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이 연구는 확립된 인간 급성 골수성 백혈병 세포주와 그 독소루비신 내성 유도체를 사용하여 수행되었습니다. 인간 참가자, 동물, 또는 1차 환자 유도 샘플은 포함되지 않았습니다. 따라서 인간 대상 연구와 동물 윤리 승인은 기관심사위원회의 승인이 필요하지 않았습니다. 세포주는 중국 톈진에 위치한 중국의학과학원 혈액학연구소에서 확보하였으며, 푸젠 의과대학 연합병원 푸젠 혈액학 연구소에서 보관되었습니다. 실험 전에 핵형 및 형태학적 평가로 세포 정체가 확인되었으며, 모든 세포 배양에서 마이코플라즈마 오염 검사를 받았습니다. 프로토콜에 사용되는 화학물질, 장비 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 세포 배양 및 내성 표현형 확인
인간 HL60 및 K562 급성 골수성 백혈병 세포와 그 독소루비신 내성 유도체인 HL60/A/A와 K562/A는 중국 톈진에 위치한 중국의학과학원 혈액학연구소에서 획득하였습니다. 세포는 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트의 1640 배지에 태아 혈청 10%와 페니실린-스트렙토마이신 1%를 보충한 배양지, 37°C에서 5% 이산화탄소가 함유된 가습 인큐베이터에서 배양하였습니다.
HL60/A 세포는 1 μg/mL 독소루비신이 함유된 완전 배지에서, K562/A 세포는 내성 표현형을 보존하기 위해 5 μg/mL 독소루비신이 함유된 완전 배지에서 유지하였다. 치료 중 급성 약물 선택 효과를 피하기 위해 실험 시험 1개월 전에 배양액에서 독소루비신을 제거했습니다.
실험 전, 부모 세포와 저항성 세포 간의 독소루비신 반최대 억제 농도 값을 비교하여 내성 표현형이 재확인되었습니다. 약물 무첨가 배양 1개월 후 내성 안정성은 독소루비신 민감성 검사법을 반복하고 기저 P-당단백질 및 다약물 내성 관련 단백질 1 발현을 검사하여 평가하였다. 배양은 내성 유도체가 부모 유도체보다 더 높은 독소루비신 반최대 억제 농도와 더 높은 수송체 발현을 유지할 때만 실험에 사용되었습니다.
2. 약물 준비 및 치료 설계
FTY720, 독소루비신, SC79는 제조사 지침에 따라 기본 용액으로 준비되었습니다. FTY720과 SC79는 디메틸 설폭사이드에 용해되었고, 독소루비신은 권장 용매에서 준비되어 취급 중 빛으로부터 보호되었습니다. 작업 용액은 처리 전에 완전 배양지에 신선하게 희석되었습니다. 최종 디메틸 설폭사이드 농도는 처리 그룹 간에 동일하게 유지되었으며 0.1%를 넘지 않았습니다.
차량 대조군은 해당 처리군과 동일한 최종 디메틸설폭화 농도를 받았습니다. 복합 처리 실험에서는 감도 농도로 5 μM FTY720이 사용되었습니다. 독소루비신은 HL60/A 세포에 대해 4 μM, K562/A 세포에 대해 8 μM 용량으로 아세포자멸사 및 세포 내 독소루비신 축적 분석에서 사용되었으며, 별도 명시가 없는 한 사용되었습니다.
3. 세포 생존 가능성 검사 및 절반 최대 억제 농도 계산
세포는 100 μL 완전 배지에 1×4 셀씩 96웰 플레이트에 시딩되었습니다. FTY720 단일 약물 검사에서는 HL60, K562, HL60/A, K562/A 세포를 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μM FTY720으로 48시간 처리하였다. 독소루비신 감응성 검사를 위해 HL60/A와 K562/A 세포는 5 μM FTY720의 존재 여부와 관계없이 48시간 동안 연속 농도의 독소루비신 처리를 수행했습니다.
세포 생존성은 제조사의 지침에 따라 세포 계수 키트-8 분석법을 사용하여 측정되었습니다. 처리 후 각 웰에 Cell Counting Kit-8 시약을 첨가하고, 플레이트를 37°C에서 2시간 배양했습니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다.
상대 셀 생존 가능성은 다음과 같이 계산되었습니다: 상대 셀 생존 = [(처리된 우물의 흡광도 - 빈 우정의 흡광) / (차량-제어 우정의 흡광도 - 빈 우물의 흡광도)] × 100%
GraphPad Prism 버전 9.5에서 4매개변수 로지스틱 용량-반응 모델을 사용한 비선형 회귀를 사용하여 절반 최대 억제 농도 값이 계산되었습니다. 각 실험은 세 개의 독립적인 생물학적 복제체를 포함했으며, 처리 조건별로 세 개의 기술적 우물을 사용했습니다.
4. 약물 조합 분석
FTY720이 독소루비신 민감성에 미치는 영향은 FTY720 유무 시 독소루비신 용량-반응 관계를 비교하여 평가하였다. HL60/A 및 K562/A 세포는 독소루비신 단독 또는 FTY720과 결합된 독소루비신 연속 농도로 48시간 처리하였다.
세포 생존 가능성은 Cell Counting Kit-8 검사법을 사용하여 평가되었으며, 반쪽 최대 억제 농도 값은 4매개변수 로지스틱 선량-반응 모델을 사용한 비선형 회귀를 통해 산출하였습니다. 독소루비신 감수성 변화는 투여군 간 용량-반응 곡선의 변화와 최대 억제 농도의 차이를 바탕으로 해석되었습니다.
이 실험들이 완전한 고정 비율 선량-매트릭스 연구로 설계되지 않았기 때문에 공식적인 조합-지수 분석은 수행되지 않았습니다. 따라서 결과는 명확한 약리학적 시너지보다는 독소루비신 감수성 변화의 증거로 해석되었습니다.
5. 부속서 V에 의한 세포자멸증 분석 및 프로피디움 요오다이드 유동 세포검사
HL60/A와 K562/A 세포는 4×10 5 세포/mL의 6웰 플레이트에 시딩된 후 48시간 동안 유체체, FTY720 단독, 독소루비신 단독, 또는 FTY720과 독소루비신 병용 처리하였다. 복합 치료에서는 HL60/A 세포에서 5 μM FTY720을 4 μM 독소루비신과 병용하거나, K562/A 세포에서는 8 μM 독소루비신을 병용하였다.
처리 후에는 배양지에 현탁된 세포를 포함해 세포를 수집하고, 차가운 인산염 완충 식염수로 두 차례 세척했습니다. 세포는 세포자사멸사 검출 키트 제조사가 권장하는 농도로 Annexin V 결합 완충제에 재현탁되었습니다. 각 샘플은 5 μL Annexin V-fluorescein isothiocyanate 또는 Annexin V-알로피코시아닌과 5 μL 프로피듐 아이오다이드로 염색한 후, 어두운 실내 온도에서 15분간 배큐했습니다.
샘플은 즉시 유세포분석으로 분석되었습니다. 무염색 대조군, 단일 염색 대조군, 형광-1 대조군이 보상 및 사분면 게이트 설정에 사용되었습니다. 파편은 전방향 산란과 측면 산란 게이팅을 사용해 배제했습니다. 초기 세포자멸 세포는 Annexin V 양성 세포와 propidium iodide 음성 세포로 정의되었고, 후기 세포멸사 또는 죽은 세포는 Annexin V-양성 및 propidium iodide 양성 세포로 정의되었습니다. 총 세포자멸사는 조기 세포멸사 세포 분획과 후기 세포 분획의 합으로 계산되었습니다. 각 샘플마다 최소 10,000건의 생존 가능한 단일 세포 이벤트가 획득되었습니다.
6. 세포 내 독소루비신 축적 분석
HL60/A와 K562/A 세포는 4×10 5 세포/mL의 6웰 플레이트에 시딩되어 하룻밤 배양했습니다. 그 후 세포는 차량 대조군, 독소루비신 단독, 또는 5 μM FTY720과 독소루비신 병용 처리하였다. HL60/A 세포는 4 μM 독소루비신으로, K562/A 세포는 8 μM 독소루비신으로 처리되었습니다. 세포는 37°C에서 4시간 배양되었으며 빛으로부터 보호받았습니다.
치료 후 세포를 채취하여 차가운 인산염 완충 식염수로 두 차례 세척하여 세포외 독소루비신을 제거했습니다. 세포는 인산염 완충 식염수에 재현탁된 후 독소루비신의 내재 형광을 이용한 유동 세포검사로 분석되었습니다. 처리되지 않은 세포를 배경 자가형광을 정의하는 데 사용되었고, 독소루비신 처리된 세포가 형광 양성 기준으로 사용되었습니다. 세포 내 독소루비신 축적량은 잔해 및 집합 배제 후 중앙값 형광 강도로 정량화하였다. 각 독립 실험 내에서 중앙값 형광 강도 값은 독소루비신 단독 그룹으로 정규화되었습니다.
7. P-당단백질 및 다약물 내성 관련 단백질 1 발현의 유동 세포분석
HL60/A와 K562/A 세포는 6웰 플레이트에 2×10 6 셀/mL로 시딩된 후 5 μM FTY720 또는 차량 대조군으로 24시간 처리하였습니다. 처리 후, 세포는 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 두 번 세척한 후 100 μL 세포 염색 완충제에 재현탁했습니다.
세포는 제조사 권장 희석 상태에서 피코에리트린 결합 항-P-당단백질 항체와 Alexa Fluor 647 결합 항-다중제내성 관련 단백질 1항체로 염색하였습니다. 게이트 설정 및 보상을 위해 매칭된 아이소타입 대조군, 염색되지 않은 대조군, 단일 염색군, 형광-1 대조군이 포함되었습니다. 샘플은 4°C에서 어두운 환경에서 30분간 배양하고, 세포 염색 버퍼로 두 번 세척한 후 500 μL 세포 염색 버퍼에 재현탁한 후 채취하였습니다.
유세포검사는 BD FACScan 유세포계를 사용하여 수행되었습니다. 각 샘플마다 최소 10,000건의 생존 가능한 단일 세포 이벤트가 획득되었습니다. P-당단백질 및 다약물 내성 관련 단백질 1 발현 수준은 해당 아이소타입 제어 신호를 뺀 후 중앙값 형광 강도로 정량화하였다. 정규화된 값은 각 독립 실험 내에서 차량-대조군을 상대적으로 표현했습니다.
8. 서부 블롯팅 및 덴시토메트릭 정량화
지시된 치료 후, 세포를 채취하여 차가운 인산염 완충 식염수로 두 차례 세척했습니다. 총 단백질은 방사면역침전법 분석액에 프로테아아제와 인산효소 억제제를 보충하여 추출하였다. 단백질 농도는 비신코닉산 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하였습니다.
계통당 총 30 μg 단백질이 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리되어 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 전달되었습니다. 막은 상온에서 1시간 동안 Tris 완충 식염수 중 Tween 20에 5% 무지방 우유 또는 5% 소 혈청 알부민으로 차단하였다.
막은 4°C에서 1차 항체와 함께 전단단백질 키나제 B, 인산화 단백질 키나제 B, 라파마이신의 총기전 표적, 인산화된 기전 표적, 절단된 카스파제-3, 절단된 폴리(아데노신 디포스페이트-리보스) 중합효소, P-당단백질, 다약물 내성 관련 단백질 1, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 배양하였다. 세척 후, 막을 적절한 고추냉이 과산화효소 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 배양하였습니다. 단백질 밴드는 향상된 화학발광 검출을 통해 시각화되었습니다.
밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어 버전 1.53t를 사용해 정량화되었습니다. 인산화된 단백질 키나제 B는 총 단백질 키나아제 B로 정규화되었고, 인산화된 라파마이신의 기전적 표적은 라파마이신의 전체 기전 표적으로 정규화되었습니다. P-당단백질, 다약물 내성 관련 단백질 1, 절단된 카스파제-3, 절단된 폴리(아데노신 디포스페이트-리보스) 중합효소가 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소로 정상화되었다. 정규화된 값은 비교에 따라 차량 대조군 또는 독소루비신 단편군에 대한 접힘 변화로 표현되었습니다. 서부 블롯 분석은 세 가지 독립적인 생물학적 복제체를 사용하여 수행되었습니다. 자르지 않은 서부 블롯 이미지는 공개 데이터 저장소에 보관되거나 보조 문서로 업로드되었습니다.
9. SC79 구조 실험
단백질 키나아제 B 신호전달이 FTY720의 관찰된 효과와 연관되는지 조사하기 위해, HL60/A와 K562/A 세포는 단백질 키나제 B 활성화제인 SC79의 유무와 관계없이 FTY720으로 처리되었습니다. 세포는 5 μM FTY720으로 12시간 전처리한 후 30 μM SC79 또는 차량 대조제로 추가로 12시간 처리했습니다.
치료 후, 인산화된 단백질 키나제 B, 라파마이신의 인산화 기전적 표적, P-당단백질, 다약물 내성 관련 단백질 1 수준을 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 동시에 독소루비신, FTY720, SC79 치료 후 부속서 V와 프로피디움 요오다이드 염색으로 세포자사멸사를 평가하였다. 구조 효과는 경로 관련 증거로 해석되었다. 유전적 과발현이나 넉다운 실험이 수행되지 않았기 때문에 인과관계 결론은 신중하게 제시되었다.
10. 통계 분석 및 데이터 보고
통계 분석은 GraphPad Prism 버전 9.5와 IBM SPSS Statistics 버전 23.0을 사용하여 수행되었습니다. 생물학적 복제는 독립적으로 배양된 세포를 사용하여 서로 다른 날에 수행된 독립적인 실험으로 정의되었습니다. 기술적 복제는 동일한 생물학적 실험 내에서 반복되는 우물 또는 반복 측정으로 정의되었습니다.
데이터는 별도 명시가 없는 한 평균± 표준오차로 제시되었습니다. 데이터가 대략 정규분포일 때 쌍이 없는 양측 학생 t-검정을 사용하여 2그룹 비교를 분석하였다. 세 개 이상의 그룹 간 비교는 분산의 일방향 분석과 Tukey의 사후 검정을 통해 분석되었습니다. 약물 농도와 치료 상태와 같은 두 독립적인 요인을 포함하는 실험은 분산의 양방향 분석과 적절한 다중 비교 보정을 통해 분석되었습니다.
정규성 가정이 지지되지 않을 때는 비모수 검정을 사용했습니다. 가능한 한 정확한 p-값을 보고했습니다. 다중 비교 보정 후 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. 모든 그림 전례는 생물학적 복제 수, 사용된 통계적 검정, 오차 바의 의미, 그리고 유의성 임계값을 명시했습니다. 개별 생물학적 복제 값은 산점도에 표시되거나 가능한 경우 막대 그래프에 겹쳐 보였습니다.