이 프로토콜은 초파리 흑개척 유충 시립엽에서 하이브리드화 연쇄 반응 형광 제자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 탐침 설계, 하이브리다이제이션, 증폭, 조직 장착 절차가 상세히 설명되어 발달 중인 시엽의 시각화를 용이하게 합니다.
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방법 논문
발달 중인 초파리 시엽에서의 잡종화 연쇄 반응 FISH
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경 발달을 이해하려면 유전자가 언제 어디서 발현되는지 정밀하게 특성화해야 합니다. 현장 잡종화( in situ hybridization)와 같은 기법은 오랫동안 발달 조직에서 유전자 발현을 시각화하는 데 도움을 주었습니다. 현장 잡종 화는 초파리 멜라노가스터 배아에서 널리 사용되지만, 시각 시스템 개발에 대한 적용은 여러 기술적 도전으로 인해 제한되어 왔습니다. 예를 들어, 긴 프로브는 시신경엽 침투가 잘 되지 않는 경우가 많고, 고추냉이 과산화효소와 같은 확산성 촉매 리포터에 의존하는 프로토콜은 전체 장착 제제에서 신호 대 잡음비가 낮은 경우가 많습니다. 하이브리다이제이션 연쇄 반응 형광 제 자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)은 이러한 한계를 많이 극복하고 보다 강력한 신호 검출을 가능하게 합니다. 기존 FISH와 마찬가지로, DNA 프로브 단량체는 조직 내에서 RNA 서열로 하이브리다이즈합니다. 반면 HCR-FISH에서는 형광 공액 증폭기 프로브가 안정적인 헤어핀 구조를 형성하여 추가 단량체의 중합을 유도하여 신호 강도를 증폭시킵니다. 다중화된 프로브 세트를 사용하면 더 짧은 올리고뉴클레오타이드(~45 nt, 기존 FISH의 최대 1,000 nt에 비해 )를 사용할 수 있어 프로브 침투율이 향상되고 전체 장착 샘플에서 더 균일한 염색을 제공합니다. 이 글에서는 초파리 유충 시엽에 최적화된 HCR-FISH 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 기존 HCR-FISH 접근법을 조정하여 고정 조건을 최적화하고 프로브 및 헤어핀 농도를 높여 신호 강도와 조직 침투를 향상시킵니다. 시약 목록과 단계별 절차가 제공됩니다. 발달 신경생물학에서의 잠재적 응용 분야도 제시되는데, 여기에는 신생아 뉴런의 시각화, 내인성 태그 단백질이나 항체 염색과 같은 기존 방법으로는 충분한 정보를 제공하지 못하는 경우 유전자 발현 패턴의 특성 규명이 포함됩니다.
서론
뇌가 어떻게 구성되는지 이해하려면 존재하는 세포 유형의 다양성과 각 세포유형 1 내에서 발현되는 유전자 레퍼토리를 모두 파악해야 합니다. 단세포 RNA 시퀀싱의 최근 발전으로 연구자들은 이러한 질문들을 고해상도로 해결할 수 있게 되었습니다. 그러나 많은 단세포 접근법은 공간 정보를 보존하지 않아, 전사 세포형 군집을 발달 중인 뇌 내 위치로 매핑하는 추가 실험이 필요합니다.
GAL4-UAS와 같은 이진 유전자 발현 시스템은 위치 정보를 제공할 수 있으나 정량적이지는 않습니다. 또한, 유전자 발현과 리포터 검출 사이의 지연은 초기 발달 단계에서 생리학적으로 중요한 발현 패턴을 가릴 수 있습니다. 면역염색은 조직 특이적발현 패턴을 결정하는 또 다른 널리 사용되는 접근법입니다. 하지만 분비된 단백질은 종종 확산되어 정확히 위치를 파악하기 어렵습니다.
유전자 발현5에 대한 공간 정보를 얻기 위해 유 전자 발현 5....
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프로토콜
모든 초파리 흑개척 실험은 뉴욕시립대학, 콜롬비아 대학교, 뉴욕 대학교의 연구 생물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 연구 도구들은 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 완충 장치 준비
참고: 모든 시약은 필터 팁을 사용해 뉴클레아제가 없는 튜브에 준비하세요.
참고: 시술 내내 장갑을 착용하세요. 작업 시작 전에 RNase 제염 용액으로 작업면을 깨끗이 청소하세요.
- 뉴클레아제가 없는 용액을 준비하세요
- 20배 PBS, 트리톤 X-100, 글리신을 뉴클레아제 없는 물에 희석하여 최종 농도인 1배 PBS, 1% (v/v) 트리톤 X-100, 1 mM 글리신 농도로 제조합니다.
- SSCT 5배를 20x SSC와 Tween-20을 뉴클레아제 무첨가물에 희석하여 0.1% (v/v) Tween-20을 포함한 5배 SSC를 준비합니다.
- 20배 PBS를 뉴클레아제가 없는 물에 희석하여 1배 PBS를 준....
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결과
발달 신경생물학을 연구하는 과학자들에게 HCR-FISH는 초 파리 시엽 내에서 유전자 발현 패턴을 시각화하고 발달 중인 뉴런의 공간적 위치를 결정하는 견고한 방법을 제공합니다.
초파리 시엽(그림 2A)에서는 연수 신경세포 내 신경세포가 외부 증식 센터(OPC)라는 공간적으로 패턴된 신경상피에서 유래한 신경 줄기세포(뉴로블라스트)에서 유래합니다(그림 2B)28. 이 신경아세포는 시간이 지남에 따라 신경 다양성을 생성하는 순차적인 전사 인자를 발현합니다. 따라서 뉴런은 출생 순서29, 30,
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토론
이 연구는 초파리 멜라노가스터 유충 시엽에 사용되는 HCR-FISH의 적응을 설명합니다. 기존의 현장 잡 종화 방법은 프로브 침투가 제한적이고 신호 강도가 낮아 전체 장착 유충 뇌 조직에서 성능이 좋지 않은 경우가 많습니다. 여기서 제시된 프로토콜은 발달 중인 시엽의 염색 품질을 개선하기 위한 여러 중요한 단계를 최적화합니다. 초파리 면역조직화학에 흔히 사용되는 고정 조건은 조직 형태를 보존하면서 RNA 무결성을 유지하도록 조정되었습니다. 프로브 및 증폭기 농도가 증가하면 신호 강도와 신호 대 잡음비가 개선되었으며, 특히 abrupt와 같이 약하게 발현된 전사체에서 그렇습니다. 또한, 짧은 탐침 길이는 약 100 μm 두께의 유충 뇌 전체, 즉 DAPI 염색이 침투가 제한적인 영역을 포함해 조직 침투를 개선했습니다(그림 2D).
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공개 사항
저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자들은 분자 기기 HCR-FISH 프로브와 dpp-GAL4에 대한 접근을 제공해 준 클로드 데스플랑에게 감사를 표합니다; UAS-스팅어 플라이 라인. 저자들은 또한 HCR-FISH 구현에 관한 기술적 피드백과 논의를 제공해 준 Molecular Instruments의 Aneesh Acharya와 Harry Choi에게 감사를 표합니다. 이 프로토콜은 Meg Younger22, Hunter Whitbeck, Bogdan Sieriebriennikov, Amanda Araujo Gomes Ferreira, Yen-Chung Chen, Yanqiqi Zeng가 개발한 이전에 발표 및 미발표된 HCR-FISH 방법론을 기반으로 변형되었습니다. 보그단 시리에브리엔니코프는 인간 프론티어 과학 프로그램(LT000010/2020-L)의 지원을 받았습니다. 제니퍼 말린은 국립보건원(NIH) R00 보조금 EY032269의 지원을 받았습니다.
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재료
```html
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10% Tween-20 | Bio-Rad Laboratories | 1662404 | NA |
| 20x PBS, pH7.4 | Growcells.com | MRGF-6396 | 2.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4 |
| 20x SSC | Quality Biological | 351-003-131 | 3M NaCl, 0.3M Sodium Citrate |
| 37 °C incubator | Fisher Scientific (Isotemp) | 15-015-2633 | NA |
| 37 °C water bath | Fisher Scientific | FSGPD15D | NA |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap/Fisher Brand | 15-078-291 | NA |
| Antibody: Mouse-anti-Abrupt | DSHB | Abrupt; RRID: AB_528344 | Dilution: 1:20 |
| Antibody: Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | Catalog# 06-896; RRID: AB-619712 | Dilution: 1:500 |
| Antibody: Rabbit anti-GFP | Life Technologies | #11122; RRID: AB_221569 | Dilution: 1:500 |
| Antibody: Rabbit anti-Dll | Genscript/Desplan lab | - | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Rat anti-NCadherin | DSHB | DN-Ex #8, RRID: AB_528121 | Dilution: 1:50 |
| Antibody: Rabbit anti-SoxN | Genscript/Desplan lab | - | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jam | Gift from D. Godt | - | Dilution: 1:2,000 |
| Antibody: Donkey anti-Rat 405 | Jackson ImmunoResearch | Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680 | Dilution: 1:100 |
| Antibody: Donkey anti-Chicken 488 | Jackson ImmunoResearch | Code #703-545-155; RRID: AB_2340375 | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | Code #715-545-151; RRID: AB_2341099 | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rabbit 488 | Jackson ImmunoResearch | Code #711-545-152; RRID: AB_2313584 | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rabbit A555 | Thermo Scientific | Catalog #A-31572; RRID: AB_162543 | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunoResearch | Code #712-165-153; RRID: AB_2340667 | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647 | Jackson ImmunoResearch | Code #706-605-148; RRID: AB_2340476 | Dilution: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rat 647 | Jackson ImmunoResearch | Code #712-605-153; RRID: AB_2340694 | Dilution: 1:200 |
| Antifade mountant | Thermo Fisher Scientific | S36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant) | Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936) |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM-880 | NA |
| Cover slips (22 x 30) | VWR | 16004-332 | NA |
| Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG | BDSC | 38626; RRID: BDSC_38626 | NA |
| Fly: D. melanogaster: Canton S | BDSC | 64349; RRID: BDSC_64349 | NA |
| Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4 | BDSC | 1553; RRID: BDSC_1553 | NA |
| Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB | BDSC | 83660; RRID: BDSC_83660 | NA |
| Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP; | BDSC | 32198; RRID: BDSC_32198 | NA |
| Fly: D. melanogaster: UAS-Stinger | BDSC | 84277; RRID: BDSC_84277 | NA |
| Fly: D. melanogaster: wit-KO-Gal4 | BDSC | 600136; RRID: BDSC_600136 | NA |
| Forceps | Dumont | #5 or #55s | NA |
| Glass slides | VWR | 16005-106 | NA |
| Glycine | Millipore Sigma | G7126-10MG | NA |
| HCR Amplification buffer | Molecular Instruments | HCR Gold RNA-FISH Kit | NA |
| HCR-Gold Amplifiers | Molecular Instruments | HCR Gold RNA-FISH Kit | NA |
| HCR HiFi Probes | Molecular Instruments |
참고문헌
- Zeng H, Sanes JR. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nat Rev Neurosci. 2017;18(9):530-46.
- Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 2015;161(5):1202-14.
- Brand AH, Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 1993;118(2):401-15.
- Coons AH, Kaplan MH. Localization of antigen in tissue cells: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 1950;91(1):1-13.
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