방법 논문

환자 유래 종양 오가노이드의 종양 침윤 림프구 매개 세포사멸 살상 능력을 정량화하기 위한 실시간 이미지 기반 공배양 분석법

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DOI:

10.3791/71688

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2026년 9월 3일

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1Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell Medicine, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine, 4Department of Systems and Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 환자 유래 종양 오가노이드를 대상으로 종양 침윤 림프구(TIL) 매개 세포독성을 정량화하기 위한 이미지 기반의 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 제공하며, 이를 통해 기능적 면역 프로파일링 및 면역 조절 치료법 평가를 위한 세포 사멸의 실시간 키네틱 분석을 가능하게 합니다.

초록

종양 침윤 림프구(TIL)가 자가 종양 세포를 인식하고 제거하는 기능적 능력을 이해하는 것은 개인 맞춤형 면역 요법을 발전시키는 데 핵심적입니다. 본 방법의 목적은 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)에 대해 TIL이 매개하는 caspase-3 의존적 세포 사멸 유도 능력을 실시간으로 측정하는 이미지 기반의 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 방법은 PDTO 및 TIL의 분리 및 증식에 관한 기성 절차를 표준화된 3차원 공배양 시스템 및 자동 형광 기반 세포 사멸 검출 방식과 통합합니다.

종양 오가노이드를 이미징 가능 96-웰 플레이트에 분주하고 적색 종양 마커로 표지하는 한편, 확장된 TIL을 caspase-3 활성 녹색 형광 기질 존재 하에 정해진 효과기-표적 비율로 첨가합니다. 공동 배양물은 라이브 셀 분석 시스템을 사용하여 4시간마다 이미징하여 위상차 및 이중 형광 채널을 캡처합니다. 정량적 이미지 분석을 통해 적색 양성 종양 구조를 식별하고, 시간에 따른 적색/녹색 이중 양성 세포사멸 종양 객체의 비율을 계산합니다. 분석의 엄격성을 보장하기 위해 적절한 기술적 및 생물학적 반복 실험과 더불어 기선, 자발적 세포사멸, 음성 및 양성 살해 대조군을 포함합니다.

이 프로토콜은 PDTO의 3차원 구조 내에서 종양의 이질성을 보존하는 동시에 종단적 정량화를 가능하게 함으로써, 환자 특이적 종양-TIL 상호작용을 기능적으로 프로파일링하고 항종양 면역을 증강시키는 면역 조절제를 연구할 수 있는 생리학적으로 유의미한 시스템을 제공합니다.

서론

암 면역요법은 프로그램 세포 사멸 단백질 1/프로그램 세포 사멸 리간드 1(PD-1/PD-L1) 및 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA-4) 경로를 표적으로 하여 다양한 고형암 종에서 내인성 T-세포 매개 항종양 반응을 재활성화하는 면역 관문 억제제(ICIs)의 개발로 인해 변화되었습니다1,2,3. 일부 환자군에서는 지속적인 반응이 나타나지만, 대부분은 의미 있는 임상적 이점을 얻지 못하며, 반응자를 사전에 식별할 수 있는 검증된 예측 바이오마커는 여전히 미충족 수요로 남아 있습니다. 따라서 T-세포 매개 종양 살상 능력을 직접 측정하는 기능적 분석법은 바이오마커 발견 및 세포독성 면역 반응을 강화하도록 설계된 치료 조합의 전임상 평가를 위한 핵심 도구입니다.

chromium-51 방출, lactate dehydrogenase (LDH) 정량화, 그리고 CellTiter-Glo와 같은 발광 기반 ATP 생존력 분석을 포함한 기존의 세포독성 분석법은 면역 매개 살해 능력을 정량화하는 데 널리 사용되어 왔으나, 공간 및 시간적 해상도가 부족한 단일 시점의 벌크 측정값만을 생성합니다4,5,6. 마찬가지로, 엔드포인트 유세포 분석 기반의 살해 분석법은 고정된 시점에서의 세포 사멸을 정량화하므로 3차원 배양 형식에는 적합하지 않습니다. 또한, 이러한 분석법에 널리 사용되는 2차원 종양 세포주는 일차 환자 종양의 종양 내 고유한 이질성을 완전히 재현하지 못합니다.

환자 유래 종양 오가노이드(PDTOs)는 기존의 세포주 모델보다 원래 종양의 게놈 변이, 세포 이질성 및 약물 반응 표현형을 더욱 충실하게 보존하는 임상적으로 유의미한 ex vivo 플랫폼으로 부상하였습니다7,8,9,10,11,12. 최근 연구들은 PDTOs를 자가 면역 세포와 함께 공배양하여 항종양 면역 반응을 ex vivo로 모델링할 수 있음을 입증하였습니다. 그러나 발표된 대부분의 접근 방식은 종점 생존율 측정이나 노동 집약적인 공초점 현미경 이미지 분석에 의존하고 있으며, 이는 실험적 처리량을 제한하고 살상 반응의 동적 모니터링을 어렵게 합니다13,14,15,16.

본 연구에서는 형광 표지된 PDTO에 대한 T세포 매개 세포독성을 이미지 기반으로 정량적 판독하는 실시간 공동 배양 분석법을 설명합니다. 이 방법은 타임랩스 형광 현미경과 caspase-3 활성 형광 기질을 결합하여, 12~36시간의 관찰 기간 동안 단일 오가노이드 해상도에서 세포사멸의 역학 곡선을 생성합니다. 기존의 세포독성 분석법과 비교하여, 이 플랫폼은 다음과 같은 몇 가지 기술적 장점을 제공합니다. 분석 전 과정 동안 3차원 종양 구조를 유지하고, 세포사멸 유도의 시간적 역학을 분석할 수 있으며, 정의된 작동 세포 대 표적 세포 비율을 적용할 수 있습니다. 또한, 면역 관문 억제제 및 표적 치료제를 단독 또는 병용 투여하여 테스트하는 중간 처리량 약물 스크리닝 형식으로 향후 응용 가능성이 있습니다. 본 프로토콜은 면역 항암학, 기능적 정밀 의료 및 T세포 생물학 분야의 연구자를 위해 고안되었으며, 표준 조직 배양 시설과 살아있는 세포 형광 이미징 시스템을 갖춘 실험실에서 구현할 수 있습니다.

인체 종양 검체로부터 환자 유래 종양 오가노이드(PDTOs) 및 그에 매칭되는 종양 침윤 림프구(TILs)를 분리하고 배양하는 방법은 이미 잘 정립되어 널리 발표된 방법론입니다. 종양의 기계적 및 효소적 해리, 기저막 매트릭스를 이용한 3D 임베딩, 오가노이드의 장기 확장, 그리고 TILs의 병행 분리 및 ex vivo 확장을 설명하는 견고한 프로토콜들이 여러 종양 유형에 걸쳐 광범위하게 검증되었습니다. 이러한 방법들은 종양 세포의 이질성, 구조 및 면역 특이성을 안정적으로 보존하며, 종양-면역 상호작용을 평가하기 위한 공동 배양 시스템에 적용되어 왔습니다. 따라서 본 연구에서 오가노이드와 TIL의 분리 및 확장은 별도의 언급이 없는 한, 기존에 발표되고 검증된 프로토콜에 따라 실질적인 수정 없이 수행되었습니다.

프로토콜

우리는 인간 종양 조직 및 종양 침윤 림프구(TILs)와 관련된 모든 절차를 기관 생명윤리위원회(IRB#1305013903)의 승인 및 기관 생물안전 규정에 따라 수행하였으며, 조직 채취 전 서면 동의서를 확보하였습니다. 승인 기관은 Weill Cornell Medicine 기관 생명윤리위원회(Institutional Review Board (IRB), Weill Cornell Medicine, New York, NY로 기재됨)이며, 프로토콜 번호는 #1305013903입니다. 본 프로토콜의 적용 대상 검체에는 정기적인 병리학적 평가 후 표준 치료 수술이나 연구 절차를 통해 얻은 잔여 종양 조직, Weill Cornell Medical College 또는 기타 기관의 기존 보관 냉동 조직 또는 포르말린 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 조직, 말초혈액 단핵구(PBMCs), 혈청 및 혈장으로 분리하여 보관한 혈액, 일부 사례에서 대조군으로 사용된 구강 면봉, 타액, 소변 또는 양성 조직, 그리고 Rapid Autopsy Program에 등록된 참여자의 경우 사망 후 6시간(최대 24시간) 이내에 수행된 부검 시 수집된 조직이 포함됩니다. 본 연구에 사용된 TILs는 위에서 설명한 종양 조직 검체로부터 증식시켰습니다. 모든 생체 시료에서 개인 식별 정보는 제거되었으며, HIPAA 및 기관 표준에 따라 고유 환자 식별 번호를 통해서만 참여자 신원과 연결되었습니다. 데이터의 재식별은 보고서 생성 시점에만 이루어졌습니다. 모든 실험은 인증된 Class II 생물안전 작업대 내에서 생물안전 2등급(BSL-2) 조건하에 수행되었습니다. 생물학적 위험 물질은 기관 정책에 따라 폐기하였습니다. 본 연구에 사용된 재료와 완충액 및 배지의 준비 과정은 재료 표(Table of Materials) 및 보충 파일 1(Supplemental File 1)을 참조하십시오.

1. 환자 유래 종양 오가노이드(PDTOs)의 형광 표지 및 재구성 (그림 1)

  1. 기존 Matrigel 제거 및 세포 해리 개시
    1. 배양 플레이트를 BSC에 넣는다. Matrigel droplet이 흐트러지지 않도록 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입한다.
    2. 웰당 실온의 세포 해리 효소 1–2 mL를 첨가한다. P1000 피펫과 멸균된 세포 스크레이퍼를 사용하여 Matrigel droplet을 완전히 분쇄할 때까지 반복적으로 피펫팅한다.
    3. 세포 혼합액을 라벨이 부착된 15 mL conical tube로 옮긴다. 잔류 세포를 세척하기 위해 각 웰에 세포 해리 효소 1 mL를 추가로 넣고 동일한 튜브로 옮긴다. 웰당 최소 5 mL의 효소가 수집되도록 부피를 조절한다. 튜브 뚜껑을 닫고 수동으로 흔들어 충분히 혼합한다.
  2. 효소적 해리
    1. 튜브를 37 °C 항온수조에 넣는다. 10분 동안 배양하며, 해리를 촉진하기 위해 2–3분마다 튜브를 수동으로 흔든다. 완전히 분해되었는지 육안으로 확인한다.
    2. 해리가 완료되면 4 °C에서 300 × g로 3분간 원심 분리한다. 원심 분리 후 튜브 상태를 확인한다.
    3. 펠렛이 형성되지 않고 Matrigel cloud가 남아 있는 경우, 세포 해리 효소를 추가로 첨가한다. 흔든 후 항온수조에서 3–5분간 다시 배양한다. 여전히 펠렛이 형성되지 않으면 튜브를 얼음에 3분간 두어 매트릭스가 가라앉도록 한다.
  3. 세포 수 측정 및 생존율 평가
    1. 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 흡입한다. +++ 세척 배지 10 mL를 첨가한다.
    2. 4 °C에서 300 × g로 3분간 원심 분리한다. 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁한다. 부드럽게 파이펫팅하여 단일 세포 현탁액을 얻는다.
    3. 세포 현탁액 15 µL와 0.4% Trypan Blue 15 µL를 혼합한다. 카운팅 슬라이드의 챔버당 10 µL씩 로딩한다. 자동 세포 계수기 또는 혈구 계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정한다.
    4. 세포 측정 동안 세포를 얼음 위에 유지한다. 추후 파종을 위해 37 °C에서 예열된 non-tissue treated 6-well 플레이트를 준비한다.
  4. 종양 세포의 형광 표지
    1. PBS 내의 세포 농도를 1 × 106 viable cells/mL로 조정한다.
    2. CellTrace Far Red 염료를 20 µL의 DMSO로 재구성하여 1 mM 스톡 용액을 준비한다. 볼텍싱 후 짧게 원심 분리한다.
    3. 세포 현탁액(1 × 106 cells/mL) 1 mL당 1 mM 스톡 용액 1 µL를 첨가하여 최종 염색 농도를 1 µM로 맞춘다. 부드럽게 반전 혼합한다. 빛을 차단한 상태로 37 °C에서 30분간 배양한다.
    4. 염료를 세척하기 위해 PBS를 5배 부피만큼 첨가한다. 300 × g로 5분간 원심 분리한다. PBS로 두 번 세척한다.
    5. 표지 효율을 평가한다. 육안으로 색이 확인되는 세포 펠렛을 정성적 합격 기준으로 한다.
    6. Trypan Blue 배제법으로 염색 후 생존율을 결정하고 관찰된 생존율(80%)을 기록한다.
      ​참고: 세포 펠렛의 색상이 균일하고 염색 후 생존율이 ≥80%인 경우에만 임베딩 단계로 진행한다.
  5. 3D 세포 매트릭스 현탁액 제조
    1. 펠렛 크기에 따라 적절한 부피의 세포 특이적 배지로 펠렛을 재현탁한다(예: 900,000개 세포의 경우 배지 500 µL 추가, 180만 개 세포의 경우 배지 1,000 µL 추가).
    2. 최종 Matrigel 농도가 67%가 되도록 냉각된 Matrigel을 1:2 비율(배지:매트릭스)로 첨가한다. 기포가 생기지 않도록 충분히 부드럽게 혼합한다(일반적인 목표: 6-well 플레이트의 웰당 300,000개 세포).
  6. 3D 매트릭스 droplet 파종
    1. 200 µL 피펫을 사용하여 100 µL droplet을 파종한다: 6-well 플레이트의 웰당 5개의 droplet을 만든다. 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 5분간 둔다.
    2. 플레이트를 뒤집어 추가로 40분간 배양하여 완전히 중합시킨다. 현미경으로 내포된 세포의 존재를 확인한다.
    3. 웰당(6-well 플레이트) 4 mL의 배지를 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 옮긴다. 100–300 µm 크기의 오가노이드가 형성될 때까지 72시간 동안 배양한다.

2. 살상 분석을 위한 오가노이드 준비

  1. 3D 오가노이드 구조를 유지하면서 기저막 매트릭스를 용해합니다.
    1. 오가노이드 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 바이오안전 작업대로 옮깁니다. Matrigel 돔이 흐트러지지 않도록 각 웰에서 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.
      참고: 완전 해리 및 종양 세포 수 측정을 위해 웰 하나를 지정하여 그대로 둡니다(섹션 2.2 참조).
    2. 각 웰에 ice-cold Cell Recovery Solution 1 mL를 직접 첨가하여 기저막 매트릭스를 용해합니다. P1000 피펫과 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 매트릭스가 플레이트 표면에서 완전히 분리될 때까지 돔을 기계적으로 파쇄합니다.
    3. 최대 3개 웰의 현탁액을 얼음 위에 보관된 라벨링 된 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브에 ice-cold Cell Recovery Solution 8 mL를 추가로 넣습니다. 매트릭스가 완전히 용해되도록 튜브를 4 °C의 로커(rocker) 위에 수평으로 놓고 30분 동안 둡니다.
      참고: 형광 표지가 수행된 경우 샘플을 빛으로부터 보호하십시오.
    4. 인큐베이션 후, 4 °C에서 300 × g로 3분 동안 원심분리합니다. 오가노이드 펠릿이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 완전히 흡입하여 제거합니다.
    5. 3D 오가노이드 구조가 유지되도록 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 천천히 PDTO 완전 배지로 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
      주의: 3D 구조를 파괴하는 과도한 피펫팅이나 볼텍싱(vortexing)을 피하십시오.
      원심분리 후 잔류 매트릭스가 보이면, 차가운 Cell Recovery Solution에서 10–15분 동안 추가로 인큐베이션합니다. 다시 원심분리하여 상태를 확인합니다.
  2. 생존 종양 세포 수를 결정하고 오가노이드 현탁액 농도를 조절합니다.
    1. 섹션 1에 설명된 대로 세포 해리 효소를 사용하여 남겨둔 웰을 완전히 해리합니다. 간헐적인 트리튜레이션(trituration)과 함께 37 °C에서 5–7분 동안 인큐베이션합니다.
    2. PDTO 완전 배지로 중화합니다. 300 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 배지 1 mL에 재현탁합니다.
    3. 세포 현탁액 15 µL를 0.4% Trypan Blue 15 µL와 섞습니다. 혈구계수기(hemocytometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정합니다.
    4. 생존 세포 수를 바탕으로 PDTO 완전 배지에서 200,000 viable cells/mL가 되도록 필요한 희석 배수를 계산합니다.
      참고: 계산 예시: 웰당 100 µL에 20,000개의 종양 세포를 목표로 하는 경우, 200,000 cells/mL의 작동 농도가 필요합니다. 96-웰 이미징 플레이트 전체(내부 60개 웰)에 분주할 경우, 필요한 총 분석 부피는 6 mL(100 µL × 60개 웰)이지만, 20%의 데드 볼륨을 고려하여 7.2 mL를 준비합니다. 따라서 필요한 세포 수는 6 mL × 200,000 cells/mL = 1.2 × 106 cells 및 7.2 mL × 200,000 cells/mL = 1.44 × 106 cells가 됩니다.
  3. 살상 분석(killing assay)을 위해 오가노이드를 플레이팅합니다.
    ​참고: 검은색 벽면과 투명한 바닥을 가진 96-웰 이미징 플레이트를 사용하십시오. 각 조건당 최소 3개의 기술적 반복구(technical replicates)로 플레이팅합니다.
    1. 멀티채널 피펫을 사용하여 웰당 20,000개의 생존 종양 세포가 되도록 오가노이드 현탁액 100 µL를 분주합니다.
    2. 증발과 가장자리 효과(edge effects)를 최소화하기 위해 플레이트의 가장 바깥쪽 웰에 멸균 PBS 200 µL를 채웁니다.
    3. 현미경 하에서 균일하게 분포되었는지 시각적으로 확인합니다.
    4. T 세포를 추가하기 전, 37 °C에서 10–30분 동안 오가노이드를 침전시킵니다.
  4. 지속적인 오가노이드 확장을 유지합니다.
    1. 계수 중에 생성된 단일 세포 현탁액을 사용합니다. 세포를 배양 특이적 배지에 재현탁합니다. 냉각된 Matrigel을 최종 농도 67%가 되도록 첨가합니다.
    2. 미리 데워진 6-웰 현탁 플레이트에 웰당 100,000 cells로 플레이팅합니다. 섹션 1에 설명된 대로 중합시키고 배지를 덮어줍니다. 지속적인 확장을 위해 인큐베이터로 옮깁니다.

3. 종양 반응성 T 세포의 준비

  1. 종양 침윤 림프구(TILs)의 증식 및 수집
    1. 기존에 확립된 프로토콜13,14을 사용하여 종양 표본에서 TILs를 분리하고 증식시킨다.
    2. 각 TIL 준비물에 대해 다음 특성을 기록한다: 증식 후 생존율: ≥80% (Trypan Blue 배제법); CD3⁺ 순도: ≥85%; CD4⁺/CD8⁺ 분포: CD8⁺ T 세포 ≥30% 및 CD4:CD8 비율 기록; 증식 기간 및 배양 조건: feeder-free 조건에서 10% human AB serum 및 recombinant human IL-2 (600 IU/mL)가 첨가된 완전 RPMI-1640에서 10–14일간 배양; 활성/소진 표현형: 분석 시점에 CD3⁺ 세포의 PD-1 ≤ 50%, TIM-3 ≤ 30% 및 LAG-3 ≤ 20%; 자극 후 검출 가능한 활성 마커 (예: CD69 또는 CD25); 종양 반응성 증거: 적어도 하나의 기능적 분석(예: IFN-γ 생성 증가, CD137/4-1BB 상향 조절, CD107a 탈과립화 또는 자가 종양 세포에 대한 세포독성)을 통해 측정 가능한 항원 특이적 활성.
    3. 각 PDTO가 해당 자가 TIL 준비물과만 단독으로 공동 배양되었음을 확인한다.
      참고: CD8+ 세포독성 집단을 보존하기 위해 feeder-free 증식 전략을 권장한다. 방사선 조사된 feeder PBMCs를 사용하는 프로토콜은 증식 방향을 CD4+ T 세포 쪽으로 치우치게 할 수 있다. Feeder-free 시스템이 CD8+ T 세포를 더 잘 보존한다.
      소진 표현형 및 세포독성 기능 상실을 방지하기 위해 TIL 증식 기간을 최대 14일로 제한한다.
    4. 분석 당일에 배양 플라스크에서 T 세포를 수집한다. 세포를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다. 실온에서 300 × g로 3분간 원심분리한다. 상층액을 완전히 흡입하여 제거한다.
  2. 기능적 분석을 위한 T 세포 준비.
    1. 단계 3.1.4의 펠렛을 1 mL의 기본 T 세포 배지 (RPMI 1640 + 10% FBS + 1% Pen/Strep)에 재현탁한다.
      참고: 배지에 IL-2, IL-15, 사이토카인, anti-CD3/CD28 비드 또는 feeder 세포가 포함되지 않았는지 확인한다.
      ​중요: 잔류 사이토카인이나 활성 비드는 세포독성을 인위적으로 강화하여 분석 결과 해석에 혼란을 줄 수 있다.
    2. Trypan Blue를 사용하여 세포 농도와 생존율을 결정한다. 생존율이 ≥ 80%인 경우에만 진행한다.
  3. 이펙터 대 표적(E:T) 비율 준비.
    1. E:T 비율을 T 세포:종양 세포로 정의한다.
      참고: E:T 비율 계산에 사용되는 종양 세포 수는 병렬로 처리된 완전히 해리된 참조 웰(섹션 2.2)에서 추정한다. 오가노이드는 온전한 3차원 구조로 분주되므로, 분석을 방해하지 않고 개별 공동 배양 웰 내에서 종양 세포 수를 직접 결정할 수 없다. 참조 웰에서 얻은 추정 종양 세포 농도를 동일한 풀링된 오가노이드 현탁액으로 준비된 모든 웰에 일률적으로 적용한다.
      1. 웰당 20,000개의 종양 세포에 대해 2:1 E:T 비율을 적용하려면, 웰당 40,000개의 T 세포를 추가한다. 웰당 100 µL를 투여하기 위해 T 세포를 400,000 cells/mL로 준비한다. 즉, 400,000 cells/mL × 0.1 mL = 40,000 cells가 된다.
      2. 96-웰 이미징 플레이트 전체(내부 60개 웰)를 분주하는 경우, 필요한 T 세포 부피는 6 mL이며, 20%의 dead volume을 고려하면 T 세포 부피는 7.2 mL가 된다.
        필요한 T 세포 수: 6 mL × 400,000 cells/mL = 2.4 × 106 cells
        7.2 mL × 400,000 cells/mL = 2.88 × 106 cells
        참고: 추정된 E:T 비율은 오가노이드 크기(통상 직경 100–300 µm)의 변이, Matrigel 용해 및 세척 중의 세포 손실(섹션 2.1), 플레이트 준비 중의 미세한 피펫팅 및 세포 침전 변이를 포함하여 3차원 오가노이드 배양과 관련된 고유한 변동성에 영향을 받는다.
        ​변동성을 최소화하려면 조건당 최소 3개의 기술적 반복군(technical replicates)을 플레이팅하고, 오가노이드의 무결성을 유지하기 위해 wide-bore 피펫 팁과 부드러운 재현탁을 사용하며, T 세포를 추가하기 전에 웰 전반에 걸쳐 오가노이드가 균일하게 분포되었는지 육안으로 확인한다(섹션 2.3).
  4. caspase-3 검출 시약 준비.
    1. Caspase-3 기질(스톡 농도: 200 µM)을 사용한다. 기질을 T 세포 현탁액에 직접 첨가하여 최종 농도가 2 µM이 되도록 작업 용액을 준비한다. 부드럽게 섞는다.
      참고: 항상 빛으로부터 보호한다.
  5. 선택 사항: 약물 스크리닝 또는 면역 조절 연구
    ​참고: 이 분석법은 저분자 억제제(예: 키나아제 억제제, 대사 조절제), 면역 관문 억제제(예: anti-PD-1, anti-PD-L1) 및 병용 요법을 평가하는 데 적용할 수 있다.
    1. 매트릭스 해리 및 T 세포 추가 전 24–72시간 동안 약물을 오가노이드와 함께 사전 배양하거나, T 세포와 동시에 첨가한다.
    2. 각 조건에 대해 vehicle-only 대조군을 포함한다.
    3. 면역 관문 억제제를 테스트하는 경우, 분석 전에 오가노이드의 표적(예: PD-L1) 발현과 T 세포의 PD-1 발현을 확인한다.

4. 공동 배양 및 실험 대조군 설정.

  1. 공동 배양 설정
    1. 배양된 오가노이드 96-웰 이미징 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮깁니다. 균질한 분포를 보장하기 위해 도말 직전에 준비된 T세포 현탁액(섹션 3)을 부드럽게 재현탁합니다.그림 2A).
    2. 멀티채널 피펫을 사용하여, 첨가하십시오 100 µL T-세포 현탁액의(다음 농도의 caspase 기질을 포함하는) 2 µM) 가 포함된 각 웰에 100 µL 오가노이드의. 첨가 후, 플레이트를 2~3회 가볍게 쳐서 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
      주의: 오가노이드의 손상을 방지하기 위해 웰 바닥에 닿지 않도록 하십시오. 웰 내부에서 피펫팅을 반복하여 용액을 섞지 마십시오. 과도한 교반은 오가노이드의 무결성을 파괴하고 T세포 침투 역학을 변화시킵니다.
    3. 온도 변화를 최소화하기 위해 플레이트를 즉시 살아있는 세포 이미징 시스템으로 옮기십시오.
      ​참고: 1:1 혼합 후 웰 내 최종 농도: 결합 100 µL (완전 오가노이드 배지 내의) 오가노이드 현탁액의 100 µL T세포 현탁액(기본 T세포 배지 내)의 경우 모든 성분의 농도가 절반이 됩니다. 최종 농도는 다음과 같습니다: B27 보충제 0.5X; 니코틴아미드 5 mM; 글루타민 대체제 0.5X; 페니실린/스트렙토마이신 50 U/mL / 50 µg/mL; HEPES 5 mM; N-아세틸시스테인 0.625 mM; Primocin 50 µg/mL; FGF-Basic (FGF-2) 0.5 ng/mL; FGF-10 10 ng/mL; PGE2 0.5 µM; SB202190 5 µM; EGF 25 ng/mL; Y-27632 5 µM; A-83-01 250 nM; NRG1 5 ng/mL; Noggin 및 R-Spondin 각각 5% v/v; FBS (T세포 배지 유래) 5%; caspase-3 기질 1 µM 최종 웰 내.
      1. 라이브 셀 이미징 소프트웨어에서 다음을 선택하여 키네틱 획득을 설정하십시오. 예약 스캔 전체 분석 기간 동안 반복적인 이미징이 가능하도록 (그림 3B), 선택하십시오 표준 위상 및 형광 호환성을 위한 스캔 유형 (그림 3C), 그리고 10에서 위상, 녹색 및 적색 채널을 지정하십시오.× 최적화된 채널당 획득 시간으로 (그림 3D).
      2. 녹색 및 적색 채널 모두에 대해 채널당 형광 획득(노출) 시간을 약 300~400ms로 설정하고, 10을 확인하십시오.× 대물렌즈가 선택됨 (이미지 보정) 1.24 µm/px 10에서×).
        참고: 대표 데이터 세트는 언급된 라이브 세포 분석 시스템에서 획득되었습니다 (다음 내용을 참조하십시오. 재료 표). 이미지 분석은 저장된 분석 정의(red-green-overlap-Bladder로 명명됨)를 사용하여 Basic Analyzer로 수행되었습니다.
      3. 96-웰 플레이트의 각 내부 웰당 4장의 이미지를 획득하도록 설정하고, 최대 36시간 동안 2시간 간격으로 스캔을 반복합니다.그림 3A,E).
      4. 다음과 같이 생성하여 이미지 분석을 시작하십시오. 새 분석 정의 및 활성화하는 단계, 초록색, 그리고 빨간색 채널 (그림 4A,B).
      5. 다음을 포함하여 적색 채널 분할 매개변수를 최적화하십시오. 면적 임계값 및 가장자리 제외 필터, 파편 및 이중체로부터 종양 객체를 분리하기 위해 (그림 4C).
      6. 적색(종양, CellTrace Far Red) 채널의 경우, 다음과 같이 설정하십시오. 분할 유형 ~로 / ~까지 / ~에게 2.0 RCU 임계값의 표면 적합도활성화 에지 민감도 = 0으로 에지 분할; 세트 홀 채우기 = 0 µm2 및 크기 조정 = 0 픽셀; 그리고 다음을 적용하십시오 최소 객체 영역 필터 ~의 50 µm2 (최대 면적, 편심률 또는 강도 필터 없음).
      7. Green (NucView 488 caspase-3/7) 채널의 경우, 다음을 사용하여 녹색 세그멘테이션을 생성하십시오. 분할 유형 ~로 설정하다 표면 적합도 그리고 하나의 임계값 의 2.0 GCU활성화 에지 민감도(Edge Sensitivity) = 0인 에지 분할(Edge Split); 세트 구멍 채우기 = 0 µm2 및 크기 조정 = 0 픽셀그리고 면적 또는 강도 필터를 적용하지 마십시오.
      8. 세포자멸사-종양 판독값을 녹색 + 적색 이중 양성 객체로 정의하십시오. 중첩 영역에 추가적인 면적 또는 강도 필터를 적용하지 마십시오. 자발적 세포자멸사 및 양성 살상 대조군 웰을 통해 중첩 기준을 검증한 후, 해당 분석 정의를 모든 웰에 동일하게 적용하십시오.
      9. 적색/녹색 이중 양성 세포사멸 객체의 비율을 정량화하기 위해 두 채널 모두에 분석 메트릭을 설정하고, 종양 객체가 정확하게 식별되었는지 확인하기 위해 세그멘테이션 오버레이를 검토하십시오.그림 4D).
      10. 모든 실험 시점을 포함하도록 스캔 시간과 웰을 선택하십시오 (그림 4E), 그리고 완료된 분석 결과가 검토 가능하며 표 또는 그래프 형태의 데이터로 내보낼 수 있는지 확인하십시오 (그림 4F,G).
      11. 후속 정량 분석을 위해 객체 수준 및 웰당 분석 데이터(시간점별)를 내보내십시오.

결과

여기에 제시된 결과에 사용된 종양 오가노이드 배양물은 계대 배양 5회 이상 수행하여 확립 및 확장하였으며, 바이알당 1 × 106 cells의 밀도로 6개 이상의 cryovial에 보관하였고, 각 분석 시 해동하여 다시 확장 배양하여 사용하였다. 악성 상피 세포의 정체성과 정상 상피 또는 기질의 과성장이 없음을 타겟 시퀀싱을 통해 확인하였으며, 이를 통해 모종양에 존재하는 체세포 돌연변이가 유지됨을 입증하였다. 또한 조직학적 임베딩을 통해 오가노이드의 형태가 원시 종양의 병리와 일치함을 확인하였으며, 모든 세포주는 사용 전 마이코플라스마 음성임을 확인하였다. 정상 상피 형태를 보이거나 모종양의 분자적 특성을 유지하지 못한 배양물은 식별하여 제외함으로써, 분석 시 비종양성 오염을 최소화하였다.

표시된 모든 결과(그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5)는 폐선암 환자 한 명으로부터 유래한 단일 일치 오가노이드-TIL 쌍을 사용하여 생성되었습니다. 종양 표본은 사전 보조 항암 화학요법 없이 수행된 외과적 절제를 통해 얻었으며, 오가노이드는 계대 배양 21대(passage 21)에서 사용되었습니다. 오가노이드는 최초 분리부터 표시된 분석 단계(계대 배양 21대)까지 약 12주 동안 배양되었습니다. 종양 절제 날짜는 보호 대상 건강 정보로 간주되어 보고하지 않았습니다.

재확장 후, PDTO를 회수하고 수를 센 다음 96-well 이미징 플레이트에 분주합니다. TIL은 2:1의 작동 세포 대 표적 세포 비율로 병행 준비하며, 공동 배양 설정 직전에 NucView 488 caspase-3 기질을 첨가합니다(그림 2A). 중간 시점의 단일 웰에서 얻은 대표 이미지는 예상되는 4채널 출력을 보여줍니다. 위상차 이미지는 오가노이드와 면역 세포의 존재를 확인하며(그림 2B), 녹색 형광은 caspase-3가 활성화된 세포 사멸 신호를 식별하고(그림 2C), 적색 형광은 CellTrace Far Red로 표지된 종양 오가노이드를 선택적으로 표시하며(그림 2D), 병합된 오버레이 이미지는 주요 분석 판독값인 적색/녹색 이중 양성 세포 사멸 종양 객체를 나타냅니다(그림 2E). TIL 매개 살상이 없는 경우, 적색 양성 구조 내에서 최소한의 자발적 녹색 신호가 나타날 것으로 예상됩니다. 정량을 위해 적색/녹색 이중 양성(세포 사멸) 오가노이드를 세포 사멸 PDTO의 백분율로 표시하며, 이를 평균 ± SEM으로 시간에 따라 도식화하고, 세그멘테이션 오버레이를 통해 정확한 종양 구조 식별을 확인합니다(그림 4D).

6가지 소분자 화합물을 1 µM 농도로 테스트한 대표 실험에서, 약물 4(Drug 4)와 약물 5(Drug 5)는 약 24 h 이후부터 대조군(vehicle) 대비 증가된 세포 사멸(apoptosis)을 나타냅니다(그림 5A; ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001); 단일 대표 실험 내 비교 결과입니다. 36 h 시점의 바이올린 도표(Violin plot)를 통해 반복 실험 간 반응 분포의 상보적 관점을 확인할 수 있으며, 이 대표 실험에서 약물 4와 약물 5가 apoptotic PDTO의 가장 큰 증가를 유도하는 반면, 약물 3(Drug 3)은 잠재적인 면역 억제 활성과 일치하게 명목상 감소된 살상 반응을 보입니다(그림 5B).

측정된 세포 사멸(apoptosis)이 약물의 직접적인 세포 독성이나 작동 세포 유래 신호가 아닌, 종양 침윤 림프구(TIL) 의존적 살상 능력을 반영하는지 확인하기 위해, 대표 화합물(Drug 5)을 이용하여 공배양(TIL + 오가노이드), 오가노이드 단독(TIL 없음), T 세포 단독의 세 가지 병렬군에서 36시간 동안 평가하였다(그림 5C).

공동 배양군은 세포 사멸이 일어난 PDTO가 시간에 따라 점진적으로 축적되어 36 h에 19.2 ± 1.0%에 도달한 반면(mean ± SEM, n = 6 wells), 오가노이드 단독(TIL 미포함)군은 전 기간 동안 낮은 수준을 유지하며 36 h에 4.0 ± 0.3%로만 상승하여(n = 3 wells), 4.8배 더 낮은 신호를 보였습니다. T 세포 단독 대조군은 전체 시간 경과 동안 기저 수준(0.0%; n = 3 wells)을 유지했는데, 이는 종양 오가노이드에만 형광 표지를 했기 때문이며, 판독값이 작동 세포에서 유래한 것이 아님을 확인시켜 줍니다. 종합적으로, 이러한 군들은 종양 단독 기저치 이상의 순수 TIL 의존적 세포 사멸 살상을 분리해 냅니다. 오가노이드 단독군은 약물이 존재하는 상태에서 획득되었으므로, 약물-종양(TIL 미포함) 대조군 역할도 수행합니다. 약물이 존재하지만 TIL이 없을 때 세포 사멸은 낮은 수준(36 h에 4.0 ± 0.3%)으로 유지되었으며, 이는 대응하는 공동 배양군에서 나타난 증가된 살상 효과가 해당 화합물의 직접적인 오가노이드 세포 독성으로 설명될 수 없음을 나타냅니다. 약물 단독 군은 Drug 5에 대해서만 생성되었습니다. 따라서 나머지 화합물의 경우, 증가된 세포 사멸은 아직 면역 강화 효과로 구체적으로 돌릴 수 없는 결합된 효과로 설명되며, 화합물별 약물 단독 대조군 설정이 필수적인 검증 단계로 확인되었습니다.

본 연구의 결과를 뒷받침하는 모든 데이터는 제한 없이 이용 가능합니다. 원본 타임랩스 이미지 시리즈, 객체 수준 내보내기 파일, Incucyte 분석 정의 파일, 분할 매개변수 설정, 메타데이터 및 그림 5의 기초가 되는 통계 소스 데이터는 공용 저장소에 보관되어 있으며 오픈 라이선스 doi: 10.5281/zenodo.21676769에 따라 자유롭게 접근할 수 있습니다. 그림 5를 생성하는 데 사용된 객체 수준 소스 데이터, 플레이트 맵, 분할 설정 및 분석 정의 파일은 보충 파일 2에 제공됩니다.

오가노이드 재구성 과정: 단일 세포 현탁액, 염색, Matrigel 돔 내 플레이팅을 보여주는 도식.
그림 1: 환자 유래 종양 오가노이드의 형광 표지 및 3차원 재구성. (A) PDTO 준비 워크플로우의 모식도: 오가노이드를 Matrigel에서 분리하고, 단일 세포 현탁액으로 해리한 후, CellTrace Far Red 염료로 표지하고, Matrigel 매트릭스에 재현탁하여 공배양 분석 전 72시간 동안 재확장을 위해 3D 드롭렛 형태로 플레이팅함. (B) 15 mL 튜브 내 표지된 세포 펠릿의 대표 사진으로, CellTrace Far Red 염색이 성공적으로 이루어졌음을 나타내는 가시적인 색상을 보여줌. (C) 72시간 배양 후 재확장된 종양 오가노이드를 포함하는 Matrigel 드롭렛의 위상차 이미지. (D) 적색으로 표지된 종양 오가노이드(CellTrace Far Red)를 보여주는 형광 오버레이 이미지로, 공배양 분석 설정 전 온전한 3D 오가노이드 형태와 균일한 형광 표지를 확인 함. 이미지는 10× 배율에서 획득함. 스케일 바 = 800 µm (C) 및 400 µm (D). 약어: PDTO = patient-derived tumor organoid. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

오가노이드-TIL 분석 워크플로우 도식; NucView 488 염색약; 세포사멸 측정; Incucyte 시스템.
그림 2. 공배양 분석 워크플로 및 TIL 매개 종양 오가노이드 사멸의 대표 형광 이미지. (A) 두 개의 병렬 준비 경로를 보여주는 전체 공배양 분석 워크플로의 모식도: (상단 경로) Matrigel로부터의 오가노이드 회수, 계수 및 96-웰 이미징 플레이트에 분주; (하단 경로) TIL 확장, 재현탁 및 caspase-3 기질과 함께 첨가. 두 경로는 키네틱 획득 및 자동 분석을 위해 라이브 셀 이미징 시스템에 적재된 96-웰 플레이트 내의 공배양 설정 단계에서 합쳐짐. 단일 시점의 공배양 웰에서 얻은 대표 이미지: (B위상차, (C) 세포 사멸 세포에서 caspase-3에 의해 활성화된 NucView 488 신호를 보여주는 녹색 형광 채널, (D) CellTrace Far Red로 라벨링된 종양 오가노이드를 보여주는 적색 형광 채널, 그리고 (E) 적색/녹색 이중 양성인 세포 사멸 종양 객체를 보여주는 병합 형광 오버레이 이미지. 이미지는 10배 배율로 획득되었다. 스케일 바 = 400 µm약어: TIL = 종양 침윤 림프구. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

자동 스캔 구성; 설정 인터페이스; 데이터 획득; 영상 분석; 소프트웨어 가이드.
그림 3라이브 셀 이미징을 위한 기기 스캐닝 설정 및 획득 파라미터 구성. (A) 플레이트 맵과 용기 유형, 이미지 채널, 대물렌즈, 스캔 지속 시간 및 획득 일정을 포함한 스캔 속성을 보여주는 활성 스캔 상태의 기기 스케줄링 대시보드. (B) 반복해서 스캔하시겠습니까, 아니면 한 번만 하시겠습니까? ~와의 대화 예약 스캔 전체 분석 기간 동안 종단적 역학 이미징을 가능하게 하도록 선택되었습니다. (C) 다음이 포함된 스캔 유형 선택 패널 표준 선택된 모드는 위상차 및 형광 기반 분석 응용 분야를 지원합니다. (D) 스캔 설정 이미지 채널(위상차, 녹색, 적색), 채널별 획득 시간 및 10배 대물렌즈 선택을 지정하는 패널. (E) 웰당 4개의 이미지로 설정된 96-웰 플레이트의 내부 웰 선택 및 예상 스캔 시간이 표시된 스캔 패턴 패널. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

이미지 분석 소프트웨어 워크플로; 현미경 이미지 설정; 데이터 스캔/통합; 교육용 도식.
그림 4통합 소프트웨어를 이용한 라이브 셀 이미징 장비 설정 및 이미지 분석 워크플로우. (A) 분석 시작 ~의 선택 화면을 보여주는 인터페이스 새 분석 정의 생성 새로운 분석 파이프라인을 시작하려면 (B) 이미지 채널 선택 이중 형광 획득을 위해 위상(Phase), 녹색(Green) 및 적색(Red) 채널이 활성화된 패널. (C) 분석 정의 최소 및 최대 면적 임계값, 가장자리 제외, 그리고 종양 객체 식별에 사용되는 데브리(debris) 필터를 포함한 레드 채널 분할 파라미터가 표시된 인터페이스.D) 분석 정의 녹색 및 적색 채널 모두에 대해 설정된 분석 메트릭을 보여주는 인터페이스로, 적색/녹색 이중 양성 세포 사멸 종양 구조의 정확한 식별을 확인해 주는 대표적인 분할 오버레이가 표시되어 있다.E) 스캔 시간 및 웰 선택 96-웰 이미징 플레이트의 내부 웰 전반에 걸쳐 반복적인 이미지 획득을 예약하는 데 사용되는 인터페이스.F) 이미지 파일 아래에서 완료된 분석 정의를 선택하십시오. (G혈관 정보, 분석 유형, 사용 가능한 지표 및 마이크로플레이트 그래프, 그래프 및 표 내보내기를 포함한 데이터 내보내기 옵션을 표시하는 분석 완료 요약 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

세포사멸 약물 반응 그래프: 시간 경과, 바이올린 도표 분석, 오가노이드 약물 테스트, 치료 효능.
그림 5. 저분자 화합물 약물이 TIL 매개 종양 오가노이드 사멸에 미치는 영향에 대한 대표 분석. (A) 여러 소분자 처리 조건과 대조군(vehicle control) 간의 시간에 따른 PDTO 세포사멸 백분율을 보여주는 동역학적 사멸 곡선이며, 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시됨. (B) 36시간 시점의 종점 분석을 보여주는 바이올린 도표(Violin plot)로, 처리 조건에 따른 세포 사멸 반응의 분포를 시각화하는 대안적인 그래픽 방법이며, 본 대표 실험 내에서 약물 처리군과 매질 대조군 공동 배양 세포 간의 기술적 비교를 가능하게 한다. (C) 대표 화합물(Drug 5)에 대한 TIL 의존성 대조군: 공배양군(TIL + 오가노이드), 오가노이드 단독군(TIL 없음) 및 T 세포 단독군에 대해 36시간 동안 측정한 PDTO의 세포 사멸 백분율이며, 이는 세포 사멸 신호가 TIL 의존적이며 작동 세포(effector cells)에서 기인한 것이 아님을 확인한다(공배양 n = 6웰; 오가노이드 단독 및 T 세포 단독 n = 3웰; 평균 ± SEM). 약어: PDTO = 환자 유래 종양 오가노이드; TIL = 종양 침윤 림프구; SEM = 평균 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 배지와 완충액의 준비.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2. 그림 5에 대한 소스 데이터 및 분석 파일.이 ZIP 폴더에는 그림 5의 화합물 스크리닝 및 약물 5 대조군 분석을 생성하는 데 사용된 객체 수준 소스 데이터, 플레이트 맵, 세그멘테이션 설정 및 분석 정의 파일이 포함되어 있습니다. 여기를 클릭하여 파일을 다운로드하십시오.

토론

본 프로토콜은 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)와 그에 상응하는 종양 침윤 림프구(TIL) 간의 세포 독성 상호작용을 평가하기 위한 이미지 기반의 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 설명합니다. 3차원 종양 구조, 자가 면역 작동 세포 및 실시간 caspase-3 활성화 측정을 통합함으로써, 이 시스템은 생리학적으로 유의미한 조건 하에서 종양 세포의 세포 사멸을 동적으로 평가할 수 있게 합니다. 이 워크플로우는 기 established된 오가노이드 및 TIL 증식 방법과 제어된 공동 배양 조건 및 자동화된 이미지 기반 정량화를 결합하여, 면역 기능 연구를 위한 이미지 기반 접근 방식을 제공합니다. 상위 단계인 PDTO 및 TIL 분리 및 증식 단계는 본 문서에서 상세히 설명하는 대신 이전에 발표된 프로토콜에 따라 수행되므로, 이 워크플로우를 완전히 재현하려면 본 프로토콜과 더불어 해당 소스 문헌을 참조해야 합니다.

이 접근법의 주요 강점은 오가노이드 내에서 종양 고유의 이질성을 보존할 수 있다는 점입니다. 2차원 단층 시스템과 달리, 오가노이드는 3차원 구조와 종양 세포 간의 상호작용을 유지합니다. 이를 일치하는 TIL과 공배양하면 T 세포 침투, 접촉 의존적 사멸 및 시간에 따른 역학적 반응을 평가할 수 있습니다. caspase-3 활성 형광 기질을 사용하면 세포 밀도 감소나 ATP 기반의 최종점 생존력 분석과 같은 간접적인 대리 지표에 의존하지 않고 세포 사멸을 직접 측정할 수 있습니다.

실험의 성공을 결정하는 몇 가지 중요한 파라미터가 있습니다. 플레이팅 시 오가노이드의 무결성을 유지하는 것이 필수적이며, 초기 종양 해리 과정 중의 과도한 소화나 공동 배양 설정 시의 과도한 기계적 손상은 오가노이드를 파편화하여 적색 객체 수를 인위적으로 증가시키고 세포 사멸 계산 값을 변경할 수 있습니다. 일관된 오가노이드 크기 분포는 세그멘테이션 정확도를 높이고 웰 간 변동성을 줄여줍니다. 마찬가지로, T 세포 계수가 부정확하거나 응집이 발생하면 살상 역학에 변동성이 생기므로, 반복 실험 전반에 걸쳐 정확한 작동 세포 대 표적 세포(E:T) 비율을 유지해야 합니다. 플레이팅 직전에 부드럽게 재현탁하면 이러한 문제를 최소화할 수 있습니다. 제시된 대표 데이터셋에서는 본 실험실 프로토콜에서 설정된 표준 작동 파라미터에 따라 단일 E:T 비율(2:1)만 평가되었습니다. 기존의 T 세포 세포독성 문헌에 근거할 때, 일반적으로 더 높은 E:T 비율은 종양 살상을 증가시킬 것으로 예상되며, 이 파라미터에 대한 공식적인 적정(titration)은 향후 이 플랫폼의 검증 방향으로 남아 있습니다. 세그멘테이션 파라미터의 선택과 검증 또한 중요한 단계입니다. 최소 및 최대 객체 크기에 대한 임계값은 파편은 제외하면서 온전한 종양 구조는 포착할 수 있어야 합니다. 임계값이 너무 관대하면 종양 수가 부풀려지고, 너무 제한적이면 종양 부담(tumor burden)이 과소평가됩니다. 적색 및 녹색 신호의 중첩 기준은 자발적 세포 사멸 대조군과 양성 살상 대조군 모두를 사용하여 검증해야 하며, 세포 사멸 백분율 계산 시 편향을 방지하기 위해 모든 웰에 일관되게 적용해야 합니다.

적절한 대조군을 포함하면 해석의 신뢰도를 높일 수 있습니다. 종양 단독 웰은 기본 적색 형광 안정성을 설정하며, 종양 및 기질 대조군은 면역 활성과 무관하게 발생하는 자발적 세포사멸을 정량화합니다. T세포 단독 대조군은 사멸하는 림프구로부터 발생하는 배경 카스파제 신호를 결정합니다. 양성 세포사멸 대조군은 기질의 기능성을 확인하고 세그멘테이션 임계값을 검증합니다. 이러한 대조군은 오가노이드 라인마다 기본 세포사멸률이 다를 수 있으므로, 독립적인 종양-TIL 쌍을 비교할 때 특히 중요합니다.

이 영상 기반 플랫폼은 크롬 방출법이나 최종 시점의 ATP 기반 생존력 측정과 같은 전통적인 세포독성 분석법에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 실시간 영상화는 종양-면역 상호작용의 지속적이고 비파괴적인 모니터링을 가능하게 하여, 면역 매개 살상 과정의 정밀한 역학적 분해능을 확보할 수 있게 합니다. 단일 누적 측정값만을 제공하여 일시적이거나 순차적인 세포독성 사건을 가릴 수 있는 최종 시점 분석법과 달리, 종단적 영상화는 초기 빠른 세포독성 반응과 지연되거나 점진적인 세포사멸(apoptosis)을 구분해 냅니다. 이러한 시간적 분해능을 통해 T-세포 활성화 또는 침윤과 관련된 지체기, 최대 살상 구간, 그리고 T-세포 소진이나 표적 세포의 저항성을 반영할 수 있는 정체기를 식별할 수 있습니다. 동일한 웰에서 반복 측정을 수행함으로써 샘플 간 변동성을 줄이고, 여러 시점에서 병렬 플레이트를 사용할 필요성을 없애줍니다. 각 간격마다 종양 부하와 세포사멸 전환이 동시에 정량화되므로 동적 정규화가 가능하며, 이는 면역 살상과 자연 세포사를 구분할 수 없는 벌크 용해 분석법에 비해 정확도를 높여줍니다. 종합적으로, 이 접근법은 전통적인 단일 시점 분석법보다 세포독성 기능에 대해 생리학적으로 더 많은 정보를 제공하고 기전적으로 해석 가능한 평가를 가능하게 합니다.

하지만 몇 가지 한계점을 고려해야 합니다. 환자 유래 종양 오가노이드는 기존의 2차원 배양보다 실제 종양 구조를 더 밀접하게 재현하지만, 종양 미세환경의 기질, 혈관 또는 골수성 성분을 완전히 모델링하지는 못합니다. 또한, 10× 배율의 이미징은 종단 분석에 충분한 처리량을 제공하지만, 밀집된 오가노이드 내의 단일 세포 상호작용을 분해하지 못할 수 있습니다. 고배율 이미징은 공간 해상도를 높일 수 있으나 시야와 분석 처리량을 감소시킵니다. 이 분석법은 특히 caspase-3 의존적인 종양 세포의 세포사멸(apoptotic death)을 정량화합니다. 괴사(necrosis) 또는 네크롭토시스(necroptosis)를 포함하여 caspase 독립적 기전으로 발생하는 T 세포 매개 세포독성은 이 판독법으로 검출되지 않으므로 분석 범위 내에서 해석해야 합니다. 또한, 단일 세포 분리, 표지 및 72 h 재확장은 원칙적으로 하위 집단을 선택적으로 배양할 가능성이 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 기간 동안 재형성된 100–300 µm 구조는 모체 오가노이드의 다세포 3차원 구조를 유지하며, 재확장 전후의 클론 구성에 대한 공식적인 비교는 수행되지 않았으나 모체 배양 대비 뚜렷한 형태학적 변화는 관찰되지 않았습니다. 본 연구에서는 분석의 동적 범위(dynamic range)를 공식적으로 보정하기 위해 PD-L1⁺/PD-1⁺ 오가노이드-TIL 쌍에서 살상 능력이 강화될 것으로 예상되는 면역 관문 억제제(예: anti-PD-1)와 같은 약리학적 양성 대조군 벤치마크를 포함하지 않았습니다. 이러한 참조 면역 강화제의 포함은 중요한 다음 검증 단계이며, 여기서 보고된 화합물 비교 결과는 이에 따라 해석되어야 합니다. 이 예시에서는 Drug 5에 대해서만 일치하는 약물 단독(TIL 없음) 대조군 실험을 수행했습니다. 화합물별 약물 단독 대조군이 없는 다른 화합물의 경우, 세포 사멸의 상대적 증가를 해당 화합물의 효과로 돌릴 수 없습니다. 유세포 분석 Annexin V 염색 또는 공초점 단일 세포 확인과 같은 독립적인 세포 사멸 표준 측정법을 통한 이 이미지 기반 판독법의 동일 시료 교차 검증은 여기서 수행되지 않았으며, 이는 적색/녹색 이중 양성 판독법의 특이성을 더욱 확립하기 위한 핵심적인 다음 단계로 파악됩니다17.

추가적으로 고려해야 할 사항은 CellTrace Far Red 형광이 종양 세포가 분열할 때마다 점진적으로 희석된다는 점입니다. 결과적으로, 72 h의 오가노이드 회복 기간 및 이후의 이미지 촬영 기간 동안 발생하는 증식으로 인해 후기 시점의 형광 강도가 감소할 수 있으며, 이는 CellTrace 양성 종양 객체의 검출 수를 감소시키고 분모 값을 줄임으로써 계산된 세포사멸(apoptosis) 백분율을 다소 증가시킬 가능성이 있습니다. 이러한 잠재적 교란 요인을 모니터링하기 위해, 이미지 촬영 기간 전반에 걸쳐 CellTrace Far Red 양성 객체의 수를 종단적으로 추적하였으며, 세포사멸 관련 caspase-3/7 활성화와 무관하게 적색 양성 신호가 실질적으로 감소했는지 여부를 웰(well)별로 평가하였습니다. 이미지 촬영 기간 동안 CellTrace 양성 객체의 설명되지 않는 유의미한 손실은 관찰되지 않았으며, 이는 염료 희석이 관찰된 세포사멸 측정값의 변화에 주요한 영향을 미쳤을 가능성이 낮음을 시사합니다. 그러나 이는 형광 희석 기반의 종양 세포 추적 방식이 가진 내재적 한계이므로, 후기 시점의 측정값을 해석할 때 고려되어야 합니다.

환자 유래 샘플 간의 생물학적 변동성은 이 분석 플랫폼의 강점인 동시에 도전 과제이기도 합니다. 이러한 변동성은 임상적으로 유의미한 종양의 이질성을 반영하지만, 적절한 실험 설계 시 연구 규모와 반복 횟수를 정의할 때 생물학적 변동성을 반드시 고려해야 합니다. 각각의 고유한 종양-TIL 쌍은 독립적인 생물학적 반복군으로 간주해야 하며, 기술적 반복군은 샘플 내 분석 변동성을 평가하는 데 사용됩니다. 그림 5에 제시된 대표 데이터 세트는 기술적 3반복으로 분석된 단일 오가노이드-TIL 쌍을 반영합니다. 따라서 여기에 제시된 이원 반복측정 분산분석(two-way repeated-measures ANOVA)은 해당 개별 샘플 내의 분석 변동성을 나타내며, 환자 간 생물학적 변동성에 대한 평가로 해석해서는 안 됩니다. 각 연구에 필요한 독립적인 오가노이드-TIL 쌍의 수는 예상 효과 크기, 생물학적 변동성 및 실험 목적에 근거한 전향적 검정력 계산을 통해 결정해야 합니다. 분석 정밀도를 정량화하기 위해 기술적 반복군을 포함해야 하지만, 이를 독립적인 생물학적 반복군의 대체물로 간주해서는 안 됩니다.

본 프로토콜의 향후 수정 버전에는 T 세포 매개 세포독성을 조절하는 메커니즘을 분석하기 위해 면역 관문 억제제, 사이토카인 조절, 저분자 억제제 또는 유전적 섭동이 포함될 수 있습니다. 단일 세포 전사체 분석 또는 공간 이미지 기술과의 통합은 기전적 통찰력을 더욱 향상시킬 수 있을 것입니다. 또한, 고처리량 384-웰 포맷으로 최적화하면 약물 스크리닝 응용이 가능해질 수 있습니다. 본 플랫폼은 다클론성 TIL 대신 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 치료제를 평가하는 용도로도 쉽게 전환할 수 있으며, 이 경우 공동 배양 전 PDTO에서 표적 항원 발현을 확인하고 표적 특이성을 검증하기 위해 항원 음성 오가노이드 대조군을 적절히 포함하기만 하면 됩니다18,19,20.

요약하자면, 본 프로토콜은 자가 종양 오가노이드를 대상으로 TIL 매개 세포독성을 실시간으로 측정할 수 있는 정량적 이미지 기반 방법을 제공합니다. 오가노이드의 무결성에 대한 세심한 주의, 일관된 작동 세포 비율, 검증된 세그멘테이션 임계값 및 적절한 대조군 설정을 통해 신뢰할 수 있는 정량화를 보장합니다. 이 시스템은 종양 면역학, 면역 관문 조절, 입양 세포 치료 최적화 및 개인 맞춤형 기능적 면역 프로파일링 연구에 폭넓게 적용 가능합니다.

공개 사항

B.D.H.는 Faeth Therapeutics의 공동 설립자이자 컨설턴트입니다. O.E.는 Volastra Therapeutics와 Owkin의 지분을 보유하고 있으나, 이는 본 프로젝트와 관련이 없습니다. Faeth Therapeutics, Volastra Therapeutics 및 Owkin은 본 연구에 대해 자금, 재료, 장비, 소프트웨어, 지적 재산 또는 연구 설계에 관한 어떠한 지원도 제공하지 않았습니다. 나머지 저자들은 상충하는 이해관계가 없음을 밝힙니다.

AI 사용 공개:
본 저작물을 준비하는 과정에서 저자는 언어 교정을 위해 Claude를 사용하였습니다. 해당 도구/서비스를 사용한 후, 저자는 내용을 검토하고 필요한 경우 수정하였으며, 출판된 논문의 내용에 대해 모든 책임을 집니다.

감사의 글

저희는 너그러운 지원과 기관 리소스 제공에 대해 Weill Cornell Medicine의 Englander Institute for Precision Medicine에 깊은 감사를 표합니다. 본 연구는 또한 Olivier Elemento와 Benjamin D. Hopkins에게 수여된 MERIT Program Gift / The Medical Excellence Foundation, Inc. (award# 61500857)의 지원을 받았습니다. 펀딩 기관은 연구 설계, 데이터 수집, 분석 또는 원고 작성에 관여하지 않았습니다. Noggin 및 R-Spondin을 분비하는 HEK293T 생산 세포주는 Yu Chen 교수 연구실(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)에서 제공받았으며, 이전에 기술된 방식대로 생성되었습니다21.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원추형 튜브Corning430791세포 수집 및 원심분리
6-웰 비조직 배양 처리 플레이트Greiner Bio-One6571853D 오가노이드 플레이팅 및 확장
A-83-01 (TGF-beta 억제제)Tocris Bioscience2939완전 오가노이드 배지
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010배지 성분
B27 보충제 (50X), 무혈청Thermo Fisher Scientific17504044완전 오가노이드 배지
검은색 벽, 96-웰 광학 바닥 마이크로플레이트, black, TC 표면Nunc165305사멸 분석용 살아있는 세포 이미징 플레이트
세포 회복 솔루션 (Cell Recovery Solution)Corning3542533D 오가노이드 구조를 유지하면서 Matrigel을 저온 용해
CellTrace Far Red 세포 증식 키트Thermo Fisher ScientificC34564종양 세포의 형광 표지 (적색 채널)
II등급 생물안전 작업대 (Class II Biosafety Cabinet)Thermo Fisher Scientific1375 (1300 Series A2, 4 ft)BSL-2 조건 하의 무균 취급
CO2 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2, 습윤)Thermo Fisher Scientific51030400 (Heracell VIOS 160i)오가노이드 확장 및 공동 배양 배양
Countess 3 자동 세포 계수기Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)AMQAX2000자동 세포 계수/생존율 측정 (Countess 슬라이드 C10312와 함께 사용)
Countess 계수 슬라이드 (또는 혈구계수기)Thermo Fisher ScientificC10312자동 세포 계수
디메틸 설폭사이드 (DMSO), 멸균Sigma-AldrichD2650CellTrace Far Red 염료 재구성
Dulbecco의 인산 완충 식염수 (PBS), 1X, Ca2+/Mg2+ 제외Corning21-040-CVR계수 및 염료 표지를 위한 세포 재현탁
소 태아 혈청 (FBS), 열 불활성화Thermo Fisher Scientific16140071배지 성분
GlutaMAX-I 보충제 (100X)Thermo Fisher Scientific35050061배지 성분
GraphPad Prism (v10.6.1)GraphPad Software / DotmaticsVersion 10.6.1통계 분석 (이원 반복측정 ANOVA) 및 그래프 작성
HEK293T 생산 세포주 (Noggin 및 R-Spondin 분비)Yu Chen Lab, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)Gift (see Gao et al., Cell 2014)조건화 배지 생산 (섹션 0.2); Yu Chen Lab (MSKCC)에서 제공; Gao et al., Cell 2014, DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.016에 따라 생성됨
HEPES (1 M 용액)Thermo Fisher Scientific15630080배지 성분
인간 재조합 FGF-10Thermo Fisher ScientificPHG0204완전 오가노이드 배지
인간 재조합 FGF-Basic (FGF-2)Thermo Fisher ScientificPHG0261완전 오가노이드 배지
Incucyte 기본 소프트웨어 (v2024B)SartoriusIntegrated software v2024B이미지 획득 일정 계획 및 자동 분할/분석
Incucyte S3 살아있는 세포 분석 시스템Sartorius4647살아있는 세포 이미징 장치 (37 °C, 5% CO2); 위상차 + 이중 형광 획득
도립 위상차 / 형광 현미경NikonEclipse Ts2-FL오가노이드 QC 및 시각적 분할 확인
실험실 냉동고 (−20 °C / −80 °C)Thermo Fisher ScientificTSX40086A (TSX Series −86 °C)성장 인자 및 조건화 배지 분주액 보관
실험실 로커 / 흔들림 플랫폼 (4 °C 호환)Benchmark ScientificB3D2300 (BenchRocker 3D)저온 세포 회복 솔루션에서의 매트릭스 용해 (섹션 2.1)
Matrigel 기저막 매트릭스, 성장 인자 감소Corning356231오가노이드 임베딩 및 확장을 위한 3D 매트릭스
마우스 재조합 EGFPeproTech315-09완전 오가노이드 배지
N-아세틸시스테인 (N-Acetylcysteine)Sigma-AldrichA9165완전 오가노이드 배지
니코틴아미드 (Nicotinamide)Sigma-AldrichN0636완전 오가노이드 배지
Noggin (조건화 배지 또는 재조합)실험실 준비 분주액—완전 오가노이드 배지
NRG1 (Neuregulin-1 / Heregulin)R&D Systems396-HB완전 오가노이드 배지
NucView 488 Caspase-3 기질 (200 µM 스톡)Biotium30029caspase-3 활성의 실시간 검출 (세포 사멸 판독, 녹색 채널)
페니실린-스트렙토마이신 솔루션 (100X)Thermo Fisher Scientific15140122배지 성분
PGE2 (Prostaglandin E2)Sigma-AldrichP0409완전 오가노이드 배지
PrimocinInvivoGenant-pm-1완전 오가노이드 배지
냉장 원심분리기 (스윙 버킷, 300 × g, 4 °C)Eppendorf022628187 (Centrifuge 5810 R, A-4-62 rotor)분해 및 세척 원심분리 단계
RPMI 1640 배지Thermo Fisher Scientific11875093T-세포 재현탁을 위한 기본 배지
R-Spondin (조건화 배지 또는 재조합)실험실 준비 분주액—완전 오가노이드 배지
SB202190 (p38 MAPK 억제제)Sigma-AldrichS7076완전 오가노이드 배지
스타우로스포린 (Staurosporine)Sigma-AldrichS4400양성 사멸 대조군; caspase 기질 기능을 확인하기 위한 전-세포사멸제
Stericup 멸균 진공 여과 시스템 (0.22 µm)MilliporeSigma (Merck)S2GPU05RENoggin 및 R-Spondin 조건화 배지의 여과/생산 (섹션 0.2)
멸균 세포 스크래퍼 (Sterile Cell Scraper)Corning3008Matrigel 돔의 기계적 파괴
트리판 블루 솔루션, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061염료 배제법을 통한 생존율 평가
TrypLE Express 효소 (1X)Thermo Fisher Scientific12604021Matrigel 및 오가노이드의 효소적 분해
항온수조 (37 °C)Thermo Fisher ScientificTSGP05 (Precision GP 05)효소적 분해 및 배지 가온
Y-27632 (ROCK 억제제)Sigma-AldrichY0503완전 오가노이드 배지

참고문헌

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