실시간 공초점 이미징을 이용한 슈반 세포의 원격 제어 가능 기계적 자극을 위한 자기 나노-액추에이션 플랫폼

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

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방법 논문

실시간 공초점 이미징을 이용한 슈반 세포의 원격 제어 가능 기계적 자극을 위한 자기 나노-액추에이션 플랫폼

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DOI:

10.3791/71685

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2026년 9월 8일

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin University, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 형광 초상자성 나노입자, 보정된 전자석 및 실시간 공초점 이미징을 통합하여 슈반 세포(Schwann cells)를 원격으로 제어하며 자극하고, 이들의 기계감각 반응을 동적으로 모니터링할 수 있는 현미경 호환 자기 나노-작동 플랫폼을 제시합니다.

초록

기계적 힘은 세포 행동을 결정적으로 조절하지만, 기존의 많은 기계적 자극 방법들은 직접적인 물리적 접촉이나 인위적으로 설계된 세포외 환경에 의존하므로, 역동적인 살아있는 세포 연구에서의 유연성이 제한적입니다. 본 연구에서는 in vitro에서 슈반 세포(Schwann cells)를 원격으로 비접촉식이며 조절 가능하게 기계적 자극을 줄 수 있는 자기 나노 액추에이션 플랫폼을 제시합니다. 이 통합 시스템은 동일한 실험 세션 내에서 원격 자기 자극과 동기화된 살아있는 세포 이미징을 가능하게 합니다. 본 원고에서는 형광 초상자성 나노입자(SPIONs) 및 선택적으로 액틴 표적 기능화 SPIONs(f-SPIONs)의 준비, 현미경 호환 전자기 자극 장치의 구축 및 보정, 단일 입자 및 단일 세포 수준에서의 자기력 추정, 그리고 자기 액추에이션과 실시간 공초점 이미징의 통합 과정을 설명합니다. 슈반 세포는 말초 신경의 발달, 유지 및 회복에 필수적인 역할을 하는 기계적 자극에 매우 민감한 글리아 세포입니다. 기계적 자극에 대한 슈반 세포의 반응을 실시간으로 모니터링하는 것은 기계적 힘이 세포골격 조직과 세포 행동에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 플랫폼은 슈반 세포의 기계생물학 연구를 위한 재현 가능한 워크플로우를 제공하며, 다른 기계 반응성 세포 유형 및 다세포 시스템에도 적용될 수 있습니다.

서론

기계적 자극은 접착, 이동, 증식, 분화 및 표현형 가소성을 포함한 광범위한 세포 과정을 조절합니다¹^,²^,³. 기계생물학 연구에 따르면 뉴런과 글리아 세포 모두 발달 과정 전반에 걸쳐 뚜렷한 기계적 민감성과 반응성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다⁴^,⁵^,⁶^,⁷. 세포가 힘을 어떻게 감지하고 반응하는지 조사하기 위해 원자간력 현미경(AFM), 미세피펫 흡입, 광학 집게, 신장 기반 배양 시스템 및 미세유체 플랫폼을 포함한 다양한 실험적 접근 방식이 개발되었습니다⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². 이러한 기술들은 기계적 신호전달 연구를 크게 발전시켰습니다. 그러나 많은 기술이 세포와의 직접적인 물리적 접촉을 필요로 하거나 미리 정의된 인공적인 기계적 환경에 의존하므로, 원격으로 동적 제어가 가능하고 이미징과 호환되는 자극을 주는 데에는 적합하지 않은 경우가 많습니다.

자기 나노입자를 매개로 한 힘 전달은 원격 기계적 자극을 위한 대안적 전략을 제공합니다¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. 대부분의 생물학적 조직은 자기 감수성이 낮기 때문에, 외부에서 가해진 자기장은 직접적인 접촉 없이 생물학적 시료에 침투할 수 있으며 세포나 조직 내로 전달된 자기 응답성 입자에 선택적으로 작용할 수 있습니다. 자기장 구배가 존재할 때, 이러한 입자들은 방향성 힘을 받게 되며, 이는 하위 세포, 세포 또는 조직 수준에서 기계적 섭동을 가하는 데 사용될 수 있습니다⁸^,⁹. 이 접근 방식은 비접촉식이며, 조절이 가능하고, 라이브 이미징과 호환되며, 더 복잡한 생물학적 시스템으로 확장 가능성이 있다는 점에서 매력적입니다.

슈반 세포(Schwann cells)는 기계적 자극에 매우 민감한 글리아 세포(glial cells)로¹⁹^,²⁰, 말초 신경의 발달, 유지 및 회복에 중요한 역할을 합니다²¹^,²².물리적 자극에 대한 슈반 세포의 반응을 동적으로 관찰하는 것은 힘이 세포골격의 조직화와 세포 행동을 어떻게 조절하는지 이해하는 데 중요합니다. 하지만 기존의 많은 힘 전달 시스템은 실시간 고해상도 현미경 관찰과 쉽게 호환되지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 액틴 세포골격을 표적으로 하는 형광 자기 초미립자(f-SPIONs), 공초점 현미경 스테이지와 호환되는 맞춤형 전자기 장치, 그리고 힘 추정을 위한 정량적 프레임워크를 결합한 자기 나노-액추에이션 플랫폼을 개발했습니다. 이 통합 설정은 동일한 실험 세션 내에서 원격 자기 자극과 동기화된 살아있는 세포 이미징을 가능하게 합니다.

여기에 설명된 워크플로우에는 형광 자성 초미립자(SPIONs)의 준비, f-SPIONs 생성을 위한 선택적인 phalloidin 기반 액틴 표적 기능화, 나노입자 특성 분석, 전자기 장치 구축 및 자기장 보정, 자기력 추정, 그리고 실시간 공초점 이미징과 결합된 자기 자극이 포함됩니다. 본 플랫폼은 여기서는 슈반 세포(Schwann cells)에 최적화되었으나, 기계적 반응성을 가진 다른 살아있는 시스템의 관련 연구에 실용적인 프레임워크를 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

본 프로토콜에 기술된 실험은 확립된 쥐 슈반 세포주(RSC96)를 사용하였으며, 인간 대상자나 살아있는 동물을 포함하지 않았습니다. 본 연구는 길림대학교 제1병원 동물복지 및 윤리위원회(승인 번호 2022-0045)의 승인을 받은 동물 실험을 포함하는 광범위한 연구 프로젝트의 일부로 수행되었습니다.

1. 형광 자성 슈퍼입자의 준비

올레산 코팅 Fe₃O₄ 나노입자를 합성한다.
참고: 올레산 코팅 Fe₃O₄ 나노입자는 이전에 설명된 열분해법으로 합성하였다²⁰^,²³.
1. 반응 플라스크에 2 mmol의 Fe(acac)₃, 6 mmol의 올레산, 6 mmol의 올레일아민, 5 mmol의 1,2-hexadecanediol을 20 mL의 벤질 에테르에 첨가한다.
2. 균일한 전구체 용액이 얻어질 때까지 질소 분위기 하에서 혼합물을 15분 동안 교반한다.
3. 혼합물을 20 °C/min의 속도로 200 °C까지 가열한다.
4. 200 °C에서 30분 동안 반응을 유지한다.
5. 온도를 265 °C까지 높이고 혼합물을 30분 동안 환류시킨다.
6. 반응 혼합물을 실온까지 자연 냉각시킨다.
7. 자기 분리를 통해 Fe₃O₄ 나노입자를 수집한다.
8. 나노입자를 에탄올로 3회 세척한다.
9. 정제된 나노입자를 톨루엔에 재분산시킨다.
Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자를 조립한다.
참고: Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자는 이전에 설명된 방법으로 준비하였다²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. 50 mL 3구 라운드 바텀 플라스크에 28 mg의 올레산 코팅 Fe₃O₄ 나노입자를 4 mL의 톨루엔에 분산시킨다.
2. 12.5 mL의 물에 12.5 mg의 도데실 황산 나트륨과 3 mg의 Cyanine 3.5 (Cy 3.5)를 포함하는 수상을 준비한다.
3. 톨루엔 내 Fe₃O₄ 나노입자 현탁액(4 mL에 28 mg; 7 mg/mL)을 수성 계면활성제/염료 용액과 결합하여 오일-인-워터(oil-in-water) 마이크로에멀젼을 형성한다.
4. 안정적인 에멀젼이 얻어질 때까지 충분히 혼합한다.
5. 3구 라운드 바텀 플라스크를 60 °C로 가열하고 300 rpm으로 6시간 동안 계속 교반한다.
  참고: 감압 또는 회전 증발 과정은 필요하지 않다.
6. 위의 조건에서 톨루엔을 증발시켜 Fe₃O₄ 나노입자의 응집을 유도한다. 일회용 전이 피펫을 사용하여 용액의 소량을 시험관에 옮기고 그대로 둔다. 상분리가 일어나지 않으면 톨루엔이 완전히 제거된 것이다.
7. Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자 현탁액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮긴다. 실온에서 2,370 × g으로 5분 동안 원심 분리하여 슈퍼입자를 수집하고, 펠릿이 흐트러지지 않게 주의하며 상층액을 조심스럽게 버린다.
8. 펠릿을 초순 탈이온수에 재분산시키고 실온에서 2,370 × g으로 5분 동안 다시 원심 분리한다. 상층액을 버리고 세척 과정을 3회 반복하여 잔류 자유 Cy3.5 염료와 도데실 황산 나트륨을 제거한다.
슈퍼입자를 폴리도파민(PDA)으로 코팅한다.
참고: 폴리도파민 코팅 슈퍼입자는 이전에 설명된 방법으로 준비하였다²⁰^,²⁶.
1. Fe₃O₄·Cy3.5 슈퍼입자 현탁액을 실온에서 2,370 × g으로 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 버린다.
2. 펠릿을 10 mM Tris 완충액(pH 8.5)에 재분산시킨다.
3. 현탁액에 26 mg의 도파민 단량체를 첨가한다.
4. 알칼리성 조건 하에서 실온으로 3시간 동안 혼합물을 교반한다.
5. 현탁액을 실온에서 2,370 × g으로 5분 동안 원심 분리한다.
6. 상층액을 제거하고 펠릿을 초순수에 재분산시켜 Fe₃O₄·Cy3.5@PDA 입자(SPIONs)를 얻는다.
선택적으로 입자를 phalloidin-Alexa Fluor 350으로 기능화한다.
참고: 슈퍼입자는 시판되는 phalloidin-Alexa Fluor 350을 사용하여 표면 기능화하였다²⁰.
1. 100 units의 phalloidin-Alexa Fluor 350을 포함하는 5 mL의 수용액을 준비한다.
2. 입자 2 mg이 포함된 200 µL의 Fe₃O₄·Cy3.5@PDA 현탁액을 용액에 첨가한다.
3. 실온에서 24시간 동안 혼합물을 부드럽게 교반한다.
4. 혼합물을 실온에서 2,370 × g으로 5분 동안 원심 분리한다.
5. 상층액을 버리고 펠릿을 탈이온수에 재분산시킨다.
6. 최종 Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPIONs) 제형을 사용 전까지 빛이 차단된 상태로 보관한다.

2. 나노입자의 특성 분석

형태와 크기를 결정하십시오.
1. 기기 요구 사항에 따라 투과 전자 현미경(TEM) 또는 고해상도 투과 전자 현미경(HRTEM)을 위한 나노입자 시료를 준비하십시오.
2. 전체적인 입자 형태, 코어-쉘 구조 및 평균 직경을 결정하기 위한 이미지를 획득합니다(그림 1).
3. 동적 광산란(DLS) 분석을 위한 수성 나노입자 현탁액을 준비하십시오.
4. 수력학적 직경과 다분산 지수(PDI)를 측정합니다.
5. 전자현미경 결과와 DLS 결과를 비교하여 제형의 균일성과 콜로이드 거동을 평가하십시오.
자기적 특성 결정.
1. 초전도 양자 간섭 장치(SQUID) 분석에 적합한 건조 또는 농축 나노입자 시료를 준비하십시오.
2. 300 K에서 자기 이력 곡선을 기록하십시오.
3. 포화 자화, 잔류 자화 및 보자력을 측정하십시오.
4. 입자가 잔류 자기와 항자기력이 거의 없는 초상자성 거동을 보이는지 확인하십시오.
형광 특성을 결정합니다.
1. 초순수 탈이온수에서 f-SPION 현탁액을 제조하여 쿼츠 큐벳에 옮깁니다.
2. 형광 분광광도계를 사용하여 광루미네선스 스펙트럼을 기록하십시오.
3. 세척 및 재현탁 후에도 형광 신호가 계속 검출되는지 확인하십시오.
표적 제형을 사용할 때 액틴 연관 국소화를 검증하십시오.
1. RSC96 세포를 준비합니다.
  참고: 본 연구에 사용된 RSC96 세포는 일차 쥐 슈반 세포(primary rat Schwann cells)의 장기 배양을 통해 확립된 자발적 변이 쥐 슈반 세포주이며, 중국 상하이 중국과학원 세포은행(Chinese Academy of Sciences Cell Bank, CSTR: 19375.09.3101RATGNR6)으로부터 분양받아 마이코플라스마 및 진균 오염 검사에서 음성임을 확인하였다. 계대 배양 3~10세대의 세포를 사용하였다.
2. 10% 태아 송아지 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(100 U/mL 페니실린 및 100 µg/mL 스트렙토마이신).
3. RSC96 세포를 1 × 10의 밀도로 분주하십시오.⁵ 35 mm 세포 배양 현미경용 디시에 세포를 분주하고 24시간 동안 다음 조건에서 배양하십시오. 37 °C 세포 부착을 위해 5% CO₂가 포함된 가습 분위기에서.
4. 기존의 배양액을 흡입하여 제거하고, 인산완충생리식염수(PBS)로 세포를 2회 세척한 후, 다음이 포함된 완전 배양액을 첨가한다. 15 µg/mL f-SPIONs. 세포를 f-SPIONs와 함께 12시간 동안 배양한다.
5. 배양액을 흡입하여 제거하고, 내부로 유입되지 않은 입자들을 완전히 제거하기 위해 1 mM deferoxamine이 포함된 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 2회 세척하십시오.
6. 입자의 세포 내 분포를 평가하기 위해 공초점 이미지를 획득합니다. 이미징 파라미터를 핀홀 1 Airy unit (AU), z-스텝을 다음으로 설정하십시오. 0.43 µm 세포 내 구조의 고해상도 광학 단면을 얻기 위해.
7. 입자들이 액틴 관련 세포 영역에서 농축되어 나타나는지 확인하십시오.

3. 전자기 자극 장치의 제작 및 교정 (그림 2)

전자기 장치를 조립하십시오.
1. 공초점 현미경 스테이지 및 살아있는 세포 챔버에 적합한 크기의 소형 전자기 코일 시스템을 구축하십시오. (그림 2A,B).
2. 코일을 제어 가능한 전원 공급 장치 또는 외부 전류원에 연결하십시오.
3. COMSOL Multiphysics 4.3b를 사용하여 경사 자기장 환경을 수치적으로 시뮬레이션한다 (그림 2C,D).
4. 다양한 입력 전류 조건하에서 전자석이 이에 상응하는 경사 자기장(gradient magnetic field, GMF)을 생성하는지 확인하십시오.그림 2G).
자기 선속 밀도를 측정하고 경사 자기장을 교정하십시오.
1. 전자석을 배양 접시 옆에 배치하되, 극 팁이 접시 중심을 향하게 하고 접시 외벽으로부터 1mm 떨어진 위치에 둡니다 (그림 2E,F).
2. 이후의 모든 살아있는 세포 자기력 자극 및 이미징 실험 동안 전자기와 배양 접시 사이의 이러한 상대적 기하학적 배치를 유지하십시오.
3. 배양 접시 바닥면의 포지셔닝 그리드를 공간적 기준으로 사용하여, 디지털 가우스 미터(Gauss meter)로 자극 영역 내의 미리 정의된 위치에서 자속 밀도를 측정하십시오.
4. 자기속 밀도의 공간적 변화로부터 국소 장 구배를 계산하십시오.
5. 실험적으로 측정 및 계산된 자기장 구배 값을 사용하여 수치 시뮬레이션된 자기장 구배를 보정하고 검증하십시오.

4. 플랫폼에 의해 전달되는 자기력의 추정.

힘 추정 모델을 정의합니다.
1. 불균일 자기장 내 자기 나노입자에 대한 힘 방정식²⁷^,²⁸을 사용합니다:
2. 인가된 자기장과 초상자성 정렬이 이루어진다는 가정하에, 방정식을 다음과 같이 단순화합니다
  $SPION 역학 계산을 위한 자기력 방정식 다이어그램, $ F_{f-SPION} = m \frac{dB}{dr} $ 표시.$
  여기서:
  F는 나노 자기력
  m은 자기 쌍극자 모멘트
  은 자기장 경사(gradient)이며
  dB/dr은 해당 자기장 생성 장치에 의해 생성된 자기장 경사(T/m)입니다.
3. 모든 계산에 보정된 장치에서 측정된 자기장 경사 값을 사용합니다.
단일 나노입자에 작용하는 힘을 추정합니다.
1. HRTEM 이미지로부터 평균 입자 크기를 결정합니다.
2. 구형 기하구조라고 가정하고 자기 코어 부피를 계산합니다.
3. 코어의 자기 분율을 기반으로 Fe₃O₄ 특이적 자기 부피를 추정합니다.
4. 다음 공식에 따라 자기 쌍극자 모멘트를 계산합니다
  여기서:
  M_m은 주어진 자기장 강도에서 f-SPIONs의 질량 자화도(16 A·m²/kg)를 나타냅니다;
  ρ 는 Fe₃O₄의 밀도(5.24 g/cm³)입니다.
  V는 각 f-SPION 내 Fe₃O₄ 자기 코어의 부피(5.89 × 10⁻¹⁷ cm³)입니다.
5. 쌍극자 모멘트에 측정된 자기장 경사 값을 곱하여 단일 나노입자에 작용하는 힘을 추정합니다 ( $정적 마찰 SPIONs; 공식 $F_{f-SPION}$; 자기 나노입자 힘 분석 개념.$ ).
슈반 세포당 나노입자 섭취량을 추정합니다.
1. 35 mm 세포 배양 현미경 디쉬의 웰당 5 × 10⁵개의 RSC96 슈반 세포를 분주합니다.
2. 표준 배양 조건에서 세포를 24시간 동안 배양합니다.
3. 배지를 15 µg/mL f-SPIONs가 포함된 신선한 배지로 교체합니다.
4. 세포를 추가로 12시간 동안 배양합니다.
5. 1 mM deferoxamine이 포함된 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 두 번 세척합니다.
6. 세포를 수집하고 수를 셉니다.
7. 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법(ICP-AES)을 사용하여 세포 내 철 함량을 측정합니다.
8. 세포당 평균 철 질량을 입자당 철 질량으로 나누어 세포당 내부로 유입된 입자 수를 계산합니다 .
단일 슈반 세포에 전달되는 힘을 추정합니다.
1. 다음 식에 따라 세포 수준의 힘을 계산합니다
  
  여기서:
  $정적 마찰 SPIONs; 공식 $F_{f-SPION}$; 자기 나노입자 힘 분석 개념.$ 는 단일 f-SPION에 가해지는 자기력입니다.
  는 세포당 내부로 유입된 f-SPIONs의 수입니다.
  F_cell은 단일 세포에 가해지는 자기력입니다.
2. 결과값을 단일 슈반 세포에 전달되는 추정 자기력(F_cell)으로 보고합니다.
3. 이 값이 직접적인 세포 내 힘 측정이 아니라 모델 기반의 추정치임을 명확히 명시합니다.

5. 자기 자극과 실시간 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미징의 결합

슈반 세포에 자성 나노입자를 로딩합니다.
1. 이미징 호환 ibidi 배양 접시 또는 미세유체 배양 챔버에 슈반 세포를 파종하십시오.
2. 세포가 부착 및 회복되도록 둡니다.
3. 기존 배지를 다음을 포함하는 신선한 배양 배지로 교체합니다. 15 µg/mL f-SPIONs.
4. f-SPION 로딩을 위해 세포를 12시간 동안 배양하십시오.
5. 다음 단계로 진행하기 전 세포 형태학을 관찰하십시오.
내부화되지 않은 입자를 제거하십시오.
1. 나노입자가 포함된 배지를 제거하십시오.
2. 1 mM deferoxamine가 포함된 PBS로 세포를 2회 세척하십시오.
3. 세척액을 이미지 촬영이 가능한 생세포 배지로 교체하십시오.
4. 이미징 전에 세포외 입자의 배경 신호가 낮은지 확인하십시오.
전자석 장치를 CLSM 이미징 시스템과 통합하십시오.
1. 전자석을 사전 보정된 위치에 배치하여 생세포 배양 챔버와 함께 조립하십시오.
2. 조립된 살아있는 세포 배양 챔버를 공초점 현미경의 스테이지 위에 놓습니다.그림 3). 배양 접시가 유효 자극 영역 내에 위치해 있는지 확인하십시오 (그림 3A).
3. 설정된 매개변수에 따라 전자석에 전원을 공급하고, 배양 접시 영역 내에서 경사 자기장이 효과적으로 노출되는지 확인하십시오.그림 3B).
4. 대물렌즈가 간섭 없이 초점면에 도달할 수 있는지 확인하십시오.
5. 장치가 대물렌즈의 위치 선정이나 스테이지 이동을 방해하지 않는지 확인하십시오.
6. 전자석 작동 중 발생하는 열을 고려하여, 내부 환경이 다음과 같이 유지되도록 미리 결정된 최적 배양 조건에 따라 라이브 셀 챔버 구성 요소의 온도 설정을 조정하십시오. 37 °C 및 5% CO₂ (그림 3C).
7. 전체 시스템이 정상적이고 안정적으로 작동하는지 확인하십시오.
기능적 칼슘(Ca)²살아있는 세포 내 ⁺ 이미징.
1. 다음을 포함하는 Krebs-Ringer 용액(pH 7.4)으로 세포를 배양한다. 3 µM Fluo-4 AM 및 0.1% Pluronic F-127을 다음 조건에서 37 °C 30분 동안.
2. 배양 후, 배양물을 PBS로 2회 세척하고, 이미징을 위해 CLSM 시스템의 살아있는 세포 이미징 플랫폼(live-cell imaging platform)으로 옮깁니다(그림 4A).
3. ibidi 배양 접시 바닥의 포지셔닝 그리드를 사용하여 미리 정의된 5곳의 위치를 촬영하십시오.
4. 각 이미징 필드를 25개 영역으로 동일하게 나누고, 해당 영역 내의 실제 세포 밀도에 따라 영역당 0~3개의 세포를 선택하여 형광 정량을 수행하십시오.
5. 개별 세포의 전체 윤곽을 관심 영역(ROI)으로 정의하고, 해당 ROI 내의 형광 강도 변화(ΔF)를 분석하여 자기적으로 유도된 칼슘 반응을 모니터링하십시오.
6. 형광 강도의 변화를 ΔF = (F_자극- F₀). 자극 전후의 형광 강도 변화(ΔF/F)를 고려하십시오.₀10%를 초과하는 경우를 칼슘 반응 이벤트로 간주한다.
  참고: F_비자극 자기력 자극 전의 형광 강도를 나타냄, F₀ 기초 형광 강도를 나타내며, F_자극 자기력 자극 후 유도된 형광 강도를 나타냅니다.
7. 배경 보정을 위해, 세포가 없는 영역에서 측정된 평균 배경 형광 강도를 각 ROI의 형광 강도 값에서 뺍니다.
8. 각 실험에 배양 접시 하나씩을 포함하여, 세 번의 독립적인 실험을 수행하십시오.
타임랩스 이미징을 수행하고, 이미징 중에 자기 자극을 가한다.
1. 타임랩스 이미징 파라미터를 다음과 같이 설정하십시오. 프레임당 획득 간격은 2.1초, 총 획득 시간은 650초, 그리고 1 AU를 이용한 표준 고해상도 광학 단면 이미징을 적용합니다.
2. 세포 이미징 과정 중, 자기력 자극(F)이 없는 상태에서 세포 내 칼슘 형광 강도를 기록하기 위해 전류 입력 없이 50초 동안 연속적으로 이미지를 획득하십시오._비자극) (그림 2H 및 그림 4B).
3. 처음 50초 동안 기록된 형광 강도를 표준화하고 이를 기저 형광 강도(F₀)로 정의하십시오.₀).
4. 그 후, 전자석에 3.0 A의 일정 전류를 인가하여 자기 나노입자가 로딩된 슈반 세포(Schwann cells)를 3.25 T/m의 기울기 자기장에 노출시킴으로써 자기력 자극을 줍니다. 자기력 자극 동안의 세포 내 칼슘 형광 강도(F_자극) (그림 2H 및 그림 4C).
5. 형광 강도의 변화량을 ΔF/F로 정량적으로 계산하십시오.₀ (그림 4D,E).
통계 분석을 수행하고 Ca²⁺를 분석하십시오.²⁺ 형광 데이터.
1. 각 세포에 대해 분석된 시계열 전체의 $\Delta F/F_0$ 중앙값을 계산하고, 이 값을 세포 수준의 Ca...²⁺ 반응 지표.
2. 각 실험 조건당 3회의 독립적인 실험을 수행하며, 각 실험에서는 조건당 하나의 배양 접시를 사용한다. 기술적 제시를 위해 3회의 독립적인 실험에서 분석된 세포들을 통합하고, n을 각 군에서 분석된 총 세포 수로 보고한다.
3. Kolmogorov-Smirnov 검정을 사용하여 세포 수준 $\Delta F/F_0$ 데이터의 정규성을 평가하십시오.
4. Ca(칼슘) 때문에²형광 응답 데이터가 정규 분포를 따르지 않는 경우, 데이터를 중앙값과 사분위수 범위(IQR)로 표시하십시오.
5. 이전에 보고된 바와 같이, 비모수적 Friedman 검정을 사용하여 그룹 간의 차이를 분석한 후, 쌍별 비교를 위해 Wilcoxon 부호 순위 검정을 수행한다.
6. 고찰하십시오 P < 통계적 유의성을 나타내기 위해 0.05로 설정함.

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결과

고해상도 투과 전자 현미경(HRTEM) 분석 결과, 최종 나노입자 제형은 표면 개질 후 군집된 자기 코어와 외각 쉘 구조를 가진 것으로 나타났다(그림 1). 최종 f-SPIONs의 평균 전체 직경은 63.36 ± 16.65 nm였으며, Fe₃O₄가 풍부한 자기 코어는 약 56.60 ± 6.19 nm, 폴리도파민과 phalloidin-Alexa Fluor 350으로 구성된 외각 쉘의 평균 두께는 약 5.79 ± 1.36 nm였다. 이러한 결과는 자기 구동 및 형광 기반 시각화에 적합한 슈퍼입자 구조가 성공적으로 구축되었음을 확인시켜 주었다.

자기 이력 분석 결과, 입자들은 잔류 자기와 항자기력이 거의 없는 뚜렷한 초상자성 거동을 보였습니다. 10,000 Oe (1.0 T)의 인가 자기장 하에서 포화 자화 값은 약 35 A·m²/kg에 도달했습니다 (그림 5...

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토론

산화철 나노입자는 우수한 생체 적합성을 가진 자기성 나노물질로 널리 알려져 있습니다. 초상자성 Fe₃O₄ 나노입자는 널리 사용되는 자기공명영상 조영제로, 임상 영상 진단에 광범위하게 적용되어 왔습니다²⁹^,³⁰. 저희 연구 그룹의 최근 연구²⁰에서 f-SPIONs는 매우 낮은 세포 독성과 우수한 생체 안전성을 나타내는 것으로 입증되었습니다. 제어 가능한 전자석과 결합하여 f-SPIONs를 기계적 작동기로 사용해 구축한 나노자기 작동 플랫폼은 슈반 세포의 세포골격 역동성을 효과적으로 활성화하고, 기계적 자극 민감성 Piezo1 이온 채널의 개방을 유도하며, 세포막을 통한 Ca²⁺ 유입을 유발함으로써 결과적으로 세포 내 유전자 발현 "재프로그래밍" 및 표현형 변화를 촉진했습니다²⁰.

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공개 사항

저자들은 상충하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가자연과학재단(Grant Numbers 82571677 및 82001304, Y.W. 수혜), 길림성 의료 및 보건 의료 인재 특별 프로그램(Grant Number JLSRCZX2025-134, Y.W. 수혜) 및 길림대학교 Bethune 프로그램 프로젝트(Grant Number 2024B19, Y.W. 수혜)의 지원을 받아 수행되었습니다. 저자들은 나노물질의 설계, 합성 및 특성 분석을 도와준 길림대학교 화학대학(초분자 구조 및 재료 국가중점연구실)과 중국과학원 창춘 응용화학연구소에 감사를 표합니다. 또한, CLSM 이미징을 도와준 길림대학교 제1병원 중개의학연구소에도 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,2-헥사데칸디올	Sigma-Aldrich	213748	공업용 등급, 90%; 열분해 합성법에 사용됨
35 mm ibidi µ-배양 접시	ibidi	80156	슈반 세포 배양 및 이미징에 사용됨
벤질 에테르	Sigma-Aldrich	108014	98%; Fe 용매₃O₄ 나노입자 합성
공초점 레이저 주사 현미경	Nikon	AXR (Ti2-E)	생세포 및 형광 이미징에 사용됨
맞춤형 전자기기	맞춤 제작된	입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다.	인 비트로(in vitro) 경사 자기장 생성을 위한 소형 단극 전자석
시아닌 3.5 카복실산	Duofluor Inc.	D10128	Fe용 형광 염료₃O₄·Cy3.5 슈퍼파티클 어셈블리; 분자량 593.20; -에서 보관20 °C, 차광 상태로
데페록사민 메실산염	Sigma-Aldrich	D9533	내부화되지 않은 철 및 막 결합 철을 제거하는 데 사용되는 철 킬레이트제
디지털 가우스메터	자성 체질	WT103	커스텀 전자석에 의해 생성되는 경사 자기장을 측정하고 보정하는 데 사용됨
도파민 염산염	Sigma-Aldrich	H8502	≥98% (TLC); 폴리도파민 코팅에 사용됨
동적 광산란 장치	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	수력학적 직경 및 PDI 측정에 사용됨
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	생세포 Ca²⁺ 측정에 사용되는 칼슘 지시약²⁺ 영상 촬영
형광 분광광도계	Shimadzu	RF-6000	광루미네선스 특성 분석에 사용됨
고해상도 투과전자현미경	JEOL	JEM-F200	나노입자의 형태 및 코어의 HRTEM 이미징에 사용됨–껍질 구조
유도결합플라즈마 원자방출분광광도계	PerkinElmer	Optima 3300 DV	세포 내 철 정량 분석에 사용됨
아세틸아세토네이트 철(III), Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	97%; Fe 전구체₃O₄ 나노입자 합성
라이브 셀 스테이지 탑 인큐베이터	TOKAI HIT	TENP&일산화탄소₂	자기 자극 중 살아있는 세포의 공초점 이미징에 사용됨
올레산	Sigma-Aldrich	O1008	≥99% (GC); Fe용 표면 리간드₃O₄ 나노입자 합성
올레일아민	Sigma-Aldrich	O7805	공업용 등급, 70%; 나노입자 합성을 위한 리간드
팔로이딘–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	선택적 액틴 표적 기능화 시약
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	살아있는 세포의 Ca2+ 측정을 위한 Fluo-4 AM 로딩을 촉진하는 데 사용됨²⁺ 이미징
프로그래밍 가능 DC 정전압 전원 공급 장치	동문	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	인비트로(in vitro) 경사 자기장 생성을 위한 맞춤형 전자기기에 전원을 공급하는 데 사용됨
RSC96 슈반 세포	중국과학원 세포은행	제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주십시오.	쥐 유래 슈반 세포주
소듐 도데실 황산염 (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	ACS 시약, ≥99.0%; 수중유(oil-in-water) 마이크로에멀젼용 계면활성제
SQUID 자력계	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	300 K에서 자기 이력 측정에 사용됨
톨루엔	Sigma-Aldrich	244511	무수, 99.8%; 초입자 조립용 용매
투과 전자 현미경	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	세포 및 신경 조직의 초미세구조 관찰에 사용됨

참고문헌

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