포르말데하이드	Servicebio	G1101
5% BSA	Solarbio	SW3015
70% 에탄올	미지정	미지정	해부 전 모발 오염 감소에 사용
흡수 종이	미지정	미지정	결합 조직에서 모발 제거에 사용
성인 C57BL/6 마우스	Vital River	미지정	수컷 또는 암컷; 12주 나이; 25–30 g
Alexa Fluor 488-접합 산양 항토끼 IgG	Servicebio	GB25303
Anti-TUBB3 항체	Proteintech	CL488-66375	TUBB3 면역형광에 사용
이산화탄소 챔버	미지정	미지정	안락사에 사용
DAPI	Servicebio	G1012
해부 보드	미지정	미지정	해부 중 마우스를 고정하는 데 사용
형광 현미경	미지정	미지정	면역형광 염색된 섹션 이미징에 사용
Friedman-Pearson 뼈 롱거	RWD	S21022-14	원고에서 추출됨: 뼈 롱거 (RWD, S21022-14)
H&E 염색 키트	Servicebio	G1005
미세 외과용 곡선 가위	ASSI	SDCT16R8	원고에서 추출됨: 미세 곡선 가위 (ASSI, SDCT16R8)
미세 외과용 포셉	Fine Science Tools	11254-20	원고에서 추출됨: 미세 외과용 포셉 (FST, 11254-20)
OCT 화합물	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
핀	미지정	미지정	해부 보드에 팔다리를 고정하는 데 사용
식염수	미지정	미지정	수술 현장을 헹구는 데 사용
가위	Fine Science Tools	14060-09	원고에서 추출됨: 가위 (FST, 14060-09)
입체 현미경	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	10447197	원고에서 추출됨: 입체 현미경 (Leica, 10447197)
Tris-EDTA 항원 회수 용액	Solarbio	C1038