방법 논문

실시간 공초점 이미징을 이용한 슈반 세포의 원격 제어 가능 기계적 자극을 위한 자기 나노-액추에이션 플랫폼

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DOI:

10.3791/71685

⸱

2026년 9월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, 2Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, 3International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, 4Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 형광 초상자성 나노입자, 보정된 전자석 및 실시간 공초점 이미징을 통합하여 슈반 세포(Schwann cells)를 원격으로 제어하며 자극하고, 이들의 기계감각 반응을 동적으로 모니터링할 수 있는 현미경 호환 자기 나노-작동 플랫폼을 제시합니다.

초록

기계적 힘은 세포 행동을 결정적으로 조절하지만, 기존의 많은 기계적 자극 방법들은 직접적인 물리적 접촉이나 인위적으로 설계된 세포외 환경에 의존하므로, 역동적인 살아있는 세포 연구에서의 유연성이 제한적입니다. 본 연구에서는 in vitro에서 슈반 세포(Schwann cells)를 원격으로 비접촉식이며 조절 가능하게 기계적 자극을 줄 수 있는 자기 나노 액추에이션 플랫폼을 제시합니다. 이 통합 시스템은 동일한 실험 세션 내에서 원격 자기 자극과 동기화된 살아있는 세포 이미징을 가능하게 합니다. 본 원고에서는 형광 초상자성 나노입자(SPIONs) 및 선택적으로 액틴 표적 기능화 SPIONs(f-SPIONs)의 준비, 현미경 호환 전자기 자극 장치의 구축 및 보정, 단일 입자 및 단일 세포 수준에서의 자기력 추정, 그리고 자기 액추에이션과 실시간 공초점 이미징의 통합 과정을 설명합니다. 슈반 세포는 말초 신경의 발달, 유지 및 회복에 필수적인 역할을 하는 기계적 자극에 매우 민감한 글리아 세포입니다. 기계적 자극에 대한 슈반 세포의 반응을 실시간으로 모니터링하는 것은 기계적 힘이 세포골격 조직과 세포 행동에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 플랫폼은 슈반 세포의 기계생물학 연구를 위한 재현 가능한 워크플로우를 제공하며, 다른 기계 반응성 세포 유형 및 다세포 시스템에도 적용될 수 있습니다.

서론

기계적 자극은 접착, 이동, 증식, 분화 및 표현형 가소성을 포함한 광범위한 세포 과정을 조절합니다1,2,3. 기계생물학 연구에 따르면 뉴런과 글리아 세포 모두 발달 과정 전반에 걸쳐 뚜렷한 기계적 민감성과 반응성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다4,5,6,7. 세포가 힘을 어떻게 감지하고 반응하는지 조사하기 위해 원자간력 현미경(AFM), 미세피펫 흡입, 광학 집게, 신장 기반 배양 시스템 및 미세유체 플랫폼을 포함한 다양한 실험적 접근 방식이 개발되었습니다8,9,10,11,12. 이러한 기술들은 기계적 신호전달 연구를 크게 발전시켰습니다. 그러나 많은 기술이 세포와의 직접적인 물리적 접촉을 필요로 하거나 미리 정의된 인공적인 기계적 환경에 의존하므로, 원격으로 동적 제어가 가능하고 이미징과 호환되는 자극을 주는 데에는 적합하지 않은 경우가 많습니다.

자기 나노입자를 매개로 한 힘 전달은 원격 기계적 자극을 위한 대안적 전략을 제공합니다13,14,15,16,17,18. 대부분의 생물학적 조직은 자기 감수성이 낮기 때문에, 외부에서 가해진 자기장은 직접적인 접촉 없이 생물학적 시료에 침투할 수 있으며 세포나 조직 내로 전달된 자기 응답성 입자에 선택적으로 작용할 수 있습니다. 자기장 구배가 존재할 때, 이러한 입자들은 방향성 힘을 받게 되며, 이는 하위 세포, 세포 또는 조직 수준에서 기계적 섭동을 가하는 데 사용될 수 있습니다8,9. 이 접근 방식은 비접촉식이며, 조절이 가능하고, 라이브 이미징과 호환되며, 더 복잡한 생물학적 시스템으로 확장 가능성이 있다는 점에서 매력적입니다.

슈반 세포(Schwann cells)는 기계적 자극에 매우 민감한 글리아 세포(glial cells)로19,20, 말초 신경의 발달, 유지 및 회복에 중요한 역할을 합니다21,22. 물리적 자극에 대한 슈반 세포의 반응을 동적으로 관찰하는 것은 힘이 세포골격의 조직화와 세포 행동을 어떻게 조절하는지 이해하는 데 중요합니다. 하지만 기존의 많은 힘 전달 시스템은 실시간 고해상도 현미경 관찰과 쉽게 호환되지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 액틴 세포골격을 표적으로 하는 형광 자기 초미립자(f-SPIONs), 공초점 현미경 스테이지와 호환되는 맞춤형 전자기 장치, 그리고 힘 추정을 위한 정량적 프레임워크를 결합한 자기 나노-액추에이션 플랫폼을 개발했습니다. 이 통합 설정은 동일한 실험 세션 내에서 원격 자기 자극과 동기화된 살아있는 세포 이미징을 가능하게 합니다.

여기에 설명된 워크플로우에는 형광 자성 초미립자(SPIONs)의 준비, f-SPIONs 생성을 위한 선택적인 phalloidin 기반 액틴 표적 기능화, 나노입자 특성 분석, 전자기 장치 구축 및 자기장 보정, 자기력 추정, 그리고 실시간 공초점 이미징과 결합된 자기 자극이 포함됩니다. 본 플랫폼은 여기서는 슈반 세포(Schwann cells)에 최적화되었으나, 기계적 반응성을 가진 다른 살아있는 시스템의 관련 연구에 실용적인 프레임워크를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

본 프로토콜에 기술된 실험은 기성 쥐 슈반 세포주(RSC96)를 사용하였으며, 인간 참여자나 살아있는 동물을 포함하지 않았습니다. 본 연구는 길림대학교 제1병원 동물복지윤리위원회의 승인을 받은 동물 실험을 포함하는 광범위한 연구 프로젝트의 일환으로 수행되었습니다(승인 번호: 2022-0045).

1. 형광 자성 슈퍼입자의 준비

  1. 올레산(oleic acid) 코팅 Fe₃O₄ 나노입자를 합성합니다.
    ​참고: 올레산 코팅 Fe₃O₄ 나노입자는 이전에 기술된 열분해법20,23에 따라 합성되었습니다.
    1. 반응 플라스크에 2 mmol의 Fe(acac)₃, 6 mmol의 올레산, 6 mmol의 올레일아민(oleylamine), 5 mmol의 1,2-hexadecanediol을 20 mL의 벤질 에테르(benzyl ether)에 첨가합니다.
    2. 균일한 전구체 용액이 얻어질 때까지 질소 분위기에서 15분 동안 혼합물을 교반합니다.
    3. 혼합물을 20 °C/min의 속도로 200 °C까지 가열합니다.
    4. 200 °C에서 30분 동안 반응을 유지합니다.
    5. 온도를 265 °C로 높이고 혼합물을 30분 동안 환류(reflux)시킵니다.
    6. 반응 혼합물을 실온까지 자연 냉각시킵니다.
    7. 자기 분리를 통해 Fe₃O₄ 나노입자를 수집합니다.
    8. 나노입자를 에탄올로 3회 세척합니다.
    9. 정제된 나노입자를 톨루엔에 재분산시킵니다.
  2. Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자를 조립합니다.
    ​참고: Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자는 이전에 기술된 방법20,24,25에 따라 준비되었습니다.
    1. 50 mL 3구 라운드 바텀 플라스크의 톨루엔 4 mL에 28 mg의 올레산 코팅 Fe₃O₄ 나노입자를 분산시킵니다.
    2. 12.5 mL의 물에 12.5 mg의 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate)과 3 mg의 Cyanine 3.5 (Cy 3.5)를 포함하는 수성 상을 준비합니다.
    3. 톨루엔 내 Fe₃O₄ 나노입자 현탁액(4 mL 내 28 mg; 7 mg/mL)과 수성 계면활성제/염료 용액을 결합하여 오일-인-워터(oil-in-water) 마이크로에멀젼을 형성합니다.
    4. 안정적인 에멀젼이 얻어질 때까지 충분히 혼합합니다.
    5. 3구 라운드 바텀 플라스크를 60 °C로 가열하고 300 rpm으로 6시간 동안 지속적으로 교반합니다.
      참고: 감압 또는 회전 증발 과정은 필요하지 않습니다.
    6. 위의 조건에서 톨루엔을 증발시켜 Fe₃O₄ 나노입자의 응집을 유도합니다. 일회용 전이 피펫을 사용하여 용액의 소량을 시험관에 옮겨 그대로 둡니다. 층 분리가 일어나지 않으면 톨루엔이 완전히 제거된 것입니다.
    7. Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자 현탁액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 2,370 × g로 5분 동안 원심 분리하여 슈퍼입자를 수집하고, 펠렛(pellet)이 흐트러지지 않게 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    8. 펠렛을 초순수 탈이온수에 재분산시키고 실온에서 2,370 × g로 5분 동안 다시 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 세척 과정을 3회 반복하여 잔류 유리 Cy3.5 염료와 도데실 황산 나트륨을 제거합니다.
  3. 슈퍼입자를 폴리도파민(PDA)으로 코팅합니다.
    ​참고: 폴리도파민 코팅 슈퍼입자는 이전에 기술된 방법20,26에 따라 준비되었습니다.
    1. Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자 현탁액을 실온에서 2,370 × g로 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거합니다.
    2. 펠렛을 10 mM Tris 버퍼(pH 8.5)에 재분산시킵니다.
    3. 현탁액에 26 mg의 도파민 단량체를 첨가합니다.
    4. 알칼리성 조건에서 실온으로 3시간 동안 혼합물을 교반합니다.
    5. 현탁액을 실온에서 2,370 × g로 5분 동안 원심 분리합니다.
    6. 상층액을 제거하고 펠렛을 초순수에 재분산시켜 Fe₃O₄·Cy3.5@PDA 입자(SPIONs)를 얻습니다.
  4. 선택적으로 입자를 phalloidin-Alexa Fluor 350으로 기능화합니다.
    ​참고: 슈퍼입자의 표면 기능화는 시판되는 phalloidin-Alexa Fluor 350을 사용하여 수행되었습니다20.
    1. 100 unit의 phalloidin-Alexa Fluor 350을 포함하는 5 mL의 수용액을 준비합니다.
    2. 2 mg의 입자가 포함된 Fe₃O₄·Cy3.5@PDA 현탁액 200 µL를 용액에 첨가합니다.
    3. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 부드럽게 교반합니다.
    4. 혼합물을 실온에서 2,370 × g로 5분 동안 원심 분리합니다.
    5. 상층액을 제거하고 펠렛을 탈이온수에 재분산시킵니다.
    6. 최종 Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPIONs) 제형을 사용 전까지 빛이 차단된 상태로 보관합니다.

2. 나노입자의 특성 분석

  1. 형태와 크기를 측정하십시오.
    1. 기기 요구 사항에 따라 투과 전자 현미경(TEM) 또는 고해상도 투과 전자 현미경(HRTEM)용 나노입자 시료를 준비하십시오.
    2. 전체적인 입자 형태, 코어-쉘 구조 및 평균 직경을 결정하기 위한 이미지를 획득하십시오.그림 1).
    3. 동적 광산란(DLS) 분석을 위한 수성 나노입자 현탁액을 준비하십시오.
    4. 수력학적 직경과 다분산 지수(PDI)를 측정하십시오.
    5. 제형의 균일성과 콜로이드 거동을 평가하기 위해 전자 현미경 분석 결과와 DLS(동적 광산란) 결과를 비교하십시오.
  2. 자기적 특성을 측정하십시오.
    1. 초전도 양자 간섭 장치(SQUID) 분석에 적합한 건조 또는 농축 나노입자 시료를 준비하십시오.
    2. 300 K에서 자기 이력 곡선을 기록하십시오.
    3. 포화 자화, 잔류 자화 및 보자력을 측정하십시오.
    4. 입자들이 잔류 자화와 강압력이 거의 없는 초상자성 거동을 보이는지 확인하십시오.
  3. 형광 특성 결정.
    1. 초순수 탈이온수에 f-SPION 현탁액을 조제하여 이를 석영 큐벳으로 옮깁니다.
    2. 형광 분광광도계를 사용하여 광루미네선스 스펙트럼을 기록하십시오.
    3. 세척 및 재현탁 후에도 형광 신호가 계속 검출되는지 확인하십시오.
  4. 표적 제형을 사용할 때 액틴 결합 국소화(actin-associated localization)를 검증하십시오.
    1. RSC96 세포를 준비합니다.
      참고: 본 연구에 사용된 RSC96 세포는 일차 쥐 슈반 세포의 장기 배양을 통해 확립된 자연 발생 변이 쥐 슈반 세포주로, 중국 상하이의 중국과학원 세포은행(CSTR: 19375.09.3101RATGNR6)으로부터 분양받았으며 마이코플라스마 및 진균 오염 검사에서 음성임을 확인하였다. 계대 배양 3~10세대의 세포를 사용하였다.
    2. 10% 소태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(100 U/mL 페니실린 및 100 µg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)).
    3. RSC96 세포를 1 × 10의 밀도로 분주합니다.5 35 mm 세포 배양 현미경용 디쉬당 세포를 분주하고 24시간 동안 다음 조건에서 배양하십시오. 37 °C 세포 부착을 위해 5% CO₂가 포함된 습윤 환경에서.
    4. 기존의 배양액을 흡입하여 제거하고, 인산완충생리식염수(PBS)로 세포를 2회 세척한 후, 다음이 포함된 완전 배양액을 첨가한다. 15 µg/mL f-SPIONs. 세포를 f-SPIONs와 함께 12시간 동안 배양하십시오.
    5. 배양액을 흡입하여 제거하고, 내부로 유입되지 않은 입자들을 완전히 제거하기 위해 1 mM deferoxamine이 포함된 ice-cold PBS로 세포를 2회 세척한다.
    6. 입자의 세포 내 분포를 평가하기 위해 공초점 이미지를 획득하십시오. 이미징 파라미터를 핀홀 1 Airy unit(AU) 및 z-스텝(z-step) [수치]로 설정하십시오. 0.43 µm 세포 내 구조의 고해상도 광학 단면을 얻기 위해.
    7. 입자들이 액틴 관련 세포 영역에서 농축되는지 확인하십시오.

3. 전자기 자극 장치의 제작 및 교정 (그림 2)

  1. 전자기 장치를 조립하십시오.
    1. 공초점 현미경 스테이지 및 살아있는 세포 챔버에 맞는 크기의 소형 전자기 코일 시스템을 제작하십시오. (그림 2A,B).
    2. 코일을 제어 가능한 전원 공급 장치 또는 외부 전류원에 연결하십시오.
    3. COMSOL Multiphysics 4.3b를 사용하여 경사 자기장 환경을 수치적으로 시뮬레이션합니다(그림 2C,D).
    4. 다양한 입력 전류 하에서 전자석이 그에 상응하는 경사 자기장(gradient magnetic field, GMF)을 생성하는지 확인합니다.그림 2G).
  2. 자기 flux 밀도를 측정하고 경사 자기장을 보정하십시오.
    1. 전자석을 배양 접시 옆에 배치하며, 이때 폴 팁(pole tip)이 접시의 중심을 향하게 하고 접시의 외벽으로부터 1 mm 떨어진 곳에 위치시킵니다(그림 2E,F).
    2. 이후의 모든 살아있는 세포 자기력 자극 및 이미징 실험 동안 전자석과 배양 접시 사이의 이러한 상대적 기하학적 배치를 유지하십시오.
    3. 배양 접시 바닥면의 포지셔닝 그리드를 공간 기준점으로 사용하여, 디지털 가우스 미터로 자극 영역 내의 미리 지정된 위치에서 자속 밀도를 측정하십시오.
    4. 자기속 밀도의 공간적 변화로부터 국소 자기장 구배를 계산하십시오.
    5. 실험적으로 측정 및 계산된 자기장 구배 값을 사용하여 수치 시뮬레이션된 자기장 구배를 보정하고 검증하십시오.

4. 플랫폼에서 전달되는 자기력 추정

  1. 힘 추정 모델을 정의합니다.
    1. 불균일 자기장 내 자기 나노입자에 대한 힘 방정식을 사용합니다27,28:
      교육용 자기장 상호작용에 대한 정적 평형 방정식, F=(m·∇)B.
    2. 인가된 자기장과 초상자성 정렬이 이루어졌다는 가정하에, 방정식을 다음과 같이 단순화합니다
      자기력 방정식 \(F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}\); 자기장 연구를 위한 공식.
      여기서:
      F는 나노자기력입니다
      m은 자기 쌍극자 모멘트입니다
      물리학 도표의 자기 선속을 나타내는 벡터 미적분 기호인 Nabla B 방정식.은 자기장 구배입니다
      dB/dr은 해당 자기장 생성 장치에 의해 생성된 자기장 구배 (T/m)입니다.
    3. 모든 계산에서 캘리브레이션된 장치로부터 측정된 자기장 구배를 사용합니다.
  2. 단일 나노입자에 작용하는 힘을 추정합니다.
    1. HRTEM 이미지로부터 평균 입자 크기를 결정합니다.
    2. 구형 기하구조를 가정하여 자기 코어 부피를 계산합니다.
    3. 코어의 자기 분율을 기반으로 Fe₃O₄ 특성 자기 부피를 추정합니다.
    4. 다음 식에 따라 자기 쌍극자 모멘트를 계산합니다 화학 질량 계산 공식 \(m=\rho \cdot V \cdot M_m\), 화학 양론을 위한 방정식.
      여기서:
      Mm은 주어진 자기장 강도 하에서 f-SPIONs의 질량 자화율 (16 A·m2/kg)을 나타냅니다;
      ρ 는 Fe₃O₄의 밀도 (5.24 g/cm3)입니다.
      ​V는 각 f-SPION 내 Fe₃O₄ 자기 코어의 부피 (5.89 × 10⁻17 cm3)입니다.
    5. 쌍극자 모멘트에 측정된 자기장 구배를 곱하여 단일 나노입자에 작용하는 힘을 추정합니다 (교육용 정적 평형 힘 방정식 Ff-SPION; 기호.).
  3. 슈반 세포당 나노입자 섭취량을 추정합니다.
    1. 35 mm 세포 배양 현미경 디시에 RSC96 슈반 세포를 웰당 5 × 105 cells로 분주합니다.
    2. 표준 배양 조건에서 세포를 24시간 동안 배양합니다.
    3. 배지를 15 µg/mL f-SPIONs가 포함된 신선한 배지로 교체합니다.
    4. 세포를 추가로 12시간 동안 배양합니다.
    5. 1 mM deferoxamine이 포함된 얼음 차가운 인산염 완충 식염수로 세포를 두 번 세척합니다.
    6. 세포를 수집하고 수를 측정합니다.
    7. 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법 (ICP-AES)을 사용하여 세포 내 철 함량을 측정합니다.
    8. 세포당 평균 철 질량을 입자당 철 질량으로 나누어 세포당 내부화된 입자 수를 계산합니다 의료 영상 연구에서 SPIONs의 세포 섭취 방정식 (n_cell^f-SPIONs)..
  4. 단일 슈반 세포에 전달되는 힘을 추정합니다.
    1. 다음 식에 따라 세포 수준의 힘을 계산합니다
      정적 평형 방정식, F_cell=n^f-SPIONs_cell·F_f-SPION, 공식; 힘 균형 분석.
      여기서:
      교육용 정적 평형 힘 방정식 Ff-SPION; 기호.는 단일 f-SPION에 가해지는 자기력입니다.
      SPION 농도 방정식, \( n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} \), 과학적 표기법, 도표.는 세포당 내부화된 f-SPIONs의 수입니다.
      Fcell은 단일 세포에 가해지는 자기력입니다.
    2. 산출된 값을 단일 슈반 세포에 전달되는 추정 자기력 (Fcell)로 보고합니다.
    3. 해당 값이 직접적인 세포 내 힘 측정이 아니라 모델 기반의 추정치임을 명확히 명시합니다.

5. 자기 자극과 실시간 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미징의 결합

  1. 슈반 세포에 자기 나노입자를 로딩합니다.
    1. 이미징 호환 ibidi 배양 접시 또는 미세유체 배양 챔버에 슈반 세포를 파종하십시오.
    2. 세포가 부착되어 회복될 수 있도록 합니다.
    3. 다음을 포함하는 신선한 배양액으로 기존 배지를 교체하십시오. 15 µg/mL f-SPIONs.
    4. f-SPION이 로딩될 수 있도록 세포를 12시간 동안 배양하십시오.
    5. 다음 단계로 진행하기 전 세포 형태를 확인하십시오.
  2. 내부화되지 않은 입자를 제거하십시오.
    1. 나노입자가 포함된 배지를 제거하십시오.
    2. 1 mM deferoxamine가 포함된 PBS로 세포를 2회 세척하십시오.
    3. 세척액을 이미징 호환 라이브-셀 배지로 교체하십시오.
    4. 이미징 전 세포 외 입자 배경이 낮은지 확인하십시오.
  3. 전자기 장치를 CLSM 이미징 시스템과 통합하십시오.
    1. 전자석을 사전 보정된 위치에 배치하여 살아있는 세포 배양 챔버와 함께 조립하십시오.
    2. 조립된 살아있는 세포 배양 챔버를 공초점 현미경의 스테이지 위에 놓습니다 (그림 3). 배양 접시가 유효 자극 영역 내에 위치해 있는지 확인하십시오. (그림 3A).
    3. 설정된 파라미터에 따라 전자석에 전원을 공급하고, 배양 접시 영역 내에 기울기 자기장이 효과적으로 노출되는지 확인하십시오.그림 3B).
    4. 대물렌즈가 간섭 없이 초점면에 도달할 수 있는지 확인하십시오.
    5. 장치가 대물렌즈의 배치나 스테이지의 이동을 방해하지 않는지 확인하십시오.
    6. 전자석 작동 중 발생하는 열을 고려하여, 내부 환경이 다음의 상태가 되도록 미리 결정된 최적 배양 조건에 따라 라이브 셀 챔버 구성 요소의 온도 설정을 조정하십시오. 37 °C 및 5% CO₂ (그림 3C).
    7. 전체 시스템이 정상적으로 안정되게 작동하는지 확인하십시오.
  4. 기능적 칼슘(Functional $\text{Ca}^{2+}$)2살아있는 세포 내 ⁺ 이미징.
    1. 다음을 포함하는 Krebs–Ringer 용액(pH 7.4)으로 세포를 배양하십시오. 3 µM Fluo-4 AM 및 0.1% Pluronic F-127이 포함된 37 °C 30분 동안.
    2. 배양 후, PBS로 배양물을 두 번 세척하고 이미징을 위해 CLSM 시스템의 살아있는 세포 이미징 플랫폼으로 옮깁니다.그림 4A).
    3. ibidi 배양 접시 바닥면의 포지셔닝 그리드를 사용하여 미리 정의된 5곳의 위치를 촬영하십시오.
    4. 각 이미징 필드를 25개의 영역으로 동일하게 나누고, 해당 영역 내의 실제 세포 밀도에 따라 영역당 0~3개의 세포를 선택하여 형광 정량을 수행합니다.
    5. 개별 세포의 전체 윤곽을 관심 영역(ROI)으로 설정하고, 해당 ROI 내의 형광 강도 변화(ΔF)를 분석하여 자기적으로 유도된 칼슘 반응을 모니터링하십시오.
    6. 형광 강도의 변화량을 ΔF = (F자극 - F0). 자극 전후의 형광 강도 변화(ΔF/F)를 고려하십시오.010%를 초과하는 경우 칼슘 반응 이벤트로 간주합니다.
      참고: F비자극 자기력 자극 전의 형광 강도를 나타냄, F0 기초 형광 강도를 나타내며, F자극 자기력 자극 후 유도된 형광 강도를 나타냅니다.
    7. 배경 보정을 위해, 세포가 없는 영역에서 측정한 평균 배경 형광 강도를 각 ROI의 형광 강도 값에서 뺍니다.
    8. 각 실험에 배양 접시 하나씩을 포함하여, 세 번의 독립적인 실험을 수행하십시오.
  5. 타임랩스 이미징을 수행하고, 이미징 도중 자기 자극을 가하십시오.
    1. 타임랩스 이미징 파라미터를 다음과 같이 설정하십시오. 프레임당 획득 간격은 2.1초, 총 획득 시간은 650초로 하며, 1 AU를 이용한 표준 고해상도 광학 섹션 이미징을 수행합니다.
    2. 세포 이미징 동안, 자기력 자극이 없는 상태(F=0)에서 세포 내 칼슘 형광 강도를 기록하기 위해 전류 입력 없이 50초 동안 연속적으로 이미지를 획득하십시오.비자극) (그림 2H 및 그림 4B).
    3. 처음 50초 동안 기록된 형광 강도를 정규화하고, 이를 기선 형광 강도(F₀)로 정의하십시오.0).
    4. 이후 전자기기에 3.0 A의 일정 전류를 인가하여, 자성 나노입자가 탑재된 슈반 세포(Schwann cells)를 3.25 T/m의 경사 자기장에 노출시킴으로써 자기력 자극을 가합니다. 자기력 자극 동안 세포 내 칼슘 형광 강도(F자극) (그림 2H 및 그림 4C).
    5. 형광 강도의 변화량을 ΔF/F로 정량적으로 계산하십시오.0 (그림 4D,E).
  6. 통계 분석을 수행하고 Ca를 분석하십시오.2⁺ 형광 데이터.
    1. 각 세포에 대하여, 분석된 시계열 전체의 ΔF/F₀ 중앙값을 계산하고 이 값을 세포 수준의 Ca 값으로 사용하십시오.2⁺ 응답 지표
    2. 각 실험 조건당 세 번의 독립적인 실험을 수행하며, 각 실험에서 조건당 하나의 배양 접시를 사용한다. 기술적 제시를 위해 세 번의 독립적인 실험에서 분석한 세포들을 통합하고, n을 각 그룹에서 분석된 총 세포 수로 보고한다.
    3. Kolmogorov-Smirnov 검정을 사용하여 세포 수준 ΔF/F₀ 데이터의 정규성을 평가하십시오.
    4. Ca(2+) 때문에2형광 반응 데이터가 정규 분포를 따르지 않는 경우, 데이터를 중앙값과 사분위수 범위(IQR)로 나타내십시오.
    5. 이전에 보고된 바와 같이, 비모수 Friedman 검정을 사용하여 그룹 간의 차이를 분석한 후, 쌍별 비교를 위해 Wilcoxon 부호 순위 검정을 실시하였다.
    6. 고려하십시오 P < 통계적 유의성을 나타내기 위해 0.05를 사용합니다.

결과

고해상도 투과 전자 현미경(HRTEM) 분석 결과, 최종 나노입자 제형은 표면 개질 후 응집된 자기 코어와 외부 셸을 가지고 있는 것으로 나타났습니다(그림 1). 최종 f-SPIONs의 평균 전체 직경은 63.36 ± 16.65 nm였으며, Fe₃O₄가 풍부한 자기 코어의 크기는 약 56.60 ± 6.19 nm, polydopamine과 phalloidin-Alexa Fluor 350으로 구성된 외부 셸의 평균 두께는 약 5.79 ± 1.36 nm였습니다. 이러한 결과는 자기 구동 및 형광 기반 시각화에 적합한 슈퍼파티클 구조가 성공적으로 구축되었음을 확인시켜 줍니다.

자기 이력 분석 결과, 입자들은 잔류 자기와 강압력이 거의 없는 뚜렷한 초상자성 거동을 보였습니다. 10,000 Oe (1.0 T)의 인가 자기장 하에서 포화 자화값은 약 35 A·m2/kg에 도달했습니다 (그림 5). 자기장 구배가 없는 상태에서 f-SPIONs는 수성 매질에서 좋은 분산성을 나타냈습니다 (그림 6A). 구배 자기장에 노출되었을 때, f-SPIONs는 민감한 자기 응답성을 보였습니다 (그림 6B). 형광 분석을 통해 합성 및 표면 개질 후에도 입자들이 광학적 검출 가능성을 유지하고 있음을 추가로 확인하였습니다 (그림 7).

전자기 자극 장치가 살아있는 세포 이미징 시스템에 성공적으로 통합되었습니다(그림 3). 자기장 교정을 통해 해당 장치가 세포 배양 영역 전체에 걸쳐 안정적인 기울기 자기장을 생성함을 확인하였으며(그림 2E,F), 현재의 실험 구성 하에서 in vitro 기울기 자기장은 약 3.25 T/m였습니다(그림 2G).

공초점 이미징을 통해 형광 자기 나노입자가 슈반 세포(Schwann cells) 내로 효율적으로 로딩되었음을 확인하였습니다(그림 7). 세척 후, 형광 신호는 배지 내의 유리 입자가 아닌 주로 세포와 결합된 상태로 유지되었습니다. 액틴 표적 제형의 경우, 공초점 이미징을 통해 입자들이 액틴 관련 세포 영역에 더욱 농축되어 있음을 확인하였습니다.

타임랩스 공초점 이미징 결과, 자극 기간 동안 세포에 대한 안정적인 광학적 접근을 유지하면서 동일한 실험 워크플로우 내에서 자기 자극과 살아있는 세포 이미징을 동시에 수행할 수 있음을 확인하였습니다 (그림 2H 및 그림 4A).

정량적 요약은 나노입자 설계, 장치 보정 및 세포 내 로딩 간의 연관성을 추가로 보여주었습니다. 3.25 T/m의 인비트로(in vitro) 기울기 자기장 하에서, 단일 f-SPION에 작용하는 자기력은 약 1.59 × 10-5 pN으로 추정되었습니다. 세포 내 철 정량 분석 결과, 각 RSC96 슈반 세포(Schwann cell)는 약 9.30 ± 2.88 × 103개의 입자를 내부화했으며, 이는 세포당 약 0.15 ± 0.05 pN의 추정 총 자기력에 해당합니다.

기초 형광과 비교하여, f-SPIONs에 의해 매개된 자기 자극 하에서 RSC96 세포는 활발한 Ca2+ 동역학을 보였으며 Ca2+ 형광 신호가 유의하게 증가하였다(그림 4D). Ca2+ 형광 신호의 정량 분석 결과, 자기 자극 군(62.96 [35.07–91.67]) 내 RSC96 세포의 Ca2+ 형광 강도 변화(ΔF/F0)는 정상 대조군(-5.74 [-15.66–1.20]), f-SPIONs 대조군(-16.70 [-22.02–-12.00]), 그리고 경사 자기장 대조군(-12.90 [-21.24–-6.97])보다 유의하게 높게 나타났다(그림 4E).

TEM 이미지의 나노입자 구조; 클러스터링된 나노입자 세부 사항을 보여주는 전자 현미경 분석.
그림 1: HRTEM으로 분석한 f-SPIONs의 형태 및 코어-쉘 구조. (A) f-SPIONs는 구형이며, Fe₃O₄ 나노입자와 Cy3.5로 구성된 내부 자기 코어를 가진 전형적인 코어-쉘 구조를 나타낸다. (B) 외부 쉘은 PDA와 phalloidin-Alexa Fluor 350으로 구성되어 있다. 패널 B의 이미지는 패널 A의 빨간색 상자 영역을 대표적으로 확대한 모습이며, 흰색 선과 화살표는 측정된 쉘 두께를 나타낸다. 패널 B의 스케일 바는 10 nm를 나타낸다. 총 680개의 나노입자를 분석하여 3회의 독립적인 측정을 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

구리선과 철심이 포함된 전자기 장치 도식; 자기장 시뮬레이션; 그래프로 표시된 자기장.
그림 2: 살아있는 세포의 자기 자극을 위해 제작된 맞춤형 전자기기의 구성, 보정 및 작동. (A,B) 전자기 코일은 1.1 mm 에나멜 구리선을 사용하여 철심 주변에 총 410회 감았습니다. 코일의 외경은 60 mm, 내경은 20 mm, 길이는 110 mm이며, 직류 저항은 약 1.2 Ω입니다. 폴 팁의 크기는 13.0 mm × 12.0 mm × 3.0 mm(길이 × 너비 × 높이)이며, 1J50 퍼말로이로 제작되었습니다. (C,D) 전자기기의 최대 입력 전류는 3 A를 초과하지 않았습니다. 입력 전류가 3 A일 때, 폴 팁 근처에서 약 6.7 T/m의 자기장 기울기가 생성되었습니다. (E,F) 입력 전류 3 A에서 폴 팁 근처 배양 접시 내의 기울기 자기장 분포. 세포 이미징 영역 전반에 걸쳐 약 3.25 T/m의 평균 정적 자기장 기울기가 생성되었습니다. (G) 1 A, 2 A, 3 A의 서로 다른 입력 전류에서 전자기기에 의해 생성된 자기장 기울기. (H) 본 연구의 살아있는 세포 타임랩스 이미징, 전류 인가 및 기울기 자기장 노출 프로토콜. 전류 입력 없이 50 s 동안 타임랩스 이미지를 연속적으로 획득하였습니다. 그 후 3.0 A의 연속 일정 전류를 인가하였으며, 10 min 동안 타임랩스 이미징을 계속하였습니다. DC: 직류. GMF: 기울기 자기장. 패널 E, F, G는 Liu 등20의 논문에서 허가를 받아 수정 인용하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

CLSM 이미징, 전자석, 가열기 및 직류 설정이 포함된 살아있는 세포 배양 챔버.
그림 3: 살아있는 세포 배양 챔버로의 전자석 통합. (A) 세포 배양 접시 영역에 경사 자기장을 노출시키기 위해 살아있는 세포 배양 챔버 내의 보정된 위치에 배치된 맞춤형 소형 전자석. (B) CLSM 이미징 시스템, 자기 나노-액추에이션 플랫폼 및 외부 직류 전원 공급 장치의 통합 설정. (C) 세포 배양 챔버 개별 구성 요소의 온도 설정 최적화를 통해 전자석 작동 중 배양 접시 내부의 안정적인 온도를 보장함. (D) 세포 배양 챔버 개별 구성 요소의 온도 설정 파라미터. CLSM: 공초점 레이저 주사 현미경. PV: 측정값. SV: 설정값. Top Heater: 상단 커버 가열기 온도. Stage heater: 현미경 스테이지 및 배양 챔버 바닥의 가열 온도. Bath heater: 워터 배스 온도. Lens heater: 대물렌즈 가열기 온도. Temp sensor: 온도 프로브에 의해 측정된 실제 온도. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

자기 나노 작동 다이어그램; f-SPIONs, 칼슘 이온, DIC 현미경, 형광 결과.
그림 4: 자기력 자극 하에 슈반 세포(Schwann cells)에서 나타나는 칼슘 반응의 대표 이미지. (A) 자기 나노 작동 플랫폼에서 자기 자극 및 살아있는 세포 Ca2+ 이미징을 위한 통합 워크플로우. (B) 자기 자극 전 획득한 기저 Ca2+ 형광 이미지 (Funstim). (C) 자기 자극 후 획득한 Ca2+ 형광 이미지 (Fstim)로, 형광 강도의 변화(ΔF)를 보여줌. (D) 자기 자극 전후로 모니터링한 시간 분해 Ca2+ 신호 추적선. (E) 서로 다른 실험군 간의 Ca2+ 형광 변화(ΔF/F₀)에 대한 정량적 분석 및 비교. DIC: 미분 간섭 대비(Differential Interference Contrast). Funstim: 자기력 자극 전의 형광 강도. F0: 기저 형광 강도. Fstim: 자기력 자극 후 유도된 형광 강도. ΔF: 형광 강도의 변화. “Normal”은 정상 대조군, “f-SPIONs+GMF”는 자기 나노 작동군, “f-SPIONs”는 f-SPIONs 대조군, “GMF”는 경사 자기장 대조군을 나타냄. 세 차례의 독립적인 실험이 수행되었으며, 각 실험에서 조건당 하나의 배양 접시를 사용함. 각 세포에 대해, 분석된 시계열 전체의 ΔF/F₀ 중앙값을 세포 수준의 반응 지표로 사용함. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위(IQR)로 표시되었으며, n은 세 차례의 독립적인 실험에서 분석된 총 세포 수를 나타냄. 통계 분석은 이전에 Liu et al.에서 보고된 바와 같이 Friedman 검정 후 Wilcoxon 부호 순위 검정을 사용하여 수행됨. 패널 E의 정량적 데이터는 Liu et al.20로부터 허가를 받아 수정하여 사용함. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

자기화 대 자기장 그래프, 300K에서의 히스테리시스 루프, 자기적 특성 분석, 차트.
그림 5: f-SPIONs의 초상자성 특성. (A) 전형적인 초상자성 거동을 보여주는 f-SPIONs의 자기 히스테리시스 루프. (B) 제로 자기장 부근의 히스테리시스 루프 확대도. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

자기장 실험: 바이알이 포함된 코일. 분산(PDI: 0.16)에 미치는 GMF 온/오프 효과.
그림 6f-SPIONs의 수성 분산성 및 경사 자기장 반응성. (A경사 자기장이 없는 상태에서 f-SPION은 수성 매질 내에 잘 분산되어 있습니다.B) 경사 자기장이 인가되면, f-SPIONs는 자기장 경사 방향을 따라 빠르게 이동하고 축적됩니다. GMF: 경사 자기장. PDI: 다분산 지수. 화살표는 경사 자기장의 방향을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

Fe3O4 나노입자를 이용한 세포 이미징; DIC, Cy3.5, phalloidin 병합 이미지를 보여주는 형광 현미경 사진.
그림 7슈반 세포 내 f-SPION 내재화를 위한 CLSM 형광 이미지 분석. (Af-SPIONs와 공동 배양 후 슈반 세포(Schwann cells)의 CLSM 이미지(15 µg/mL)으로 12시간 동안 처리한 후 세척함(핀홀 = 1 AU; z-단계 = 0.43 µm), 세포 형태가 보존되어 있으며 세포 외 입자 배경이 최소화된 것을 보여줍니다. (B) Cy3.5 채널(Ex/Em: 561–568/607 nm)에서 적색 형광이 검출되었으며, 이는 슈반 세포(Schwann cells) 내에 Cy3.5로 표지된 f-SPIONs가 존재함을 나타낸다.C) Alexa Fluor 350 채널(Ex/Em: 350–360 nm/440–460 nm)에서 청색 형광이 검출되었으며, 이는 phalloidin-Alexa Fluor 350 기능화 모듈이 성공적으로 결합되었음을 뒷받침합니다.D) 적색 및 청색 형광 신호 사이에 상당한 공간적 중첩을 보여주는 병합 이미지이며, 이는 자성-형광 슈퍼입자의 성공적인 구축과 일치한다. DIC: 미분 간섭 대비. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

토론

산화철 나노입자는 우수한 생체 적합성을 가진 자기성 나노물질로 널리 알려져 있습니다. 초상자성 Fe₃O₄ 나노입자는 널리 사용되는 자기공명영상 조영제로, 임상 영상 진단에 광범위하게 적용되어 왔습니다29,30. 저희 연구 그룹의 최근 연구20에서 f-SPIONs는 매우 낮은 세포 독성과 우수한 생체 안전성을 나타내는 것으로 입증되었습니다. 제어 가능한 전자석과 결합하여 f-SPIONs를 기계적 작동기로 사용해 구축한 나노자기 작동 플랫폼은 슈반 세포의 세포골격 역동성을 효과적으로 활성화하고, 기계적 자극 민감성 Piezo1 이온 채널의 개방을 유도하며, 세포막을 통한 Ca2⁺ 유입을 유발함으로써 결과적으로 세포 내 유전자 발현 "재프로그래밍" 및 표현형 변화를 촉진했습니다20.

이 플랫폼을 성공적으로 구현하기 위해서는 몇 가지 단계가 특히 중요합니다. 첫 번째 핵심 단계는 나노입자 제조입니다. 입자는 합성과 표면 개질 후에도 잘 분산된 상태를 유지해야 하며, 자기 반응성과 광학적 검출 가능성을 갖추어야 합니다. 어느 단계에서든 응집이 발생하면 세포 흡수 일관성이 떨어지고, 유효 자기 특성이 변하며, 살아있는 세포 이미징의 품질이 저하될 수 있습니다.

두 번째 중요한 단계는 세포 내 로딩 및 세척 과정입니다. 나노입자 농도와 배양 시간은 세포 형태를 손상시키거나 과도한 세포 외 축적을 일으키지 않으면서 검출 가능한 수준의 세포 내 로딩을 유도하기에 충분해야 합니다. 특히 세포 내 국소화를 평가하기 위해 형광 이미징을 사용할 때는 내부로 유입되지 않은 입자와 세포막 결합 입자를 철저히 제거하는 것이 필수적입니다. 세척이 불충분하면 국소화 패턴을 오해할 수 있으며, 세포 수준의 힘 추정치 또한 왜곡될 수 있습니다.

세 번째 중요한 단계는 샘플에 대한 자기 자극 장치의 기하학적 정렬입니다. 자기력은 국소 자기장 구배(local field gradient)에 직접적으로 의존하므로, 전자기 코일과 샘플 평면의 상대적 위치는 교정 설정과 일치하게 유지되어야 합니다. 코일과 샘플 사이의 거리나 정렬의 작은 변화만으로도 유효 자극 조건이 달라질 수 있습니다.

해당 플랫폼은 다루고자 하는 생물학적 질문에 따라 수정될 수 있습니다. 일반적인 자기 부하 및 힘 전달로 충분한 경우에는 액틴 표적 기능화가 되지 않은 PDA 코팅 형광 초미립자(SPIONs)를 사용할 수 있습니다. 액틴이 풍부한 영역 근처의 세포 내 국소화가 필요한 경우에는 대신 팔로이딘 기능화 제형(f-SPIONs)을 사용할 수 있습니다. 이러한 모듈성은 이 플랫폼의 실질적인 장점입니다.

현재의 기술에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 세포당 섭취된 자기 입자의 계산된 수는 집단 평균값을 나타내며, 단일 세포 수준에서의 입자 로딩은 필연적으로 불균일성을 보입니다. 둘째, 본 연구에서 보고된 자기력 값은 세포 내 기계적 부하의 직접적인 측정이 아닌 모델 기반의 추정치입니다. 셋째, 이 프로토콜은 주로 인 비트로(in vitro) 이미징 조건에서 배양된 슈반 세포를 위해 설계 및 개발되었습니다. 밀도가 높은 3차원 세포 배양 시스템 및 조직에서는 나노입자의 섭취, 세포 내 분포, 광학적 접근성 및 기계적 결합이 2차원 배양과 다를 수 있으므로 상당한 최적화가 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 선택 사항인 액틴 표적화 전략은 입자가 액틴 관련 영역에 국소화될 가능성을 높여주지만, 살아있는 세포 내의 모든 액틴 풍부 구조에 대해 균일하거나 특이적인 표적화를 보장하지는 않습니다.

이러한 한계에도 불구하고, 본 자기 나노-액추에이션 플랫폼은 기존의 힘 전달 기술과 비교하여 몇 가지 뚜렷한 방법론적 장점을 제공합니다. 예를 들어, 원자 힘 현미경(AFM)은 정밀한 국소적 힘 적용이 가능하지만 대상과의 직접적인 기계적 접촉이 필요하며, 장기 라이브 세포 이미징과의 통합이 항상 용이한 것은 아닙니다8. 신장 기반 시스템과 엔지니어링된 기판은 세포 집단 수준에서 기계적 신호를 제공할 수 있으나, 사전 정의된 재료 인터페이스에 의존하며 원격 세포 내 힘 전달에는 적합하지 않습니다10. 광학 집게는 힘 적용 시 높은 공간 해상도를 제공하지만 레이저로 인한 조직 손상의 위험이 있습니다8. 마이크로피펫 기반 방법은 조작이 비교적 간단하지만 처리량과 힘 해상도가 상대적으로 낮습니다12. 미세유체 시스템은 전단 응력 및 유체 압력과 같은 특정 기계적 미세환경을 생성하는 데 유리하지만, 복잡한 세포 환경을 재현하고 여러 모드의 기계적 자극을 통합하는 데 기술적 어려움이 있습니다11. 이와 대조적으로, 본 플랫폼은 원격 비접촉 자극, 제어 가능한 자기 액추에이션, 형광 기반 입자 추적 및 실시간 공초점 이미징과의 직접적인 호환성을 단일 워크플로우 내에 통합하였습니다.

동일한 일반적 전략을 다른 기계적 반응성 세포 유형 및 더 복잡한 생물학적 모델에 적용할 수 있습니다. 또한 신경 오가노이드, 상피 낭종 또는 Madin-Darby canine kidney (MDCK) 유사 상피와 같은 더 밀도가 높은 다세포 시스템으로 확장 가능할 수 있습니다. 이러한 환경에서는 입자 침투, 입자 분포 및 기계적으로 결합된 3차원 샘플 내의 힘 추정을 위해 추가적인 최적화가 필요할 것입니다. 이러한 과제에도 불구하고, 현재의 워크플로우는 생체 시스템에서 자성 기계적 자극 전략을 광범위하게 개발하기 위한 실질적인 토대를 제공합니다.

공개 사항

저자들은 상충하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가자연과학재단(Grant Numbers 82571677 및 82001304, Y.W. 수혜), 길림성 의료 및 보건 의료 인재 특별 프로그램(Grant Number JLSRCZX2025-134, Y.W. 수혜) 및 길림대학교 Bethune 프로그램 프로젝트(Grant Number 2024B19, Y.W. 수혜)의 지원을 받아 수행되었습니다. 저자들은 나노물질의 설계, 합성 및 특성 분석을 도와준 길림대학교 화학대학(초분자 구조 및 재료 국가중점연구실)과 중국과학원 창춘 응용화학연구소에 감사를 표합니다. 또한, CLSM 이미징을 도와준 길림대학교 제1병원 중개의학연구소에도 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-헥사데칸디올Sigma-Aldrich213748공업용 등급, 90%; 열분해 합성법에 사용됨
35 mm ibidi µ-배양 접시ibidi80156슈반 세포 배양 및 이미징에 사용됨
벤질 에테르Sigma-Aldrich10801498%; Fe 용매3O4 나노입자 합성
공초점 레이저 주사 현미경NikonAXR (Ti2-E)생세포 및 형광 이미징에 사용됨 
맞춤형 전자기기맞춤 제작된입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다.인 비트로(in vitro) 경사 자기장 생성을 위한 소형 단극 전자석 
시아닌 3.5 카복실산Duofluor Inc.D10128Fe용 형광 염료3O4·Cy3.5 슈퍼파티클 어셈블리; 분자량 593.20; -에서 보관20 °C, 차광 상태로 
데페록사민 메실산염Sigma-AldrichD9533내부화되지 않은 철 및 막 결합 철을 제거하는 데 사용되는 철 킬레이트제
디지털 가우스메터자성 체질WT103커스텀 전자석에 의해 생성되는 경사 자기장을 측정하고 보정하는 데 사용됨
도파민 염산염Sigma-AldrichH8502≥98% (TLC); 폴리도파민 코팅에 사용됨
동적 광산란 장치Malvern InstrumentsZetasizer Nano-ZS수력학적 직경 및 PDI 측정에 사용됨 
Fluo-4 AM Invitrogen, Thermo Fisher ScientificF14201생세포 Ca²⁺ 측정에 사용되는 칼슘 지시약2+ 영상 촬영
형광 분광광도계ShimadzuRF-6000광루미네선스 특성 분석에 사용됨 
고해상도 투과전자현미경JEOLJEM-F200나노입자의 형태 및 코어의 HRTEM 이미징에 사용됨–껍질 구조 
유도결합플라즈마 원자방출분광광도계PerkinElmerOptima 3300 DV세포 내 철 정량 분석에 사용됨
아세틸아세토네이트 철(III), Fe(acac)3Sigma-AldrichF30097%; Fe 전구체3O4 나노입자 합성
라이브 셀 스테이지 탑 인큐베이터TOKAI HITTENP&일산화탄소2자기 자극 중 살아있는 세포의 공초점 이미징에 사용됨 
올레산Sigma-AldrichO1008≥99% (GC); Fe용 표면 리간드3O4 나노입자 합성
올레일아민Sigma-AldrichO7805공업용 등급, 70%; 나노입자 합성을 위한 리간드
팔로이딘–Alexa Fluor 350Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA22281선택적 액틴 표적 기능화 시약 
Pluronic F-127 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificP3000MP살아있는 세포의 Ca2+ 측정을 위한 Fluo-4 AM 로딩을 촉진하는 데 사용됨2+ 이미징
프로그래밍 가능 DC 정전압 전원 공급 장치동문eTM-L605SPL (60 V, 5 A)인비트로(in vitro) 경사 자기장 생성을 위한 맞춤형 전자기기에 전원을 공급하는 데 사용됨
RSC96 슈반 세포중국과학원 세포은행제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주십시오.쥐 유래 슈반 세포주 
소듐 도데실 황산염 (SDS)Sigma-Aldrich436143ACS 시약, ≥99.0%; 수중유(oil-in-water) 마이크로에멀젼용 계면활성제
SQUID 자력계Quantum Design Inc.MPMS-XL300 K에서 자기 이력 측정에 사용됨 
톨루엔Sigma-Aldrich244511무수, 99.8%; 초입자 조립용 용매
투과 전자 현미경FEIEP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin세포 및 신경 조직의 초미세구조 관찰에 사용됨 

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