방법 논문

알레르기성 기도 염증에 영향을 미치는 환경 독성 물질 스크리닝을 위한 STAT6 리포터 어세이 구축

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DOI:

10.3791/71694

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2026년 8월 25일

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 인간 기도 상피 세포에서 안정적인 STAT6 루시퍼레이스 리포터 분석법의 구축 및 검증 방법을 설명합니다. 이 방법은 통제된 in vitro 조건 하에서 STAT6 활성을 조절하는 환경 독성 물질 및 대기 오염 성분을 효율적으로 스크리닝할 수 있게 합니다.

초록

대기 오염과 관련된 알레르기성 기도 염증은 점차 심각해지는 공중 보건 문제입니다. 알레르기성 기도 염증의 핵심 매개체인 Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6) 경로를 활성화하는 Interleukin‑4 (IL‑4)와 interleukin‑13 (IL‑13)은 오염 물질의 호흡기 독성을 조절할 수 있습니다. 본 연구에서는 STAT6 신호 전달을 조절하는 환경 독성 물질을 평가하기 위해 인간 기도 상피 세포에서 안정적인 STAT6 루시퍼레이즈 리포터 분석법을 구축하고 검증하는 방법을 설명합니다. 인간 기관지 상피 16HBE14o− 세포에 렌티바이러스 벡터를 사용하여 STAT6 반응성 루시퍼레이즈 리포터를 형질도입하였으며, 이후 puromycin 선택 및 감염 다중도(multiplicity of infection)를 최적화하고 한계 희석법을 통해 단일 클론을 분리하였습니다. 연속 계대 배양 후에도 강력하고 재현 가능한 유도를 보이는 안정적인 클론을 선택하였습니다. 리포터의 반응성은 IL-4/IL-13 자극을 통해 검증하였으며, STAT6 의존성은 선택적 STAT6, STAT5 및 STAT3 억제제를 사용하여 확인하였습니다. 분석 성능은 Z′-factor 분석으로 정량화하였으며, 이를 통해 재현 가능한 신호 분리가 가능함을 확인하였습니다. 나아가 본 분석법을 개별 대기 오염 성분에 적용한 결과, benzo[b]fluoranthene과 미세먼지가 STAT6 리포터 활성을 유의하게 증가시켰습니다. 이 방법은 기도 상피 세포에서 STAT6 활성을 측정하고 알레르기성 기도 신호 전달을 조절하는 환경 독성 물질의 우선순위를 정하는 데 유용한 확장 가능한 접근 방식을 제공합니다.

서론

대기 오염은 심각한 건강 영향과 사회경제적 파급 효과를 동반하며, 전 세계적으로 가장 시급한 공중 보건 과제 중 하나입니다. 현재 대기 오염은 연간 810만 명의 사망자를 발생시키는 두 번째로 주요한 사망 위험 요인으로 꼽힙니다1,2,3. 공기 중 오염 물질 중에서 직경 2.5 µm 미만의 미세먼지(PM2.5)는 호흡기 깊숙이 침투할 수 있는 능력 때문에 가장 큰 건강 위험을 초래합니다4,5. PM2.5 노출 증가와 폐 기능 저하 및 호흡기 질환으로 인한 입원율 증가 사이에는 일관된 연관성이 있음이 밝혀졌습니다6. 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염을 포함한 알레르기성 염증성 질환의 유병률은 전 세계적으로 증가하고 있으며, 특히 오염이 심한 거대 도시에서 불균형적으로 높게 나타납니다4.

아토피성 천식과 같은 알레르기성 기도 질환은 주로 인터루킨-4 (IL-4) 및 인터루킨-13 (IL-13) 사이토카인의 수치 상승과 신호 전달 및 전사 활성화 인자 6 (STAT6) 신호 전달 경로의 활성화를 특징으로 하는 제2형 염증 반응에 의해 매개됩니다7. 기도 상피 세포에서 IL-4 및 IL-13에 의해 유도되는 STAT6의 인산화는 점액 과분비와 상피 장벽 붕괴를 촉진하며, 이는 STAT6가 알레르기성 기도 병리의 핵심 매개체이자 관련 치료 표적임을 시사합니다8,9. 마우스 모델의 실험적 증거에 따르면 PM2.5와 이산화황에 노출될 경우 STAT6 신호 전달이 증강되고 알레르기성 기도 염증이 악화되는 것으로 나타났습니다10,11. 그러나 개별 대기 오염 성분이 인간 기도 상피 세포에서 STAT6의 전사 활성을 직접적으로 조절하는지 여부는 아직 체계적으로 평가되지 않았습니다.

대기 오염은 미세먼지, 다환방향족탄화수소(PAHs), 중금속 및 무기염을 포함한 화학적으로 복잡한 성분들의 혼합물로 구성되어 있으며, 이러한 개별 성분들이 기도 STAT6 활성화에 기여하는 정도는 아직 명확하게 정의되지 않았습니다12,13. 종말점 인산화 분석이나 일시적 형질전환 기반 리포터 시스템과 같이 기도 상피 세포에서 STAT6 활성을 측정하는 현재의 방법론들은 대규모 화학 물질 스크리닝에 적합하지 않습니다. 따라서 인간 기도 상피 세포 내에 안정적인 세포 기반 STAT6 리포터 플랫폼을 구축한다면, 알레르기성 기도 신호를 조절하는 오염 유래 화합물을 식별할 수 있는 확장 가능한 도구를 제공할 수 있을 것입니다. 본 프로토콜에서는 16HBE14o− 기도 상피 세포에서 안정적인 STAT6 루시퍼레이즈 리포터 분석법의 개발 및 검증 과정을 설명하며, 이를 통해 환경 시료 및 개별 화학 독성 물질의 체계적인 스크리닝을 위한 STAT6 활성의 정량적 평가가 가능해집니다.

프로토콜

본 연구에서는 기성 16HBE14o− 인간 기관지 상피 세포주를 사용하였으므로, 인간 대상자 윤리 승인은 해당되지 않습니다.

1. 16HBE14o 생성− STAT6 활성 리포터를 안정적으로 발현하는 세포

참고: 그림 1에서 전체 워크플로의 개요를 확인할 수 있습니다.

  1. 세포 배양
    참고: 모든 과정은 II등급 생물안전 작업대(biosafety cabinet)에서 무균 기법을 사용하여 수행하십시오. 사용 전 세포에 마이코플라스마 오염이 없는지 확인하십시오.
    1. 16HBE14o− 세포를 10% 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin–streptomycin)이 첨가된 최소 필수 배지(minimum essential medium)에서 배양하십시오. 세포를 5% CO2가 포함된 가습 분위기의 37 °C에서 배양하고, 이틀마다 배양액을 교체하십시오.
    2. 세포가 약 80%의 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양하십시오. 배양액을 흡입하여 제거하고 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline)로 세포 단층을 1회 세척하십시오.
    3. 세포 단층이 충분히 덮일 정도로 인산염 완충 식염수를 넣고 37 °C에서 20분 동안 배양하십시오. 인산염 완충 식염수를 완전히 제거하십시오.
      참고: 20분간의 인산염 완충 식염수 배양은 이 세포주에서 형성되는 견고한 세포 간 결합(tight intercellular junctions)의 분리를 촉진하기 위함입니다. 이 시간은 내부적으로 최적화된 수정 사항입니다.
    4. 세포 단층을 충분히 덮을 정도로 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid) 용액을 넣으십시오. 세포를 37 °C에서 10분 동안 배양하십시오.
      참고: 도립 광학 현미경을 사용하여 세포 박리 상태를 모니터링하십시오. 박리를 돕기 위해 필요한 경우 배양 용기를 가볍게 두드리십시오.
    5. 효소 활성을 중단시키기 위해 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 용액 부피의 약 5배에 해당하는 완전 배양액을 넣으십시오. 현탁액을 가볍게 파이펫팅하여 단일 세포 현탁액을 얻으십시오.
    6. 세포 현탁액을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮기십시오. 25 °C에서 300 × g로 5분 동안 원심 분리하십시오.
    7. 상층액을 주의 깊게 제거하고 신선한 배양액으로 세포 펠릿을 재현탁하십시오. 현탁액을 부드럽게 분쇄(triturate)하고 도립 광학 현미경 하에서 단일 세포 현탁액 상태인지 확인하십시오.
    8. 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 세고, 이후 실험에 필요한 밀도로 세포 농도를 조정하십시오. 일반적인 분할 비율은 1:8로 합니다.
      참고: 배양 용기의 성장 면적과 그에 해당하는 인산염 완충 식염수 및 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 용액의 부피는 부록 표 1과 부록 표 2를 참조하십시오.
  2. 퓨로마이신 유도 세포독성 결정
    참고: 렌티바이러스 컨스트럭트에 의해 인코딩된 내성 유전자에 따라 항생제를 선택하십시오.
    1. 웰당 100 µL의 완전 배양액이 담긴 96-웰 배양 플레이트에 16HBE14o− 세포를 웰당 2 × 104 cells로 분주하십시오. 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오.
    2. 배양액을 퓨로마이신 최종 농도가 0.5, 1, 2 또는 4 µg/mL인 신선한 배지로 교체하십시오. 24, 48, 72시간 시점별로 별도의 플레이트를 준비하십시오.
    3. 각 웰에 5 µL의 세포 계수 시약을 넣으십시오. 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오.
      참고: 흡광도 측정에 방해가 될 수 있으므로 웰 내에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.
    4. 650 nm를 기준 파장으로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하십시오. 엔드포인트 모드(endpoint mode)로 흡광도를 기록하기 직전에 플레이트를 15초 동안 흔들어 주십시오.
    5. 식 1을 사용하여 세포 생존율14을 계산하십시오.
      세포 생존율 식, 시료, 대조군, 공시료의 OD450-650; 바이오에세이 분석 공식.
      여기서:
      흡광도 식 OD450-650, 감산법, 분광 광도법에 사용됨, 공식.
      분광법 실험의 흡수 분석을 위한 광학 밀도 공식 (OD450-650).
      분광 데이터 분석을 위한 광학 밀도 식, OD450-650blank=OD450blank-OD650blank.
      참고: 처리하지 않은 세포를 대조군으로, 분석 시약이 포함된 세포 없는 배지를 공시료(blank)로 정의하십시오. 48~72시간 이내에 형질전환되지 않은 세포를 완전히 제거하는 가장 낮은 퓨로마이신 농도를 선택하십시오.
  3. 최적 감염 다중도(MOI) 결정
    주의: 렌티바이러스 입자는 등록된 생물안전 2등급(BSL-2) 시설 내의 BSL-2 조건에서 기관의 생물안전 규정에 따라 취급하십시오. 모든 바이러스 조작은 II등급 생물안전 작업대에서 수행하십시오. 바이러스에 오염된 소모품 및 유출물은 생물학적 위험 폐기물로 처리하기 전 최소 1시간 동안 10% 표백제로 덮어 두십시오.
    참고: 감염 다중도는 형질전환 효율에 직접적인 영향을 미치므로 최적화가 필요합니다.
    1. 식 2를 사용하여 필요한 렌티바이러스 스톡 부피15를 계산하십시오.
      MOI 계산 공식, 바이러스 입자와 표적 세포의 비율, 분자생물학 식.
      여기서:
      기능적 바이러스 역가 공식, T_virus = TU/mL, 바이러스 연구 데이터 분석 식.
      바이러스 부피 식, V_virus=mL 단위의 바이러스 부피, 공식, 바이러스 연구, 계산 방법
      정적 평형 식: N_cells = 표적 세포 수, 교육 연구용 도표.
      참고: 본 프로토콜에 사용된 STAT6 루시페레이스 리포터 렌티바이러스 스톡의 기능적 역가는 5 × 107 transducing units/mL였습니다. 표적 세포 2 × 104개에 대해 MOI 20은 웰당 8 µL의 렌티바이러스 스톡에 해당합니다. 역가가 다른 바이러스 제제의 경우 바이러스 부피를 다시 계산해야 합니다.
    2. 웰당 100 µL의 완전 배양액이 담긴 96-웰 화이트 투명 바닥 플레이트에 16HBE14o− 세포를 웰당 2 × 104 cells로 분주하십시오. 세포가 약 80%의 합류도에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양하십시오.
    3. 배양액을 5 µg/mL polybrene과 MOI 1, 5, 10, 20의 STAT6 루시페레이스 리포터 렌티바이러스가 포함된 신선한 배지로 교체하십시오. 렌티바이러스를 넣지 않은 비형질전환 모의 대조군(mock-control) 웰을 포함하십시오.
      참고: 스톡의 기능적 역가로부터 각 MOI에 필요한 렌티바이러스 부피를 계산하십시오.
    4. 세포를 렌티바이러스 입자와 함께 48시간 동안 배양하십시오. 형질전환 배지를 신선한 배양액으로 교체하고 24시간 동안 추가로 배양하십시오.
    5. 배양액을 각각 10 ng/mL의 인터루킨-4(interleukin-4) 및 인터루킨-13(interleukin-13)이 포함된 신선한 배지로 교체하십시오. 세포를 24시간 동안 배양하십시오.
    6. 각 웰에 25 µL의 루시페레이스 분석 시약을 넣으십시오16. 플레이트를 빛으로부터 보호하고 상온에서 20분 동안 배양하십시오.
    7. 플레이트를 20초 동안 선형으로 흔들어 주십시오. 전체 플레이트 리드(full-plate read)와 게인(gain) 설정 120을 사용하여 엔드포인트 모드로 발광을 측정하십시오.
      주의: 최대 신호를 포착하기 위해 루시페레이스 분석 시약을 넣은 후 1시간 이내에 발광을 기록하십시오. 시약 제조사의 안전 및 취급 지침을 따르십시오.
      참고: 모든 흡광도 및 발광 측정에 동일한 멀티모드 마이크로플레이트 리더기와 획득 설정을 사용하십시오.
  4. 형질전환된 세포의 선택
    1. 24-웰 배양 플레이트에 16HBE14o− 세포를 2 × 105 cells/mL로 분주하십시오. 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오.
    2. 배양액을 MOI 20의 STAT6 루시페레이스 리포터 렌티바이러스와 5 µg/mL polybrene이 포함된 신선한 배지로 교체하십시오. 세포를 48시간 동안 배양하십시오.
    3. 형질전환 배지를 신선한 배양액으로 교체하십시오. 세포를 24시간 동안 추가로 배양하십시오.
    4. 배양액을 제거하고 1 µg/mL 퓨로마이신이 포함된 신선한 배지를 넣으십시오. 선택 배지를 2일마다 교체하며 세포를 5일 동안 배양하십시오.
    5. 비형질전환 모의 대조군 웰의 모든 세포가 제거될 때까지 퓨로마이신 선택을 계속하십시오.
      참고: 내성 유전자가 발현될 수 있도록 형질전환 후 항생제 선택을 적용하기 전 최소 24시간의 간격을 두십시오.
  5. 한계 희석법을 통한 단일 세포 클론 분리
    1. 퓨로마이신으로 선택된 STAT6 리포터 세포를 박리하여 수를 세십시오. 연속 희석을 통해 5 cells/mL의 단일 세포 현탁액을 준비하십시오.
      참고: 희석 중 세포 뭉침을 방지하십시오. 필요한 경우 현탁액을 세포 스트레이너(cell strainer)에 통과시키십시오.
    2. 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 200 µL를 분주하여 웰당 평균 약 1개의 세포 밀도를 얻으십시오.
    3. 24시간 이내에 도립 현미경을 사용하여 각 웰을 검사하고 단일 세포가 포함된 웰을 확인하십시오. 두 개 이상의 세포가 있거나 공간적으로 분리된 여러 세포 초점이 있는 웰은 제외하십시오.
    4. 클론 성장을 확인하기 위해 첫 일주일 동안 선택된 웰을 모니터링하십시오. 배양액을 3일마다 교체하십시오.
    5. 각 클론을 원래의 96-웰 플레이트에서 약 20일 동안 또는 세포가 합류도에 도달할 때까지 확장 배양하십시오. 각 클론을 순차적으로 6-웰 플레이트로 옮긴 후 T-25 배양 플라스크로 옮기십시오.
      참고: 세포를 T-25 플라스크로 옮기기 전 6-웰 플레이트에서 약 6일 동안 배양하거나, 적절한 합류도에 도달했을 때 옮기십시오.
      일시 중단 지점: 클론 확장을 계속하거나, 90% 태아 송아지 혈청과 10% 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)가 포함된 1 mL의 동결 보존 배지에 1 × 106 cells/vial 농도로 동결 보존하십시오.
    6. 확장된 각 클론을 96-웰 화이트 투명 바닥 플레이트에 2 × 105 cells/mL로 분주하십시오. 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오.
    7. 배양액을 각각 10 ng/mL의 IL-4 및 IL-13이 포함된 신선한 배지로 교체하십시오. 세포를 24시간 동안 배양하십시오.
    8. 단계 1.3.6~1.3.7에 설명된 대로 루시페레이스 활성을 측정하십시오. 개별 클론 간의 유도된 리포터 활성을 비교하십시오.
    9. 세포 계대 수를 늘려가며 루시페레이스 분석을 반복하십시오. 계대 전반에 걸쳐 일관된 사이토카인 유도 리포터 활성을 유지하는 클론을 선택하십시오.
      참고: 기초 발광(basal luminescence)이 낮고 연속 계대 동안 일관된 사이토카인 유도 활성 신호를 유지하는 능력이 있는 클론 3을 선택하였습니다.

2. STAT6 활성 리포터 분석법의 구축 및 검증

참고: 그림 2에서 워크플로의 개요를 확인할 수 있습니다.

  1. STAT6 활성 리포터 분석법의 검증
    1. STAT6 리포터 세포를 96-well white clear-bottom 플레이트에 웰당 100 µL의 완전 배지를 사용하여 2 × 105 cells/mL 농도로 분주한다. 세포를 하룻밤 동안 배양한다.
    2. 배양액을 최종 농도가 각각 10 ng/mL인 IL-4 및 IL-13이 포함된 새 배지로 교체한다. 다음과 같이 선택적 억제제를 동시에 첨가한다: 100 nM AS1517499 (STAT6 억제제), 2.5 µM AC-4-130 (STAT5 억제제), 또는 2.5 µM Stattic (STAT3 억제제).
    3. 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO)가 포함된 용매 대조군(vehicle control)을 포함한다. 세포를 24시간 동안 배양한다.
    4. 단계 1.2.3-1.2.5에 기술된 세포 계수 분석법을 사용하여 세포 생존율을 측정한다.
    5. 단계 1.3.6-1.3.7에 기술된 대로 루시퍼레이스(luciferase) 활성을 측정한다.
    6. 각 웰의 발광 신호를 해당 세포 생존율로 정규화한다. 정규화된 값을 사이토카인 처리 대조군에 상대적인 값으로 표시한다.
      참고: 세포 생존율의 감소는 STAT6 활성과 무관하게 루시퍼레이스 신호를 감소시킬 수 있다. 허용 가능한 세포 생존율을 확인한 후에만 리포터 활성을 해석한다.
  2. 분석법의 견고성 평가
    1. 양성 및 음성 대조군 그룹에 대해 각각 21개의 반복 웰을 사용하여 Z′-인자를 계산함으로써 분석법의 견고성을 평가한다.
    2. 식 3을 사용하여 Z′-인자를 계산한다.
      정적 평형 방정식, Z-인자 공식, 분석 품질 관리를 위한 수학적 표현.
      여기서:
      정적 평형 방정식, σₚ는 대조군의 표준 편차를 나타냄, 교육용 공식 삽화.
      표준 편차 방정식, σn, 음성 대조군 정확도에 대한 통계 분석에 사용됨.
      방정식 μ<sub>p</sub>=양성 대조군의 평균 신호; 통계 데이터 분석 개념.
      정적 평형, 방정식 μn= 음성 대조군의 평균 신호, 교육용 분석.
      참고: Z′-인자가 0.5에서 1.0 사이이면 해당 분석법이 고속 대량 스크리닝(high-throughput screening)에 적합함을 나타낸다.

3. 환경 독성 물질 스크리닝을 위한 STAT6 리포터 분석의 응용

주의: 다환 방향족 탄화수소와 중금속 염은 독성 및 잠재적 발암 물질로 취급하십시오. 적절한 개인 보호 장구를 사용하고, 모든 조작은 인증된 화학 흄 후드 내에서 수행하며, 오염된 물질은 기관의 유해 폐기물 처리 절차에 따라 폐기하십시오.

  1. 환경 독성물질 스크리닝
    1. 96-well 화이트 투명 바닥 플레이트의 각 웰에 완전 배양액 100 µL를 사용하여 STAT6 리포터 세포를 2 × 105 cells/mL 농도로 분주한다. 세포를 하룻밤 동안 배양한다.
    2. 배양액을 본 프로토콜의 최종 농도인 10 µM로 설정한 각 테스트 화합물이 포함된 신선한 배지로 교체하고, IL-4 및 IL-13이 없는 상태에서 세포를 처리한다.
    3. 0.1% dimethyl sulfoxide를 포함하는 음성 대조군과 각각 10 ng/mL의 IL-4 및 IL-13을 포함하는 양성 대조군을 포함한다. 세포를 24시간 동안 배양한다.
    4. 단계 1.2.3~1.2.5에 기술된 세포 계수 분석법을 사용하여 세포 생존율을 결정한다.
    5. 단계 1.3.6~1.3.7에 기술된 방법으로 루시페라제 활성을 측정한다.
    6. 각 웰의 발광 신호를 해당 세포 생존율 값으로 정규화한다. 정규화된 결과는 음성 대조군에 대한 상대값으로 표시한다.
    7. 세포 생존율을 80% 미만으로 감소시키는 화합물은 STAT6 리포터 활성 해석에서 제외한다.
      참고: 세포 생존율 감소는 STAT6 경로 활성과 무관하게 발광에 영향을 줄 수 있으므로, 세포 독성 조건에서 얻은 리포터 신호는 신뢰할 수 없는 것으로 간주한다.

결과

안정적 선택(stable selection)을 위한 최적의 puromycin 농도를 결정하기 위해, parental 16HBE14o− 세포에 puromycin의 농도를 점진적으로 높여(0.5–4 µg/mL) 처리하고, 24, 48, 72시간 후에 세포 생존율 분석법을 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. Puromycin은 농도 및 시간 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, 모든 농도에서 48–72시간 후 생존율이 20% 미만으로 감소하였다(그림 3). 1 µg/mL 농도는 비형질전환 세포를 완전히 제거하는 가장 낮은 농도였으며, 48시간 이내에 잔류 생존 신호를 약 4.5%까지 감소시켰다(p < 0.0001). Puromycin 농도를 더 높여도 세포 생존율의 추가적인 감소는 나타나지 않았다. 따라서 이후 형질전환된 세포의 선택을 위해 1 µg/mL의 puromycin을 선정하였다.

렌티바이러스 형질도입 효율을 최적화하기 위해, 16HBE14o− 세포에 STAT6 루시페레이스 리포터 렌티바이러스를 1, 5, 10, 20의 감염다중도(MOI)로 48시간 동안 형질도입시킨 후, STAT6 신호 전달을 활성화하기 위해 IL-4와 IL-13(각 10 ng/mL)으로 24시간 동안 자극하였습니다. 그림 4에서 보듯이, 상대 발광 단위(RLU)는 MOI에 의존적으로 증가하였습니다. MOI 20에서 리포터 유도가 가장 크게 나타났으며, 이는 자극하지 않은 대조군에 비해 발광이 약 50배 증가한 결과였습니다(p < 0.0001). 이 결과에 근거하여, 이후 실험에서는 MOI 20을 선택하였습니다.

최적화된 조건에서 형질도입 및 퓨로마이신(puromycin) 선택을 거친 후, 형질도입되지 않은 세포들은 광범위한 세포 사멸을 보인 반면, 형질도입된 세포들은 정상적인 형태와 생존력을 유지했습니다(그림 5). 생존한 세포들은 이후 단일 클론 STAT6 리포터 세포주를 확립하기 위해 한계 희석법(limiting dilution)을 거쳤습니다.

단일 세포에서 유래한 세 가지 단클론 리포터 세포주를 대상으로 STAT6 리포터 활성을 평가하였습니다. 모든 클론은 낮은 기저 발광 값(<1,000 RLU)을 보였습니다. IL-4 및 IL-13 자극 시 클론 2와 3에서 강력한 리포터 활성이 유도되었으며, 발광 값은 20,000 RLU를 초과하여 20배 이상의 유도를 나타냈습니다(그림 6A). 클론 3은 기저 발광 값이 가장 낮았으므로 추가 특성 분석을 위해 선택되었습니다. 장기 안정성을 평가하기 위해 클론 3의 리포터 활성을 연속 계대 배양(P9–P21) 과정 전반에 걸쳐 평가하였습니다. 그림 6B에 나타난 바와 같이, STAT6 의존적 리포터 유도는 평가된 계대 범위 전체에서 안정적으로 유지되었습니다. 정상적인 성장 속도를 보이고, 기저 발광 값이 약 1,000 RLU 미만이며, 사이토카인 자극 후 20배 이상의 유도를 보이는 클론을 후속 실험에 적합한 것으로 간주하였습니다.

IL-4와 IL-13이 STAT3 및 STAT5를 포함한 추가적인 STAT 가족 구성원을 활성화할 수 있으므로, 리포터 분석의 특이성을 추가로 평가하였다17,18. STAT6 리포터 세포를 STAT6, STAT5 또는 STAT3를 표적으로 하는 선택적 억제제의 존재 또는 부재 하에 IL-4 및 IL-13으로 24시간 동안 자극하였다19,20,21. 모든 처리 조건에서 세포 생존율은 90% 이상으로 유지되었다 (STAT6 억제제 AS1517499, 100 nM: 98.4%; STAT5 억제제 AC-4-130, 2.5 µM: 97.4%; STAT3 억제제 Stattic, 2.5 µM: 96.2%; 그림 7A). STAT6의 억제는 루시퍼레이스 활성을 현저히 감소시킨 반면 (p < 0.0001), STAT5 또는 STAT3의 억제는 리포터 활성에 유의미한 영향을 미치지 않았다 (p = 0.2593 및 p = 0.8857; 그림 7B). 이러한 결과는 리포터 활성화가 주로 STAT6 의존적임을 확인시켜 주었다.

IL-4 및 IL-13로 자극한 세포를 고신호 대조군으로, STAT6 억제제를 처리한 세포를 저신호 대조군으로 하여 Z′-인자를 계산함으로써 분석법의 견고성을 평가하였다. 분석 결과 Z′-인자는 0.703 ± 0.097로 나타났으며, 이는 우수한 분석 성능과 넓은 신호 창을 보여주어 고속 대량 스크리닝(high-throughput screening)에 적합함을 나타낸다.

마지막으로, STAT6 리포터 분석을 적용하여 선택된 미세먼지 환경 성분들이 STAT6 신호 전달을 조절하는 능력이 있는지 스크리닝하였다. 24시간 처리 후, benzo[b]fluoranthene (10 µM)은 STAT6 리포터 활성을 약 1.75배 유의하게 증가시켰으며 (p = 0.0006), 미세먼지 (100 µg/mL)는 리포터 활성을 약 1.5배 증가시켰다 (p = 0.0398; 그림 8). 반면, CdCl2, HgCl2, NiSO4 (각 10 µM)를 포함한 나머지 다환 방향족 탄화수소 및 중금속 화합물들은 리포터 활성을 유의하게 변화시키지 않았다. 종합적으로, 이러한 결과는 STAT6 리포터 분석이 안정적이고 특이적이며 강력하여, STAT6 신호를 조절하는 환경 화합물의 고속 대량 스크리닝에 적합함을 입증한다.

세포 형질도입 도식; STAT6 루시페레이스 리포터; 항생제 선택; MOI 최적화.
그림 1: 16HBE14o− STAT6 리포터 세포 제작 워크플로. STAT6 루시페레이스 리포터를 안정적으로 발현하는 16HBE14o− 세포 제작 프로토콜의 모식도. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

STAT6 리포터 세포 분석 과정 도식; IL4/13 자극, CCK8, 루시퍼레이스 첨가, 결과.
그림 2: STAT6 리포터 분석의 구축 및 적용 워크플로우. 분석 검증 및 환경 독성 물질 스크리닝을 위한 STAT6 리포터 분석의 모식도. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

24-72시간 동안 0.5-4µg/mL 농도에서 puromycin의 효과를 보여주는 세포 생존율 막대 그래프; 통계 분석.
Figure 3: 안정적 세포 선택을 위한 최적 puromycin 농도 결정.Parental 16HBE14o− 세포를 puromycin (0.5, 1, 2, 또는 4 µg/mL)으로 24, 48, 또는 72시간 동안 처리하였다. Vehicle 대조군 세포에는 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO)를 처리하였다. 세포 생존율은 세포 생존율 분석법을 사용하여 측정하였다. 세포 생존율은 블랭크 값을 빼고 vehicle 대조군으로 정규화한 후 450 nm와 650 nm 사이의 흡광도 차이로부터 계산하였다. 데이터는 기술적 반복 실험을 포함한 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)의 평균 ± SD로 표시하였다. 통계적 유의성은 one-way ANOVA와 Dunnett's 다중 비교 검정을 사용하여 결정하였다. vehicle 대조군과의 비교에 대한 p-값이 표시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

발광도 대 MOI 막대 그래프; RLU 배수 변화의 데이터 분석 및 통계적 p-값.
그림 4: 렌티바이러스 형질도입 효율의 최적화. 16HBE14o− 세포에 STAT6 루시퍼레이즈 리포터 렌티바이러스를 감염 다중도(MOI) 1, 5, 10 또는 20으로 48시간 동안 형질도입하였다. 24시간의 회복 기간 후, 세포를 IL-4 및 IL-13(각 10 ng/mL)으로 24시간 동안 자극하였다. (A) 모의 형질도입 세포와 표시된 MOI에서 리포터 형질도입 세포의 상대 발광 단위(RLUs). 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Dunnett의 다중 비교 검정을 사용하여 수행하였다. (B) 자극되지 않은 MOI 20 대조군 대비 사이토카인 자극 후의 유도 배수. 통계 분석은 비쌍체 Student's t-test를 사용하여 수행하였다. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)의 평균 ± SD로 나타냈다. p-값이 표시되어 있다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

puromycin 노출 하의 세포 형태; 50 μm 스케일에서 변화를 보여주는 현미경 이미지.
그림 5: puromycin 선택 후 세포의 대표 이미지. 16HBE14o− 세포에 STAT6 luciferase 리포터 렌티바이러스를 도입하거나 도입하지 않은 후(MOI = 20), 1 µg/mL puromycin으로 5일간 처리하였다. 이미지는 동일한 이미징 조건 하에서 위상차 도립 현미경을 사용하여 100× 배율로 획득하였다. 처리하지 않은 모세포는 정상적인 상피 단일층을 형성하였다(왼쪽). puromycin을 처리한 비도입 세포는 광범위한 세포 사멸 및 박리가 나타난 반면(가운데), puromycin으로 선택된 도입 세포는 생존율을 유지하며 정상적인 형태를 유지하였다(오른쪽). 스케일 바 = 50 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

발광 분석 결과; 세포 클론 및 계대 배양에서 대조군과 IL 조건의 비교 막대 그래프.
그림 6: STAT6 리포터 클론의 확인 및 리포터 안정성 평가. 한계 희석 후, 세 가지 단일 클론 STAT6 리포터 세포주를 확장하고 IL-4 및 IL-13 (각 10 ng/mL)로 24시간 동안 자극하였다. (A) 사이토카인 자극 후 개별 리포터 클론의 루시퍼레이스 활성을 자극하지 않은 대조군과 비교한 결과. (B) 연속 계대 배양(P9–P21)에 따른 클론 3의 STAT6 리포터 활성 안정성. 데이터는 기술적 반복 실험의 평균 ± SD로 나타냈다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

약물 처리된 세포 분석에서 % 세포 생존율과 정규화된 발광 강도를 비교한 막대 그래프.
그림 7: 세포 생존율에 영향을 주지 않고 STAT6 리포터 활성만을 선택적으로 억제함. STAT6 리포터 세포를 STAT6 억제제 AS1517499 (100 nM), STAT5 억제제 AC-4-130 (2.5 µM) 또는 STAT3 억제제 Stattic (2.5 µM) 존재 하에서 IL-4 및 IL-13 (각각 10 ng/mL)으로 24시간 동안 자극하였다. 사이토카인 자극을 받은 용매 대조군에는 0.1% DMSO를 처리하였다. (A) 세포 생존율 분석을 통해 세포 생존율을 결정하였다. (B) 사이토카인 자극 대조군으로 정규화한 STAT6 의존적 루시퍼레이스 활성이다. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)의 평균 ± SD로 나타내었다. p-값이 표시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

화학적 처리군과 대조군 샘플의 정규화된 발광 분석 결과를 비교한 막대 그래프.
그림 8: 환경 독성 물질의 STAT6 조절 효과 평가. STAT6 리포터 세포를 미세먼지(100 µg/mL) 또는 다환방향족탄화수소(PAHs) 및 중금속(각 10 µM)을 포함하여 표시된 환경 독성 물질로 24시간 동안 처리하였다. STAT6 의존적 루시페라아제 활성은 용매 대조군(0.1% DMSO) 대비 정규화하였다. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험(n = 3)의 평균 ± SD로 나타내었다. 통계적 유의성은 용매 대조군과의 비교를 통해 결정하였으며, p-값이 표시되어 있다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 16HBE14o− 세포 배양을 위한 배양 용기 사양 및 계대 배양 매개변수.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: STAT6 활성 측정 방법의 비교.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

IL-4/IL-13–JAK–STAT6 신호 전달 체계는 중요한 치료 표적일 뿐만 아니라 천식 및 알레르기성 비염을 포함한 알레르기 질환 발병 기전의 핵심 동인입니다22. 본 프로토콜은 STAT6 활성 조절제를 식별하기 위한 간단하고 안정적인 세포주 기반 리포터 분석법을 설명합니다. 이 분석법은 광범위한 환경 화합물의 STAT6 조절 효과를 평가하는 데 적용할 수 있으며, 개념 증명 스크리닝 연구(그림 8)에서 입증된 바와 같이 고속 스크리닝에 용이하게 적용 가능합니다. 루시퍼레이스 리포터와 병행 세포 생존력 분석을 결합함으로써, 이 방법은 화합물로 인한 세포 독성에서 비롯되는 혼란 효과를 최소화하면서 STAT6 경로 조절에 대한 정량적 평가를 가능하게 합니다.

이 방법의 특징은 안정적으로 형질도입된 인간 기관지 상피 16HBE14o− 세포를 사용하는 것으로, 이는 오염물질로 유도된 IL-4/IL-13 신호 전달이 알레르기성 기도 염증에 기여하는 생리학적으로 유의미한 세포 유형입니다. STAT6 활성을 측정하기 위한 기존의 접근 방식에는 중요한 실질적 제한 사항이 있습니다. 웨스턴 블롯팅이나 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 통한 STAT6 인산화 또는 하위 표적 단백질의 검출은 노동 집약적이며 처리량이 상대적으로 낮습니다. 일시적 형질전환 루시퍼레이스 리포터 분석법은 STAT6 전사 활성을 직접 측정하지만, 가변적인 형질전환 효율, 배치 간 변동성, 그리고 매 실험마다 형질전환을 반복해야 하는 필요성으로 인해 영향을 받으며, 결과적으로 재현성과 처리량을 저하시킵니다.

본 연구에서 설명한 안정적 리포터 세포주는 이러한 제한 사항 중 상당수를 극복하였습니다. 리포터 컨스트럭트가 게놈에 통합되고 클론 선택되었기 때문에, 세포 집단 전반에 걸쳐 리포터 발현이 균일하게 유지되며 계대 배양 시에도 재현 가능하므로 일시적 형질전환과 관련된 변동성을 제거할 수 있습니다. 발광 신호는 살아있는 세포에서 측정되며, 세포 독성으로 인한 인위적 결과(artifact)를 배제하기 위해 병행 실시한 세포 생존율 측정값으로 정규화할 수 있습니다. 또한, 본 분석법은 중·고처리량 응용을 위한 96-웰 포맷과 쉽게 호환됩니다. 본 분석법은 Z′0.703의 Z-인자(Z-factor)는 고신호 대조군과 저신호 대조군 사이의 우수한 분리도를 나타내며, 이는 고속 대량 스크리닝(high-throughput screening)에 적합함을 확인시켜 줍니다. STAT6 활성 측정을 위해 일반적으로 사용되는 방법들의 비교 분석이 다음에서 제공됩니다. 보충 표 2그럼에도 불구하고, 해당 분석법은 내인성 표적 유전자의 발현이 아니라 STAT6 반응성 프로모터의 활성화를 보고하므로, MUC5AC 및 CCL26과 같은 하위 STAT6 표적을 이용한 교차 검증이 여전히 중요합니다.

STAT6 리포터 분석법을 성공적으로 구축하고 적용하기 위해서는 몇 가지 단계가 매우 중요합니다. 렌티바이러스 감염 다중도(MOI)의 최적화는 필수적인데, 바이러스 투입량이 불충분하면 형질전환 효율이 떨어지는 반면, 과도한 바이러스 노출은 세포 스트레스를 유발하고 세포 생존력을 저하시킬 수 있기 때문입니다. 마찬가지로, 저항성을 가진 리포터 세포의 생존력은 유지하면서 형질전환되지 않은 세포를 제거하기 위해 퓨로마이신(puromycin) 선택 농도의 최적화가 필요합니다. 렌티바이러스 형질전환 및 항생제 선택에 대한 민감도는 세포 유형마다 다르므로, 안정적인 리포터 세포주를 구축하기 전에 두 매개변수 모두를 실험적으로 최적화해야 합니다. 16HBE14o− 세포주는 기능적인 밀착 연접(tight junction)을 형성하고 점액을 생성하여 기도 염증 연구에 널리 사용되는 불멸화된 인간 기관지 상피 세포주입니다8,23. 리포터 생성에 선택된 세포는 기능적인 IL-4 및 IL-13 수용체를 발현해야 하며, 온전한 하위 JAK-STAT 신호 전달 체계를 유지해야 합니다24. 안정적인 리포터 세포주를 구축하기 전, 리포터 구조체는 사이토카인 자극에 대한 반응성, 경로 특이적 억제제에 의한 억제 여부, 그리고 선택된 분석 조건에서의 세포 독성 효과 부재를 확인하여 검증되어야 합니다. 이러한 검증 단계는 리포터 활성의 변화가 비특이적인 세포 스트레스가 아닌 STAT6 의존적 신호 전달을 정확하게 반영하도록 보장하는 데 도움이 됩니다.

본 방법의 몇 가지 한계점 또한 고려되어야 합니다. 렌티바이러스 벡터는 호스트 게놈에 무작위로 통합되므로, 기초 리포터 활성, 유도 가능성 및 장기 발현 안정성에서 클론 간의 변이가 발생할 수 있습니다. 또한, 본 분석법은 STAT6 반응성 프로모터의 활성화를 측정하므로, 상위 수용체 활성화나 하위 내인성 신호 전달 사건을 직접적으로 평가하지는 않습니다. 안정적인 리포터 세포를 장기간 배양하면 후성유전학적 silencing 또는 트랜스진 발현 감소로 이어질 수 있습니다. 이러한 영향을 최소화하기 위해 초기 계대 마스터 세포 뱅크를 구축해야 하며, 정해진 계대 범위 내에서 리포터 반응성을 주기적으로 검증해야 합니다. 나아가, 본 분석법은 일차 인간 기도 상피 세포나 완전 자동화된 고속 스크리닝 플랫폼에서 아직 검증되지 않았습니다. 마지막으로, 본 연구에서 평가된 환경 독성 물질들은 포괄적인 화학 라이브러리가 아니라 개념 증명 패널을 대표합니다.

대기 오염, 특히 초미세먼지(PM2.5)는 블랙카본, 무기염, 다환방향족탄화수소 및 중금속을 포함하여 화학적 및 물리적으로 다양한 성분들이 복잡하게 섞여 있는 혼합물입니다12,13. 배출원과 대기 중 처리 과정의 차이는 입자 조성의 상당한 차이를 만들어내며, 이는 서로 다른 부정적인 건강 결과의 원인이 될 수 있습니다. 결과적으로, 역학 조사 및 in vivo 연구에서 알레르기 반응을 일으키는 특정 성분을 식별하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 본 연구에서 설명하는 STAT6 리포터 어세이는 개별 공기 중 독성 물질, 배출원별 입자상 물질 추출물 또는 화학적으로 정의된 입자 분획의 STAT6 조절 활성을 스크리닝하기 위한 실용적인 in vitro 플랫폼을 제공합니다. 이 프로토콜은 기전 연구를 위한 후보 독성 물질의 우선순위 선정 및 복잡한 대기 오염 혼합물에 대한 위험 중심 평가를 지원하는 데 도움이 될 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 태국 국립연구위원회(NRCT)(Grant No. N42A680388)의 지원을 받았으며, 본 연구 프로젝트는 마히돌 대학교(전략 연구 기금: 2025)(Grant No. 35)의 지원을 받았습니다. 그림 1과 2는 BioRender.com(Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h)을 사용하여 작성되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200072세포 해리 시약
15 mL 원뿔형 원심분리 튜브CorningCLS430791멸균 폴리프로필렌 원심분리 튜브
16HBE14o- 인간 기관지 상피 세포주Nawiya Huipao 박사(태국 송클라 왕립대학교)와 Dieter C. Gruenert 교수(미국 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스)의 제공분RRID:CVCL_0112인간 기관지 상피 세포주 (계대 배양 35회–40); 마이코플라스마 음성이 확인되었으며, 분화된 기도 상피 형태 및 장벽 특성을 유지하고 있습니다. 참고 문헌: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
24웰 투명 평저 조직 배양 처리 플레이트Corning3527세포 배양 플레이트
6-웰 투명 평저 조직 배양 처리 플레이트Corning3516세포 배양 플레이트
96-웰 투명 평저 폴리스티렌 조직 배양 처리 마이크로플레이트Corning3599세포 생존율 분석 플레이트
96-well 백색 투명 바닥 폴리스티렌 조직 배양 처리 마이크로플레이트Corning3610루미네선스 분석 플레이트
AC-4-130 (STAT5 억제제)MedChemExpressHY-124500선택적 STAT5 억제제
AS1517499 (STAT6 억제제)MedChemExpressHY-100614선택적 STAT6 억제제
벤조[b]플루오란텐AccuStandardH-128N다환방향족탄화수소
생물안전작업대, 2등급NuaireNU-543-400E무균 세포 배양 절차를 위해
염화카드뮴 (CdCl2)2)시그마202908중금속 화합물
세포 계수 키트-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301세포 생존율 분석
세포 배양 플라스크, 25 cm² (T-25)Corning430639조직 배양 플라스크
일산화탄소2 배양기NuaireNU-5710E~로 유지됨 37 °C, 5% CO22, 가습 분위기
디메틸설폭사이드 (DMSO)시그마D2650용매(최종 농도 0.1%) 및 동결보호제(10%)
소태아혈청 (FBS)시그마F7524배지 보충제(10%) 및 동결 보존 배지(10%)
혈구계수기BOECOBOE14수동 세포 계수
倒立 위상차 광학 현미경ZEISSPrimovert세포 형태 관찰
루시퍼라제 분석 시스템 (원스텝)BPS Bioscience60690루시페라제 리포터 분석
염화수은 (HgCl2)시그마215465중금속 화합물
마이크로플레이트 리더BioTekSynergy Neo2Gen5 소프트웨어(v3.08.01)로 제어되는 멀티모드 마이크로플레이트 리더/루미노미터. 15분 후 650 nm 참조 파장을 사용하여 450 nm에서 흡광도 측정–20초간 선형 진탕. 20초간의 선형 진탕 후, 검출기 게인을 120으로 설정하여 엔드포인트 모드로 발광을 측정함.
최소 필수 배지 이글 (MEM)Gibco11095-080기초 배양 배지
황산니켈 (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203중금속 화합물
미세먼지 (PM)미국 국립표준기술연구소SRM 2975미세먼지 표준 참조 물질
페니실린-스트렙토마이신 (100×)Gibco15140122항생제 보충제 (최종 농도 1%)
인산완충생리식염수 (PBS)Gibco18912014세척 완충액
폴리브렌(Polybrene)시그마TR-1003-G렌티바이러스 형질도입 증강제
퓨로마이신MedChemExpressHY-B1743A안정적 세포 선택을 위한 항생제
재조합 인간 IL-13Thermo Fisher ScientificA42526자극용 사이토카인
재조합 인간 IL-4Thermo Fisher ScientificA42602자극용 사이토카인
STAT6 루시퍼레이스 리포터 렌티바이러스BPS Bioscience78799렌티바이러스 리포터 구조체; 스톡 역가 5 × 107 TU/mL
Stattic (STAT3 억제제)MedChemExpressHY-13818선택적 STAT3 억제제

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