만성 외상성 뇌손상의 마우스 모델 구축을 위한 반복적 체중 감소 절차

요약

뇌의 구조적 병변이 없는 상태에서 만성 우울과 유사 행동의 기전을 연구하기 위한 반복 폐쇄형 경미외상성 뇌손상 마우스 모델을 구축하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

외상성 뇌손상(TBI)은 지속적인 신경병리학적 변화와 장기적인 신경정신과적 후유증을 초래할 수 있습니다. 회복 기간 동안, 상당수의 환자들이 우울 증상과 수면 관련 불만을 포함한 정서 장애를 겪는데, 정기적인 컴퓨터 단층촬영이나 자기공명영상에서는 명백한 구조적 이상이 발견되지 않아도 나타납니다. 이러한 특징을 재현하는 실험 모델이 만성 외상 후 신경정신과 증상의 기전을 조사하는 데 필요합니다. 여기서는 거시적 검사와 T2 가중 MRI로 감지할 수 있는 명백한 구조적 뇌 병변이 없는 상황에서 만성 우울 유사 행동의 기전을 연구하기 위한 반복 폐쇄형 경미외상성 뇌손상 마우스 모델을 제시합니다. 이 방법에서는 온전한 두개골을 노출시키고 정의된 무게 낙하 매개변수를 사용하여 5일 연속 반복 충격을 가합니다. 여기서 설명한 조건 하에서는, 이 수술은 두개골 골절이나 거시적 국소 타박상 없이 폐쇄성 두부 손상을 유발합니다. 손상 후 일정 기간 동안, 쥐는 본 연구에서 사용한 조건에서 대접적 검사나 T2 가중 자기공명영상에서 뚜렷한 국소 구조적 이상이 없으나 우울과 유사한 행동을 보입니다. 이 프로토콜은 반복적인 경미한 외상성 뇌손상 후 만성 우울과 유사 행동을 연구하고 잠재적 치료 중재를 평가하는 실험적 접근법을 제공합니다.

서론

그러나 현재 패러다임은 주로 머리를 고정한 쥐에 선형적인 충격을 제공하므로, 스포츠 관련 뇌진탕이나 경미한 교통 부상의 직접적인 생체역학적 모방보다는 만성 정서 결과 연구에 최적화된 폐쇄형 머리 RMTBI 모델로 해석되어야 합니다." 외상성 뇌손상(TBI)은 현재 외상 관련 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나로, 가족과 사회에 상당한 의학적 및 경제적 부담을 가하고 있습니다 ^1,2. 특히, 외상성 뇌손상 후 중추신경계 손상은 일시적이지 않습니다; 보통 만성적이고 점진적으로 진행됩니다. TBI 연구에 따르면, 부상 후 18년이 지난 지금도 미세아교세포 활성화가 지속되며, 장기간 만성 신경염증이 심각한 신경 퇴화를 유발한다는 결과가 나타났습니다^. 역학 자료에 따르면 회복⁴단계 동안 환자의 최대 28%에서 32%가 심각한 정서 장애를 겪습니다. 본 글에서 rmTBI는 반복적이고 경미한 외상성 뇌손상 유도 패러다임을 의미하며, 지속적인 행동 변화가 특징인 만성 손상 후 단계는 만성 외상성 뇌손상(c-TBI)이라고 부릅니다. 여기서 c-TBI라는 용어는 rmTBI 이후 지속적인 행동 변화가 특징인 만성 부상 후 상태를 설명하기 위해 사용되었으며, 별도의 부상 패러다임이 아닙니다. 이러한 용어는 실험적 TBI가 장기적인 조직병리학적 및 행동적 이상과 연관된 점진적 만성 과정으로 진화할 수 있음을 보여주는 이전 연구와 개념적으로 일치합니다.

이러한 만성 신경정신과적 후유증은 환자의 삶의 질과 기능적 결과에 심각한 저해를 초래합니다. 그러나 이러한 2차 정서 장애의 정확한 발병 기전은 여전히 불확실하며, 임상적 치료 옵션도 심각하게 제한적입니다. 따라서 c-TBI로 인한 우울유사 행동의 기전을 조사하고 정확한 치료 표적을 규명하는 것은 시급한 임상적 필요와 실질적 중요성을 지니고 있습니다.

TBI의 병리학적 기전을 밝히기 위해 연구자들은 다양한 동물 모델을 개발했으며, 그중 통제된 피질 충격(CCI) 모델은 현재 가장 널리 사용되는^모델 중 하나입니다^. CCI는 충돌 매개변수를 정밀하게 조절하여 고재현성 국소 병변을 생성할 수 있게 합니다. 하지만 CCI와 전통적인 액체 타격 손상(FPI) 모델 모두 일반적으로 두개골 절개술을 요구합니다. 이 접근법들은 국소 타박상, 조직 손실, 심각한 병변 관련 신경염증 반응 연구에 특히 유용하지만, 스포츠 관련 뇌진탕과 같은 경미한 폐쇄 두부 손상의 가장 흔한 임상 증상과는 상당히 다른 심각한 개방성 TBI를 시뮬레이션하는 경향이 있습니다 ^8,9. 중요한 점은, 두개골 절개술과 충격으로 인한 뇌 조직 괴사, 교세포 흉터, 후기 공동화가 두 가지 주요 한계를 제공한다는 것입니다. 첫째, 심각한 구조적 결함은 종종 운동 기능 장애를 유발하여 행동 결과의 정확한 평가를 혼동시킵니다. 둘째, 조직의 물리적 손실은 장거리 신경 투사를 끊는다. CCI 유도 TBI 모델을 사용한 이전 연구에서 입증된 바와 같이, 쥐는 유의미한 국소성 뇌 타박상을 보였습니다⁴. 이러한 구조적 교란은 바이러스 추적과 같은 첨단 신경해부학 기법의 적용을 심각하게 방해하여 정신과 증상과 관련 신경 회로를 조사하는 것이 거의 불가능하게 만듭니다. 따라서 이러한 모델들은 중증 또는 국소성 TBI 연구에 여전히 유용하지만, 반복적인 경미한 폐쇄성 두부 손상 후 만성 정서 이상을 조사하는 목적으로, 특히 행동 및 회로 수준 분석에서 구조적 완전성 보존이 중요한 경우에는 덜 적합할 수 있습니다.

앞서 언급한 중증 개방형 뇌손상 모델의 한계를 극복하기 위해, 본 연구는 노출된 온전한 두개골에 무게 낙하 방법을 사용하여 두개절술 없이 반복성 경미외상성 뇌손상(rmTBI) 마우스 모델을 확립하는 프로토콜을 상세히 설명합니다. 이 프로토콜은 정확히 정의된 충격 매개변수를 사용합니다: 낙하 높이 25cm, 무게 20g. 충돌 부위는 시상실에서 왼쪽 2mm, 관상선에서 뒤쪽 2mm를 목표로 했으며, 직경 4mm의 곡선 금속 충격기 팁을 사용해 충격력의 정확성과 균일성을 보장했습니다. 더불어, 5일 연속 반복 영향의 특정 빈도는 만성 병리학적 변화의 안정성을 보장합니다. MRI, 조직병리학, 행동 검사를 포함한 종합 평가 결과, 이 마우스 모델은 명백한 국소 타박상이나 운동 기능 장애 없이 뇌의 구조적 완전성을 유지하면서도 우울과 유사한 행동을 보인다는 것을 보여줍니다. 이 표현형 프로파일은 명백한 구조적 이상이 없음에도 불구하고 반복성 경미한 두부 손상의 선택된 행동 특징을 포착하며, 신경정신과적 유사 변화를 포함한다^10,11,12,13. 그러나 현재 패러다임은 주로 머리를 고정한 마우스에 선형적인 충격을 전달하므로, 스포츠 관련 뇌진탕이나 경미한 교통 부상의 직접적인 생체역학적 모방보다는 만성 정서 결과 연구를 위해 최적화된 폐쇄형 머리 RMTBI 모델로 해석되어야 합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 허페이 종합과학센터 인공지능연구소 기관동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호는 IAI2024071004). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 기관 및 국가 지침에 따라 수행되었습니다. 실험 프로토콜의 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 20g 충격 무게, 25cm 낙하 높이, 4mm 충격기 팁 직경, 신뢰할 수 있는 이소플루란 전달, MRI 설정 등 중요한 성능 특성이 유지된다면 다른 공급업체의 동등한 장비를 사용할 수 있습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 준비

1. 동물들을 준비해.
   1. 8주에서 10주 된 수컷 C57BL/6N 마우스를 사용하고, 체중은 20에서 25g입니다.
   2. 쥐는 특정 병원체가 없는 동물 시설 내 개별 환기된 케이지(IVC)에 보관하세요. 음식과 물을 자유롭게 제공하고, 온도와 습도가 조절된 상태에서 12시간 빛과 12시간 어두운 주기를 유지하세요.
   3. 실험 전에 쥐들을 사육실에 적응시키고, 기관 동물 관리 절차에 따라 정기적인 건강 검진을 실시하세요.
2. 그룹을 배정하세요.
   1. 쥐들을 무작위로 순진군, 샴군, 그리고 c-TBI 그룹에 배정하세요. MRI 해석, 대략적인 병리 평가, 행동 점수 채점/데이터 분석을 담당하는 연구자들은 그룹 배정에 눈을 가리켰습니다.
   2. 첫 부상 세션 전에 동물 식별 번호와 그룹 배정을 기록하세요.

2. 수술 및 마취 준비

1. 수술 기구와 마취 시스템을 준비하세요.
   1. No. 11 블레이드가 장착된 멸균 메스, 멸균 면봉, 멸균 생리식염수, 10% 포비돈-요오드 용액, 5-0 비흡수성 폴리프로필렌 단필라멘트 봉합사, 접착 테이프, 클로르테트라사이클린 안과 연고를 준비하세요.
   2. 사용 전에 수술 기구를 소독하고, 깨끗한 수술 부위에 놓으며, 시술 내내 무균 기법을 유지하세요. 장갑, 실험복, 안구 보호 장비 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
   3. 온도 조절 패드를 준비하고 37 °C ± 0.5 °C로 설정하세요.
   4. 유도실과 코콘을 실험용 동물 가스 마취 시스템에 연결하세요.
   5. 산소 유량을 0.5–1.0 L/min으로 설정하고, 유도 및 유지를 위해 아이소플루란 증기 발생기를 준비하세요. 마취는 환기가 잘 되는 곳에서 시행하거나 승인된 폐가스 청소 시스템을 사용하세요.
2. 쥐를 수술 준비해.
   1. 승인된 동물 프로토콜에 따라 마취 및 수술 30분 전에 부프레노르핀 HCl(0.1 mg/kg, 복막 내 투여)을 투여하십시오.
   2. 마우스를 유도실에 넣고 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 증기 조절기를 3%–5%로 설정해 유도 반응을 주고, 마우스를 계속 모니터링하여 교정 반사가 사라지고 자발적인 팔다리 움직임이 멈출 때까지 계속하세요. 유도 시에는 5% 이상의 이소플루란 함량을 사용하지 마십시오.
   3. 마우스를 엎드린 자세의 입체 이동 프레임으로 옮기고, 코 콘을 통해 마취를 유지하세요. 유지보수를 위해 증발기 설정을 1%–2%로 낮추고, 산소 유량은 분당 0.5–1.0 L로 유지하세요.
      1. 시술 중에는 분당 약 60–100회 정도의 안정적인 호흡 속도를 유지하세요. 호흡 수가 분당 60회 이하로 떨어지거나 호흡이 얕거나 불규칙해지면 즉시 이소플루란 농도를 줄이고 지지 보온을 제공하며, 안정된 호흡이 회복될 때까지 충격을 지연시키세요. 유지 중에는 이소플루란 2%를 초과하지 마세요.
   4. 발달 철회 반사가 없어 적절한 마취를 확인하고, 고막을 손상시키지 않고 입체성 프레임의 귀 봉으로 머리를 고정하며(그림 2A), 쥐를 엎드린 자세로 유지합니다. 적절한 마취가 명시된 유도 및 유지 범위 내에서 이루어지지 않거나 과도한 호흡 억제가 발생하면 해당 부상 세션에서 동물을 제외합니다.
   5. 양쪽 눈에 클로르테트라사이클린 안과 연고를 바르고, 두피를 면도한 후 수술 부위를 10% 포비돈-요오드 용액으로 소독하세요.

3. 반복성 경미한 외상성 뇌손상 모델 구축

1. 두개골을 노출시켜.
   1. No. 11 블레이드가 장착된 멸균 메스를 사용해 두피에 약 0.5cm에서 1cm 길이의 종방향 중앙선 절개를 합니다.
   2. 멸균된 겸자나 면봉으로 피하 조직과 골막을 무딘 채로 해리하여 뼈 표면에 긁히지 않고 두개골을 완전히 노출시킵니다.
   3. 생리적 식염수로 적신 멸균 면봉으로 두개골 표면을 닦아내어 두개골 부위와 관상 봉합선을 포함한 두개골 랜드마크를 시각화하세요.
2. 충격 장치 준비해.
   1. 자유 낙하 중추 낙하 장치에 직경 4mm 곡선 금속 충격기 팁을 장착하세요.
   2. 드롭 높이를 25cm로 설정하고 20g 임팩트 웨이트를 사용하세요(그림 2B).
3. 임팩트를 전달하세요.
   1. 두개골 표면에서 시상실에서 왼쪽 2mm, 관상실에서 2mm 뒤쪽에 충돌 부위를 확인한다(그림 2C).
   2. 임팩터 팁을 목표 부위에 수직으로 맞추고, 두개골 표면에 닿을 때까지 부드럽게 내리며, 무게를 떨어뜨리기 전에 팁이 두개골에 수직으로 중앙에 위치하도록 하세요.
   3. 20g 무게를 25cm 높이에서 해제해 단일 충격을 가하세요.
   4. 순진한 그룹에게는 마취나 수술을 하지 마세요. 샴 그룹의 경우, 마취를 하고 두피 절개를 하되 효과는 주지 않는 것이 좋습니다.
4. 절개 부위를 봉합하고 수술 후 관리를 제공합니다.
   1. 충돌 직후 충격기 팁을 제거하고 수술 부위를 점검하세요.
   2. 두피 절개 부위를 5-0 흡수성 폴리프로필렌 모노필라멘트 봉합사로 봉합하고, 절개 부위를 10% 포비돈-요오드 용액으로 소독합니다.
   3. 쥐를 37°C± 0.5°C로 유지된 온도 조절 온열 패드에 올려놓고, 의식과 자유 보행이 완전히 회복될 때까지 호흡을 모니터링한 후 다시 집 케이지로 돌려보내세요.
      참고: 회복은 규칙적인 자연 호흡 회복, 교정 반사 회복, 자발적 보행으로 정의됩니다. 급성 무호흡증과 눈에 띄는 출혈은 각 충격 직후와 초기 회복 중에도 모니터링해야 합니다. 장기간 무호흡, 눈에 띄는 출혈, 아이소플루란 중단 후 10분 이내에 올바른 반사를 회복하지 못하거나 15분 이내에 자발적으로 보행하지 못하는 동물은 추가 시술에서 제외하고 승인된 동물 프로토콜에 따라 관리되어야 합니다.
   4. 사용한 칼날과 바늘은 승인된 날카로운 용기에 버리세요. 동물 배설물 및 오염 물질은 기관 생물안전 규정에 따라 처리합니다.
5. 부상 동작을 반복하세요.
   1. 3.1–3.4 단계를 24시간마다 5일 연속으로 반복하여 총 5회의 충격을 줍니다.
   2. 수술 후 회복 기간 동안 체중과 활동을 지속적으로 모니터링하세요. 두개골 골절, 눈에 띄는 출혈, 발작, 지속적인 원형 돌기, 또는 독립적으로 먹거나 마실 수 없는 상태가 나타나면 후속 분석에서 제외하십시오.

4. 자기공명 영상 획득

참고: 본 연구에서는 MRI가 최종 부상 후 7일째에 시행되었습니다. 쥐들은 이소플루란 마취 하에서 스캔되었으며, 영상 촬영 전에 희생되지 않았습니다. 영상 촬영 후 실험 일정에 따라 조직 채취가 이루어졌습니다.

1. 동물을 MRI 준비하세요.
   1. 이소플루란으로 마취한 후 MRI 호환 동물 침대에 코 콘이 장착된 동물 침대에 눕히세요.
   2. 스캔 내내 호흡을 모니터링하고 체온을 37 °C ± 0.5 °C로 유지하세요.
2. T2 가중 이미지 획득
   1. 30cm 구경과 최대 기울기 세기 1000 mT/m, 최대 슬루 속도 10000 T/m/s의 구배 시스템을 가진 9.4 T 초전도 자석에서 이미지를 획득합니다.
   2. 고주파 전송에는 86mm 용량 코일을, 신호 수신에는 15mm 평면 표면 코일을 사용하세요.
   3. 다음 매개변수를 사용하여 T2 가중치 고해상도 다중 슬라이스 고속 스핀-에코 이미지를 획득합니다: 반복 시간 = 3000 ms, 에코 시간 = 46.34 ms, 에코 트레인 길이 = 13, 수신기 대역폭 = 220 Hz/픽셀, 시야각 = 20 ×^{20 mm 2}, 획득 행렬 = 208 × 208, 슬라이스 두께 = 0.5 mm, 슬라이스 갭 = 0 mm, 여기 수 = 2.
   4. 뇌 전체를 덮을 수 있도록 30개의 조각을 확보하세요. 총 획득 시간을 1분 33초로 설정하세요. 본 연구에서는 T2 가중 MRI가 정성적 평가에만 사용되었습니다. 정량적 MRI 분석은 수행되지 않았습니다.
      참고: MRI 영상은 그룹 배정에 눈이 가린 연구자가 정성적으로 검토하였습니다.

5. 대신경병리학 평가

1. 조직 채취를 하세요.
   1. 승인된 동물 프로토콜에 따라 쥐를 깊게 마취하세요.
   2. 흉강을 열고 심장을 노출한 뒤, 관류 바늘을 좌심실에 삽입하고 우심방을 절개하세요.
   3. 생리식염수로 관류한 후 4% 파라포름알데히드(PFA)를 관류하세요. 전체 관류 절차를 인증된 화학 훈기 후드에서 수행하고, PFA와 직접 접촉하거나 눈을 마주치지 마세요. 조직과 액체 폐기물은 유해 폐기물 및 생물안전 규정을 준수하여 처리해야 합니다.
   4. 두개골과 온전한 뇌를 수집하고 고해상도 카메라로 역겨운 이미지를 촬영하세요.
      참고: 대괄 병리학적 평가는 그룹 배정에 눈가림이 없는 연구자가 수행했습니다.

6. 체중 모니터링

1. 체중을 기록하세요.
   1. 첫 부상 세션 전과 부상 후 1, 3, 7, 14, 21, 30일에 각 쥐의 체중을 측정하고, 시간이 지남에 따라 전반적인 건강 상태를 평가하기 위해 값을 기록하세요.

7. 빔-워크 테스트 수행

1. 장비 준비해.
   1. 길이 1m, 너비 1cm인 수평 나무 빔을 사용해 지면에서 30cm 높이에 매달아 두세요.
2. 운동 협응력 테스트.
   1. 마우스를 빔의 시작 끝에 놓고, 끝까지 이동하게 한 뒤, 빔을 통과하는 데 걸리는 시간을 기록하세요.
   2. 부상 전과 부상 후 1, 3, 7, 14, 21, 30일에 검사를 수행하세요.
      참고: 행동 검사는 검사 간 이승 효과를 최소화하기 위해 일정이 조정되었습니다. 꼬리 서스펜션 테스트(TST)와 강제 수영 테스트(FST)가 오픈 필드 테스트(OFT)보다 더 스트레스를 유발하기 때문에 먼저 수행되었고, 이후 OFT와 반스 미로가 나중에 시행되었습니다. 이 시퀀스는 이전 습관화나 반복적인 탐색적 노출로 인한 잠재적 혼란을 줄이기 위해 선택되었습니다.

8. 꼬리 서스펜션 테스트 수행

1. 장비 준비해.
   1. 부상 후 7일째에 테스트를 수행하고, 꼬리 위에 플렉시글라스 실린더를 올려 꼬리 등반을 방지하세요. 길이 4cm, 외경 1.6cm, 내경 1.2cm, 무게 1.6g의 원통을 사용하세요.
2. 행동을 기록하세요.
   1. 꼬리를 접착 테이프로 서스펜션 박스에 고정시키고, 쥐가 박스 바닥에 닿지 못하게 한 뒤 3분간 매달아 두세요.
   2. 고해상도 카메라로 전체 세션을 녹화하고, 눈이 멀었던 관찰자가 녹화한 영상을 통해 이동 시간과 비이동 시간을 수동으로 분석합니다.

9. 강제 수영 시험 수행

1. 장비 준비해.
   1. 부상 후 10일째에 검사를 수행하며, 높이 25cm, 직경 15cm의 투명 원통에 23–25 °C 유지의 물을 채웁니다. 꼬리와 뒷다리가 바닥에 닿지 않도록 수심을 설정하세요.
2. 행동을 기록하세요.
   1. 쥐를 물에 6분간 넣고 고해상도 카메라로 전체 세션을 녹화하세요.
   2. 실명한 관찰자가 녹음의 마지막 4분을 수동으로 분석하여 이동 시간과 움직임 제한 시간을 정량화합니다.
   3. 움직임 제한을 머리를 물 위에 유지하기 위해 필요한 최소한의 움직임만으로 정의하세요.

10. 오픈 필드 테스트 수행

1. 장비 준비해.
   1. 부상 후 14일째에 조용한 방에서 꾸준한 조명이 있는 곳에서 검사를 수행하세요. 이 후반 시점은 이전 TST 및 FST 세션과 분리되어 급성 스트레스 관련 OFT로의 연속을 줄이기 위해 선택되었습니다.
   2. 40cm× 40cm× 40cm 크기의 개방형 필드 박스를 사용하세요.
2. 탐색 행동을 기록하고 분석하세요.
   1. 쥐를 경기장 중앙에 놓고 6분간 자유롭게 탐험하게 하세요.
   2. 행동 추적 및 분석 소프트웨어를 사용해 6분간 행동을 추적하세요. 소프트웨어에서 경기장 크기를 40cm × 40cm 장치에 맞추고 경기장을 가상으로 5× 5 그리드로 나누세요.
   3. 16개의 바깥 칸을 주변 구역으로, 9개의 안쪽 칸을 중심 구역으로 정의합니다. 동물 색깔을 배경색보다 더 어둡게 설정하세요. 동물의 몸만 추적하세요; 머리나 꼬리를 추적하지 마세요. 배경을 수동으로 캡처하세요.
   4. 소프트웨어를 사용해 평균 속도, 중심 구역에서 머무는 시간, 주변 구역에서 머무는 시간, 그리고 전체 테스트 기간 동안 이동한 총 거리를 측정하세요.
   5. 각 시술 전후에 기구를 청소하고 탈취하여 후각 신호를 제거하세요.

11. 반즈 미로 공연

1. 장비 준비해.
   1. 부상 후 30일째부터 반스 미로 평가를 시작하세요.
   2. 직경 1m의 원형 스테인리스 플랫폼을 사용하고, 20개의 균등한 간격으로 구멍을 뚫으세요.
   3. 탈출 상자를 지정된 목표 구멍 아래에 두고, 미로 주변에 시각적 단서를 배치하며, 모든 시험 동안 목표 구멍 위치를 일정하게 유지하세요.
2. 훈련 단계 진행
   1. 훈련 중에 90dB 백색소음을 혐오 자극으로 켜보세요.
   2. 마우스를 플랫폼 중앙의 투명 원통 아래에 120초간 두세요.
   3. 실린더를 제거하고 마우스가 최대 180초까지 탐색하도록 허용하세요.
   4. 네 발이 모두 탈출 상자에 들어갈 때 성공적인 시도를 기록하세요.
   5. 180초 이내에 목표를 찾지 못하면 마우스를 이스케이프 박스 안으로 유도하고 지연 시간을 180초로 기록하세요.
   6. 마우스가 60초 동안 탈출 박스에 머무르도록 하세요.
   7. 각 훈련일마다 4–5시간 간격 후에 훈련 시험을 한 번 반복하고, 4일 연속으로 훈련을 계속하세요.
3. 휴식일과 시험 단계 진행
   1. 교육 단계 후 하루 동안 훈련을 중단하세요.
   2. 테스트 당일에는 마우스를 플랫폼 중앙에 두고 최대 180초까지 탐색을 허용합니다.
   3. 미로 직경을 100cm로 설정해 스케일 보정을 하고, 트래킹 아레나가 영상 프레임 중앙에 있는지 확인하세요. 동물 색깔을 배경보다 어둡게 설정하세요. 동물의 몸만 추적하세요; 머리나 꼬리를 추적하지 마세요. 배경을 수동으로 캡처하세요.
   4. 행동 추적 및 분석 소프트웨어를 사용해 탈출 박스 진입 지연, 평균 속도, 총 이동 거리를 180초 테스트 세션 동안 기록합니다. 분석 전에 지정된 목표 구멍의 위치에 따라 소프트웨어에서 탈출 구역을 정의하세요.

12. 데이터 분석

1. 데이터셋을 준비하세요.
   1. 행동, 영상, 체중 데이터를 통계 및 그래프 소프트웨어로 수집하세요.
   2. 데이터를 평균의 표준오차 ± 표현(SEM)으로 표현합니다.
2. 통계 분석을 수행하세요.
   1. 이 연구에서 종단 체중 및 빔-보행 데이터를 선형 혼합 효과 모델로 분석하는데, 그룹, 시간, 상호작용을 고정 효과로, 동물을 무작위 효과로 보고, 해당 시 사후 다중 비교 검정을 수행합니다.
   2. 정규분포 데이터에 대해 TST, FST, OFT, Barnes 미로 결과를 분석하여 균질 분산이 있는 정규 분포 데이터를 분석하고, 전체 ANOVA가 유의미할 때는 Tukey의 사후 검정을 적용합니다. 비모수 데이터의 경우, Kruskal-Wallis 검정 후 Dunn 사후 검정을 사용하세요.
   3. 가능한 한 정확한 p값과 검정 통계량, 자유도, 효과 크기 측정값(일방향 ANOVA의 경우 R² )을 보고하세요. 위에 명시된 통계 검정에서 보고된 모든 p-값을 도출하고, 모든 분석을 통계 및 그래프 소프트웨어에서 수행하세요.
   4. 통계적 유의성을 p. < 0.05에 설정하라.

결과

c-TBI 마우스의 영상 및 신경병리학적 평가

동물의 전반적인 건강 상태와 기저 운동 기능을 평가하기 위해, 그림 1에 표시된 시간표에 따라 체중과 빔 걷기 수행 수행을 모니터링하였습니다. 종단 그룹 차이는 동물을 무작위 효과로 사용하는 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 분석하였다. 모델링 이전에는 그룹 간 체중에 통계적 차이가 없었습니다(그림 4A). 모델링 후 c-TBI 마우스의 전체 체중은 Naive와 Sham 그룹보다 약간 낮았으며, TBI 후 3일째에 최저점을 찍었습니다; 그러나 이러한 집단 간 차이는 통계적으로 유의미하지 않았습니다. 외상성 뇌손상 후 3일째부터 C-TBI 생쥐의 체중은 점차 회복되고 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 빔-워크 테스트에서는 평가된 시점에서 c-...

토론

본 연구는 반복 자유낙하 체중 낙하 방법을 사용하여 반복적인 경미한 외상성 뇌손상(rmTBI) 마우스 모델을 구축하기 위한 표준화된 실험 프로토콜을 상세히 설명합니다. 두개골에 노출된 쥐를 입체주행 장치에 고정하고, 25cm 높이에서 떨어진 20g 무게추를 5일 연속으로 정의된 좌표에 반복적으로 충격을 가함으로써, 두개골 골절이나 심한 국소 뇌 타박상 없이 만성 우울 유사 행동이 특징인 행동 표현형을 유도했습니다. 이 모델의 주요 특징은 반복적이고 경미한 폐쇄 머리 충격 후 부상 후 기간 동안 우울과 유사한 행동이 재현 가능하게 나타나는 점입니다. 따라서 본 연구는 만성 외상 후 우울 유사 행동과 관련 신경정신과적 후유증의 기전을 조사할 수 있는 rmTBI 마우스 모델을 확립합니다. 본 연구에서는 최종 충격 후 최대 30일까지 결과를 평가했으며, 이는 급성 반응이 아닌 만성 부상 후 시점으로 사용되었습니다. 추가적인 후속 시점들은 향후 연구에서 모델의 시간적 특성화를 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	진환 메디컬	I303	상처 닫기
마취 기기	RWD 생명 과학	R550	동물 모델 구성
ANY-maze 행동 추적 소프트웨어	Stoelting	버전 7	행동 소프트웨어
Barnes 미로	상하이 신루안 정보 기술	XR-XB108	행동 소프트웨어
Biorender	BioRender	https://biorender.com	과학 연구 도면 소프트웨어
부프레노르핀	Sigma-Aldrich	Y0001108	수술 후 진통
전기 면도기	AUX	AUX-C5-1	수술 전 털 제거
강제 수영 테스트	상하이 신루안 정보 기술	XR-XQX201	행동 소프트웨어
GraphPad Prism 9.5	라 호야	9.5	통계 소프트웨어
아이소플루란	RWD 생명 과학	R510-22-10	동물 모델 구성
마우스	찰스 리버	C57/6N	실험용 동물
개방형 테스트	상하이 신루안 정보 기술	XR-XZ301	행동 소프트웨어
안과용 연고	베이징 트윈럭 제약	H11021342	마취 중 각막 건조 방지
파라포르말데하이드(PFA), 4%	바이오샤프	BL539A	세척 및 조직 고정
인산염 완충 생리 식염수(PBS)	바이오샤프	BL1425A	세척 및 조직 세척
포비돈-아이오딘 용액, 10%	베요타임	27883-25g	수술 전 피부 소독
임상 전 자기 공명 영상 시스템	유나이티드 이미징 생명 과학 기기	uMR9.4T	이미징 소프트웨어
스칼펠 블레이드 No. 11	진환 메디컬	K3-11	수술 중 피부 절개
스칼펠 핸들	진환 메디컬	K6-10	No. 11 스칼펠 블레이드와 함께 사용
스테레오탁시 기기	RWD 생명 과학	68025	동물 모델 구성
무균 거즈	하이노트	BK05	출혈 제어 및 수술 세정
꼬리 현수 테스트	상하이 신루안 정보 기술	XR-XQX201	행동 소프트웨어
무게 강타 임팩터	RWD 생명 과학	68093	동물 모델 구성