막 단백질 기능화 고분자 및 고분자/지질 하이브리드 대형 및 거대 단층 소포의 제제

요약

이 프로토콜은 세제 매개 막 단백질인 시토크롬 bo3 유비퀴놀 산화효소를 PDMS-g-PEO로 만든 대형 유라멜라 소포로 재구성하고, 융합-전기형성을 통해 거대한 소포로 전환하는 과정을 입증합니다. 이로 인해 기능성 폴리머 기반 구획은 고급 생화학 및 생물물리학 연구에 적합합니다.

초록

양친성 공중합체에서 형성된 소포는 단독이거나 인지질과 혼합되어 기존의 지질 소포보다 기계적 및 화학적 안정성이 우수합니다. 이로 인해 이들은 매력적인 섀시로, 약물 전달, 진단 생체감각, 인공 세포 제작, 생체 모방 마이크로 및 나노 반응기 등 특정 응용을 가능하게 할 수 있도록 추가 개발 및 확장이 가능합니다. 특히, 막 단백질 통합을 통한 기능화는 이러한 응용 중 많은 부분에서 필수적입니다. 여기서는 접목 공중합체 PDMS-g-PEO에서 세제 매개 재구성을 통해 막 단백질 기능화된 대형 단층 소포(LUVs)를 제조하는 프로토콜을 제시합니다. 더 나아가, 우리는 이러한 큰 소포를 융합-전기형성 방식을 사용하여 거대 유일라멜라 소포(GUV)로 변환하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 막 단백질의 형광 표지, 고분자 및 하이브리드 LUV 제조, 막 단백질 재구성, 동적 광산란(DLS)을 통한 크기 분포 분석, 산소 소비 측정을 통한 단백질 활성 평가, 단백질 기능화된 GUV 준비, 그리고 공초점 현미경을 통한 GUV의 단백질 삽입 및 양성자 펌핑 활성 분석을 포함합니다. 대표적인 결과는 다분산 지수(PDI)가 0.2 미만인 단분산 프로테오-LUV의 형성과 직경 5–35 μm 범위의 프로테오-GUV를 성공적으로 생성함을 보여줍니다. 단백질 활성은 고분자 LUV(18.2 nmol/min/mL)와 하이브리드 LUV(26.9 nmol/min/mL) 모두에서 산소 소비량 측정으로 확인됩니다. GUV에 대한 단백질 삽입은 형광 강도를 통해 정량화되며, 폴리머 GUV는 20.6 ± 3.7 a.u., 하이브리드 GUV는 26.2 ± 5.0 a.u.를 산출합니다. 캡슐화된 pH 민감성 염료를 통해 모니터링되는 GUVs의 양성자 펌핑 활동은 단백질 기능과 일치하며, 내향 양성자 펌핑이 우세합니다. 공중합체의 기계적 부드러움과 지질과 유사한 이중층 두께(~5.3 nm)는 단백질의 효율적인 삽입과 기능 보존을 지원합니다.

서론

양친성 블록 공중합체는 수용 내에서 자기 조립하여 막을 형성할 수 있으며, 막은 자발적으로 굽어 닫혀 구형의 막으로 둘러싸인 구획인 폴리머좀(고분자 소포)을 형성합니다. 지질막과 비교할 때, 폴리머 기반 구획은 화학적 다양성과 향상된 화학¹, 기계적 안정성²를 제공하여 약물 전달, 나노 및 마이크로 반응기, 내구성 강한 인공 세포 제작과 같은 응용 분야에 매우 매력적입니다. 우리 연구팀과 다른 연구자들은 인공 세포소기관과^세포 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15를 생성하여 고분자 막을 기능화했습니다 . 폴리(디메틸실록산)(PDMS) 소수성 코어를 포함하는 고분자는 높은 사슬 유연성과 단백질의 방막 관통 도메인에 더 잘 맞도록 막 소수성 두께를 조절할 수 있기 때문에 막 단백질 통합에 특히 적합합니다^. 우리 연구실은 주로 접목 공중합체 폴리(디메틸실록산)-접목-폴리(에틸렌 옥사이드)(PDMS-g-PEO)에 집중해 왔으며, 이 물질은 기존 지질 이중층보다 부드럽고 두께가 약 5.3 nm1인 고동적 막 ^4,16,17을 형성^{합니다. 다른} 연구팀들은 PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA⁵와 같은 PDMS 기반 삼블록 공중합체를 성공적으로 사용했습니다막 단백질 재구성을 위해 ,^{6,7,8,9,10,11} 및 PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹². 특히 지질과 혼합된 하이브리드 시스템에서 PBD-b-PEO와 같은 비교적 강단한 이블록 공중합체도 단백질 통합에 성공적으로 활용된^{바 있습니다.} 이러한 사례들은 고분자 기반 막이 재구성 플랫폼으로서 얼마나 다재능적인지를 강조하며, 이는 추가로 화학 안정성¹과 장기적인 기능 수명을 제공할 수 있습니다. 고분자/지질 하이브리드 막이 순수 고^{분자 시스템의} 화학적 안정성을 항상 충족하지는 못할 수 있지만, 고분자의 기계적 견고성과 지질의 생물학적 중요성을 결합하여 매력적인 타협점을 제공합니다. 이로 인해 합성 재료의 주요 장점을 보존하면서도 천연 생물학적 막을 더 가깝게 모방하는 막 환경이 만들어집니다. 이러한 하이브리드 아키텍처는 나노스케일 재배열¹과 막¹⁵ 내 도메인 형성으로 인한 양성자 투과성 감소 등 추가적인 장점을 제공할 수 있습니다.

막 단백질을 나노 크기 소포(LUVs)로 재구성하는 여러 기법이 있으며, 여기에는 유기 용매 매개 재구성(예: 역상 증발, 지질 단백질 막의 재수화), 기계적 접근법(예: 초음파 검사, 프렌치 프레스, 동결-해동), 세제 매개 재구성(세제 제거, 희석 또는 직접 결합을 통해)¹⁸, 그리고 스티렌-말레산 공중합체 나노디스크에서의 직접 전달과 같은 최근의 전략이 포함됩니다¹⁹. 포린은 예를 들어 재수화 과정에서 단백질을 폴리머 필름에 첨가하여 직접 삽입하여 폴리머 LUV에 성공적으로 통합된 바^{있습니다.} 이 방법은 일반적으로 더 크거나 복잡한 막 단백질에서 삽입 효율이 낮아지며, 종종 무작위 단백질 배정을 초래합니다. 따라서 세제를 조절해서 첨가한 후 제거하는 세제 매개 재구성법이 가장 널리 사용되는 방법으로 남아 있습니다. 또한 특히 기능적으로 방향을 제어하는 비대칭 단백질에서 더 큰 막 단백질을 고분자 기반 LUV에 통합하는 데 선호되는 전략입니다. 이 접근법에서는 소포 막이 먼저 선택한 세제(포화 세제 농도를 R_sat로 표기), 부분 용해(소포와 미셀의 공존), 또는 완전히 용해되어 미셀로 분해된 상태(세제 농도는 R_sol로 표기)를 합니다. 이 초기 막 처리 후에는 단백질 첨가, 배양, 세제 제거가 이어집니다¹⁸. 후자는 투석, 크기 배제 크로마토그래피, 또는 소수성 폴리스티렌 비즈(예: 바이오 비즈)에 흡착하는 방식으로 달성할 수 있습니다. 세제 선택, 농도, 제거 방법은 각 막 유형과 단백질에 최적화되어 통합 효율을 극대화하고 단백질 방향을 조절합니다²⁰.

LUV는 대량 활성 측정에 적합하지만, 단일 소포 연구와 광학 현미경 기반 분석은 막 단백질을 거대한 단층 소포(GUVs)로 재구성해야 합니다. 단백질을 GUV에 통합하는 데는 다섯 가지 주요 방법이 사용됩니다: 단백질과 유기 용매가 존재하는 공형성²¹, 세제 존재 하의 공형성²², 세제 희석을 통한 사전 형성된 GUV에 삽입²³, 프로테오-LUVs와 막 융합을 통한 삽입^16,24, 그리고 융합-전기형성²⁵. 이러한 접근법은 지질 GUV에 성공적으로 적용되었으나, 고분자 또는 고분자/지질 하이브리드 GUV로의 전이는 종종 도전적입니다. 특히, 공형성 및 세제-희석 방법은 종종 고분자 막에서 삽입 효율이 낮거나 특정 고분자 조성과 호환되지 않습니다¹⁵. 추가적인 퓨소제를 사용하는 융합 기반 전략 4,16,24,26,27도 문제를 일으킬 수 있는데, 합성 양이온 지질/폴리머나 퓨소제닉 펩타이드는 막 단백질의 안정성을 저해하거나 막 특성을 변화시키거나 표적 단백질의 통합 효율을 저하시킬 수 있기 때문입니다. 융합-전기형성은 이러한 한계를 극복하며, 막 단백질을 고분자 및 고분자/지질 하이브리드 GUV^{에 통합}하는 견고하고 효율적인 방법임이 입증되었습니다 ^1,5,15. 이 접근법은 막의 무결성과 단백질 기능을 보존하면서 제어된 단백질 통합을 가능하게 하여, 단백질 기능화된 고분자 GUV 생성에 특히 적합합니다.

프로톤 펌프를 폴리머 기반 소포로 재구성하는 것은 내구성 있는 인공 세포를 만드는 데 필수적이며, 이는 생명체의 기본 에너지 화폐인 막 간 양성자 구배를 생성할 수 있게 합니다. 통제된 최소 막 환경에서 화학내투 에너지 변환을 재구성함으로써^이 소포들은 ATP 합성, 능동적 수송, 대사 반응을 촉진하여 자율적이고 생명적인 기능을 위한 에너지 기반을 마련합니다. 이러한 시스템에서 사용되는 대표적인 프로톤 펌프 중 하나는 대장균(E. coli)에서 추출한 사이토크롬 보₃ 산화효소로, 산소 환원과 양성자 막 전위를 결합하는 말단 호흡 효소입니다. 전자 전달과 양성자 펌핑이 밀접하게 결합되어 있기 때문에, 합성 소포에서의 활성은 산소 소비량 ^1,20 또는 양성자 구배 형성^{추적 1}을 통해 정량적으로 모니터링할 수 있습니다.

본 프로토콜에서는 순수 폴리머 및 폴리머/지질 하이브리드 막을 포함한 PDMS-g-PEO 기반 LUV의 준비, 막 단백질과의 기능화, GUVs로의 확장, 그리고 대량 산소 소비 분석법과 단일 소포 양성자 펌핑 측정을 통한 재구성된 양성자 펌프 사이토크롬 bo₃ 산화효소의 활성 측정을 포함한 상세한 워크플로우를 제시합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜 중 발생하는 모든 유해 화학 폐기물은 기관 및 지역 규정에 따라 처리되어야 합니다.

1. 바이오 비즈 SM-2 준비

참고: 바이오 비즈 SM-2는 세제 흡착 전에 방부제와 유기 오염물질을 제거하기 위해 메탄올로 미리 세척됩니다.

1. 필터 종이를 유리 깔때기에 넣고, 깨끗한 유리 비커나 플라스크 위에 올려놓으세요.
2. 깔때기에 최소 600mg의 Bio-Beads SM-2를 추가하세요(하이브리드 및 폴리머 LUV 모두에 대해 3회 재구성 시 충분한 양).
   참고: 재구성당 최소 90mg의 바이오-비즈 SM-2가 필요하며, 이는 4.4.1 단계에 명시되어 있습니다. 더 많은 재구성이 계획된다면 더 많은 금액을 준비할 수 있습니다.
3. 구슬을 순수 메탄올로 세 번 세척하며, 매번 구슬을 완전히 담갈 수 있을 만큼 충분한 부피를 사용하세요.
   주의: 화학 연기 후드에서 모든 메탄올 취급 절차를 수행하세요.
4. 즉시 Milli-Q 물로 세 번 비즈를 세척하여 잔여 메탄올을 제거하세요.
   참고: 세척 중 구슬이 마르지 않도록 하세요. 세척액을 제거할 때는 비즈가 촉촉한 상태를 유지하고 완전히 마르지 않도록 하세요.
5. 세척된 구슬을 적절한 저장 용기(예: 멸균된 50 mL 폴리프로필렌 원심분리관 또는 뚜껑이 꽉 닫힌 유리병)로 옮기고, Milli-Q 물을 넣어 구슬이 완전히 잠길 때까지 넣은 후 최대 3개월간 4 °C에서 보관합니다.

2. 막 단백질의 형광 표지

1. 단백질 희석
   1. 사이토크롬 bo₃ 산화효소를 0.05% n-도데실 β-D-말토사이드(DDM)(w/v), pH 8.3 함유 20 mM HEPES 버퍼에 2.2 mg/mL로 용해합니다. 이 pH는 효율적인 표지에 충분한 비율의 비양성자(반응성) 1차 아민을 보장합니다.
      참고: ATTO N-하이드록시숙시니미딜(NHS) 염료로 최적의 표지를 위해 완충 pH를 8.3에서 8.5 사이로 유지하세요. 다른 염료의 경우, 권장 라벨링 조건을 포함한 제조사의 단백질 접합 지침을 따르세요.
2. 염료 첨가
   1. 아민 반응성 ATTO 643 N-하이드록시숙시니미딜(NHS) 에스터를 무수 DMSO에 2 mg/mL로 용해한 8배 과잉 단백질 용액에 첨가합니다.
      참고: 다른 염료의 경우, 염료와 단백질 간 권장 몰 과잉 성분을 포함한 제조사의 단백질 결합 지침을 따르세요.
   2. 염료가 균일하게 분포되도록 마이크로 원심분리기 튜브를 세 번 두드려 부드럽게 섞으세요.
3. 부화
   1. 반응 혼합물을 실온(20–25°C)에서 1.5시간 동안 부드러운 교반(250rpm)으로 열믹서에서 어두운 곳에서 배양하여 광표백을 방지합니다.
4. 결합되지 않은 염료 제거
   1. Superdex 200 10/300 GL 컬럼(CV: 23.562 mL)을 최소 2컬럼(약 48 mL)의 막 단백질 용출 버퍼(20 mM HEPES, pH 7.5, 200 mM KCl, 0.05% DDM (w/v))를 ÄKTA 정제 시스템을 사용하여 0.3 mL/min의 유량으로 평형을 맞춥니다.
      참고: 과도한 형광 염료를 제거하려면, 특히 친수성이 낮은 염료의 경우 10–20cm 길이의 짧은 젤 여과 기체가 일반적으로 충분합니다. 염료 제조사는 Sephadex G-25 매트릭스를 이용한 탈염을 권장합니다. 이 연구에서는 기기의 가용성 때문에 Superdex 200 10/300 GL 컬럼이 사용되었습니다.
   2. 1 mL 모세관 루프를 이용해 최대 500 μL의 표지된 단백질을 적재하고, 같은 완충액으로 분당 0.3 mL로 용출합니다.
   3. 단백질은 280nm, ATTO의 643 염료는 643nm에서 흡수를 측정하여 용출을 모니터링합니다.
   4. 1.5 컬럼 부피에 걸쳐 0.5 mL 분획을 수집합니다. 단백질과 염료를 모두 포함하는 분획을 식별합니다. 충분히 농축되면 직접 사용하거나, 아미콘 원심 필터 유닛을 사용해 농축하세요. Amicon 필터를 사용해 농축을 위해서는 분자량 30 kDa의 원심 필터를 사용하고, 14,000 × g 원심분리기를 4 °C에서 30분간 사용하세요.
5. 단백질 농도 및 표지 정도(DOL) 측정
   1. 정제된 켤레의 흡수 스펙트럼을 측정합니다.
   2. 단백질 농도와 효소당 평균 염료 분자 수를 다음과 같이 계산합니다:
      
      여기서 A_max는 염료 흡수 최대치(λ_abs; ATTO 643, λ = 643 nm), A₂₈₀은 280 nm에서의 흡광도(단백질 흡수 최대치), _{ε 프로트}는 변성 시토크롬 bo₃ 산화효소의 몰 소광 계수(184,720 M⁻¹cm⁻¹), ε_염료는 염료의 몰 소광 계수(150,000 M⁻¹cm⁻¹), CF₂₈₀은 280 nm에서 ATTO 643 흡수력의 보정 계수(0.04)입니다.

3. 대형 유라멜라 소포(LUV) 준비

1. 얇은 폴리머 또는 폴리머/지질 필름의 준비
   1. 용매 저항 팁이나 가스 밀폐 유리 주사기를 사용하는 양방향 피펫을 사용해 클로로포름:메탄올(2:1, v/v)에 용해된 폴리머, 지질, 형광 염료 용액을 표 1에 나열된 조성에 따라 깨끗한 유리 바이알로 옮깁니다.
      주의: 모든 용매 취급은 보호용 장갑과 안전안경을 착용한 채 연기 후드 아래에서 진행됩니다.
   2. 바이알을 똑바로 세운 채 부드럽게 소용돌이로 섞어 균질성을 유지하세요.
      주의: 소용돌이 속도를 조심스럽게 조절하여 액체가 바이알에서 튀거나 손에 튀지 않도록 하세요.
   3. 유기 용매를 연기 후드에서 부드러운 질소 흐름 아래 약 1시간 증발시킨 후, 바이알 벽에 균일한 얇은 막이 형성될 때까지 유지합니다(그림 1).
      참고: 액체가 튀지 않고 부드럽게 움직이도록 질소 흐름을 조절하세요; 유량이 너무 높으면 필름이 고르지 않게 형성될 수 있습니다. 5분에서 10분 후에는 소포 혼합물이 바이알 바닥을 따라 완전히 건조되고 고르게 퍼지도록 유량을 약간 증가시킬 수 있습니다.
2. 필름 재수화
   1. 건조된 필름을 1 mL의 재수화 완충제(1 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM 자당)로 재수화하여 최종 양피성 농도인 5 mg/mL(중합체의 경우 1.67 mM, 하이브리드 소포의 경우 2.14 mM에 해당)를 얻습니다. 재구성에 중합체를 사용하는 경우, 0.1% 나트륨 콜레이트를 보충하여 재수화 버퍼를 투여하세요.
      주의: 콜레이트나트륨은 가벼운 자극물질입니다. 피부 접촉과 파우더 흡입을 피하세요. 제조사의 안전 데이터 시트(SDS)에 따라 핸들링을 하세요.
   2. 필름이 완전히 분리되어 부유될 때까지 격렬하게 소용돌이를 돌리며, 다층 소포(MLV)를 형성합니다.
3. 동결-해동 사이클 (하이브리드 소포만)
   1. 하이브리드 MLV 현탁액을 다음과 같이 5번의 동결-해동 사이클에 적용합니다: 샘플을 액체 질소에 1분간 동결시키고, 35°C 수욕에서 완전히 녹일 때까지 해동하며, 튜브 셰이커를 사용해 2500–3000rpm에서 30초간 소용돌이를 만듭니다. 이 과정을 총 5주기 동안 반복합니다.
      참고: 순수 폴리머좀은 이 단계를 건너뛰세요.
      주의: 액체 질소(−196 °C)는 심각한 극저온 화상을 일으킬 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(극저온 장갑, 안전 안경, 실험복)를 착용하고 환기가 잘 되는 곳에서 다루세요. 피부와 눈과의 접촉을 피하세요.
4. 압출
   1. 소포 현탁액을 100 nm 기공 크기의 폴리카보네이트 멤브레인이 장착된 미니 익스트루더로 옮깁니다.
   2. 현탁을 21번 압출하여 크기가 균일한 LUV를 얻습니다.
      참고: 최종 압출 단계가 LUV 서스펜션이 초기 로딩 주사기와 반대편에 남도록 하세요. 이로 인해 막을 완전히 통과하지 못한 더 큰 소포나 잔류 물질이 최종 샘플에 오염되는 것을 최소화할 수 있습니다.
5. 저장
   1. LUV 현탁액은 4°C에 보관하고 일주일 이내에 사용하여 소포 크기 분포를 유지하고 자당 함유 완충제 내 응집이나 미생물 증식을 방지하세요.
   2. 사용 전에 부드럽게 소용돌이로 LUV 서스펜션을 균질화하세요.

4. 막 단백질의 LUV로 재구성됨

1. 세제로 소포를 전처리하기
   1. 200 μL LUV를 2 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다(그림 1). 하이브리드 LUV를 사용할 경우, 20% 콜레이트 나트륨 1 μL을 첨가하여 최종 세제 농도가 0.1%(w/v)를 얻습니다. 폴리머 LUV를 사용할 경우, 이미 콜레이트나트륨이 존재하므로 추가 세제가 필요하지 않습니다.
      참고: 실험에 사용된 것과 동일한 완충제에 세제 재고를 준비하여 소포와의 호환성을 확인하세요.
   2. 마이크로 원심분리기 튜브를 세 번 가볍게 두드려 부드럽게 섞으세요. 거품을 일으키거나 기포를 유발할 수 있는 격한 교란이나 소용돌이 현상은 피하세요.
2. 세제 처리 소포에 단백질 도입
   1. 세제로 불안정화된 소포에 사이토크롬 bo₃ 산화효소(활성 측정용) 또는 사이토크롬 bo₃ 산화효소–ATTO 643(형광 영상용)을 첨가하여 최종 단백질 농도를 얻습니다: 폴리머좀의 경우 LUV 실험은 0.556 μM, GUV 실험은 1.112 μM; 하이브리드 소포의 경우 LUV 실험은 0.714 μM, GUV 실험은 1.428 μM입니다.
      참고: 이 농도는 LUV의 경우 단백질 대 고분자 몰 비율 1:3,000, GUV의 경우 1:1,500에 해당합니다.
   2. 단백질을 천천히 넣으면서 부드럽게 섞으면서, 용액 전체에 고르게 분포하고 국소 과농도를 방지하는 것이 목표입니다.
      참고: 단백질 스톡 농도 차이로 인해 첨가된 단백질의 양은 분획마다 다를 수 있습니다.
3. 단백질-세제-고분자 복합체의 조립
   1. 혼합물을 4°C에서 30분간 가볍게 교반(400rpm)하며 열믹서에서 배양하여 혼합된 단백질-세제-폴리머 조립체가 형성되도록 하여 세제를 제거하기 전에 사용합니다.
4. 세제 제거
   1. 세제는 순차적으로 바이오-비즈 SM-2(바이오-라디)를 첨가하여 제거합니다. 저장액에서 30mg의 바이오비즈를 제거하여 촉촉한 상태(젖은 상태지만 과도한 액체 없음)를 유지하세요. 비즈를 샘플에 넣고 4°C에서 30분간 600rpm의 부드럽게 저으며 열믹서에서 배양합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하면 총 90mg 바이오 비즈와 1.5시간의 배양 시간이 됩니다.
      참고: 완전히 수분이 들어간 바이오 비즈만 사용하세요. 마른 비즈, 바이오 비즈 스톡 튜브 벽에 달라붙은 비즈, 표면에 떠 있는 비즈는 옮기지 마세요. 추가된 후 재구성 반응관 벽에 액체 수준 위에 비즈가 부착되면, 잠시 원심분리기(예: 벤치 탑 미니 원심분리기에서 3–5초)하여 배양 전에 바닥에 비즈를 수집합니다.
   2. 바이오 비즈를 2,000 × g에서 벤치탑 미니 원심분리기를 사용해 2분간 원심분리하여 펠릿으로 뿌립니다. 비드 펠릿을 건드리지 않고 상청액을 조심스럽게 수집하세요.
      참고: 원심분리 대신 구슬을 중력에 의해 약 5분간 가라앉히게 한 후 상원액을 조심스럽게 제거하세요.
5. 저장
   1. 재구성된 bo 3-LUV를 4°C에 저장하고 같은 날 단백질 활성 측정에 사용한다.

5. 동적 빛 산란(DLS)에 의한 LUV의 크기 및 분산

1. DLS 측정을 위한 LUV 로딩
   1. 45μL 희석되지 않은 LUV 또는 프로테오-LUV 현탁액을 깨끗한 석영 쿠벳에 옮깁니다. 큐벳에 먼지, 지문 또는 기타 잔여물이 없는지 확인하여 빛 산란 인공물을 최소화하세요.
      참고: 공기 방울을 도입하지 마세요. 이는 DLS 측정에 방해가 될 수 있습니다. 기포를 방지하기 위해 샘플을 큐벳 벽을 따라 천천히 피펫팅하며 마지막 방울은 강하게 배출하지 마세요. 작은 기포가 생기면 측정 전에 기포가 상승했다가 사라지도록 기다려 두세요.
2. DLS에 의한 LUV 크기 및 분산 결정
   1. 633nm 헬륨-네온 레이저와 173° 고정 각도에서 역산란 검출이 장착된 DLS 기기를 사용하여 유체역학적 직경과 다분산 지수(PDI)를 측정합니다.
   2. 재현성을 보장하기 위해 샘플당 최소 세 가지 독립적인 측정을 수행하세요.
   3. 범용 (정규분포) 모델을 사용하여 데이터를 분석하여 평균 크기와 PDI를 구합니다.

6. LUV의 산소 소비 분석

1. 온도 설정
   1. 클라크형 산소 전극 시스템의 측정 챔버를 22 °C로 설정하고 시스템이 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
2. 버퍼 추가
   1. 측정실에 1 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 200 mM 자당 버퍼를 추가하여 총 부피 1,000 μL로 만듭니다. 샘플 유형에 따라 버퍼 부피를 조절합니다: 폴리머 보_3-LUV는 942.9 μL, 하이브리드 보_3-LUV는 953.7 μL.
      참고: 나머지 부피는 LUV와 DTT/Q₁ 혼합물이 차지하여 최종 측정 부피에 도달합니다.
3. LUV 추가
   1. 측정실에 _3-LUV를 추가하고 100rpm, 22°C에서 자기 교반기를 사용해 부드럽게 저어주기 시작하세요. bo_3-LUV의 부피를 조정하여 이론상 bo ₃ 산화효소 농도를 약 27 nM(폴리머 bo_3-LUV는 48.6 μL, 하이브리드 bo_3-LUV는 37.8 μL)로 달성합니다.
      참고: 음성 대조군의 경우, bo_3-LUV를 동일한 지질/고분자 조성과 농도를 가진 단백질 없는 LUV로 대체하십시오. 이후 모든 단계는 동일하게 유지됩니다.
4. 기준선 측정
   1. 산소 농도를 안정시키고 22°C에서 3분간 지속적으로 저어주어 안정적인 기준선을 얻으세요.
5. 환원/퀴논 혼합물 준비
   1. DTT/Q₁ 혼합물을 사용 직전에 밀리-Q 물에 1 M DTT 9.6 μL와 DMSO에 80 mM 유비퀴논-1(Q₁) 0.6 μL을 혼합하여 균일성을 확보하여 완전히 소용돌이를 만듭니다.
6. 효소 활성화
   1. 측정실에 신선하게 준비된 DTT/Q₁ 혼합물 8.5 μL을 첨가하여 bo₃ 산화효소를 활성화하면, 최종 농도는 8 mM DTT와 40 μM Q₁ 농도를 얻습니다.
7. 복제
   1. 재현성을 위해 각 샘플을 세 번 측정하세요.
8. 데이터 분석
   1. 산소 농도와 시간 관계를 그래프로 그려보세요. 곡선의 선형 부분의 기울기를 결정하는데, 이는 산소 소비율에 해당합니다.
9. 보고
   1. 산소 소비율을 세 가지 측정값의 평균으로 보고하고, 표준편차를 포함하세요.

7. 단백질 기능화된 GUV의 제조

1. ITO 코팅 유리 슬라이드의 플라즈마 세척
   1. 인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 유리를 플라즈마 클리너에 넣고, 전도성(ITO 코팅된) 면을 위를 향하게 합니다. 플라즈마는 고출력 설정("HI")(230 V, 최대 RF 전력 18 W)과 약 0.5 mbar 압력에서 1분간 세척합니다.
      참고: 플라즈마 점화는 챔버 내부에 분홍색/보라색 빛이 나타나는 것으로 시각적으로 확인할 수 있습니다.
2. 프로테오-LUV의 부분 탈수
   1. 단백질 없는 LUV 20 μL과 재구성된 bo₃ 산화효소-ATTO 643을 포함한 프로테오-LUV 20 μL을 혼합합니다. 균일하게 섞이기 위해 부드럽게 소용돌이를 돌리세요.
   2. 전기성형에 사용되는 각 슬라이드의 전도성(ITO 코팅) 표면에 생성된 5 mg/mL LUV/프로테오-LUV 현탁액 7개의 2 μL 방적을 증착합니다(그림 2A). 방울을 160.6 mm² 표면에 고르게 분포하여 균일한 필름 형성을 촉진합니다.
      참고: 다른 고분자 시스템의 경우 LUV 농도와 방울 부피는 최적화가 필요할 수 있습니다(일반적인 범위: 5–100 mg/mL LUV; 0.2–2 μL 방울).
   3. 물방울을 상온(약 22°C)과 약 20% 습도에서 약 40분 동안 부분적으로 탈수시키거나, 방울 둘레에 흰색 고리가 형성될 때까지 기다립니다(그림 2B).
      참고: 탈수는 주변 습도에 따라 달라집니다. 상대습도가 40% 이상이라면 필요하다면 탈수 시간을 최대 20분까지 연장하세요. 고정된 시간이 아니라 물방울 둘레에 흰색 고리가 나타나는 것을 기준으로 종점을 결정하세요. 일정한 환경 조건(온도와 습도) 하에서는 필요한 탈수 시간이 재현 가능합니다. 과도한 건조는 완전히 평평하고 균일하게 흰색인 물방울로 나타나 단백질 침전을 유발할 수 있으므로 피하세요.
3. 전기형성실 조립
   1. 두 개의 ITO 코팅된 슬라이드(안쪽을 향한 코팅된 슬라이드)를 1.81mm 두께의 실리콘 스페이서로 샌드위치로 조립하며, 한쪽 면에 절단이 있어 충전 및 수집 시 완충제를 추가하거나 제거할 수 있습니다.
   2. 챔버를 재수화 완충제(1 mM 트리스-HCl, pH 7.5; 200 mM 자당)로 채웁니다.
      pH 민감 실험의 경우, 완충액에 10 μM 피라닌(8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 트리소듐 염, HPTS)을 첨가합니다.
4. 전기성형
   1. 다음 프로그램을 사용하여 사인파 교전장을 인가합니다: 50 Hz, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 900 mV 각각 6분 동안 사용; 50Hz, 1.1V, 2시간 동안 사용.
      참고: 더 큰 프로테오-GUV 형성을 촉진하기 위해 이 단계는 분리 단계에서 12시간, 4Hz, 2 V에서 30분간 연장할 수 있습니다. 버퍼에 10 μM 피라닌이 있을 때는 첫 두 단계의 전압 증가 단계에서 주파수를 500Hz로 증가시킵니다.
5. GUV 컬렉션
   1. 핀셋으로 챔버를 조심스럽게 열고 FineTip Ultra-Micro Pastette 피펫(또는 동등한 저전단 전도 피펫)으로 GUV를 채취하여 기계적 스트레스를 최소화하세요.
      참고: 표준 저용량 피펫 팁 200 μL 미만은 큰 GUV가 파열될 수 있으므로 피해야 합니다. 또는 표준 팁을 끝에서 잘라 구멍을 넓히고 수집 시 전단을 줄일 수도 있습니다.
6. 저장
   1. 프로테오-GUV는 4°C에 보관하고 48시간 이내에 사용하여 단백질 활성을 보존하세요.
      참고: 활성 손실 속도는 재구성된 막 단백질의 유형과 안정성, 그리고 막의 조성에 따라 달라집니다.

8. 단백질 기능화된 GUV의 현미경

1. 현미경 설치
   1. 공초점 현미경을 켜. 라이카 시스템을 사용 중이라면 LAS X 소프트웨어를 실행하세요. 다른 현미경 브랜드의 경우, 제조사가 권장하는 획득 소프트웨어를 사용하세요.
   2. 63× 오일 침수 목표물(NA 1.40)을 선택; GUV 크기에 따라 필요에 따라 더 높이거나 낮은 배율로 조절할 수 있습니다.
   3. 형광체에 대응하는 두 개의 영상 채널을 열어: 로다민 적색(막)과 ATTO 643(재구성 단백질).
      참고: 부분적으로 겹치는 스펙트럼을 가진 형광체의 경우, 스펙트럼 교차를 최소화하기 위해 적절한 레이저 선과 좁은 검출 창을 선택하세요. 각 채널을 순차적으로 획득하여 신호 누출을 방지하고 정확한 형광 정량을 보장합니다.
2. GUV의 퇴적
   1. 깨끗한 No. 1.5 유리 커버슬립(두께 0.17mm)에 프레스 투 씰 실리콘 아이솔레이터를 붙이세요.
      참고: 직립(비역형) 현미경의 경우, 더 두꺼운 유리 슬라이드를 사용할 수 있습니다.
   2. 스페이서 중앙에 60 μL 버퍼(1 mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM 포도당)를 피펫 삽입합니다.
   3. 버퍼 위에 GUV 현탁액 20μL을 부드럽게 추가하세요.
   4. 증발을 막기 위해 즉시 두 번째 유리 커버 슬라이드로 챔버를 덮으세요.
   5. GUV가 침전될 때까지 ~5분 정도 기다려 영상을 찍으세요.
3. 이미지 획득
   1. GUV의 단면을 포착하려면 챔버 바닥에 초점을 맞추세요.
   2. 방 내 다양한 GUV의 이미지를 왼쪽 상단에서 오른쪽 하단('뱀' 패턴)으로 체계적으로 스캔하여 대표성 집단(~100 GUV)을 얻습니다. 선선택 없이 스캔 중 만난 모든 소포를 크기나 형광 강도에 관계없이 영상화하여 선택 편향을 피하고 재현성을 보장합니다.
      참고: 광표백을 방지하기 위해 동일한 GUV를 반복 촬영하지 마세요.
4. 이미지 분석
   1. 개별 GUV의 막을 따라 폴리라인을 그려 재구성된 ATTO 643 표지 단백질의 형광 강도를 정량화합니다. LAS X 소프트웨어를 사용할 때는 라인 프로파일 → 정량화(Quantify Line Profile)를 선택한 후 폴리라인 도구를 선택해 각 GUV의 멤브레인을 따라 추적하세요. 평균 형광 강도를 얻으려면 통계 도구를 열고 평균값을 기록합니다. 깨끗하고 단층 GUV만 분석하세요; 분석에서 다낭포 및 집집 소포는 제외합니다.
      참고: 측정이 다른 날에 이루어진 경우, 형광 강도는 동일한 영상 설정(파장 및 명목 전력)에서 레이저 출력에 맞게 정규화되어야 합니다. 레이저 출력의 일상별 변동을 고려하기 위해 다음과 같은 정규화가 적용됩니다: 여기서 F_a.u. 는 임의의 단위로 측정된 형광 세기, P_기준 은 기준일에 측정된 레이저 파워, 는 획득일에 측정된 레이저 출력입니다. 이 보정은 비포화 조명 조건에서 레이저 출력과 형광 세기 간의 선형 관계를 가정합니다. 본 연구에서는 모든 영상이 같은 날 촬영되었으므로 정규화가 필요하지 않았습니다.
   2. 형광 강도는 평균 100 GUV와 해당 표준편차로 보고합니다.

9. 프로테오-GUV에서의 양성자 펌핑 분석

1. 현미경 설치
   1. 공초점 현미경을 켜고 적절한 획득 소프트웨어(예: 라이카 시스템용 LAS X)를 실행하세요.
   2. 63× 오일 침수 대물렌즈(NA 1.40)를 선택하세요. GUV 크기에 따라 필요하면 더 높거나 낮은 배율로 조절하세요.
   3. 형광체에 대응하는 세 개의 영상 채널을 구성하세요. 로다민 적색(막 마커)의 경우, 여기 561nm, 방출 범위는 570–620nm입니다. 피라닌(캡슐화된 pH 민감성 염료)의 경우, 448nm와 405nm에서 여기를 사용하고, 499–551nm 거리에서 방출을 수집합니다.
      참고: 458nm 레이저가 있다면, 탈양성자화(염기성기) 형태의 피라닌을 여기시키기 위해 448nm 레이저 대신 사용하세요.
   4. 레이저 출력과 검출기 이득을 조정하여 픽셀 포화를 피하고 광표백을 최소화하세요. 실험 내내 획득 설정을 일정하게 유지하세요.
2. GUV의 퇴적
   1. 8웰 챔버 슬라이드의 한 웰에 280 μL(1 mM 트리스-HCl, pH 7.5; 200 mM 포도당)을 추가합니다(총 웰 부피: ~874 μL).
      참고: 200 μL 미만은 사용하지 마세요. 200 μL 이하일수록 증발과 pH 이동이 증가합니다. 400 μL를 초과하지 말아 유출을 방지하고 피펫팅을 편안하게 해야 합니다. 다른 챔버 포맷을 사용할 경우, 볼륨을 그에 맞게 조절하세요. 역현미경의 경우, #1.5H 커버슬립 두께와 호환되는 챔버 슬라이드를 사용하세요.
   2. 공기 방울을 유발하지 않고 버퍼 위에 bo _3-GUV 현탁액 20μL을 부드럽게 추가하세요.
      참고: 음성 대조군의 경우, bo_3-GUV 현탁액을 동일한 지질/고분자 조성의 단백질 무첨가 GUV 부유액(20 μL)으로 교체하며, 동일한 조건에서 준비 및 침전됩니다. 이 대조군은 _Bo3 산화효소 활성과는 무관하게 DTT와_Q1이 피라닌 형광 비율에 미치는 비특이적 영향을 고려합니다.
   3. 영상 촬영 전에 GUV가 약 5분간 침전되도록 두세요.
3. 기준선 획득
   1. GUV가 침전된 챔버 하단면에 집중하세요.
   2. 줌을 조절하면 시야 내에 3–6개의 GUV가 나옵니다.
   3. 활성화 5분 전 모든 채널에서 기초 형광을 기록하세요.
4. 양성자 펌핑의 활성화
   1. 사용 직전에 1 M DTT 4.8 μL과 80 mM Q₁ 0.3 μL를 DMSO에 혼합하여 신선한 DTT–Q₁ 혼합물을 준비한 후 소용돌이 작용으로 충분히 혼합합니다.
   2. 피펫 팁을 완충기에 삽입하지 않고 DTT–Q₁ 혼합물 2.6 μL을 용액 표면에 부드럽게 첨가하여 사이토크롬 bo₃ 산화효소를 활성화하여, 챔버 내 최종 농도는 약 8 mM DTT와 40 μM Q₁ 수준으로 나옵니다.
   3. 지속적 획득 상태에서 30분간 소포 내 피라닌 형광을 모니터링합니다.
5. 소포 내 피라닌 형광 분석
   1. 각 GUV에 대해 소포 내의 관심 영역(ROI)을 정의합니다. LAS X 소프트웨어에서 Quantify → Stack Profile에 가서 Draw Ellipse를 선택한 후 각 GUV 안에 원형 ROI를 그려보세요.
   2. 499–551 nm에서 두 가지 여기 파장(448 nm 및 405 nm)에 대해 평균 형광 강도를 측정하기 위해 소프트웨어에서 통계 모드를 열고 평균값을 기록합니다.
   3. 형광 비율을 R = I₄₄₈ / I₄₀₅로 계산합니다.
   4. 시간에 따른 비율을 그래프로 표시하여 소포 내 pH 변화의 동역학적 흔적을 얻습니다.

결과

대장균 사이토크롬 bo₃ 산화효소^{는 대}장균 C43(DE3) ΔcyoABCDE의 플라스미드 pETcyo에서 발현되었으며, 앞서 설명한 대로 정제되었습니다. 정제된 _bo-3 산화효소는 재구성 및 활성 측정에 직접 사용되었거나, ATTO 643(본 연구)과 같은 형광 염료 또는 다른 ATTO 염료로 표지되었습니다 ^1,15. ATTO 643과 같은 친수성 염료의 경우, 표지된 단백질에서 결합되지 않은 염료를 효율적으로 분리하기 위해 30cm 컬럼을 사용했습니다(그림 3A). 표지량(DOL)은 흡광도 스펙트럼에서 계산되었으며, 일반적으로 사용되는 ATTO 염료에 따라 효소당 1.1–1.3 염료 분자 범위였습니다. ATTO 643으로 표기된 bo₃ 산화효소의 경우 DOL은 1.16이었습니다(그림 3B).

단백질 재구성을 위해 LUV는 먼저 박막 재수화를 통해 준비한 후, 동결-해동 사이클과 압출을 거쳐 균일한 소포 크기를 얻었습니다. 중합체의 경우, 재수화 완충제에 세제가 보충되었습니다. 재구성 전에 소포 크기 분포를 동적 광산란으로 분석했습니다(그림 4, 표 2). 하이브리드 및 폴리머 LUV 모두 평균 직경 85–95 nm를 보이며 크기가 좁았다(PDI < 0.2). PDMS-g-PEO 기반 소포는 압출막의 명목상 기공 크기보다 약간 작을 것으로 예상됩니다. 전형적인 중합체는 PDI 값이 0.1 미만으로 매우 균일한 크기를 보였으나, 하이브리드 소포는 PDI 값이 가끔 0.1을 초과하지만 일관되게 0.2 이하인 비교적 균일한 개체군을 형성했습니다.

그 후 세제(본 연구에서는 콜레이트나트륨)가 있는 LUV에 막 단백질 _bo-3 산화효소를 삽입하였습니다. 세제는 이후 바이오 비즈를 사용해 제거했습니다. 재구성 후 중합체 크기는 약간 증가했을 뿐(그림 4A), 하이브리드 소포 크기는 변하지 않았습니다(그림 4B). 두 시스템 모두 PDI가 소폭 증가하는 것이 관찰되었습니다(표 2). 세제 매개 용해화 및 제거가 막 내 고분자 사슬을 재조직할 수 있으므로 이러한 미미한 크기 변화는 예상됩니다. 단백질 활성은 산소 소비량을 측정하여 단백질이 기능적 활성을 유지했는지 여부를 판단했습니다(그림 5A). 단백질 없는 LUV 음성 대조군에서 산소 소비가 없다는 사실은 관찰된 신호가 _bo-3 산화효소 활성에서 특이적으로 발생함을 확인시켜 줍니다. 여기서 사용된 농도에서 나트륨 콜레이트 매개 재구성은 하이브리드 소포에서 단백질 활성이 폴리머좀보다 약간 더 높았습니다(그림 5B). 정제 배치 간, 심지어 같은 배치 내 분획 간에도 단백질 활성에 약간의 변동이 관찰되었습니다. 따라서 서로 다른 막 시스템 간 단백질 활성을 비교하는 비교 연구에서는 일관성을 보장하기 위해 정제된 단백질의 동일한 비율을 사용해야 합니다.

단백질 기능화된 PDMS-g-PEO 및 PDMS-g-PEO/대두 PC GUV를 생성하기 위해 융합-전기형성 방식을 사용하였습니다. 이 방법에서는 단백질 없는 LUV와 프로테오-LUV를 혼합하여 ITO 코팅 유리 슬라이드에 증착한 뒤, 부분 탈수를 통해 소포 융합과 고분자/단백질 또는 고분자/지질/단백질 막의 형성을 촉진했습니다. 탈수 부족으로 인해 프로테오-GUV 수율이 낮고, GUV 크기가 작아지며, 융합되지 않은 (프로테오-)LUV가 존재했습니다.

표지된 단백질인 bo₃ 산화효소–ATTO 643이 자당/포도당 밀도 구배에서 침전된 후 공초점 현미경으로 막에 성공적으로 통합된 것이 확인되었습니다(그림 6A, B). 단순 선 프로파일을 이용한 막 관련 형광의 정량화는 측정된 강도가 선을 그려지는 각도에 따라 달라지기 때문에 편향될 수 있습니다. 이 효과를 최소화하기 위해 각 GUV의 전체 막 윤곽선을 따라 폴리라인을 그려 형광 강도를 평가했습니다.

소포 크기와 단백질 통합 간의 상관관계를 평가하기 위해 GUV 직경을 병렬로 분석하였다(그림 6C, D). 더 큰 GUV(20 μm 이상)는 일반적으로 작은 소포에 비해 막 관련 단백질 형광이 더 낮았습니다. 이 관찰은 융합-전기형성 메커니즘에 기인할 수 있는데, 작은 소포는 더 일찍 형성되어 단백질을 더 효율적으로 통합할 수 있지만, 더 큰 소포는 이후 융합 및 막 성장으로 인해 단백질이 부족한 물질과 희석될 수 있습니다.

전체 단백질 도입은 주로 세제의 종류, 농도, 첨가 단계에서 LUV로 재구성되는 초기 단계에서 결정됩니다. 고분자 LUV의 경우, 세제를 미리 형성한 소포에 첨가했을 때 소포 형성 단계(재수화 단계)보다 약간 낮은 포입량이 관찰되어 각각 18.9 ± 3.9 a.u., 20.6 ± 3.7 a.u.의 형광 강도를 얻었다(그림 6C, D, 왼쪽). 소포 형성 후에 세제를 첨가하는 하이브리드 시스템에서는 세제 농도가 중요한 역할을 합니다: 콜레이트나트륨 비율을 0.015%에서 0.1%로 올리면 단백질 통합량이 현저히 증가했습니다(22.1 ± 5.2 a.u. vs. 26.2 ± 5.0 a.u., 그림 6C, D, 오른쪽). 폴리머 시스템과 하이브리드 시스템을 비교했을 때, 일반적으로 하이브리드 GUV에서 bo ₃ 산화효소의 막 포함량이 약간 더 높게 관찰되었습니다. 이는 고분자-지질 경계면에 패킹 결함이 존재하기 때문인 것으로 보이며, 세제에 의한 결함 외에도 막 단백질에 유리한 삽입 부위를 제공합니다.

두 번째 전기형성 단계인 2시간을 사용하면, bo₃ 산화효소 기능화된 GUV의 평균 직경은 약 14–15 μm(고분자 GUV는 13.5 ± 3.7 μm, 하이브리드 GUV는 15.4 ± 6.3 μm)였으나, 눈에 띄게 더 큰 소포도 존재했다(그림 6C, D). 두 번째 전기성형 단계를 12시간으로 늘리자 전체 GUV 크기가 ^1,27로 증가했습니다.

융합-전기형성 프로토콜은 전기형성 과정에서 염료를 재수화 버퍼에 첨가하여 pH 민감성 염료(예: 피라닌)를 캡슐화할 수 있게 합니다(그림 7A). GUV 크기는 일반적으로 수용성 염료가 존재하는 곳에서 소포가 형성될 때 감소합니다. 이 효과를 보완하기 위해 초기 전기형성 단계 동안의 주파수를 50–500 Hz에서 증가시켜야 합니다.

피라닌과 같은 비율 pH 민감성 염료의 캡슐화는 단일 소포 프로톤 펌핑 모니터링을 가능하게 하며, 프로톤 펌프의 방향에 대한 통찰을 제공합니다. 소포 내강이 산성화되면 448 nm와 405 nm에서 여기된 피라닌의 형광 비율이 감소합니다. 이 비율은 피라닌의 프로톤화 상태를 반영하여 pH와 상관관계가 있습니다. 비율 측정은 염료 캡슐화 효율과 광표백의 변동에 크게 영향을 미치지 않아 유리합니다. 양성자 펌핑 활동의 예는 그림 7B에 나타나는데, 전자 공여체 DTT와 전자 매개체 Q₁이 첨가된 후 재구성된 bo₃ 산화효소를 포함한 하이브리드 GUV에서 소포내 피라닌 형광 비율(I₄₄₈/I₄₀₅)이 감소하는 것이 관찰된다. 형광 비율은 활성화 약 1분 후 급격히 감소하기 시작하고, 약 1분 동안 급격히 감소하다가 다음 ~18분 동안 느려집니다. 이 행동은 대부분의 _bo-3 산화효소 분자가 GUV 내부로 양성자 펌핑이 일어나도록 배열되어 있음을 나타냅니다. 동일한 조건에 노출된 단백질 없는 GUV는 형광 비율이 더 작게 감소했으며, 이는 음성 대조군으로 작용하여 bo_3-GUV에서 관찰된 큰 감소가 DTT와_Q1의 비특이적 효과가 아닌 bo₃ 산화효소 양성자 펌핑 활동에서 비롯된 것임을 확인시켜 주었습니다.

그림 1. 대형 유니라멜라 소포(LUV) 준비물의 도식적 표현, 막 단백질 사이토크롬 Bo₃ 산화효소의 LUV로 재구성, 그리고 융합-전기형성 접근법을 통한 bo₃ 산화효소 기능화된 거대 유일라멜라 소포(GUV) 형성. LUV 는 박막 재수화, 동결-해동 사이클, 그리고 100 nm 기공 크기의 막을 통한 압출로 제조됩니다. 세제가 존재하는 상태에서 시토크롬 bo₃ 산화효소의 재구성은 세제가 존재하면서, 이후 바이오비즈를 사용해 제거합니다. bo_3-GUV는 인듐 주석 산화물(ITO) 코팅된 유리 슬라이드에 bo_3-LUV를 침착시키고, 전류가 흐르는 상태에서 부분 탈수 및 재수화를 거쳐 형성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2. 탈수에 의한 융합된 대형 단알멜라 소포(LUV) 막의 형성. 혼합 프로테오-LUV와 LUV의 7 μL 방적이 인듐 주석산화물(ITO) 코팅 유리 슬라이드에 침착되었습니다: (A) 증착 직후, (B) 부분 탈수 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. 사이토크롬 bo₃ 산화효소 의 형광 표지. (A) Superdex 200 10/300 GL 컬럼에서 정제된 Bo₃ 산화효소-ATTO 643의 크로마토그램(용출 프로필). 회색으로 강조된 분획들은 수집되어 이후 농축되었습니다. (B) 농축 bo₃ 산화효소-ATTO 643의 흡수도 스펙트럼에서 280 nm(단백질), 400 nm( bo₃ 산화효소의 소렛 밴드 헴 보인자), 643 nm(염료)에서 피크가 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4. 단백질 재구성 전후 대형 단층 소포(LUV)의 크기 분포: (A) 폴리(디메틸실록산)-접목-폴리(에틸렌 옥사이드) (PDMS-g-PEO) 폴리머 및 (B) PDMS-g-PEO/대두 포스파티딜콜린(PC) 하이브리드 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5. 큰 단층 소포(LUVs)에서 재구성된 Bo₃ 산화효소에 의한 산소 소비. (A) 재구성된 시토크롬 bo₃ 산화효소가 디티오트레이톨(DTT)과 유비퀴논-1(Q₁)을 첨가하여 활성화된 후 시간에 따른 산소 농도의 대표적 흔적. 녹색 미량은 단백질 재구성된 LUV에 해당하며, 회색 미적은 음성 대조군(단백질 없는 LUV)에 해당합니다. (B) 폴리(디메틸실록산)-접목-폴리(에틸렌 옥사이드)(PDMS-g-PEO) 및 PDMS-g-PEO/대두 인산티딜콜린(PC) LUVs에서 재구성된 _Bo-3 산화효소의 산소 소비율(OCR). 막대는 세 가지 독립적인 측정값(n = 3)의 평균 ± 표준편차(SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6. 형광 표지된 Bo₃ 산화효소를 거대 단층 소포(GUV)에 삽입. (A) 폴리(디메틸실록산)-접목-폴리(에틸렌 옥사이드)(PDMS-g-PEO) 및 (B) PDMS-g-PEO/대두 인산티딜콜린(PC) GUV(인산틸레탄올라민-로다민(PE-Rho, 빨간색으로 표지된 막)의 대표적인 현미사진으로, 재구성된 사이토크롬 bo₃ 산화효소-ATTO 643(마젠타)이 포함되어 있습니다. 다양한 재구성 조건에서 GUV 크기(N = 100)에 따른 bo₃ 산화효소-ATTO 643 형광 강도의 정량화: (C) 미리 형성된 고분자 대형 단알멜라 소포(LUV)에 0.2% 콜레이트(SC), 혼합 혼합 LUV에 0.015% SC를 첨가; (D) 0.1% SC가 존재하여, 형성 후 0.1% SC로 처리된 하이브리드 LUV가 형성되었습니다. 값은 개별 GUV의 형광 강도를 나타냅니다(조건당 N = 100). 평균 ± 표준편차(SD) 수치가 본문에 보고되어 있습니다. 비교는 묘사적이며; 공식적인 통계 검정은 수행되지 않았습니다. A.U.(임의의 단위). 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 7. 거대 유일라멜라 소포(GUVs)에서 재구성된 _bo3 산화효소에 의한 양성자 펌핑. (A) 폴리(디메틸실록산)-접목-폴리(에틸렌 옥사이드)(PDMS-g-PEO)/대두 인산티딜콜린(PC) GUV의 대표적인 형광 현미사진으로, 0.05 mol% 인산틸레탄올라민-로다민(PE-Rho, 빨간색)으로 표지된 막을 포함하고 있으며, 재구성된 사이토크롬 _bo-3 산화효소와 캡슐화된 pH 민감성 염료 피라닌(여기 405 nm 및 448 nm; 청색 및 녹색 채널)이 챔버 유리 슬라이드에 침전되어 있습니다. (B) 재구성된 bo₃ 산화효소를 포함한 PDMS-g-PEO/대두 PC GUV에서 디티오트레이톨(DTT)과 유비퀴논-1(Q₁)으로 활성화될 때 소포내 피라닌 형광 비율이 변화함. 녹색 흔적은 단백질 재구성된 GUVS, 회색 무늬는 음성 대조군(단백질 없는 GUV)에 해당합니다. 트레이스는 평균 ± 표준편차(SD)(n = 3개의 소포)를 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

	구성 요소	재고	양	최종 막 구성
폴리머좀	염화포름 내 PDMS-g-PEO 메탄올 (2:1, v/v)	10 mg/mL	499.9 μL	99.95 몰%
	클로로포름 내 PE-로다민	1 mg/mL	1.1 μL	0.05몰%
하이브리드 소포	염화포름 내 PDMS-g-PEO 메탄올 (2:1, v/v)	10 mg/mL	450.1 μL	70몰%
	대두 PC (95%) 클로로포름 함유	10 mg/mL	49.8 μL	29.95 몰%
	클로로포름 내 PE-로다민	1 mg/mL	1.4 μL	0.05몰%

표 1: 대형 단층 소포(LUV) 형성을 위한 박막 준비에 사용되는 스톡 용액 및 부피. 스톡 농도는 mg/mL 단위로 표기됩니다. 부피는 5 mg/mL 양피성 농도의 전체 필름에 대해 계산됩니다. 최종 막 조성은 mol% 단위로 표현됩니다. PDMS-g-PEO: 폴리(디메틸실록산)-이식편-폴리(에틸렌 옥사이드); PE-로다민: 포스파티딜레탄올라민-로다민; 대두 PC: 대두 인산티딜콜린; v/v: 볼륨 대비.

	재구성 조건	직경 (nm)	PDI
폴리머좀	재구성 이전	84.34 ± 0.22	0.084
	재구성 이후	100.73 ± 0.81	0.109
잡종	재구성 이전	89.21 ± 0.77	0.129
	재구성 이후	85.01 ± 0.42	0.17

표 2: 재구성 전후 중합체(폴리(디메틸실록산)-접편-폴리(에틸렌 옥사이드), PDMS-g-PEO)와 하이브리드 소포(PDMS-g-PEO/대두 인산티딜콜린(PC))의 평균 소포 크기 및 다분산도(PDI). 이 데이터는 세 가지 독립적인 측정의 평균을 나타냅니다.

토론

폴리머좀과 폴리머/지질 하이브리드 소포는 기존 지질 소포에 비해 화학적 및 기계적 안정성이 향상되어, 약물 전달, 생체감지, 나노 및 마이크로 반응기, 인공 세포 등 다양한 응용 분야에 매우 매력적입니다. 그러나 이들의 독특한 막 구조와 생물물리학적 특성 때문에 지질 소포에 최적화된 프로토콜을 고분자 기반 시스템으로 직접 이전하는 것이 종종 불가능하다 15,20,30. 여기서 제시된 프로토콜은 이러한 차이점을 해결하고, PDMS-g-PEO 기반 고분자 및 하이브리드 LUV로 막 단백질 재구성을 최적화한 워크플로우를 제공하며, 이후 융합-전기성형을 통해 GUV로 확장합니다.

프로토콜에서 중요한 단계는 좁고 재현 가능한 크기 분포를 가진 LUV를 준비하는 것입니다. 지질 막과 마찬가지로 PDMS-g-PEO 필름은 수용성 완충제로 재수화될 때 자기 조립하여 소포로 형성됩니다. 지질 시스템이 단층 및 다층 소포의 혼합을 자주 생성하는 반면, PDMS-g-PEO는 우선적으로 단층 구조¹을 형성하여 지질 준비물에서 다층 층을 줄이기 위해 일반적으로 사용되는 동결-해동 과정을 없애줍니다. 압출은 소포 크기 분포를 표준화하기 위해 수행됩니다. PDMS-g-PEO 막이 지질 이중층에 비해 더 연약해지기 때문에^{, 1.} 낮은 압출압력으로도 충분하다. 제조사가 권장하는 11번의 압출 패스는 일반적으로 충분하지만, 통과 횟수가 늘어날수록 크기 분포가 좁아지고 재현성이 향상되는 경우가 많습니다. 하지만 과도한 압출은 막의 명목상 기공 크기보다 약간 작은 소포를 생성할 수 있습니다. 반복 압출은 재료 손실로 인해 소포 수율을 감소시킬 수도 있습니다; 우리는 이전에 100 nm 막을 21회 통과한 후 PDMS-g-PEO와 PDMS-g-PEO/대두 PC 소포 물질의 약 31%가 손실된다는 것을 확인^{했습니다.} 따라서 압출 통과 횟수는 크기의 균일성과 소포의 무결성 및 수율 균형을 맞추도록 최적화되어야 합니다.

세제 매개 재구성은 성공의 또 다른 중요한 결정 요인입니다. 최적의 세제 종류와 농도는 특정 막 단백질과 막 조성 모두에 따라 달라집니다 ^3,20. 순수 폴리머 막의 경우, 포화 조건이 최적일 때, 필름 재수화 과정에서 세제를 첨가하면 포화 기체 소포보다 삽입 효율이 더 높습니다. PBD-b-PEO와 같이 더 단단한 고분자 막은 막 용^{해를 위해} 훨씬 높은 세제 농도를 요구하며, 이는 고분자 특이적 최적화의 필요성을 강조합니다. 성공적인 삽입은 세제 미셀이나 지질 소포와 비교한 활성 측정뿐만 아니라, 투입 깊이와 소수성^불일치에 대한 막 적응을 평가하기 위해 크라이오-TEM과 같은 구조 분석으로도 검증되어야 합니다. 단백질 배정도 매우 중요하며, 특히 양성자 펌프에서는 기능적 양성자 구배가 대부분의 펌프가 균일하게 배치되어야 하기 때문입니다. 이상적으로는 펌프가 ATP 합성과 같은 구배 소모 과정과의 결합을 가능하게 하기 위해 양성자를 안쪽으로 운반해야 합니다 ^3,15. 방향은 단백질 태그를 사용하여 평가할 수 있는데, 예를 들어 소포 외부에 노출된 염료를 선택적으로 소환하거나 His 태그에 부착된 형광 표지를 치환하여 평가^{할 수 있습니다}. 이러한 접근법들은 프로토콜 최적화를 위한 일반적인 권고로 제시되었으며, 본 연구에서는 수행되지 않았습니다.

융합-전기성형을 이용한 프로테오-LUV에서 프로테오-GUV로 확장하려면 침착 및 탈수 매개변수를 세밀하게 제어해야 합니다. LUV의 농도와 방울 크기는 최종 GUV 수율과 순도에 결정적인 영향을 미칩니다. 지나치게 높은 LUV 농도(≥10 mg/mL)는 최종 샘플에 융합되지 않은 LUV가 남을 수 있으며, 너무 낮은 농도(< 5 mg/mL)는 침착 물질이 부족해 GUV 수율을 감소시킵니다. 탈수는 완전하지 않고 부분적으로 이루어져야 하며, 이는 물방울 가장자리에 흰색 고리가 나타나는 것으로 나타난다. 과도한 탈수는 특히 양성자 펌프의 경우 막 단백질 활성을 저하시키거나 없애버릴 수 있다. 따라서 습도와 온도를 조절하는 것은 단백질 기능을 보존하면서 융합을 위해 막을 충분히 불안정하게 만드는 데 필수적입니다.

단백질 부하가 높으면 GUV 크기가 줄어들 수 있지만, 단백질 기능화된 LUV를 단백질 없는 LUV로 희석함으로써 이 효과를 완화할 수 있습니다. 이렇게 하면 GUV 막 내 단백질 밀도를 침착 전에 정밀하게 조절할 수 있습니다. 예를 들어, 고부하 bo_3-LUV와 빈 LUV(최대 1:10, v/v)를 혼합하면 직경 5–30 μm의 GUV와 단백질 함량을 조절하면서 균일한 막 분포를 유지할 수 있습니다²⁷. 이 전략은 단백질 밀도 측면에서 소포 집단이 이질적으로 나타나지만, 보정 절차를 통해 통합 수준^23,31의 정량적 평가가 가능하다. 중요한 점은, 혼합 방식을 통해 GUV 크기²⁷을 과도하게 줄이지 않으면서 전체 단백질 적재량을 높일 수 있다는 점입니다.

재구성된 단백질의 기능 분석은 전기형성 완충제에 피라닌과 같은 pH 민감성 염료를 캡슐화하여 소포 내 pH 변화를 모니터링함으로써 수행할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 실시간 영상 촬영을 위해서는 소포가 침전되거나 움직임을 막아야 하며, 이는 형광 신호를 흐리고 소포 내 pH 역학의 정확한 정량화를 방해합니다. 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통한 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통한 고정은 안정적인^{부착을 제공}하지만 막 조성이나 장력을 변화시킬 수 있습니다. 마이크로플루이딕 트랩에서의 반고정은 추가 막 성분을 피하고 교란을 최소화하는 대안을 제공합니다 ^1,33. 외부 염료를 반복적으로 침전하고 버퍼 교환을 통해 제거한 후에도 대량 형광 측정이 가능하지만, 잔류 막 관련 염료가 판독에 간섭할 수 있습니다; 따라서 단일 GUV의 공초점 현미경 검사가 일반적으로 선호됩니다.

기존 GUV에 직접 단백질을 삽입하려는 대안적 접근법과 비교할 때, 융합-전기형성 전략은 GUV로 확장하기 전에 LUV 수준에서 재구성 조건을 독립적으로 최적화할 수 있게 합니다. 이 모듈식 워크플로우는 특히 기존 지질 기반 프로토콜에 덜 적합한 폴리머 및 하이브리드 멤브레인에서 재현성과 기능적 수율을 향상시킵니다. 이 방법은 다중^{단백질 시스템을 포함한} 다양한 막 단백질과 호환되며, 추가 구성 요소의 막 기능화 및 공동 캡슐화를 가능하게 합니다. 따라서 내구성 있는 인공 세포, 마이크로 반응기, 그리고 통제된 조건 하에서 고분자-단백질 상호작용을 연구하는 모델 시스템을 구축할 수 있는 다목적 플랫폼을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ÄKTA pure™ 크로마토그래피 시스템	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 웰 챔버드 커버글래스	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL 원심분리기 필터	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS 에스터	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (소듐 콜레이트)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X 소프트웨어	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P 시스템	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (벤치탑)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (원형, 직경 20 mm, 깊이 1 mm)	Grace Bio-Labs	41161502
실리콘 스페이서 (원형, 외경 24.2 mm, 내경 14.3 mm, 깊이 1.8 mm)			실험실에서 실리콘 시트에서 절단
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS 분광광도계	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL 컬럼 (컬럼 L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
시험관 셰이커 (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600