오비트랩 질량분석기와 결합된 해착 전기분무 이온화를 이용한 단세포 질량분석법 영상

요약

이 프로토콜은 탈착 전기분무 이온화와 Orbitrap 질량분석기를 결합하여 고공간 해상도 대사체 분석을 위한 OVCAR-8 세포의 단일 세포 질량분석법 영상을 설명합니다.

초록

탈착 전기분무 이온화-질량분석법(DESI–MSI)은 최소한의 샘플 준비로 대기체가 없는 분자 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 DESI를 Orbitrap 질량분석기와 결합하여 OVCAR-8 셀의 단일 셀 MSI 워크플로우를 설명합니다. 이 시스템은 DESI 분무기, 수정된 질량분석기 인터페이스, 모터 구동 XYZ 스테이지, 그리고 고해상도 이미징을 위한 광학 브레드보드를 통합합니다. 세포는 격자형 유리 덮개 위에 배양되고, 염분 간헐을 줄이기 위해 암모늄 포마트 용액으로 세척한 후 건조된 후 상온 조건에서 분석합니다. 용매는 나노-액체 크로마토그래피 시스템을 통해 연속적으로 공급되며, 질소 가스의 네뷸라이징은 분무 안정성을 유지하기 위해 조절됩니다. 프로토콜은 또한 단일 셀 위치 지정을 위한 래스터 이미징, 픽셀 제어, 광학-질량 분석법 이미지 등록도 설명합니다. Orbitrap 검출이 제공하는 높은 질량 해상도와 질량 정확도는 밀접한 분자 종의 구분을 가능하게 하고 단일 세포 대사체 분석을 지원합니다. 이 프로토콜은 여러 Orbitrap 질량분석기 플랫폼을 사용하여 고공간 해상도 단일 셀 MSI를 구현하는 데 적응 가능한 전략을 제공합니다.

서론

대사체학은 생물^{학적 시스템의 기능} 상태를 반영하는 소분자 대사산물을 포괄적으로 특성화하고자 ^합니다. 대사산물은 효소 활성의 직접적인 산물이기 때문에 세포 표현형과 생화학적 조절에 대한 동적 판독을 제공합니다. 그러나 기존의 대사체 워크플로우는 일반적으로 수천에서 수백만 개의 세포에서 신호를 평균화하는 대량 추출 방법에 의존하여 세포 이질성을 가립니다 ^6,7,8.

단세포 대사체학은 개별 세포 수준에서 분자 프로파일링을 가능하게 하여 복잡한 집단 내 대사 다양성을 드러내고 질병 진행, 약물 반응, 세포 분화에 대한 기전적 이해를 개선함으로써 이러한 한계를 해결합니다. 질량분석법(MS)은 생물학적 샘플의 분자 분석에 필수적인 도구입니다. 최근 MS 기법의 발전, 샘플 준비, 기기 설치, 데이터 분석 등으로 MS 대사체학 연구가 단일^{세포 수준에서} 수행될 수 있게 ^{되었습니다.}

MS 영상(MSI)은 생물학적 샘플의 공간적으로 분해된 분자 분석을 가능하게 하며, 샘플 표면^{12, 13, 14} 전반에 걸쳐 각 정의된 공간 좌표에서 전체 질량 스펙트럼을 획득하여 정밀 샘플 운동, 최소 샘플링, 효율적인 이온화, 데이터 시각화를 통합합니다. MS 이미지는 x–y 좌표 전반에 걸쳐 선택된 질량-전하비(m/z) 값의 세기를 그래프로 표시하여 복원하여, 복잡한 생물학적 시스템 12,13,15,16,17,18 내에서 화학 공간 정보를 보존합니다. 공간적으로 해상도된 단세포 대사체학을 달성하려면 분자 위치를 보존하면서도 충분한 감도와 질량 해상도를 유지하여 저품도 종을 검출할 수 있는 분석 플랫폼이 필요합니다^{9, 12, 19, 20}.

단일 셀 MSI는 개별 셀의 직경이 일반적으로 5에서 20 μm 사이이기 때문에 추가적인 도전 과제가 있습니다 ^8,21. 이 공간 규모에서 샘플링 이벤트별 분석된 풍부도는 극히 제한적입니다. 따라서 샘플 움직임의 정확한 제어, 샘플링 최소화, 높은 이온화 효율, 효율적인 이온 전달 등 여러 요소가 개별 세포에서 해석 가능한 분자 정보를 얻는 데 필수적입니다^14,22. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)–MSI는 고공간 해상도 MSI 연구에 일상적으로 사용되는 진공 기반 기법으로, 매트릭스 증착과 진공 작동이 필요합니다; 그러나 MALDI에서의 매트릭스 결정화는 분석물의 탈국소화와 변이성을 단일 세포 규모인^{23, 24, 25, 26, 27}에서 도입할 수 있습니다. 반면, 대기 MSI 접근법은 주변 조건에서 작동하며, 샘플은 거의 또는 전혀 필요하지 않아 거의 원래의 화학 상태를 유지합니다. 상위음 MSI 방법 중에서는 DESI²⁸, nano-DESI²¹, 공압 보조 나노-DESI²⁹, 단일 프로브 8,30,31,32,33,34,35가 단일 세포 MSI 연구에 사용된 바 있습니다. 나노-DESI, 공압 보조 나노-DESI, 단일 프로브 등 마이크로 액체 추출 기반 기법은 높은 샘플링 및 이온화 효율을 제공하지만, 샘플링 프로브 끝에서 안정적인 액체 다리를 유지하는 데 의존하는 반면, 표면 형태 변화나 프로브 막힘과 같은 액체 다리의 교란은 MSI 실험의 품질에 영향을 줄 수 있습니다 ^{5,8, 21, 30, 35}.

DESI는 전하를 띤 용매 방울이 표면에 충돌하여 분석 물질을 추출하고, 이온화된 종^을 포함한 2차 방울을 생성하는 주변 이온화 기법입니다. DESI는 비접촉적이고 막힘 없는 샘플링을 제공하며, 래스터 기반 영상 워크플로우와 호환되어, 고해상도 Orbitrap 플랫폼 20,37,38,39,40과 결합할 때 광학 식별 단일 세포의 고해상도 다이온 분자 매핑에 적합합니다. DESI는 조직 영상에 널리 사용되지만, 기술적 어려움 때문에 단일 세포 MSI에는 거의 적용되지 않았습니다^20,28. 최근 Waters DESI XS와 SELECT SERIES 순환 IMS 질량분석기를 결합한 상업적 설비를 사용한 연구들은 여러 세포주에 대해 단일 세포 해상도를 달성할 수 있음을 입증했습니다. DESI–MSI에서 높은 공간 해상도를 달성하려면 이온화 효율, 이온 투과, 획득 속도, 분무기 정렬^{12, 20, 28}의 조정된 제어가 필요합니다. 특히, DESI XS와 탈착 전기흐름 집중 이온화(DEFFI)를 포함한 신세대 DESI 분무기 설계의 발전으로 샘플링 면적이 크게 줄었습니다^41,42. 또한, 나노-액체 크로마토그래피(LC) 펌프가 제공하는 분당 나노리터 유량과 같이 용매 유량을 줄이면 공간 구속이 크게 개선되어 단일 세포 분자 경계²⁸을 달성할 수 있습니다. 이 방법은 단일 셀 해상도 MSI를 달성했지만, 특정 공급업체(워터스)의 계측에 의존합니다. 따라서 단일 셀 DESI–MSI의 광범위한 구현은 Orbitrap 시스템과 같은 널리 사용 가능한 고해상도 질량분석기와 통합되어 높은 감도, 질량 정확도, 해상도를 제공하는 전략이 필요합니다. DESI와 Orbitrap 질량분석기를 결합하면 복잡한 세포 추출물 20,43,44에서 밀접하게 배치된 등압 종의 분화를 포함한 단일 세포 MSI 연구에 새로운 기회를 제공합니다.

이 프로토콜은 Waters DESI XS 분무기를 Orbitrap 질량분석기와 통합하여 단일 세포 MSI 연구를 위한 모듈식 전략을 설명합니다. 워크플로우는 세포 부착 및 광학 상관을 위한 격자 커버슬립, 제어된 래스터 스캔을 위한 모터 구동 XYZ 단계, 안정적인 분무 형성을 위한 나노 규모 용매 전달, 고해상도 오비트랩 탐지를 통합합니다. 플랫폼으로 Thermo Orbitrap Tribrid Lumos 질량분석기가 선택되었지만, 호환되는 소스-인터페이스 형상을 갖춘 많은 다른 Orbitrap 질량분석기 모델도 적절한 기계적 적응 및 최적화 후 유사한 맞춤형 DESI XS 구성과 결합될 가능성이 있습니다.

프로토콜

OVCAR-8 세포는 미국 유형 배양 컬렉션(ATCC)에서 획득했습니다. 모든 세포 배양 절차는 기관 생물안전 지침에 따라 수행되었습니다. 제조사의 지침에 따라 마이코플라즈마 검출 키트를 사용해 세포 오염 여부를 정기적으로 검사했습니다.

참고: 모든 절차는 기관 생물안전 지침에 따라 수행하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 화학 연기 후드에서 유기 용매를 다루세요.

1. 격자형 커버슬립에 OVCAR-8 세포를 배양 및 준비한다

1. RPMI-1640 배지를 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 완전한 배지를 준비하세요. 매체를 37°C로 데우세요.
2. OVCAR-8 세포를 10cm 크기의 배양 접시에 10mL 완전 배지를 보관합니다. 세포를 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
3. 배양 표면의 약 80%가 부착 세포로 시각적으로 차지될 때, 일반적으로 2일마다 이 배양 조건에서 세포를 전달합니다.
   1. 10cm 배양 접시에서 배지를 흡인한 후 1× 인산염 완충 식염수 5mL로 세포를 한 번 헹군다.
   2. 배양 접시에 0.25% 트립신-에틸렌디아미네테트라아세트산 2mL를 첨가합니다. 세포를 37°C에서 약 3분간 배양하거나, 현미경으로 검사할 때 대부분의 세포가 배양 표면에서 눈에 띄게 분리될 때까지 보관합니다.
   3. 트립신을 중화시키기 위해 미리 데운 완전 배지 8mL를 접시에 넣으세요. 10 mL 혈청학적 피펫을 사용해 세포 현탁액을 약 15–20회 부드럽게 위아래로 움직여 세포를 분산시킵니다.
   4. 현탁액 1mL를 신선한 완전 배지 9mL에 옮깁니다.
   5. 자동 셀 카운터를 사용해 셀 수를 세세요. 재현탁된 셀 현탁액 10 μL를 추가 희석 없이 카운팅 슬라이드에 직접 주입하고, 제조사 지침에 따라 셀 카운팅을 수행합니다.
      참고: 이 프로토콜에서는 트리판 블루와 같은 세포 생존성 염료가 사용되지 않았습니다. 트립신화 전 세포 형태와 부착 상태를 관찰하여 시각적으로 세포 상태를 평가합니다.
4. 표지에 세포를 뿌려.
   1. 완전한 배지를 사용해 세포를 최종 농도인 ~1 ×^{10 6} cells/mL로 희석합니다. C ₁은 집계된 셀 농도, V 1은 필요한 셀 현탁액, C₂는 목표 농도, V 2는 목표 농도, V₂는 원하는 최종 부피를 사용하여 필요한 셀 현탁 부피를 계산합니다.
   2. 50 μm 격자 간격의 28mm 격자 유리 커버슬립을 6웰 플레이트의 웰에 배치합니다.
      참고: 세포 배양 사용 전에 유리 커버슬립을 오토클레이브하세요. 격자 쪽을 아래를 향하게 하여 세포 성장에 방해를 최소화하세요.
   3. 각 웰에 완전 배지 2mL와 세포 현탁액 200 μL(~2 ×^{10 5} 셀/웰)을 추가합니다. 6웰 플레이트를 'X'자 모양으로 부드럽게 흔들어 셀들이 커버슬립 표면에 고르게 분포되도록 하세요.
   4. 세포를 약 15–20시간 배양하여 세포 부착을 가능하게 합니다.
      참고: 세포 성장을 정상적으로 확인하기 위해 현미경을 이용해 정기적으로 세포 형태를 관찰하세요. 세포가 잘 성장하지 않는다면 마이코플라즈마 검출 키트를 사용해 잠재적인 마이코플라즈마 오염 가능성을 검사하세요.

2. 암모늄 포마테(AF) 용액을 이용한 세포 세척

참고: 사용 전에 신선한 AF 용액을 준비하세요.

1. 사용 직전에 등장성 AF 세척 완충제를 준비하세요. AF 0.45g을 무게로 측정하고 LC/MS 등급의 물 50mL에 녹여 최종 AF 농도인 0.14 M(0.9% w/w)을 준비합니다. pH ^5.45는 조절하지 마세요.
   참고: 준비 당일에 신선하게 준비한 AF 용액을 사용하세요. 사용 전까지 용액을 얼음처럼 차갑게(0°C–4°C) 보관하세요.
2. 6웰 플레이트의 각 웰에서 배양 배지를 흡인하세요. 즉시 각 웰에 2mL의 냉액을 추가하세요.
3. 멸균 겸자를 사용해 세포가 부착된 각 덮개를 부드럽게 웰에서 들어 올리면서, 세포로 코팅된 표면을 위로 향하게 유지합니다. 커버슬립을 2–3초간 잠시 별도의 웰에 넣어 2mL의 차가운 0.9% AF 용액을 미리 채웁니다.
4. 각 헹구마다 신선한 AF 용액을 사용해 총 두 번 반복하세요. 최종 헹굼 후에는 AF 용액에서 커버슬립을 제거하고, 화학 훈제 후드에서 약 20–30분간 공기 건조한 후 DESI–MSI 분석을 진행합니다.
   참고: 세척 단계에서 세포를 자극하지 않도록 부드럽게 헹구세요.

3. 수정된 FAIMS 기반 MS 인터페이스 제작

1. FAIMS Pro 전극 이온 소스 하우징 어댑터를 분해하여 내부 전극 영역에 접근하세요. 어댑터가 FAIMS Pro 인터페이스 구성이 장착된 Thermo Orbitrap 질량분석기와 호환되는지 확인하세요.
2. 내부 전선, 전극 조립체, O-링 및 지지 내부 구조를 포함한 FAIMS 전극 부품을 제거하세요. 어댑터의 질량분석기 인식에 필요한 외부 하우징 쉘, 장착 플랜지, 인터페이스 검출 핀을 유지합니다.
3. 표준 기계 가공 절차를 사용하여 원형 개구부를 수정하세요. 돌출된 오비트랩 입구/이온 굴뚝 조립체 주변에 충분한 여유 공간을 제공할 때까지 개구부를 확장하세요.
4. 가공 후 가공된 가장자리를 매끄럽게 하고 버러를 제거하세요. 수정된 개구부가 질량분석기 내 하우징 어댑터를 방해받지 않고 위치시킬 수 있는지 확인해 주세요.
5. 하우징 어댑터의 두 다리 길이를 톱으로 조절하세요. 다리를 최종 길이 약 2 1/4인치로 다듬어 광학 브레드보드와 연결할 수 있게 하세요.
   참고: 적절한 가공 도구를 사용하며 남은 하우징의 구조적 완전성을 손상시키지 않도록 주의하세요.
6. 알루미늄 광학 브레드보드(10인치 × 12인치 × 0.5인치, 1/4인치-20 탭 구멍)을 준비하세요. 브레드보드를 수정된 FAIMS 어댑터 아래에 수평으로 위치시킵니다.
7. 수정된 FAIMS 어댑터를 광학 브레드보드에 연결할 때 두 개의 장착 브래킷을 사용하세요. 무게를 줄이고 브레드보드를 오비트랩 인렛에 대해 적절한 위치에 놓을 수 있도록 필요에 따라 브래킷을 다듬으세요.
8. 수정된 FAIMS 인터페이스를 브레드보드의 1/4"-20 탭 구멍 패턴에 맞춘 기계적 호환 장착 하드웨어로 광학 브레드보드에 고정합니다. 영상 실험 중 안정적인 위치 확보를 보장합니다.
   참고: 무대 이동 및 데이터 수집 시 진동을 최소화하기 위해 인터페이스가 단단히 고정되도록 하세요.
9. FAIMS 하우징 접촉 영역 바로 아래에 광학 브레드보드에 얕은 홈을 가공하거나 절단합니다. 홈의 크기와 위치를 조정하여 수정된 FAIM 하우징이 오비트랩 흡입구에 대해 안정적으로 앉을 수 있도록 충분한 여유 공간을 제공합니다.
   참고: FAIM 하우징 어댑터의 바닥을 수용할 수 있도록 홈 크기를 조절하여 위치 재현성을 높이세요.
10. 장착된 인터페이스와 질량분석기 입구를 정렬하세요. 고정된 장착 플랜지가 기기에 제대로 위치하는지, 광학 브레드보드가 인터페이스 아래에서 수평을 유지하는지 확인하세요.
11. DESI 분무기를 설치하기 전에 수정된 원형 개구부가 Orbitrap 입구/이온 깔때기 조립체 주변에 방해받지 않는 여유를 제공하는지 확인하세요.

4. DESI 분무기와 오비트랩 인터페이스 조립

1. DESI 분무기를 맞춤형 FAIMS 프레임, 모터 구동 XYZ 스테이지, 가스 조절기, 광학 브레드보드로 구성된 통합 세팅에 장착하세요. CONEX-MFACC 컨트롤러로 제어되는 모터 스테이지를 사용하세요.
2. x축을 래스터 스캔 방향으로 정의하고, y축을 위에서 아래로의 라인-스텝 방향으로 정의합니다. 획득 전에 z축 위치를 설정하고 영상 촬영 중에는 고정하세요.
3. 스테이지 이동 범위는 약 1mm x 방향, 1 mm 정도의 거리를 사용하세요. 획득 중에는 z축 이동을 하지 마십시오.
4. DESI 분무기를 샘플 표면에 대해 약 70° 각도로 위치시킵니다. 샘플을 분무기 바로 아래에 놓고, 분무기 팁을 물리적 접촉 없이 오비트랩 입구 가까이에 위치시키세요.
5. DESI 접지 금속을 질량분석기 아래의 접지원에 연결합니다. 스테이지 제어 소프트웨어를 사용해 래스터 이동을 제어합니다(그림 1).
   참고: 본 연구에 사용된 DESI 분무기는 DESI–MSI 기기 사용자에게만 제공됩니다.
6. 무대 이동과 위치 조정을 위해 모터가 달린 XYZ 스테이지 컨트롤러를 사용하세요. 작동하기 전에 전압선, 질소 가스 라인, 용매 라인, 접지선을 연결하세요.
7. Orbitrap 이온 소스 입구와 일치하도록 설계된 맞춤 제작된 스테인리스 이온 전송관(1/16인치 외경 × 0.033인치 내경)을 설치하세요. 이온 전송관을 오비트랩 입구와 직접 정렬하되, DESI 플룸 접근이 방해받지 않도록 충분히 바깥쪽으로 확장되도록 위치시키세요.
   참고: 질량분석기 구성에 따라 이온 전달관을 맞춤 설정하세요. 적절한 가공 절차를 사용하여 이온 전달관을 제작하세요.
8. DESI 분무기의 시료 표면과 오비트랩 입구에 대한 위치 조정을 개선하기 위해 구부러진 기하학적 이온 전송 튜브를 사용하세요.
9. 분사기를 샘플 표면에 대해 약 70° 각도로 정렬하여 DESI 분무 플룸이 샘플 표면과 접촉하지 않고 오비트랩 입구 영역과 교차하도록 하세요.
10. 획득 시 안정적인 질량 스펙트럼과 일관된 정규화 수준(NL) 값의 존재를 통해 안정적인 분무 플룸을 정의합니다. 분사기 위치를 조절하여 안정적인 이온 신호가 관찰됩니다.
11. 분무기와 표면 사이의 거리를 시작 조건으로 약 1.0–1.5 mm로 설정하세요. NL 값을 모니터링하면서 스프레이어 위치를 수동으로 미세 조정하여 가장 안정적인 이온 신호를 얻으세요.

그림 1. 통합 탈착 전기분무 이온화(DESI)-질량분석기(MSI) 장비를 Orbitrap 질량분석기와 결합했습니다. DESI 분무기는 수정된 고장 비대칭 이온 이동성 분광기(FAIMS)  어댑터, 모터 구동 XYZ 스테이지, 가스 조절기, 광학 브레드보드로 구성된 통합 플랫폼에 장착되어 있습니다. 용매는 나노-액체 크로마토그래피 시스템을 사용해 공급되며, 분무 안정화를 위해 약 12 psi의 질소 가스가 공급됩니다. 그림은 또한 이온화 전압 연결, 용매 라인, 그리고 분무기의 오비트랩 입구 위치 기준을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

5. 용매 전달 및 분사 조건 설정

1. DESI–MSI 분석 전에 메탄올/물/개미산(98:2:0.1, v/v/v)으로 구성된 신선한 분무 용매를 준비합니다.
   참고: 최적화 후에는 아세토니트릴 기반 용매 및 다양한 메탄올/물 비율 등 DESI 호환 용매 시스템을 사용할 수 있습니다. 메탄올/물/개산(98:2:0.1, v/v/v)은 이 프로토콜에서 표준 시작 조건으로 사용되었는데, 이는 안정적인 플룸 형성, 용매 확산 감소, 단일 세포 DESI–MSI 실험 중 재현 가능한 양이온 모드 지질 신호를 제공했기 때문입니다.
   주의: 메탄올은 가연성이며 독성이 있습니다. 개미산은 부식성이 있습니다. 용매는 화학 연기 후드에서 다루세요.
2. 보고된 실험에서 Ultimate 3000 나노-LC 시스템을 사용하여 이소크라틱 용매 펌프로 작동하여 750 nL/min으로 운용했습니다. 나노-LC 콘센트를 PEEK 튜브(외경 1/16인치 × 내경 0.005인치)로 DESI 분무기에 연결하세요.
3. C18 컬럼(예: nanoEase M/Z 펩타이드 BEH; 130 Å, 1.7 μm, 300 μm × 150 mm)을 직렬로 설치하여 저유량에서 안정적인 분사 형성을 위한 충분한 배압을 제공합니다.
4. 질량분석기 방식을 양이온 모드로 설정하고, 오비트랩 검출, 0.85 kV의 분무 전압, m/z 200에서 오비트랩 해상도 120,000, m/z 범위 150–1200으로 설정합니다.
5. 정규화된 AGC 타겟을 100%, 최대 주입 시간을 100ms, RF 렌즈를 45%, 마이크로스캔을 1로 설정하세요. 쿼드러폴 격리와 소스 단편화를 비활성화하세요.
6. 질소 발생기나 액체 질소원에서 약 12psi의 질소 가스를 공급하여 DESI 분무 플룸을 안정화합니다. 시작 작동 압력은 12 psi를 사용하고, 필요할 때만 소폭 수동 조정을 하여 NL 값을 개선하고 질량 스펙트럼을 안정적으로 유지하세요.

6. 래스터 이미징 및 픽셀 제어 수행

1. 격자형 커버슬립을 기준으로 광학 가시 단일 셀이 포함된 관심 영역을 식별합니다. 이웃 세포와 명확한 시각적 분리, 형태가 온전하고 잔해나 세포 군집과 명확한 겹침이 없는 분리된 세포를 선택하라.
2. Fance Stage Controller 소프트웨어⁴⁶을 사용하여 래스터 영역을 정의합니다. 래스터 스텝 사이즈는 0.01 mm, 스테이지 속도는 0.01 mm/s, 드웰 시간은 20초로 설정하세요.
3. 각 선을 좌우로 래스터 스캔한 후 y 방향으로 다음 선으로 이동하는 방식을 사용하세요. 래스터 라인 간의 직교 스텝 크기를 10 μm로 설정하세요.
4. 오비트랩 획득 속도에 따라 단계 속도를 조정하여 원하는 스캔 방향 픽셀 크기(예: 약 2.5–6.5 μm)를 달성합니다. 스캔 방향 픽셀 치수는 다음 관계를 사용하여 계산합니다: 스캔 방향 픽셀 치수 = 단계 속도× 스캔당 획득 시간.
5. 0.01 mm/s(10 μm/s)의 스테이지 속도를 사용하여 102초 동안 376회의 스캔을 획득하면 스캔당 0.271초의 획득 시간과 약 2.7 μm의 스캔 방향 픽셀 크기를 얻습니다. 오비트랩 획득 타이밍을 단계 이동과 거주 타이밍의 합산 파라미터보다 약간 짧게 설정하여 단계 이동과 질량 스펙트럼 획득을 동기화합니다.
   참고: 직교 픽셀 치수는 프로그래밍된 스텝 크기와 스테이지의 물리적·기계적 한계에 의해 결정되며, 스캔 방향 디멘트는 스테이지 속도와 스펙트럼 획득 속도에 의해 결정됩니다.
6. 미리 정의된 래스터 영역이 완성될 때까지 선택한 질량 범위 내에서 영상 데이터를 획득합니다. 0.01 mm 라인 스텝과 0.01 mm/s 스테이지 속도를 사용하여 획득한 1 mm × 1 mm 영상 영역의 경우 총 획득 시간은 약 4–5시간입니다.
7. 획득 시 RAW 데이터 파일을 생성하고, 지정된 x–y 래스터 좌표와 해당 기기 방법 시간을 완료하면 획득을 중단합니다. 여기서 설명한 양의 이온 모드 조건 하에서, 각 래스터 라인은 일반적으로 약 50MB 크기의 RAW 파일을 생성하며, 총 101개의 래스터 라인에 대해 약 5GB의 데이터를 생성합니다.

7. 광학에서 MS로 이미지 등록

1. AF 세척 및 건조 후 DESI 획득 전 10× 대물렌즈가 장착된 밝시야 현미경을 사용해 선택한 격자 영역의 밝시야 이미지를 촬영합니다.
2. ProteoWizard⁴⁸의 msConvert를 사용해 RAW 파일을 mzML 파일로 변환하세요. imzML Converter⁴⁹를 사용해 mzML 파일을 imzML 형식으로 변환하세요.
3. 획득한 데이터 형식에 맞는 중심/프로필 변환 설정을 사용하세요. 이미지 시각화를 위해 imzML 파일을 METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ 에 직접 업로드하세요.
4. 시각화 전에 정규화, 핫스팟 제거 또는 추가 이미지 처리 보정을 적용하지 마십시오. 격자 랜드마크를 위치 기준으로 사용해 광학 및 MS 이미지를 수동으로 정렬하세요.
5. 알려진 이미지 크기와 격자 간격을 사용하여 광학 이미지를 축소합니다. MS 이미지를 수동으로 겹쳐 광학 가시 세포 위치와 국소화된 이온 신호 간의 대응을 평가합니다.
6. 밝은 영역 이미지에서 분리된 세포와 해당 MS 이온 분포 간의 시각적 일치를 통해 단일 세포 위치 확인.

결과

이 프로토콜의 성공 실행은 광학적으로 식별된 단일 세포가 국소화된 분자 이온 신호와 공간적으로 대응하는 DESI–MSI 데이터셋을 생성합니다(그림 2). DESI–MSI 분석 전에 촬영한 밝은 필드 현미경 이미지는 개별 OVCAR-8 셀의 시각적 식별을 가능하게 하며, 격자형 커버슬립을 위치 기준으로 사용하여 광학 장비에서 MS로 이미지 등록을 용이하게 합니다. 대표적인 DESI–MSI 이온 이미지는 해당 밝은 영역 이미지에서 식별된 개별 세포와 공간적으로 상관관계가 있는 국소화된 이온 분포를 보여줍니다(그림 2A–2D).

그림 2. OVCAR-8 세포의 밝은 영역 현미경과 MSI 비교. (A) 10× 배율로 획득한 OVCAR-8 세포의 밝은 필드 현미경 이미지. (B–D) 5.5 μm × 10 μm 픽셀 크기의 DESI–MSI로 촬영된 MS 이미지입니다. 대표 이온 분포는 (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562, (D) m/z 788.616에 대해 나타난다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

개별 세포는 여러 지질 관련 이온과 소분자를 포함하는 완전한 질량 스펙트럼을 생성합니다. 단일 분자 표지자에 의존하는 대신, 각 세포는 화학적 지문 역할을 하는 다이온 분자 프로필을 보입니다. m/z 317.111, m/z 808.562, m/z 788.616의 대표 이온 이미지는 인접 세포 간에 분자 분포가 이질적으로 나타나며, 단일 세포 수준에서 측정 가능한 대사 이질성을 나타냅니다(그림 2B–2D). METASPACE 기반 주석은 m/z 808.562와 m/z 788.616에서 검출된 이온이 주로 인산티딜콜린과 인산틸레탄올라민 지질과 연관되어 있는 반면, m/z 317.111은 여러 후보 소분자 및 디펩타이드 관련 종과 연관되어 있음을 시사했다. 이 결과는 이 플랫폼이 상온 환경에서 광학적으로 식별된 단일 세포의 공간적으로 국소화된 분자 특징을 검출할 수 있음을 보여줍니다. 추가 결과, 잠정 주석이 달린 종, MS/MS로 확인된 종, 대표적인 MS 이미지, 질량 스펙트럼 등은 이전 연구에서 제공되었습니다²⁰.

통합된 DESI–MSI 플랫폼은 DESI 분무기, 수정된 FAIMS 어댑터, 모터 구동 XYZ 스테이지, 그리고 Orbitrap 입구 옆에 장착된 광학 브레드보드로 구성되어 있습니다(그림 1). 이 장치는 안정적인 용매 전달, 제어된 스테이지 이동, 그리고 DESI 분무 플룸과 질량분석기 입구의 정렬을 가능하게 하여 환경 단일 세포 영상 실험을 가능하게 합니다. 그림 3 에 표시된 맞춤형 이온 전달관은 DESI 소스 영역과 오비트랩 입구 간 이온 전달을 가능하게 합니다. 굽은 모세관 형상은 DESI 분사기를 시료 표면과 입구 영역에 대해 위치를 조정하면서도 이온 전달이 방해받지 않도록 돕습니다.

그림 3. Orbitrap MSI용 맞춤형 이온 전송관입니다. DESI 분무기를 Orbitrap Fusion Lumos 질량분석기에 연결하는 데 사용되는 맞춤 제작 이온 전달관 사진입니다. 그림은 주변 단셀 MSI 실험에서 이온 전달에 사용되는 휘어진 전이 모세관 형상과 장착 조립체를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4 는 광학 브레드보드와 모터 구동 XYZ 스테이지와 통합된 수정된 FAIMS 어댑터를 보여줍니다. 상단 모습(그림 4A)은 샘플 스테이지와 수정된 어댑터의 오비트랩 입구 위치 기준을 보여주며, 하단 뷰(그림 4B)는 영상 플랫폼을 지지하는 장착 브래킷과 단계 조립체를 보여줍니다. 통합 조립체의 기계적 안정성은 일관된 래스터 움직임을 유지하고 영상 획득 시 위치 이동을 최소화하는 데 중요합니다.

그림 4. 광학 브레드보드와 모터 구동 XYZ 스테이지와 통합된 수정된 고장 비대칭 파형 이온 이동도 분광법(FAIMS) 어댑터. (A) 오비트랩 흡입구와 샘플 단계 인접에 장착된 수정된 어댑터의 상단 모습. (B) 이미지 플랫폼을 지지하고 정렬하는 데 사용되는 수정된 브래킷, 광학 브레드보드, 모터 구동 XYZ 단계 조립체의 하단 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Orbitrap 검출이 제공하는 높은 질량 분해 덕분에 밀접하게 배치된 등압 지질 종을 구분할 수 있어, 저질량 해상도 시스템에 비해 분자 특이성과 이미지 대비가 향상됩니다. 단계 속도와 스펙트럼 획득 속도를 동기화함으로써 작은 픽셀 크기를 달성할 수 있습니다. 예를 들어, 빠른 획득 오비트랩 플랫폼과 최적화된 래스터 매개변수⁴²를 사용해 2.7 μm× 10 μm까지 픽셀 크기가 달성되었습니다. 고공간 해상도 영상은 인접한 세포의 분자 구분을 가능하게 하면서 인접한 세포 영역 간 신호 중복을 최소화합니다.

성공적인 DESI–MSI 실험은 안정적인 분무 조건, 래스터 라인 전반에 걸쳐 일관된 이온 강도, 광학 이미지 내 개별 세포에 대응하는 분자 신호의 공간적 위치 지정이 특징입니다. 최적이 아닌 실험은 확산된 이온 분포, 낮은 신호 강도, 일관성 없는 래스터 패턴, 불안정한 분무 형성, 부적절한 분사 정렬, 과도한 용매 확산, 채취 중 샘플 이동으로 인한 세포 위치 상실 등을 초래할 수 있습니다. 분무 정렬, 용매 유량, 스테이지 속도, 시료 위치 조정의 세심한 최적화는 단일 세포 영상 실험 중 공간 충실도와 이온 신호 안정성을 향상시킵니다.

토론

이 프로토콜은 정밀 단계 제어, 나노스케일 용매 전달, 광학 표적 지정, 고공간 해상도 질량 분석을 통합하여 고질량 해상도 Orbitrap 질량분석기를 사용하여 주변 단일 세포 DESI–MSI를 가능하게 합니다. 이 요소들의 결합은 역사적으로 단일 셀 수준에서 DESI–MSI 적용을 제한해온 여러 기술적 장벽을 해소합니다. 특히, 분무 안정성, 이온 전달, 획득 타이밍을 조율하여 개별 세포에 해당하는 극히 작은 샘플 부피에서 분자 신호를 신뢰성 있게 검출할 수 있게 합니다. 이 작업 흐름에서 성능을 결정하는 핵심 요인은 DESI 분사 플룸의 안정성과 밀집 상태입니다. 마이크로미터 규모의 공간 해상도에서는 용매 유량, 가스 압력, 분무기 위치의 작은 교란이 유효 샘플링 면적을 크게 변화시킬 수 있습니다. 적절한 배압과 결합된 나노스케일 용매 전달은 분무 안정성을 높이고 용매 확산을 줄여 공간적 정확도를 높입니다. 또한, 분사기와 표면의 거리와 각도를 일정하게 유지하는 것이 재현 가능한 이온화 효율을 위해 매우 중요합니다. 기하학적 미세한 편차조차도 특히 이질적인 세포 샘플을 분석할 때 신호 강도에 상당한 변동을 초래할 수 있습니다. 실제로는 DESI 분무 조건의 최적화를 얻는 과정에서 총 이온 전류, 스펙트럼 안정성, NL 값(일반적으로 약 10⁵–10⁶)을 모니터링하여 경험적으로 수행되었습니다. 재현 가능한 신호 품질은 분무기 위치, 용매 흐름 안정성, 가스 압력, 그리고 DESI 플룸의 오비트랩 입구 대비 정렬을 반복적으로 조정하여 달성되었습니다.

이온 전달 효율성은 단일 세포 규모에서 또 다른 주요 한계를 나타내는데, 이는 개별 세포 내에서 분석물의 풍부도가 본질적으로 낮기 때문입니다. 이러한 공간적 규모에서는 일부 구현에서는 효율적 이온 투과가 이온화 효율보다 더 큰 실질적 한계가 될 수 있는데, 이는 탈록된 이온의 극히 일부만이 질량 분석기 입구에 도달하기 때문입니다. 따라서 샘플링 영역에서 질량분석기 입구로 이온을 효율적으로 이동시키는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜에 사용된 수정된 FAIMS 하우징 어댑터는 DESI 분무원과 열질량분석기 간의 인터페이스를 제공하여 Orbitrap Tribrid, Exploris, Astral 시리즈 플랫폼 등 여러 기기 모델과의 호환성을 가능하게 합니다. 수정된 FAIMS 하우징 어댑터와 광학 브레드보드의 통합은 기계적 안정성을 제공하여 장시간 영상 실험 중 정렬 불량을 최소화합니다. 단계 움직임과 질량 스펙트럼 획득 간의 동기화는 높은 공간 해상도를 달성하는 데 똑같이 중요합니다. DESI–MSI에서는 스캔 방향의 픽셀 치수가 단계 속도와 획득 속도의 관계에 의해 결정되는 반면, 직교 차원은 프로그래밍된 스텝 크기에 의해 정의됩니다. 이 매개변수들을 정확히 제어하면 정밀한 샘플링이 가능합니다. 많은 포유류 세포가 일반적으로 직경 약 5–20 μm 사이이기 때문에, 인접 세포 간 신호 중첩을 최소화하고 분자 특징을 개별 세포 영역에 더 잘 위치시키기 위해 몇 마이크로미터에 가까운 픽셀 크기가 필요합니다. 하지만 명목상 픽셀 크기가 반드시 실제 샘플링 풋프린트와 일치하지는 않는데, 용매 플룸과 시료 표면의 상호작용으로 인해 인접한 픽셀 간 측면 확산과 부분 신호 중첩이 발생할 수 있기 때문입니다. 따라서 보고된 픽셀 치수는 엄격한 기하학적 정의보다는 효과적인 공간 해상도의 맥락에서 해석되어야 합니다. 이 연구에 사용된 맞춤형 이온 전달관은 표준 이온 전달관의 기하학에 따라 설계되어 이온 투과 특성을 보존하면서도 DESI 소스 구성과의 통합을 가능하게 했습니다.

오비트랩 질량분석기가 제공하는 높은 질량 분해력과 질량 정확도는 개별 세포 내에 존재하는 복잡한 대사산물과 지질 혼합물을 해독하는 데 필수적입니다. 많은 분자 특징은 정확한 질량 측정과 METASPACE 분석을 통해 잠정적으로 주석이 달렸습니다. 여러 후보 할당이 단일 측정된 m/z 값에 대응할 수 있기 때문에, 추가적인 MS/MS 검증 및 직교 분자 확인 전략은 향후 연구에서 분자 식별을 더욱 강화할 수 있습니다. 양이온 모드에서는 DESI 스펙트럼이 종종 밀접하거나 등압 m/z 값을 가진 인지질 종이 우세합니다. 고해상도 오비트랩 검출은 이들 종의 구분을 가능하게 하여 분자 특이성을 높이고 스펙트럼의 모호성을 줄입니다. 이 능력은 제한된 수의 이온에 의존하는 단일 세포 분석에서 특히 중요하며, 이는 세포 이질성에 대한 오해로 이어질 수 있습니다. 이러한 적응성은 유사한 전략이 적절한 수정을 통해 대응하는 인터페이스를 사용하는 다른 질량분석 플랫폼에도 적용될 수 있음을 시사합니다. 이러한 장점에도 불구하고 여러 가지 제한점이 고려해야 합니다. 첫째, 현재 작업에 사용되는 DESI 소스는 DESI–MSI 시스템 사용자에게만 제공되며, 따라서 DESI 분무기/Orbitrap 시스템의 제작은 DESI 소스 가용성에 의해 제한될 수 있습니다. 그러나 DEFFI를 포함한 대체 DESI 장치도 고해상도 MSI 연구에 적용될 수 있습니다^42,47. 둘째, 이 플랫폼의 구현에는 계측기 인터페이스의 가공과 장착 부품의 제작을 포함한 상당한 맞춤화가 필요합니다. 이러한 요구사항은 기기 개발이나 기계 제작 경험이 없는 실험실의 접근성을 제한할 수 있습니다. 현재 구현에서는 FAIM 인터페이스 하우징이 DESI 분무기 조립체를 Orbitrap 입구에 대해 위치시키는 편리한 기계적 장착 플랫폼 역할을 했습니다. 따라서 FAIMS 호환 Orbitrap 시스템과 기본 가공 지원을 갖춘 실험실에서는 설명된 구성의 구현이 더 실용적입니다. 그러나 DESI 소스를 오비트랩 인렛에 기계적으로 결합하는 더 넓은 개념은 FAIM 인터페이스 하드웨어를 수정하지 않고도 대체 설계를 통해 달성할 수 있습니다. 셋째, 낮은 용매 유량은 공간 가두기를 개선하지만, 전체 이온 수율을 감소시킬 수 있어 감도와 공간 해상도의 균형을 맞추기 위한 세심한 최적화가 필요합니다.

또 다른 중요한 고려사항은 샘플링 중 분석물의 비국재화 가능성입니다. DESI는 상온 조건에서 작동하며 매트릭스 적용이 필요하지 않지만, 용매 방울과 시료 표면의 상호작용은 특히 고용해성 종의 경우 분석 물질의 재분포를 초래할 수 있습니다. 따라서 용매 부피를 최소화하고 분무 조건을 최적화하는 것이 단일 세포 수준에서 공간적 무결성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 마찬가지로, 등장성 암모늄 포마트를 이용한 세척 절차는 세포의 무결성을 유지하고 세포 종을 보존하면서 염분 관련 이온 억제를 줄이면서도 단일 세포 MS 워크플로우에서 이전에 보고된 바와^{같습니다.}

향후 개발은 이 플랫폼의 성능과 적용 가능성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 예를 들어, 더 빠른 데이터 수집 시스템과의 통합은 더 작은 유효 픽셀 크기와 더 높은 처리량의 MSI 실험을 가능하게 할 수 있습니다. 자동 정렬 시스템이나 실시간 피드백 제어의 구현은 변동성을 줄이고 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 이 접근법을 형광 영상이나 표적 표지 전략과 같은 보완적 기법과 결합하면 세포 유형 식별을 향상시키고 다중 모달 분석을 가능하게 할 수 있습니다.

기술적 고려를 넘어, 이 플랫폼은 생물학 및 생의학 연구에 광범위한 영향을 미칩니다. 주변 조건에서 개별 세포 수준에서 분자 프로파일을 특성화할 수 있는 능력은 복잡한 시스템에서 세포 이질성을 연구하는 새로운 기회를 제공합니다. DESI–MSI는 이미 종양 미세환경, 신경학적 질환, 숙주-병원체 상호작용, 약물 내성 세포 집단 연구에 조직 수준에서 성공적으로 적용되었습니다 12,15,16,35. DESI–MSI를 단일 세포 수준으로 확장하면 인접 세포 간 국소화학적 이질성을 구분하고, 희귀 세포 아집단을 식별하며, 대량 조직 측정에서 가려질 수 있는 분자 표지자를 발견하는 능력을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 그러나 본 연구는 단순화된 단일층 세포 배양 모델을 사용하여 수행되었으며, 다양한 세포 모델, 조직, 오가노이드, 3D 배양 등 다른 복잡한 생물학적 시스템과의 호환성을 입증하기 위해 추가 연구가 필요합니다. 현재의 워크플로우는 추가 검증과 최적화를 거쳐 점점 더 이질적인 생물학적 환경에 고해상도 DESI 측정을 확장할 수 있는 기반을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 공간적 맥락을 보존하면서 상세한 분자 정보를 제공하기 때문에, 영상과 오믹스 기반 접근법 사이의 다리 역할을 할 수 있습니다. 요약하자면, 이 프로토콜은 Orbitrap 질량분석기에서 단일 셀 해상도 DESI–MSI를 달성하기 위한 유연하고 적응력 있는 프레임워크를 확립합니다. 이온화 효율, 이온 전달, 공간 제어, 질량 해상도와 관련된 주요 과제를 해결함으로써 이 접근법은 개별 세포의 상세한 분자 특성 분석을 가능하게 합니다. 추가적인 최적화와 검증이 필요하지만, 이 방법론은 단일 세포 및 공간 대사체 연구에서 주변 MSI 활용을 확대할 수 있는 기반을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
−80 °C 냉동고	Eppendorf New Brunswick	U700	준비 전 생물학적 샘플 저장.
6" 수직 브래킷, 1/4"-20 구멍(2개)	Millipore Sigma	VB01A	맞춤형 분무기 장착 어셈블리의 기계적 지원 및 안정화
아세토니트릴	Fisher Chemical	240744	DESI 호환 용매 준비 및 최적화를 위한 유기 용매
암모늄 포맷	Thermo Fisher Scientific	401152500	DESI–MSI 전 세포 세척을 위한 등삼투압 암모늄 포맷 세척 완충액 준비
밝은 현미경	Fisher Scientific	12575252	DESI–MSI 획득 전 부착 세포의 광학 이미지 및 시각화
C18 컬럼	Waters	186009259	안정한 나노 흐름 DESI 분무 형성을 위한 인라인 역압 생성
구리 와이어	N/A	N/A	분무기 장착 제작 중 전기 연결 및 접지
DESI XS 분무기	Waters	700014033	단일 세포 DESI–MSI 실험을 위한 앰비언트 DESI 이온화 소스
에폭시 수지	Devcon	20945	맞춤형 분무기 장착 부품의 기계적 안정화 및 고정
FAIMS Pro 전극 이온 소스 하우징 어댑터	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	맞춤형 Orbitrap 호환 DESI 인터페이스의 수정 및 제작
포름산	Ward’s Science	470301-120	DESI 분무 용매 준비를 위한 산 개질제
메탄올	Fisher Chemical	A456-4 Optima	DESI 분무 용매 준비를 위한 유기 용매
가스 조절기	Millipore Sigma	23831-U	DESI 작동 중 질소 시스 가스 압력 조절
격자 유리 커버슬립	Ibidi	10817	세포 배양 기판 및 광학-MS 이미지 등록을 위한 위치 참조
접지 와이어	N/A	N/A	DESI 분무기 및 인터페이스 어셈블리의 전기 접지 연결
인큐베이터	HeraCell	51026282	제어된 온도 및 CO2 조건에서 포유류 세포 배양 유지
LC/MS 등급 물	Thermo Fisher Scientific	W6500	암모늄 포맷 세척 완충액 및 DESI 분무 용매 준비
METASPACE 플랫폼	METASPACE	https://metaspace2020.eu	클라우드 기반 MS 이미지 시각화 및 공간 대사체학 데이터 분석
수정된 FAIMS 인터페이스	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	DESI 분무기와 Orbitrap 질량 분석기를 연결하기 위한 맞춤형 인터페이스
모터 제어 XYZ 스테이지	Newport Corporation	CONEX-MFACC	DESI–MSI 획득 중 제어된 래스터 스테이지 움직임
MycoAlert PLUS 마이코플라스마 검출 키트	Lonza	LT07-703	배양된 세포의 마이코플라스마 오염 정기 모니터링
나노-액체 크로마토그래피 시스템	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	DESI 분무 생성을 위한 나노 흐름 용매 전달 시스템
광학 브레드보드	Thorlabs	MB1012	DESI 분무기 및 수정된 인터페이스 어셈블리를 위한 기계적 지원 플랫폼
Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기	Thermo Fisher Scientific	UVPD	DESI–MSI 데이터 획득을 위한 고해상도 Orbitrap 질량 분석기
PEEK 튜브	IDEX	1535	나노-LC 시스템과 DESI 분무기 사이의 용매 라인 연결
페니실린–스트렙토마이신	Gibco	15140-122	포유류 세포 배양 배지 용 항생제 보충제
인산 완충 식염수(PBS)	VWR	0780-50L	배양 세포 전이 중 세척 용액
RPMI-1640 배지	Gibco	11875093	OVCAR-8 세포 유지를 위한 포유류 세포 배양 배지
스테이지 제어 소프트웨어	Lasken Group	버전 6	래스터 스캔, 스테이지 이동 및 이미지 획득 매개변수의 소프트웨어 제어
스테인리스 스틸 튜브	MicroGroup