방법 논문

항섬유화 약물 스크리닝을 위한 마우스 콜라겐 1형 알파 1 프로모터 기반의 섬유아세포 유래 아데노바이러스 리포터 시스템

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DOI:

10.3791/71678

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2026년 8월 14일

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1Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education, Shihezi University School of Medicine, 2NHC Key Laboratory of Cardiopulmonary Rehabilitation and Functional Recovery; Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), 3School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences, 4Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, 5State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Institute of Advanced Clinical Medicine, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 7Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, 8Haihe Laboratory of Cell Ecosystem

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 섬유아세포 활성화를 종단적으로 모니터링하고 항섬유화 화합물의 고처리량 스크리닝을 촉진하기 위해, 마우스 type I collagen 프로모터에 의해 구동되는 섬유아세포 기반 아데노바이러스 리포터 시스템의 개발 방법을 설명합니다.

초록

비정상적인 섬유아세포 활성화와 과도한 세포외 기질 침착을 특징으로 하는 심장 섬유화는 종단적이고 확장 가능하며 비파괴적인 in vitro 스크리닝 플랫폼의 부재로 인해 표적 특이적 치료제가 부족한 실정입니다. 전통적인 종점 분석(end-point assay)과 자원 집약적인 줄기세포 모델은 본질적으로 섬유화 진행의 실시간 모니터링을 불가능하게 합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본 프로토콜에서는 NIH/3T3 섬유아세포에서 마우스 collagen type I alpha 1 (Col1a1) 프로모터 기반의 아데노바이러스 mCherry 형광 리포터 시스템(Ad-mCol1a1p-mCherry)의 생성, 최적화 및 검증 방법을 설명합니다. 재조합 아데노바이러스 패키징을 위한 핵심 단계, 세포 독성을 최소화하기 위한 형질전환 최적화(감염 다중도, MOI), 그리고 강력한 transforming growth factor beta (TGF-β) 유도 섬유화 모델의 구축 과정을 상세히 다룹니다. 이 시스템은 세포 고정 과정이 필요 없으므로, 살아있는 세포에서 콜라겐 전사를 직접적이고 종단적으로 모니터링할 수 있게 합니다. 해당 모델의 특이성과 신뢰성은 TGF‑β type I 수용체 (ALK5) 억제제인 SB431542를 사용하여 약리학적으로 검증되었으며, 형광 판독값은 역전사 정량 PCR 및 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 정량화된 내인성 섬유화 마커와 상관관계를 보였습니다. 궁극적으로, 이 비용 효율적인 플랫폼은 새로운 항섬유화제 고속 스크리닝을 위한 접근 가능한 도구를 제공함으로써 중개 심혈관 연구를 가속화할 것입니다.

서론

심장 섬유화의 관리는 상당한 임상적 과제를 안겨줍니다. 정지 상태의 섬유아세포가 근섬유아세포로 비정상적으로 활성화되고 세포외 기질(ECM)이 과도하게 침착되는 것이 특징인 심장 섬유화는 심부전, 심근경색 및 기타 심혈관 질환이 공유하는 가역 불가능한 종말 경로를 나타냅니다1,2,3. 그러나 현재의 치료 전략은 상당한 한계에 직면해 있습니다. 이뇨제, β-차단제, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템 억제제와 같은 기존의 중재법은 주로 전신 혈역학적 스트레스를 완화하고 신경호르몬 활성화를 경감시키는 데 그칩니다4,5,6,7. 이러한 요법들은 섬유아세포 활성화를 직접적으로 표적하거나 진행 중인 콜라겐 침착을 중단시키지 못합니다. 또한, transforming growth factor beta (TGF-β)/Smad 경로, 산화 스트레스 및 대사 재프로그래밍과 같은 신호 전달 폭포가 이 병리를 주도하지만, 전신 독성과 비특이적 전달 메커니즘으로 인해 이러한 통찰을 직접 작용하는 항섬유화 치료법으로 전환하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다8,9,10. 따라서 표적 특이적인 새로운 항섬유화 치료법이 시급히 필요합니다. 주요한 중개 연구의 병목 현상은 섬유아세포 활성화를 민감하고 동적으로 보고할 수 있는 기능적 평가 시스템의 부재입니다. 전통적인 실험 모델은 효율적인 약물 스크리닝을 방해하는 상당한 한계를 보입니다11,12. in vivo 동물 모델은 전반적인 심장 리모델링을 재현하지만, 종 간 차이, 장기간의 실험 기간, 높은 비용 및 낮은 처리량이라는 단점이 있습니다11.

이러한 장애물을 극복하기 위해 다양한 in vitro 스크리닝 플랫폼이 등장했지만, 여전히 중대한 방법론적 결함이 남아 있습니다. 고함량 면역형광 분석법은 파괴적인 세포 고정과 노동 집약적인 처리 과정이 필요하며, 섬유아세포 활성화의 실시간 역학을 포착하기보다는 정적인 스냅샷만을 제공합니다. 마찬가지로, 무표지 임피던스 모니터링과 질량 분석법(MS/MS)을 통합한 플랫폼은 비특이성과 낮은 확장성이라는 문제를 안고 있는데, 이는 일반적인 세포 독성으로 인한 임피던스 감소가 실제 항섬유화 효능과 쉽게 혼동될 수 있기 때문입니다. 또한, 유도만능줄기세포(iPSCs)를 이용하여 세포골격 마커(예: alpha-smooth muscle actin [α-SMA]/ACTA2)를 추적하는 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 공학 리포터 시스템은 매우 높은 중개 연구 장벽을 가지고 있습니다13. 이러한 iPSC 기반 모델은 비용이 매우 비싸고 기술적으로 까다로우며, 일상적인 고속 스크리닝에 활용하기에는 접근성이 크게 떨어집니다. 더욱이, α-SMA와 같은 세포골격 마커에 의존하는 방식은 그 발현이 ECM의 기능적 분비 및 과도한 침착과 엄격하게 상관관계가 있지 않으므로, 병리적 종말점을 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다14. 따라서 이러한 시스템들은 약리학적 개입에 대한 초기 단계의 세포 반응을 종단적으로 매핑하기에는 불충분합니다.

이와 대조적으로, 본 프로토콜은 섬유아세포 활성화를 모니터링하기 위한 비파괴적이고 강력한 플랫폼 구축을 목표로 하는 collagen type I alpha 1 (Col1a1) 프로모터 기반의 종단적 기능적 리포터 시스템을 설명합니다. Type I collagen은 심장 리모델링 중에 침착되는 주요 ECM 성분이기 때문에, 이를 인코딩하는 유전자인 Col1a1의 전사 활성화를 포착하는 것은 섬유아세포 활성화에 대한 직접적이고 병리학적으로 유의미한 판독값 역할을 합니다. 이 Col1a1 프로모터 기반 모델은 섬유화 과정의 지속적인 분자 수준 모니터링을 가능하게 하여, 기전 기반 약물 스크리닝에 최적화된 민감하고 종단적이며 정량 가능한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

모든 실험이 기관 및 국가 가이드라인에 따라 수행되었음을 확인합니다. 본 연구는 기성 NIH Swiss 마우스 배아 섬유아세포 세포주(NIH/3T3)와 mCol1a1p-mCherry 리포터 시스템만을 독점적으로 사용하였으며, 척추동물, 배아 또는 인간 피험자를 포함하지 않았으므로, 본 원고에 기술된 절차에 대해 기관 생명윤리위원회(IRB)의 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다.

재조합 아데노바이러스 벡터와 관련된 모든 절차는 기관의 생물안전 규정 및 표준 생물안전 2등급(BSL-2) 지침에 따라 수행되었습니다. 바이러스 취급, 형질도입, 보관 및 폐기물 처리는 인증된 생물안전 작업대와 적절한 개인 보호 장구를 사용하여 수행되었습니다. 아데노바이러스 물질이 포함된 액체 폐기물은 폐기 전 갓 제조한 표백제 용액을 사용하여 오염을 제거하였으며, 오염된 소모품은 기관의 생물안전 프로토콜에 따라 고압 증기 멸균 처리하였습니다. 우발적 유출 시에는 기관의 유출 대응 절차에 따라 승인된 바이러스 사멸제를 사용하여 즉시 소독하였습니다.

1. 실험 워크플로 개요

  1. 마우스 생성 Col1a1 단계 2에 기술된 프로모터 구동 재조합 아데노바이러스.
  2. 단계 3에 기술된 대로 NIH/3T3 섬유아세포에서의 바이러스 형질도입 조건을 최적화하십시오.
  3. TGF-β 반응성 체계 구축 in vitro 단계 4에서 설명한 섬유화 리포터 모델.
  4. 단계 4에서 설명한 바와 같이, 시간 및 농도 의존적 TGF-β 자극을 사용하여 모델의 안정성, 특이성 및 생물학적 재현성을 검증하십시오.
  5. 단계 5에 기술된 대로 SB431542를 사용하여 약리학적 억제를 수행하십시오.
  6. 단계 5에 기술된 대로 하위 단계의 효소결합면역흡착분석법(ELISA) 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR) 분석을 수행하십시오.
    참고: 다음을 참조하십시오. 그림 1A 실험 워크플로의 도식적 개요를 참조하십시오. 다음을 참조하십시오. 재료 목록 실험 장치 및 시약을 위해.

mCol1a1p-mCherry 아데노바이러스 리포터 다이어그램; PCR, 플라스미드 클로닝, 섬유아세포 스크리닝 과정.
그림 1m의 구축 및 검증 워크플로우Col1a1p-mCherry 섬유아세포 내 아데노바이러스 리포터 시스템 (A) 아데노바이러스(AdV) m의 구축에 대한 도식적 개요Col1a1p-mCherry 리포터 시스템 및 NIH/3T3 섬유아세포에서의 모델 검증을 위한 실험 워크플로입니다. 해당 워크플로는 프로모터 클로닝, 재조합 아데노바이러스 조립, HEK293 세포에서의 바이러스 패키징, 감염 다중도(MOI) 최적화 및 후속 고함량 형광 스크리닝을 포함합니다.BAd-m에 감염된 NIH/3T3 섬유아세포의 대표 형광 이미지Col1a1p-mCherry 0, 1, 10, 100, 10의 MOI로 아데노바이러스를 처리하였다. 핵은 Hoechst 342(청색)로 염색하였으며, mCherry 형광(적색)은 ~을 나타냅니다 Col1a1 프로모터 활성. 형광 강도는 고함량 이미징(high-content imaging)을 통해 정량화되었으며, 핵 수로 정규화되었다. 형태학적 변화가 최소화되면서도 강하고 균일한 리포터 발현이 확인됨에 따라, 이후 실험에서는 MOI 10을 선택하였다. 스케일 바 = 200 µm본 도표는 BioRender.com의 승인된 라이선스를 통해 제작되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

2. mCol1a1 프로모터 아데노바이러스의 구축, 패키징 및 증폭

  1. 재조합 아데노바이러스 벡터의 구축
    1. 2354 bp 마우스 유전자를 클로닝하십시오. Col1a1 ~의 상류에 위치한 프로모터 단편(유전체 좌표: chr1:9482479–94827132; 전사 시작 부위[TSS] 기준 −271에서 +83 bp) mCherry pDC315 아데노바이러스 셔틀 벡터로의 리포터 유전자 삽입.
      참고: ~의 전체 서열은 Col1a1 프로모터 및 pDC315-m의 상세 정보Col1a1p-mCherry 플라스미드 지도는 다음에서 제공됩니다. 보충 자료 1 및 부록 그림 1.
    2. BamHI와 KpnI을 사용하여 pDC315 벡터를 선형화하십시오. 15–25 bp의 상동성 팔(homology arms)을 포함하는 프라이머를 사용하여 프로모터 삽입물을 증폭하십시오.
      참고: 원활한 진행을 위해 상동 재조합 기반의 심리스 클로닝(seamless cloning) 전략을 사용하십시오. 인비트로(in vitro) 재조합
    3. PCR 스크리닝과 생거 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 통해 결과 플라스미드를 검증하십시오.
      참고: 프로모터-리포터 접합 서열을 주의 깊게 검사하여 프레임시프트(frameshift)나 조기 종결 코돈(premature stop codon)이 없는지 확인하십시오.
    4. 세포 내 Cre 매개 재조합을 통한 AdMax 시스템을 이용하여 재조합 아데노바이러스를 생성하십시오.
      참고: pBHGloxΔE1,3Cre 백본 플라스미드는 E1/E3가 결실된 비복제형 Ad5 게놈과, 셔틀 벡터의 loxP 부위와의 부위 특이적 재조합을 용이하게 하는 Cre 재조합효소 발현 카세트를 포함하고 있습니다.
    5. 검증된 pDC315-m을 HEK293 세포에 공동 형질전환합니다.Col1a1p-mCherry 셔틀 벡터 및 pBHGloxΔE1,3Cre 아데노바이러스 백본 플라스미드.
  2. 아데노바이러스 패키징 및 증폭
    1. 10% 소태아혈청(FBS)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)에서 HEK293 세포를 배양하십시오. 계대 배수가 낮은 세포를 사용하십시오(<아데노바이러스 패키징을 위해 (20회 계대 배양)까지 수행합니다.
    2. 형질도입 24시간 전에 HEK293 세포를 30%~40%의 합류도로 파종하여, 형질도입 시점에 50%~60%의 합류도가 되도록 합니다.
    3. HEK293 세포에 ~를 공동 형질전환(co-transfect)한다. 5 µg 셔틀 플라스미드 및 5 µg Lipofectamine 20 transfection 시약을 이용한 pBHGloxΔE1,3Cre helper plasmid transfection.
      참고: DNA 대 시약의 비율을 1:1로 유지하십시오.10 µg 전체 DNA를 10 µL 형질전환 시약).
    4. 형질전환된 세포를 다음 조건에서 배양하십시오. 37°C 5% CO₂ 조건에서 배양하며 세포병성 효과(cytopathic effects)가 나타나는지 매일 모니터링하십시오.
      참고: 초기 CPE가 나타나기까지 7~14일이 소요될 수 있습니다. 배지가 산성화되어 노란색으로 변하는 경우, 세포가 교란되지 않도록 주의하며 배지를 절반만 조심스럽게 교체하십시오.
    5. 세포의 원형화 및 수축으로 특징지어지는 전형적인 세포병성 효과(CPE)가 관찰되고, 세포의 50% 이상이 배양 표면에서 박리되었을 때 세포와 상층액을 수확하십시오.
      참고: 이 단계는 통상적으로 형질전환 후 10~15일에 도달합니다.
    6. 샘플을 −에서 동결시켜 세 차례의 동결-해동 사이클을 수행하십시오.70°C 30분 동안 유지하며, 다음의 장소에서 해동합니다. 37°C 항온수조
    7. 세포 용해를 촉진하기 위해 각 해동 단계 후 현탁액을 30초 동안 볼텍싱하십시오.
      주의: 다음 온도에서 장시간 배양하는 것을 피하십시오. 37°C 바이러스 안정성을 유지하기 위해 해동하는 동안.
    8. 바이러스 용해물(10)의 10배 단계 희석액을 준비하십시오.−1 10까지−13완전 DMEM을 사용하여. 추가하십시오. 90 µL 각 바이러스 희석액을 96-웰 플레이트에 분주된 HEK293 세포에 처리하며, 희석 단계별로 10개의 반복 웰을 사용합니다.
      참고: 1 × 10 이상의 바이러스 역가9 PFU/mL은 이후 정제를 위한 충분한 증폭 종말점으로 정의되었습니다.
    9. 10 mL의 조 viral lysate를 다음을 통해 정제합니다. 0.45 µm 세포 잔해를 제거하기 위한 필터.
    10. 정제된 용해물을 Benzonase 뉴클레아제(10 U/mL)로 처리하여 37°C 30분 동안.
    11. 제조사의 지침에 따라 Adeno-X Virus Purification Kit를 사용하여 재조합 아데노바이러스를 정제하십시오.
      참고: 전평형화된 정제 필터에 로딩하기 전, 용해물(lysate)을 1× 희석 완충액과 혼합하십시오. 필터를 1× 세척 완충액으로 세척하고, 3 mL의 1× 용출 완충액을 사용하여 정제된 바이러스를 용출하십시오.
    12. 플레이트를 10일 동안 배양하고 광학 현미경으로 세포변성효과(CPE)를 평가한다. 특징적인 세포 원형화 및 탈락 여부를 바탕으로 양성 CPE 점수를 매긴다. CPE 점수를 기반으로 Spearman-Karber 방법을 사용하여 감염성 바이러스 역가를 계산한다.
      참고: 최종 바이러스 스톡이 최소 1 × 10^10에 도달하도록 하십시오.11 후속 응용 단계에 필요한 mL당 PFU(PFU/mL).
    13. 정제된 아데노바이러스를 소분하여 바이러스 스톡을 − 온도에서 보관하십시오.80°C.
      참고: 정제된 아데노바이러스 분주액은 −에서 보관하십시오.80°C 장기 보존을 위해 사용하십시오. 바이러스 감염력을 유지하기 위해 반복적인 냉동-해동 주기를 피하십시오.

3. 세포 배양 및 바이러스 감염 조건의 최적화

  1. 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin–streptomycin)이 첨가된 DMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) 배지에서 NIH/3T3 섬유아세포를 배양한다.
    참고: 일관된 세포 상태를 유지하기 위해, 배양 플라스크 내에서 70%~80%의 합쳐짐(confluence)에 도달한 계대 배수 3~8회 사이의 세포를 사용하십시오.
  2. NIH/3T3 섬유아세포를 384-웰 플레이트에 4 × 10^5 /mL 농도로 분주하십시오.3 웰당 세포 수 40 µL 완전 배양 배지.
  3. 세포를 다음 조건에서 배양하십시오. 37°C 세포 부착 및 대수 성장기로의 진입을 위해 5% CO₂ 환경에서 12시간 동안 배양합니다.
    참고: 세포 분포의 불균형과 가장자리 효과를 최소화하기 위해, 배양 전 플레이트를 실온에서 20~30분 동안 방치하십시오. 가장 바깥쪽 웰에는 멸균 된 인산완충식염수(PBS) 또는 멸균 증류수를 채우십시오.
  4. 감염되지 않은 대조군과 함께, 1–1,00 범위의 감염 다중도(MOI)로 재조합 아데노바이러스를 세포에 감염시킵니다.
    참고: 다음 공식을 사용하여 필요한 아데노바이러스 부피를 계산하십시오.

    바이러스 부하 공식 V=N×MOI/T, 바이러스학 연구 및 분석을 위한 수학 방정식.
    여기서 V는 아데노바이러스 스톡 부피(mL)이며, N은 웰당 분주된 세포 수(4 × 103), MOI는 목표 감염 다중도로, T는 감염성 바이러스 역가(PFU/mL)이다. 본 연구에 사용된 바이러스 스톡의 감염성 역가는 1 × 1011 단계 2.2.12에 기술된 Spearman-Karber법으로 결정된 PFU/mL.
  5. 추가되는 바이러스 스톡 부피가 웰 전체 부피의 10%를 초과하지 않도록 하십시오.
    참고: 과도한 양의 바이러스 스톡(viral stock)은 배지의 pH를 변화시키고 비특이적 세포독성을 유도할 수 있습니다.
  6. 바이러스가 포함된 배지를 다음으로 교체하십시오. 40 µL 감염 24시간 후 신선한 완전 배양 배지.
    참고: 단계 3.1과 동일하게 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/F12를 사용하십시오.
  7. 저속 자동 액체 핸들러를 사용하거나, 각 웰의 위쪽 측벽에 멀티채널 피펫 팁을 조심스럽게 기울여 배지 교체를 수행하십시오.
    참고: 세포 박리를 최소화하기 위해 384-웰 플레이트를 취급할 때는 일반적인 진공 흡입 방식을 피하십시오.
  8. 최적 MOI를 가시적이고 균질한 결과를 생성하는 가장 낮은 바이러스 용량으로 정의하십시오. mCherry 비감염 대조군 세포와 유사한 세포 형태 및 핵 수를 유지하면서 형광을 나타내었다.
    참고: Hoechst 염색된 핵 수 측정 및 형광 이미징을 통해 리포터 발현을 평가하십시오. 세포는 원형으로 변하거나 박리되지 않고 특유의 방추형 형태를 유지해야 합니다. 과도하게 높은 MOI는 기저 발현을 유도할 수 있습니다. mCherry 세포 스트레스 반응을 통한 활성화. 서로 다른 MOI에서의 대표적인 형광 결과가 다음의 그림에 나타나 있다. 그림 1B.
  9. 모든 후속 실험을 위한 최적화된 MOI를 선택하십시오.
    참고: 본 연구에서는 이후의 실험을 위해 10의 MOI를 선택하였습니다.

4. TGF-β 자극을 이용한 모델 안정성 평가

  1. 단계 3.9에서 결정된 최적화된 MOI 10으로 재조합 아데노바이러스를 NIH/3T3 섬유아세포에 감염시킨다.
  2. TGF-β 자극 전, 0.2% FBS가 포함된 DMEM/F12에서 섬유아세포를 12시간 동안 혈청 기아(Serum-starve) 상태로 둔다.
    참고: 혈청 기아는 세포를 동기화하고 Col1a1 프로모터의 기저 활성화를 최소화하기 위해 수행되었다.
  3. 0.1% bovine serum albumin (BSA)가 포함된 4 mM HCl을 사용하여 10 µg/mL 농도의 재조합 인간 TGF-β 스탁 용액을 준비한다.
    참고: 반복적인 동결-해동 사이클을 피하기 위해 TGF-β 스탁 용액을 소량으로 분주하여 −80°C에 보관한다.
  4. 6개의 독립적인 생물학적 반복 실험군에서 0–40 ng/mL 범위의 TGF-β 농도 구배로 세포를 처리한다.
    참고: 0 ng/mL 조건은 비자극 대조군으로 사용되었다.
  5. 자극된 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24, 48 또는 72시간 동안 배양한다. 누적 광독성을 최소화하기 위해 각 이미지 촬영 시점마다 별도의 평행 플레이트를 사용한다.
  6. 이미지 촬영 전, 최종 작동 농도 2.5 µg/mL의 Hoechst 3342 용액으로 세포를 15분 동안 염색한다.
    참고: 10 mg/mL Hoechst 342 스탁 용액을 멸균 PBS로 1:4,00 비율로 희석하여 염색 용액을 준비한다. 광퇴색을 최소화하기 위해 차광 조건에서 염색을 수행한다.
  7. 10× 건식 대물렌즈가 장착된 고함량 이미징 시스템(high-content imaging system)을 사용하여 형광 이미지를 획득한다.
  8. 각 실험 조건에 대해 384-웰 플레이트 형식에서 웰당 5개의 비중첩 영역을 캡처한다.
    참고: 비교 가능성을 보장하기 위해 모든 실험군에 걸쳐 동일한 이미징 설정을 유지한다. 라이브 셀 이미징 동안 자동 레이저 기반 오토포커스를 사용하고 37°C, 5% CO₂ 환경 제어 조건을 유지한다.
  9. 561 nm 여기, Bandpass 60/52 (BP60/52) 방출 필터 및 20 ms 노출 시간으로 mCherry 형광 이미지를 획득한다.
  10. 405 nm 여기, BP445/45 방출 필터 및 30 ms 노출 시간으로 Hoechst 형광 이미지를 획득한다.
    참고: 카메라 게인을 1.0으로 설정하고, 선형 형광 검출을 유지하고 공간 해상도를 최대화하기 위해 1 × 1 비닝을 사용하여 모든 이미지를 최대 카메라 해상도로 획득한다.
  11. CellPathfinder 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 분석한다.
  12. 기준 핵 직경 20 µm 및 면적 범위 20–40 µm2를 사용하여 Hoechst 채널에서 핵을 기본 객체로 식별한다.
  13. 기준 세포 직경 60 µm를 사용하여 핵 경계로부터 확장함으로써 mCherry 채널에서 세포질 관심 영역(ROI)을 정의한다.
    참고: 세그멘테이션 과정에서 “Exclude Edge” 필터를 적용하여 이미지 경계에 접촉한 부분적인 세포를 제거한다.
  14. 식별된 각 세포의 평균 형광 강도를 계산하고, 캡처된 5개 영역 전체에서 웰당 평균 형광 강도를 결정한다.

5. ELISA 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응을 이용한 모델 신뢰성 검증

  1. 단계 3.9에 설명된 대로, 최적화된 MOI 10으로 재조합 아데노바이러스를 NIH/3T3 섬유아세포에 감염시킨다.
  2. TGF-β 자극 전, SB431542로 30–60분 동안 세포를 전처리한다.
    참고: 20 mM SB431542 스톡 용액을 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 조제하여 분주한 후 −20°C에서 보관한다.
  3. 세포에 10 ng/mL TGF-β 및 최종 농도가 1, 5, 10, 15 µM인 SB431542를 처리한다. SB431542 처리를 하지 않고 0.1% (v/v) DMSO만 포함된 용매 대조군을 포함시킨다.
    참고: 모든 처리군에서 최종 DMSO 농도를 0.1% (v/v)로 유지한다.
  4. 2단계 희석법을 사용하여 TGF-β 작동 용액을 준비한다.
    참고: 100 µg/mL TGF-β 스톡 용액(0.1% BSA를 포함한 4 mM HCl로 조제됨)을 멸균 PBS에서 1:10으로 희석한 후, 완전 배지로 추가 희석하여 최종 작동 농도 10 ng/mL를 맞춘다.
  5. 처리된 세포가 담긴 6-웰 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한다.
  6. ELISA 분석을 위해 각 웰에서 2 mL의 배양 상층액을 수집한다.
  7. 수집한 상층액을 4°C에서 1,0 × g로 5분 동안 원심 분리하여 세포 잔해를 제거한다.
  8. 정제된 상층액을 분주하여 ELISA 분석 전까지 −80°C에 보관한다.
    참고: 정제된 상층액은 ELISA 분석 전까지 −80°C에 보관할 수 있다.
  9. 상층액 제거 후, 부착 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 조심스럽게 세척한다.
  10. 각 웰에 TRIzol 시약 1 mL를 직접 첨가하여 세포를 용해한다.
    참고: 샘플을 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기 전, 완전히 균질화되도록 용해물을 여러 번 피펫팅한다. RNA 용해물은 RNA 추출 전까지 −80°C에 보관할 수 있다.
  11. 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위해 용해물에서 총 RNA를 추출한다.
  12. 1 µg의 총 RNA를 사용하여 역전사를 수행한다.
    참고: 역전사는 다음 반응 조건으로 진행한다: 25°C에서 10분, 42°C에서 15분, 85°C에서 2분.
  13. PerfectStart Green qPCR SuperMix를 사용하여 정량 PCR을 수행한다. 각 반응은 5 µL의 상보적 DNA(cDNA) 템플릿을 포함하여 최종 부피 20 µL로 준비한다.
  14. 다음 사이클 조건으로 qPCR 반응을 진행한다: 94°C에서 30초 동안 초기 변성 후, 94°C 5초, 60°C 15초, 72°C 10초를 40회 반복한다.
    참고: 증폭 후 멜팅 커브 분석을 수행하여 산물의 특이성을 확인한다.
  15. 내부 대조군인 18S rRNA를 기준으로 Col1a1 유전자 발현을 정규화한다.
    참고: 모든 프라이머 서열은 부록 표 1(Supplementary Table 1)에 제공되어 있다.
  16. 제조사의 지침에 따라 ELISA를 이용하여 정제된 상층액 내 분비된 Collagen I 단백질 수준을 정량한다. 마우스 type I 콜라겐 ELISA 분석의 표준 곡선 범위는 0.78–50 ng/mL이며, 분석 검출 감도는 0.37 ng/mL이다.
  17. 모든 표준물질과 샘플을 기술적 반복(technical duplicates)으로 분석하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정한다.
    참고: 분비된 Col1a1 검출을 위한 분석 감도를 극대화하기 위해 희석하지 않은 정제 상층액을 사용한다.

결과

mCol1a1p-mCherry 재조합 아데노바이러스의 제작 및 패키징에 대한 개략적인 개요가 그림 1A에 제시되어 있습니다. 마우스 Col1a1 프로모터를 mCherry 리포터 유전자 상위에 클로닝하여 아데노바이러스 벡터에 삽입한 후, HEK293 세포에서 바이러스 패키징 및 증폭을 진행하였습니다. 이 워크플로우는 바이러스 감염, 섬유화 자극, 약물학적 개입 및 형광 기반 신호 판독을 포함한 주요 실험 단계를 보여줍니다. 이 모식도는 리포터 시스템의 구현을 위한 시각적 프레임워크를 제공하며, 이후의 기능적 검증 실험 해석을 뒷받침합니다.

최적의 바이러스 감염 조건을 결정하기 위해, 다양한 MOI 범위에서 NIH/3T3 섬유아세포를 mCol1a1p-mCherry 아데노바이러스로 감염시켰습니다. 그림 1B에 나타난 바와 같이, MOI가 증가함에 따라 mCherry 형광 강도가 증가했습니다. 낮은 MOI에서는 리포터 발현이 약하고 불균일하여 정량 분석을 위한 최적 조건이 아니었습니다. 높은 MOI에서는 세포가 둥글게 변하거나 박리되는 등 형태학적 변화가 나타났으며, 이는 세포 독성 효과를 나타냅니다. MOI 10에서 세포 형태가 유지되면서 강하고 균일한 형광이 관찰되었으며, 따라서 이를 이후 실험을 위한 최적 조건으로 선정하였습니다.

최적화된 MOI에서 NIH/3T3 섬유아세포를 농도를 높여가며 TGF-β로 자극했습니다. 자극 후 24, 48, 72시간에 리포터 형광을 측정했습니다. 그림 2A–C에 나타난 바와 같이, 모든 시점에서 mCherry 형광 강도가 농도 의존적으로 증가했습니다. 신호 강도는 24~72시간 동안 점진적으로 증가하여 시간 의존적 반응을 보였습니다. 이러한 결과는 리포터 시스템이 섬유화 자극에 대해 종단적이고 재현성 있게 반응함을 나타내는 긍정적인 결과입니다.

세포의 mCherry 강도에 미치는 TGF-β의 영향을 보여주는 형광 현미경 이미지와 막대 그래프 결과.
그림 2. m의 시간 및 용량 의존적 활성화Col1a1p-mCherry TGF-β(transforming growth factor beta) 자극에 의한 리포터 활성화. Ad-m에 감염된 NIH/3T3 섬유아세포Col1a1p-mCherry 최적화된 MOI의 아데노바이러스로 감염시킨 후, TGF-β의 농도를 높여가며 자극하였습니다. 이에 대한 대표 형광 이미지 및 해당 정량 분석 결과는 다음과 같습니다. mCherry 리포터 활성이 24시간에 나타납니다 (A), 48시간 (B), 그리고 72시간 (C) 자극 후. mCherry 형광(적색)은 ~을 반영합니다 Col1a1 프로모터 활성을 측정하였으며, 핵은 Hoechst 342(청색)로 대조 염색하였다. 형광 강도는 고함량 분석 이미징(high-content imaging)을 통해 정량화하고 핵 수로 표준화하였다. 데이터는 조건당 6회의 독립적인 생물학적 반복 실험으로부터 얻은 평균 ± 표준오차(SEM)로 나타내었다. 통계적 비교는 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 처리되지 않은 대조군과 비교하여 수행하였다. 이미징 파라미터는 모든 실험 조건에서 일정하게 유지하였다. 스케일 바 = 200 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

경로 특이성을 평가하기 위해, TGF-β 자극 하에서 NIH/3T3 섬유아세포를 TGF-β 제1형 수용체(ALK5) 억제인 SB431542로 처리하였습니다. 그림 3A–C에서 보는 바와 같이, SB431542는 mCherry 형광 강도를 농도 의존적으로 감소시켰습니다. 리포터 활성의 억제는 조사된 모든 시점에서 관찰되었으며, 억제 농도가 높을수록 더 큰 억제 효과가 나타났습니다. 이러한 결과는 긍정적인 성과를 나타내며, 리포터 활성화가 TGF-β 신호 전달에 의존하며 약리학적으로 조절될 수 있음을 시사합니다.

형광 현미경, mCherry, Hoechst, 24-72시간 TGF-β+SB43 분석, 강도 분석, 그래프.
그림 3SB431542는 TGF-β로 유도된 m의 활성화를 억제합니다.Col1a1p-mCherry 시간 및 용량 의존적인 방식으로 리포터를 나타냈습니다. Ad-m에 감염된 NIH/3T3 섬유아세포Col1a1p-mCherry 아데노바이러스는 TGF-β (10 ng/mL)로 자극되었으며, 이때 TGF-β 제1형 수용체(ALK5) 억제인 SB431542의 농도를 점진적으로 증가시켜(0, 1, 5, 10 및 15 µM(그림 패널에서는 SB43으로 약칭함). 대표적인 형광 이미지와 그에 따른 정량 분석 결과가 24시간 시점에서 제시되어 있습니다(A), 48시간 (B), 그리고 72시간(C) 처리 후. mCherry 형광(적색)은 다음을 반영합니다 Col1a1 프로모터 활성을 분석하였으며, 핵은 Hoechst 342(청색)로 대조 염색하였다. 형광 강도는 고해상도 이미지 분석(high-content imaging)을 통해 정량화하고 핵의 수로 표준화하였다. 데이터는 조건당 6회의 독립적인 생물학적 반복 실험 결과의 평균 ± 표준오차(SEM)로 나타내었다. 통계적 비교는 TGF-β 처리군을 기준으로 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 다중 비교 검정을 통해 수행하였다. 이미지 촬영 파라미터는 모든 실험 조건에서 동일하게 유지하였다. 스케일 바 = 200 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

리포터 활성이 내인성 섬유화 반응을 반영하는지 평가하기 위해, 최적화된 감염, 자극 및 억제 조건에서 NIH/3T3 섬유아세포를 분석하였습니다. 리포터 시스템 검증에 사용된 실험 워크플로우는 그림 4A에 요약되어 있습니다. 섬유화 관련 마커를 단백질 및 mRNA 수준에서 측정하였습니다. 그림 4B–C에서 보듯이, ELISA 결과 TGF-β 자극 후 섬유화 관련 단백질의 분비가 증가하였으며, 이는 SB431542 처리에 의해 감소되었습니다. 이와 일관되게, RT-qPCR에서는 Col1a1을 포함한 섬유화 관련 유전자의 발현에서 상응하는 변화가 나타났습니다. 형광 판독값, 단백질 분비 및 유전자 발현 사이의 일치성은 긍정적인 검증 결과이며, 이는 해당 조건에서 리포터 시스템이 섬유화 활성화를 반영함을 나타냅니다.

모델 검증을 위한 실험 워크플로우. ELISA, Col1a1 mRNA의 RT-qPCR 분석, 콜라겐 분비.
그림 4m의 검증Col1a1p-mCherry 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 및 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 통한 리포터 시스템. (A) 리포터 시스템 검증을 위한 실험 워크플로우의 모식도. NIH/3T3 섬유아세포를 TGF-β (10 ng/mL)로 자극하고, TGF-β 수용체 억제인 SB431542 (SB43)를 농도별로 처리하였다. 이후 하위 분석을 위해 세포 용해물과 배양 상층액을 수집하였다. (B) 의 정량 분석 Col1a1 SB431542의 농도 구배 하에서 TGF-β 자극에 따른 RT-qPCR 기반의 메신저 RNA(mRNA) 발현 측정. 상대적 Col1a1 mRNA 발현 수준은 18S 리보솜 RNA(18S rRNA)를 기준으로 표준화하였으며, 처리하지 않은 대조군에 대한 상대적 배수 변화(fold change)로 표시하였습니다.C) 패널 B와 동일한 실험 조건에서 ELISA를 이용하여 세포 배양 상층액 내 분비된 제I형 콜라겐 수치를 정량함. 제I형 콜라겐 농도는 ng/mL로 표시함. 데이터는 조건당 6회의 독립적인 생물학적 반복 실험의 평균 ± 표준오차(SEM)로 나타냄. 통계적 비교는 one-way ANOVA 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 TGF-β 처리군 대비로 수행함. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1. 아데노바이러스 리포터 벡터 구축에 사용된 마우스 Col1a1 프로모터 단편의 전체 뉴클레오타이드 서열. 2354 bp의 프로모터 영역은 게놈 좌표 chr1:9482479–94827132 (NC_077.7)에 해당하며, TSS 기준으로 −271에서 +83 bp까지 걸쳐 있다. 재조합 아데노바이러스 리포터 시스템 생성을 위해 프로모터 단편을 pDC315 셔틀 벡터의 mCherry 리포터 유전자 상위에 클로닝하였다.이 파일을 다운로드하시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1. RT-qPCR 분석에 사용된 프라이머 서열. Col1a1 및 내부 참조 유전자인 18S rRNA에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 서열이 5′–3′ 방향으로 나열되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1. pDC315-mCol1a1p-mCherry 아데노바이러스 셔틀 벡터의 플라스미드 지도. 재조합 아데노바이러스 리포터 컨스트럭트를 생성하기 위해, 상동 재조합 기반의 심리스 클로닝 전략을 사용하여 2354 bp 길이의 마우스 Col1a1 프로모터 단편을 mCherry 리포터 유전자 상위에 삽입하였습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

심장 섬유화는 심부전의 진행에 기여하며, 효과적인 항섬유화 치료법의 개발은 종단적 스크리닝 플랫폼의 부재로 인해 제한적입니다2,13. Western blotting, RT-qPCR, 면역형광 염색을 포함하여 항섬유화 효능을 평가하는 기존 방법들은 세포 용해나 고정이 필요한 종점 측정 방식에 의존합니다. 이러한 접근 방식은 살아있는 세포에서 섬유화 진행 과정을 실시간으로 모니터링하는 것을 방해하며, 종단적 및 고처리량 분석에 대한 적용 가능성을 제한합니다. 또한, 플라스미드 형질전환이나 렌티바이러스 통합을 통한 안정적인 리포터 세포주 구축은 섬유아세포의 낮은 형질전환 효율, 무작위 게놈 통합과 관련된 가변성, 그리고 지속적인 계대 배양에 따른 리포터 발현의 점진적 소실로 인해 종종 제약을 받습니다15.

NIH/3T3 섬유아세포의 유전자 전달에는 렌티바이러스 벡터가 빈번하게 사용되지만, 본 연구에서는 섬유아세포의 생리학적 충실도를 유지하기 위해 특히 아데노바이러스 리포터 시스템을 활용하였습니다. 렌티바이러스는 숙주 게놈에 영구적으로 통합되어 삽입 돌연변이의 내재적 위험을 수반하며, 이는 TGF-β 유도 섬유화와 같은 복잡한 캐스케이드를 평가할 때 내인성 신호 전달 네트워크를 의도치 않게 방해할 수 있는 중대한 우려 사항입니다. 반면, 아데노바이러스 벡터는 에피솜 형태로 남아 게놈의 무결성을 보장합니다. 또한, 안정적인 렌티바이러스 세포주 구축에 필요한 장기간의 항생제 선택 과정을 생략함으로써 치료로 인한 표현형 변화를 방지할 수 있으며, 고처리량 스크리닝에 적합한 신속하고 강력하며 효율적인 일시적 발현이 가능합니다.

이러한 기술적 한계를 해결하기 위해, mCol1a1 프로모터 구동 mCherry 아데노바이러스 리포터 시스템은 in vitro에서 섬유아세포 활성화를 모니터링하는 방법을 제공합니다. 이 시스템은 아데노바이러스 전달 방식과 섬유아세포 활성화 및 ECM 침착과 관련된 전사 마커인 마우스 Col1a1 프로모터를 결합한 것입니다16. Col1a1 프로모터 활성을 형광 리포터와 연결하면 살아있는 세포 내에서 섬유화 전사 반응을 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 리포터 형광은 여러 시점의 TGF-β 자극 이후에 증가하며, 이는 섬유아세포 활성화의 종단적 진행을 반영합니다. ALK5 억제제인 SB431542에 의한 리포터 활성 억제는 경로 의존적 조절을 나타냅니다. RT-qPCR 및 ELISA로 측정한 리포터 형광과 내인성 섬유화 관련 유전자 및 단백질 발현 사이의 일치성은 이러한 조건에서 섬유화 반응을 모니터링하기 위한 이 방법의 사용을 뒷받침합니다.

최근 연구들은 약물 스크리닝 및 타겟 발굴을 위해 CRISPR-Cas9 기반의 유전자 섭동과 결합된 iPSC 유래 심장 세포를 활용해 왔습니다11,13. 예를 들어, CRISPR로 엔지니어링된 형광 리포터 iPSC 유래 심장 섬유아세포가 대규모 화합물 스크리닝 접근법에 적용되었습니다11,17. 이러한 방법들은 높은 유전적 정밀도를 제공하지만, 긴 분화 기간, 기술적 복잡성, 배치 간 변동성 및 실험 비용 증가라는 단점이 있습니다13,18. 이에 비해, 본 문서에서 설명하는 아데노바이러스 리포터 플랫폼은 게놈 편집이나 장기간의 세포 분화 없이 더 신속한 구현이 가능합니다. 이러한 접근법들은 상호 보완적인 방식으로 사용될 수 있으며, mCol1a1p-mCherry 리포터 시스템을 초기 스크리닝 도구로 사용하고 iPSC 기반 모델을 후속 검증에 적용할 수 있습니다11.

여기에서 설명하는 mCol1a1p-mCherry 리포터 시스템은 섬유아세포 기반 모델에서 대사 조절제 및 천연물을 포함한 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 재현성을 확보하기 위해 몇 가지 중요한 단계와 문제 해결 고려 사항에 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 아데노바이러스 준비물의 순도가 필수적입니다. 정제되지 않은 바이러스 용해물을 사용하면 숙주 세포 잔해와 세포 독성 성분이 유입되어 NIH/3T3 섬유아세포에 비특이적 효과를 일으키고 리포터 판독 결과에 혼선을 줄 수 있습니다. 또한, 후속 스크리닝 적용 시 엄격한 재현성과 배치 간 일관성을 보장하기 위해, 모든 바이러스 준비물은 표준화된 정제 과정을 거쳤으며 엔드포인트 희석 분석(endpoint dilution assay)을 통해 엄격하게 정량화되었습니다. 부피 기준의 양이 아닌 기능적 바이러스 역가(PFU/mL)에 기반하여 정밀하게 정의된 감염 다중도(MOI)를 적용함으로써, 배치 간 편차를 성공적으로 상쇄하고 모든 독립적인 실험 실행에서 리포터 반응을 표준화했습니다. 둘째, 이 MOI를 최적화하는 동안 바이러스 접종액의 부피가 전체 배양 부피의 10%를 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 과도한 바이러스 버퍼는 배양 배지의 pH와 삼투압을 변화시켜 TGF-β 자극과 무관하게 세포 스트레스 반응을 유도할 가능성이 있습니다.

또한, 고함량 이미징(high-content imaging)을 위해 384-웰 플레이트를 다루는 것은 기술적인 어려움을 수반합니다. NIH/3T3 섬유아세포는 배지 교체 및 세척 단계에서 쉽게 탈락될 수 있습니다. 낮은 분주 속도의 자동 액체 처리 장치를 사용하거나 피펫 팁을 웰의 측벽에 기울여 사용하는 것과 같은 부드러운 액체 핸들링을 통해 세포 손실을 줄일 수 있습니다. Col1a1 프로모터의 기저 활성화를 최소화하고 신호 대 잡음비를 높이기 위해, TGF-β 자극 전 12–24 h 동안 혈청 기아(serum starvation) 상태를 유지할 수 있습니다. 여러 시점(예: 24, 48, 72 h)에 걸쳐 순차적인 살아있는 세포 이미징을 수행하는 동안, 반복적인 Hoechst 염색으로 인한 누적 광독성 및 DNA 결합 효과를 최소화하기 위해 노출 조건을 최적화하거나 각 시점별로 병렬 실험 플레이트를 사용해야 합니다19.

이 방법의 몇 가지 한계점을 고려해야 합니다. 첫째, 본 시스템은 불멸화된 섬유아세포 세포주를 기반으로 하므로 in vivo 상태의 심장 섬유아세포가 가진 세포 이질성을 완전히 대변하지 못합니다. 둘째, 리포터는 Col1a1의 전사 활성화를 반영하며, 전사 후 조절이나 세포외 기질의 성숙 과정은 포착하지 못합니다. 향후 생리학적 관련성을 높이기 위해 일차 심장 섬유아세포의 사용, 공배양 시스템 또는 3차원 모델의 도입을 고려할 수 있습니다. 요약하자면, 본 프로토콜은 섬유아세포 활성화를 모니터링하기 위한 Col1a1 프로모터 기반의 아데노바이러스 리포터 시스템을 설명합니다. 이 방법은 바이러스 전달, 약리학적 조절 및 보완적인 분자 분석법을 통합하여 살아있는 세포에서 종단적이고 비파괴적인 분석을 가능하게 합니다. 이러한 접근 방식은 화합물 스크리닝 및 제어된 in vitro 조건 하에서의 섬유화 신호 전달 과정 연구에 적용될 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 공개할 이해상충 관계가 없습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가자연과학재단(H.X.에게 32371158), 국가 핵심 R&D 프로그램(H.X.에게 2023YFA1800902), "Tianchi Talent" 프로그램, 혈관 항상성 및 재형성 국가 핵심 실험실(베이징 대학교) 오픈 프로젝트(R.Z.에게 202404, Y.M.W.에게 202403), 교육부 신장 풍토병 및 민족 질병 핵심 실험실(베이징 대학교) 오픈 프로젝트(H.X.에게 KF202404)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
384-웰 유리 바닥 마이크로플레이트Cellvis, USAP384-1.5H-N세포 파종, 바이러스 감염, 염색 및 형광 이미징에 사용되는 384-웰 유리 바닥 플레이트.
아데노바이러스 백본 플라스미드Microbix, CanadapBHGloxΔE1,3Cre전장 재조합 아데노바이러스 게놈을 생성하는 데 사용되는 플라스미드.
아데노바이러스 셔틀 벡터: pDC315-mCol1a1p-mCherryGeneChem, ChinaCustom servicemCherry 발현을 유도하는 2354 bp 마우스 Col1a1 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스 셔틀 벡터.
Benzonase 뉴클레아제Merck Millipore, USA70664-3아데노바이러스 정제 과정 중 오염된 핵산을 제거하는 데 사용되는 엔도뉴클레아제.
생물안전작업대 (Class II)Esco Lifesciences Group, SingaporeAC2-4S1재조합 아데노바이러스 취급 및 무균 세포 배양 절차에 사용되는 인증된 생물안전작업대.
세포 배양 배지 (Complete DMEM/F12)HyClone, USA12800-017NIH/3T3 및 HEK293 세포 유지에 사용되는 완전 배양 배지.
CellPathfinder 이미지 분석 소프트웨어Yokogawa Electric Corporation, JapanVersion 3.08.01자동 형광 정량화 및 세포 분할(segmentation)에 사용되는 이미지 분석 소프트웨어.
CellVoyager CV8000 고함량 스크리닝 시스템Yokogawa Electric Corporation, JapanCV8000mCherry 및 Hoechst 형광 획득에 사용되는 고함량 이미징 시스템.
CO2 세포 배양 인큐베이터Thermo Fisher Scientific, USA3111포유류 세포 배양을 위해 5% CO2 농도와 37 °C로 유지되는 가습 인큐베이터.
디메틸 설폭사이드 (DMSO)Sigma-Aldrich, USAD2650SB431542 조제에 사용되는 용매.
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소태아혈청 (FBS)Ausbian, AustraliaVS500T완전 배양 배지 조제를 위해 10% (v/v)로 첨가되는 혈청 보충제.
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HEK293 세포ATCC, USACRL-1573아데노바이러스 생산 및 증폭에 사용되는 패키징 세포주.
Human Recombinant TGF-β1MedChemExpress, ChinaHY-P78214NIH/3T3 섬유아세포의 섬유화 활성화를 유도하는 데 사용되는 사이토카인.
이미지 획득 소프트웨어Yokogawa Electric Corporation, JapanVersion 3.08.01.03자동 형광 이미지 획득 및 현미경 제어에 사용되는 소프트웨어.
지질 기반 형질전환 시약Invitrogen, USA11668-019HEK293 세포 내로 아데노바이러스 플라스미드를 전달하는 데 사용되는 형질전환 시약.
마이크로원심분리 튜브Axygen, USAMCT-150-CRNA 용해물 저장 및 샘플 처리에 사용되는 튜브.
마이크로플레이트 리더Tecan, SwitzerlandSparkELISA 흡광도 측정에 사용되는 다중 모드 마이크로플레이트 리더.
마우스 Type I 콜라겐 ELISA 키트Meike Biotechnology, ChinaMK6778A배양 상층액 내 분비된 type I 콜라겐을 정량하는 데 사용되는 ELISA 키트.
NIH/3T3 마우스 섬유아세포Procell Life Science, ChinaCL-0171리포터 모델 구축 및 검증에 사용되는 마우스 섬유아세포 세포주.
PacI 제한 효소New England Biolabs, USAR0547S아데노바이러스 플라스미드 선형화에 사용되는 제한 효소.
Penicillin–Streptomycin 용액Gibco, USA15140-122세균 오염 방지를 위해 1% (v/v)로 첨가되는 항생제 용액.
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen Biotech, ChinaAQ602정량적 PCR 분석에 사용되는 SYBR Green 기반 qPCR 마스터 믹스.
인산염 완충 식염수 (PBS)Servicebio, ChinaG4202세포 세척 및 시약 조제에 사용되는 완충액.
pDC315-EGFP 셔틀 벡터GeneChem, ChinaN/A리포터 플라스미드 구축에 사용되는 모체 아데노바이러스 셔틀 벡터.
qPCR 시스템Applied Biosystems, USAQuantStudio 5정량적 유전자 발현 분석에 사용되는 실시간 PCR 시스템.
제한 효소 (BamHI 및 KpnI)Abclonal, ChinaRK21101, RK21104셔틀 벡터 선형화에 사용되는 제한 효소.
역전사 키트TransGen Biotech, ChinaAT311RT-qPCR 전 cDNA 합성에 사용되는 역전사 키트.
RNA 용해 시약Invitrogen, USA15596026배양된 세포로부터 총 RNA를 추출하는 데 사용되는 시약.
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Sanger 시퀀싱 서비스/시약Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., ChinaCustom Service플라스미드 서열 검증에 사용되는 시퀀싱 서비스/시약.
혈청학적 피펫Corning, USA4488세포 배양 절차 중 액체 취급에 사용되는 멸균 피펫.
T30 열 순환기LongGene Scientific Instruments, ChinaT30역전사 및 PCR 증폭에 사용되는 열 순환기.
Trypsin-EDTA 용액Gibco, USA25200-056일상적인 세포 계대 배양에 사용되는 세포 해리 시약.
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