방법 논문

발달 중인 초파리 시엽에서의 잡종화 연쇄 반응 FISH

DOI:

10.3791/71681

⸱

2026년 7월 17일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 초파리 흑개척 유충 시립엽에서 하이브리드화 연쇄 반응 형광 제자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 탐침 설계, 하이브리다이제이션, 증폭, 조직 장착 절차가 상세히 설명되어 발달 중인 시엽의 시각화를 용이하게 합니다.

초록

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신경 발달을 이해하려면 유전자가 언제 어디서 발현되는지 정밀하게 특성화해야 합니다. 현장 잡종화( in situ hybridization)와 같은 기법은 오랫동안 발달 조직에서 유전자 발현을 시각화하는 데 도움을 주었습니다. 현장 잡종 화는 초파리 멜라노가스터 배아에서 널리 사용되지만, 시각 시스템 개발에 대한 적용은 여러 기술적 도전으로 인해 제한되어 왔습니다. 예를 들어, 긴 프로브는 시신경엽 침투가 잘 되지 않는 경우가 많고, 고추냉이 과산화효소와 같은 확산성 촉매 리포터에 의존하는 프로토콜은 전체 장착 제제에서 신호 대 잡음비가 낮은 경우가 많습니다. 하이브리다이제이션 연쇄 반응 형광 제 자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)은 이러한 한계를 많이 극복하고 보다 강력한 신호 검출을 가능하게 합니다. 기존 FISH와 마찬가지로, DNA 프로브 단량체는 조직 내에서 RNA 서열로 하이브리다이즈합니다. 반면 HCR-FISH에서는 형광 공액 증폭기 프로브가 안정적인 헤어핀 구조를 형성하여 추가 단량체의 중합을 유도하여 신호 강도를 증폭시킵니다. 다중화된 프로브 세트를 사용하면 더 짧은 올리고뉴클레오타이드(~45 nt, 기존 FISH의 최대 1,000 nt에 비해 )를 사용할 수 있어 프로브 침투율이 향상되고 전체 장착 샘플에서 더 균일한 염색을 제공합니다. 이 글에서는 초파리 유충 시엽에 최적화된 HCR-FISH 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 기존 HCR-FISH 접근법을 조정하여 고정 조건을 최적화하고 프로브 및 헤어핀 농도를 높여 신호 강도와 조직 침투를 향상시킵니다. 시약 목록과 단계별 절차가 제공됩니다. 발달 신경생물학에서의 잠재적 응용 분야도 제시되는데, 여기에는 신생아 뉴런의 시각화, 내인성 태그 단백질이나 항체 염색과 같은 기존 방법으로는 충분한 정보를 제공하지 못하는 경우 유전자 발현 패턴의 특성 규명이 포함됩니다.

서론

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뇌가 어떻게 구성되는지 이해하려면 존재하는 세포 유형의 다양성과 각 세포유형 1 내에서 발현되는 유전자 레퍼토리를 모두 파악해야 합니다. 단세포 RNA 시퀀싱의 최근 발전으로 연구자들은 이러한 질문들을 고해상도로 해결할 수 있게 되었습니다. 그러나 많은 단세포 접근법은 공간 정보를 보존하지 않아, 전사 세포형 군집을 발달 중인 뇌 내 위치로 매핑하는 추가 실험이 필요합니다.

GAL4-UAS와 같은 이진 유전자 발현 시스템은 위치 정보를 제공할 수 있으나 정량적이지는 않습니다. 또한, 유전자 발현과 리포터 검출 사이의 지연은 초기 발달 단계에서 생리학적으로 중요한 발현 패턴을 가릴 수 있습니다. 면역염색은 조직 특이적발현 패턴을 결정하는 또 다른 널리 사용되는 접근법입니다. 하지만 분비된 단백질은 종종 확산되어 정확히 위치를 파악하기 어렵습니다.

유전자 발현5에 대한 공간 정보를 얻기 위해 유 전자 발현 5와 같은 뉴클레오타이드 표지 기법도 널리 사용되어 왔습니다. ISH에서는 표지된 DNA 올리고뉴클레오타이드가 관심 있는 역상보성 RNA 서열에 결합합니다. 초기 ISH 방법은 방사성 표지된 DNA 프로브6을 사용했으며, 이후 프로토콜에서는 디곡시제닌, 플루오레세인, 로다민 7,8,9와 같은 더 안전한 라벨을 포함했습니다. 과학자들은 ISH를 빠르게 Drosophila melanogaster에 적용하여 폴리텐 염색체 조직을 특성화하고 홀마운트 배아에서 꼽추와 같은 간극 유전자의 발현 패턴을 지도화하는 데 적용했습니다10,11.

광범위한 유용성에도 불구하고, 유충 시엽과 같은 두꺼운 전체 장착 제제에서 ISH의 채택을 방해하는 여러 기술적 한계가 있었습니다. 많은 현장 프로토콜은 고추냉이 과산화효소와 같은 확산성 촉매 보고체에 의존했는데, 이는 종종 낮은 신호 대 잡음비를 초래했습니다12. 또한, 특이성을 높이기 위해 단일 서열을 표적으로 하는 긴 프로브를 사용하는 많은 접근법이 사용되었습니다. 초파리 배아와 폴리텐 염색체에서는 효과적이지만, 긴 프로브는 유충 뇌 깊숙이 침투하지 못하고 종종 10,11,13의 표지가 불균형하게 나타납니다.

단일 분자 형광 ISH(smFISH)와 하이브리다이제이션 체인 반응인 형광 제자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)의 개발은 이러한 한계 중 많은 부분을 해결했습니다14,15. 단일 유전자 영역에 짧은 프로브 세트를 배치함으로써, smFISH는 평균 프로브 길이를 약 1,000 nt에서 약 40 nt16으로 줄입니다. 이로 인해 프로브 침투율이 크게 향상되면서도 강한 신호 강도를 유지할 수 있습니다. HCR-FISH는 위치 정확도를 높이고 신호 출력을 증폭하는 형광 공액 증폭기 프로브를 사용하여 신호 대 잡음비를 더욱 향상시킵니다. 중요하게도, 이 증폭 단계는 전사체 농도에 따라 선형적으로 확장되어 유전자 발현 수준의 정량적 측정이 가능하다17.

HCR-FISH는 표적 서열에 상보적인 개시 프로브로 시작합니다. 이 표지되지 않은 DNA 올리고뉴클레오타이드는 형광 표지된 H1 증폭기 프로브의 입력 도메인에 결합하는 단일 가닥 개시자 서열을 포함하고 있습니다. H1 증폭기는 촉매 비활성 상태를 유지하는 헤어핀 구조를 채택하여 시작자 서열에 결합할 때까지 유지합니다. 결합 시 H1 증폭기는 열을 열고 파트너 프로브인 H2에 결합하는 서열을 노출시킵니다. 이 상호작용은 H2 헤어핀을 열어 또 다른 H1 프로브와 결합할 수 있게 합니다(그림 1)15. H1/H2 결합의 반복 사이클은 형광 신호를 증폭시키고 배경 잡음을 줄이는 안정적인 고분자를 생성합니다. 각 시작자 서열은 해당 H1/H2 쌍에 특이적이기 때문에, 서로 다른 시작자 서열과 형광체를 가진 여러 프로브를 동시에 사용하여 동일한 샘플 내 여러 유전자를 표지할 수 있습니다.

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그림 1: HCR-FISH 워크플로우의 그래픽 표현. 개시 서열을 포함한 DNA 프로브는 표적 RNA 전사체로 하이브리다이즈합니다. 형광 표지된 DNA 증폭기 헤어핀은 개시 서열에 결합하여 순차적 중합을 거쳐 안정적인 이중 가닥 증폭 사슬을 형성합니다. 직접 형광체 결합은 신호 증폭과 신호 대 잡음비를 향상시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

최근 HCR-FISH의 개선으로 그 활용도가 더욱 높아졌습니다. 분할 개시자 프로브 설계는 증폭기 특이성을 향상시키며, HCR 개시자에 결합된 2차 항체는 동시에 면역조직화학과 HCR-FISH18을 가능하게 합니다. 또한, 확장된 형광체 옵션을 통해 최대 10개의 유전자를 동시에 다중화할 수 있게 되었습니다.

HCR-FISH에 대한 초기 개념 증명 실험은 제브라피시(Danio rerio)에서 수행되었지만, 이 방법은 특히 항체가 비싸거나 구하기 어려운 비모델 생물에서 널리 사용되고 있습니다15. 프로브 합성은 또한 수개월간의 개발이 필요할 수 있는 항체 생성보다 더 빠른 대안을 제공합니다. 따라서 HCR-FISH는 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터셋을 통해 확인된 후보 유전자를 신속히 검증하는 방법을 제공합니다21. 확립된 유전 모델 생물에서도 HCR-FISH는 GAL4 리포터나 면역조직화학이 특정 세포 집단을 적절히 표지하지 못할 때 신생 뉴런을 공간적으로 지도화하는 데 유용한 방법을 제공합니다.

이 글에서는 3령 유충인 초파리 시엽에 최적화된 HCR-FISH 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 이전에 다른 생물체에서 발표된 방법을 초 파리 시각 시스템에 적용한 것입니다22. 초파리 면역조직화학에 일반적으로 사용되는 고정 조건은 FISH 응용에 최적화되었습니다. 신호 강도와 조직 침투를 개선하기 위해 프로브 및 헤어핀 농도를 높였다. 시약 소모를 줄이고 소규모 조직 샘플의 취급을 단순화하기 위해 스팟 플레이트 대신 PCR 튜브가 사용되었습니다. 또한, 세척 및 잡종화 시간은 초 파리 뇌의 크기가 HCR-FISH에 일반적으로 사용되는 다른 곤충 시스템에 비해 작다는 점을 고려하여 단축되었습니다.

대표적인 응용은 이 접근법이 발달 중 특정 신경 집단에 대해 위치 정보를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 이 실험들은 갑 작스러운 전사체와 같은 특정 전사체가 HCR-FISH로 항체 염색이나 리포터 라인보다 더 빨리 감지될 수 있음을 보여줍니다. 초 파리 시각 시스템 발달 연구를 위한 HCR-FISH의 잠재적 도전 과제, 문제 해결 전략 및 적용 방법도 논의됩니다.

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프로토콜

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모든 초파리 흑개척 실험은 뉴욕시립대학, 콜롬비아 대학교, 뉴욕 대학교의 연구 생물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 연구 도구들은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 완충 장치 준비

참고: 모든 시약은 필터 팁을 사용해 뉴클레아제가 없는 튜브에 준비하세요.
참고: 시술 내내 장갑을 착용하세요. 작업 시작 전에 RNase 제염 용액으로 작업면을 깨끗이 청소하세요.

  1. 뉴클레아제가 없는 용액을 준비하세요
    1. 20배 PBS, 트리톤 X-100, 글리신을 뉴클레아제 없는 물에 희석하여 최종 농도인 1배 PBS, 1% (v/v) 트리톤 X-100, 1 mM 글리신 농도로 제조합니다.
    2. SSCT 5배를 20x SSC와 Tween-20을 뉴클레아제 무첨가물에 희석하여 0.1% (v/v) Tween-20을 포함한 5배 SSC를 준비합니다.
    3. 20배 PBS를 뉴클레아제가 없는 물에 희석하여 1배 PBS를 준비합니다.

2. 프로브 설계

  1. 상업적으로 프로브를 설계하려면, 관심 종의 아이소폼을 선택하고 공급업체의 웹 인터페이스를 통해 원하는 증폭기에 맞는 프로브를 주문합니다.
    참고: 상업용 HCR 프로브 화학과 시작자 서열은 Molecular Instruments에서 독점적이며 특허를 보유하고 있습니다.
    1. 전사체 특이적 또는 프리-mRNA 검출이 필요하다면 웹 인터페이스에서 표적 영역을 수정할 수 있습니다.
    2. 고발현 전사체를 위해 약 20개의 프로브를 주문합니다. 전체 마운트 초파리 제제에서 저품도 전사체로 최대 40개의 프로브를 사용하세요.
      참고: 프로브 결합 부위가 적은 짧은 전사체를 위해 특수화된 올리고를 주문합니다.
  2. 프로브를 수동으로 설계하려면 표적 전사본의 FASTA 서열을 다운로드하세요. 유전자의 단일 아이소폼을 표적으로 할지 모든 아이소폼을 표적으로 할지 결정하세요.
    참고: RNA 시퀀싱 데이터셋에서 확인된 구성성 엑손 또는 고발현 아이소폼을 우선순위로 지정하여 신호를 개선합니다.
    1. 프리-mRNA 검출용 프로브를 설계할 때는 인트론-엑손 접합부를 아우르는 프로브를 설계해야 합니다. 성숙한 전사체를 탐지하기 위해 접합부를 아우르는 프로브를 설계합니다. 인트로닉 프로브를 사용해 핵 내 초기 전사체를 검출합니다.
      참고: 인트로닉 프로브는 성숙한 세포질 전사체와 공존 위치하지 않을 수 있으며, 세포 식별을 위해 추가 마커가 필요할 수 있습니다.
    2. 프로브 세트 크기를 결정하세요. 더 큰 프로브 세트를 설계할 수 없을 때는 짧은 전사체에 최소 5개의 프로브를 사용하세요. 표준 적용에는 20개의 프로브를, 전체 마운트 샘플에서는 최적의 감도를 위해 약 40개의 프로브를 사용하세요18,23.
    3. 직접 프로브를 설계할 때는 25nt 서열을 2bp 스페이서로 분리하고, 각 올리고의 5' 끝에 분할된 이니시에이터 서열을 추가하세요.
      참고: 1세대 분할 이니시에이터 서열은 공개되어 있지만, 차세대 상업용 이니시에이터 서열은 독점적인18.
    4. 직접 프로브를 설계할 때는 프로브 서열을 검증하세요. 각 세트 내의 프로브가 비슷한 녹는가를 가질지 확인하세요. 프로브 간 100% 동일성을 확인해.
      참고: 강한 G가 풍부한 영역을 피하고24번 프로브들 사이에서 유사한 GC 함량을 유지합니다. BLAST25를 사용하여 반복 서열을 최소화하고 비표적 결합을 평가합니다.
    5. 적절할 경우 공개된 프로브 설계 소프트웨어를 사용하세요26,27.
      참고: 오픈 소스 설계 도구는 상업용 프로브 설계 파이프라인의 최적화된 성능을 재현하지 못할 수 있습니다.

3. 뇌를 해부, 고정, 프리하이브리드화

  1. 프로브 하이브리드화 버퍼를 37 °C까지 예열 설치.
    주의: 프로브 하이브리다이제이션 버퍼에는 포름아마이드가 포함되어 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 훈기 후드 아래에서 다루세요.
  2. 각 프로브를 최종 농도인 1 μM로 희석하여 뉴클레아제가 없는 증류수를 사용한다.
  3. 약 250μL 무핵효소 PBS를 해부 접시에 분할 투여합니다.
  4. 3령 유충을 겸자를 이용해 PBS로 옮깁니다. 한 쌍의 겸자로 복부를 잡고, 다른 한 쌍의 입 갈고리를 잡으세요. 입 갈고리를 몸에서 멀리 당겨 뇌와 복측 신경줄(VNC)을 분리하세요.
  5. VNC를 유지하면서 지방 체와 침샘을 제거하세요. 해부된 뇌를 600 μL 얼음 냉각 무핵효소 PBS가 들어있는 튜브에 옮긴다.
    참고: 시엽은 해부 내내 잠겨 조직이 건조해지는 것을 방지하세요.
  6. 약 6개의 시엽이 채취될 때까지 반복 해부. 조직 분해를 최소화하기 위해 20분 이내에 완전한 해리를 수행하세요.
  7. 16% 파라포름알데히드(PFA) 200 μL을 첨가하여 최종 농도는 4% PFA로 만듭니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞어 실온에서 15분간 배양하세요.
    주의: PFA는 독성이 있고 돌연변이를 유발합니다. 장갑을 끼고 화학 연기 후드 아래에서 만져보세요.
  8. 시료에서 고정제를 제거하고 지정된 화학 폐기물로 보관하세요. 600 μL 냉핵효소 없는 PBS로 세 번 세척 샘플을 채취하며, 해부 접시를 이용해 세척액을 포착합니다.
    참고: 세척액에 조직 손실이 있는지 점검하고, 해부 현미경으로 자리를 잡은 뇌를 회수하세요.
  9. 뇌를 100 μL의 예열된 프로브 하이브리다이제이션 버퍼가 들어 있는 PCR 튜브로 옮깁니다.
    튜브를 살짝 튕겨 부드럽게 섞고 실온에서 10분간 배양하세요.
    참고: 뇌가 계속 잠겨 있고 관 벽에 붙지 않도록 하세요.

4. 프로브 하이브라이다이즈

  1. 프로브 하이브리다이제이션 버퍼에 설정된 각 프로브를 0.4 pmol 추가하여 최종 부피 100 μL로 4 nM 프로브 용액을 준비합니다.
    참고: 초기 얼룩에서 신호 강도가 낮으면 프로브 농도를 최대 16 nM까지 증가시킵니다.
  2. 조직을 교란하지 않고 프리하이브리다이제이션 버퍼를 제거하세요. 각 샘플에 희석된 프로브 용액을 추가하세요.
  3. 샘플을 37°C에서 뉴테이터 위에서 16–24시간 배양합니다.

5. 프로브 신호 증폭

  1. 증폭 버퍼를 실온으로 옮기세요. 샘플당 약 200μL의 증폭 버퍼를 준비하세요.
  2. 평형 워시 버퍼. 워터 욕조를 사용해 37°C까지 따뜻한 프로브 세척 버퍼를 사용하세요.
    주의: 프로브 워시 버퍼에는 포름아마이드가 포함되어 있습니다. 손잡이는 화학 연기 후드 아래에 있습니다.
  3. 프로브 용액을 제거하여 -20 °C에서 재사용을 위해 보관하세요.
    참고: 프로브 용액을 염색 강도가 줄어들 때까지 재사용하세요.
  4. 샘플을 37°C에서 예열된 프로브 워시 버퍼에서 각각 10분씩 네 번씩 세척합니다. 샘플을 두 번, 각각 5분씩 실온에서 세척하세요.
  5. 헤어핀 없이 증폭 버퍼 100 μL를 추가하세요. 상온에서 30분간 배양하세요.
  6. 열순환기를 95°C로 가열하세요. 각 3 μM 헤어핀 스톡 2 μL을 별도의 PCR 튜브에 추가합니다. 각 머리핀 종마다 튜브 하나씩 준비하세요.
    참고: 염색 시 드문드문 점이 생기거나 신호 대 잡음비가 낮으면 증폭기 농도를 높입니다.
  7. 헤어핀을 95°C에서 90초간 부화시킵니다. 튜브를 빛으로부터 보호하고 최소 30분 이상 실온에서 배양하세요.
  8. 증폭 용액을 준비하세요. 증폭 버퍼에서 헤어핀을 샘플당 최종 100 μL로 결합합니다.
  9. 샘플에서 증폭 버퍼를 제거하세요. 헤어핀 포함 증폭 버퍼를 추가하세요.
    호일로 감싼 빛을 차단한 누테이터 위에서 실온에서 하룻밤 부양하세요.
  10. 증폭 용액을 제거하세요. 샘플을 5x SSCT 150 μL 용액에 5분간 두 번 세척합니다. 5x SSCT 50μL 소포에 150 μL 소포에 세 번 세척하여 10분간 샘플을 세척합니다. 뉴클레아제가 없는 PBS로 두 번 짧게 세척하여 세제를 제거하세요.

6. 영상 촬영을 위한 뇌 마운트

  1. 이미징 스페이서 스티커를 유리 슬라이드에 붙이세요. 겸자 하단으로 부드럽게 눌러 갇힌 기포를 제거하세요.
  2. 겸자를 사용해 뇌를 복측 신경줄로 반으로 나누세요.
  3. 뇌를 스페이서 웰 중앙에 배치하세요. 시엽이 위를 향하도록 조직을 옆으로 정렬하세요.
  4. 공기 방울을 유발하지 않고 충분한 안티페이드 마운팅 매체(약 25 μL)를 추가하여 웰을 채웁니다. 포스프를 사용해 장착 매체를 고르게 분배하세요.
  5. 샘플 위에 커버 슬립을 덮고 매니큐어로 밀봉하세요.

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결과

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발달 신경생물학을 연구하는 과학자들에게 HCR-FISH는 초 파리 시엽 내에서 유전자 발현 패턴을 시각화하고 발달 중인 뉴런의 공간적 위치를 결정하는 견고한 방법을 제공합니다.

초파리 시엽(그림 2A)에서는 연수 신경세포 내 신경세포가 외부 증식 센터(OPC)라는 공간적으로 패턴된 신경상피에서 유래한 신경 줄기세포(뉴로블라스트)에서 유래합니다(그림 2B)28. 이 신경아세포는 시간이 지남에 따라 신경 다양성을 생성하는 순차적인 전사 인자를 발현합니다. 따라서 뉴런은 출생 순서29, 30,

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토론

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이 연구는 초파리 멜라노가스터 유충 시엽에 사용되는 HCR-FISH의 적응을 설명합니다. 기존의 현장 잡 종화 방법은 프로브 침투가 제한적이고 신호 강도가 낮아 전체 장착 유충 뇌 조직에서 성능이 좋지 않은 경우가 많습니다. 여기서 제시된 프로토콜은 발달 중인 시엽의 염색 품질을 개선하기 위한 여러 중요한 단계를 최적화합니다. 초파리 면역조직화학에 흔히 사용되는 고정 조건은 조직 형태를 보존하면서 RNA 무결성을 유지하도록 조정되었습니다. 프로브 및 증폭기 농도가 증가하면 신호 강도와 신호 대 잡음비가 개선되었으며, 특히 abrupt와 같이 약하게 발현된 전사체에서 그렇습니다. 또한, 짧은 탐침 길이는 약 100 μm 두께의 유충 뇌 전체, 즉 DAPI 염색이 침투가 제한적인 영역을 포함해 조직 침투를 개선했습니다(그림 2D).

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공개 사항

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저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

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저자들은 분자 기기 HCR-FISH 프로브와 dpp-GAL4에 대한 접근을 제공해 준 클로드 데스플랑에게 감사를 표합니다; UAS-스팅어 플라이 라인. 저자들은 또한 HCR-FISH 구현에 관한 기술적 피드백과 논의를 제공해 준 Molecular Instruments의 Aneesh Acharya와 Harry Choi에게 감사를 표합니다. 이 프로토콜은 Meg Younger22, Hunter Whitbeck, Bogdan Sieriebriennikov, Amanda Araujo Gomes Ferreira, Yen-Chung Chen, Yanqiqi Zeng가 개발한 이전에 발표 및 미발표된 HCR-FISH 방법론을 기반으로 변형되었습니다. 보그단 시리에브리엔니코프는 인간 프론티어 과학 프로그램(LT000010/2020-L)의 지원을 받았습니다. 제니퍼 말린은 국립보건원(NIH) R00 보조금 EY032269의 지원을 받았습니다.

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재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% Tween-20Bio-Rad Laboratories1662404NA
20x PBS, pH7.4Growcells.comMRGF-63962.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4 
20x SSCQuality Biological351-003-1313M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubatorFisher Scientific (Isotemp)15-015-2633NA
37 °C water bathFisher ScientificFSGPD15DNA
Aluminum foilReynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291NA
Antibody: Mouse-anti-AbruptDSHBAbrupt; RRID: AB_528344 Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFPMillipore SigmaCatalog# 06-896; RRID: AB-619712Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFPLife Technologies#11122; RRID: AB_221569Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-DllGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherinDSHBDN-Ex #8, RRID: AB_528121Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxNGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jamGift from D. Godt-Dilution: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405Jackson ImmunoResearchCode # 712-475-150; RRID: AB_2340680Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488Jackson ImmunoResearchCode #703-545-155; RRID: AB_2340375Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488Jackson ImmunoResearchCode #715-545-151; RRID: AB_2341099Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488Jackson ImmunoResearchCode #711-545-152; RRID: AB_2313584Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555Thermo ScientificCatalog #A-31572; RRID: AB_162543Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunoResearchCode #712-165-153; RRID: AB_2340667Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647Jackson ImmunoResearchCode #706-605-148; RRID: AB_2340476Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647Jackson ImmunoResearchCode #712-605-153; RRID: AB_2340694Dilution: 1:200
Antifade mountantThermo Fisher ScientificS36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal MicroscopeZeissLSM-880NA
Cover slips (22 x 30)VWR16004-332NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAGBDSC38626; RRID: BDSC_38626NA
Fly: D. melanogaster: Canton SBDSC64349; RRID: BDSC_64349NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4BDSC1553; RRID: BDSC_1553NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTBBDSC83660; RRID: BDSC_83660NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;BDSC32198; RRID: BDSC_32198NA
Fly: D. melanogaster: UAS-StingerBDSC84277; RRID: BDSC_84277NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4BDSC600136; RRID: BDSC_600136NA
ForcepsDumont#5 or #55sNA
Glass slidesVWR16005-106NA
GlycineMillipore SigmaG7126-10MGNA
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