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방법 논문

인간 상아질 디스크를 이용한 수직 적층형 상아질-치수 복합체 장기 칩 소자의 제작

110 조회수

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DOI:

10.3791/71713

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2026년 8월 14일

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1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

이 논문에서

요약

인간 상아질 디스크와 포토리소그래피로 제작된 미세 채널을 포함하는 수직 적층형 상아질-치수 복합체 칩-온-어-칩(organ-on-a-chip) 장치의 제작 및 조립 과정과, 이어서 진행되는 치수 줄기세포의 파종 및 배양 방법을 설명합니다.

초록

동물 모델 및 정적 세포 배양을 포함하여 치과 연구에 사용되는 기존의 전임상 모델은 상아질-치수 계면의 생리적 조건을 재현하고 치과용 생체 재료에 대한 인간의 생물학적 반응을 예측하는 데 있어 중요한 한계가 있습니다. 장기 칩(Organ-on-a-chip, OoC) 기술은 제어된 미세 유체 시스템 내에서 조직 특이적 미세 환경을 재현함으로써 대안적인 접근 방식을 제공합니다. 본 논문은 3층 구조의 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세 유체 플랫폼 내에 인간 상아질 디스크를 통합한 상아질-치수 복합체 OoC 장치의 제작 및 조립을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 상아질 디스크 준비, 포토리소그래피를 이용한 미세 구조 몰드 제작, PDMS 캐스팅 및 경화, 플라스마 보조 층 결합, 장치 조립, 누수 테스트, 그리고 정적 배양 조건에서의 치수 줄기세포 파종을 포함합니다. PDMS 층 두께 제어, 플라스마 표면 처리, 누수를 최소화하기 위한 장치 내 상아질 디스크 통합 등 장치 성능에 영향을 미치는 핵심 제작 파라미터에 대해 논의합니다. 장치 내 세포 부착 및 생존능은 주사전자현미경과 공초점 생사 염색법을 사용하여 평가되었습니다. 대표적인 결과는 미세 유체 조립체 내 상아질 디스크의 성공적인 통합, 누수 없는 상태의 유지, 그리고 상아질 표면에 생존 가능한 치수 줄기세포의 부착을 보여줍니다. 본 프로토콜은 치과용 생체 재료 및 미세 환경 자극에 대한 세포 반응을 조사하는 향후 연구를 지원할 수 있는 상아질-치수 복합체 OoC 플랫폼 제작을 위한 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다.

서론

동물 실험은 병리학적 및 생리학적 과정에 대한 이해를 증진하는 데 오랫동안 중요한 도구였으며, 약물 개발의 초기 단계에서 중심적인 역할을 해왔습니다1. 20세기에 걸쳐 인간의 기대 수명은 상당히 증가했으며, 이러한 개선이 오직 동물 연구 덕분이라고 정확히 정량화할 수는 없으나, 많은 현대적 의료 처치들이 동물 모델을 사용하여 개발되었거나 검증되었다는 점은 널리 인정되고 있습니다2. 주목할 만한 사례로는 소아마비, 홍역, B형 간염 백신의 개발, 페니실린의 안전성과 효능 평가, 그리고 인슐린 생산 등이 있습니다. 치과 및 생체 재료 연구 분야에서 이러한 모델들은 치아 우식 과정, 상아질-치수 복합체의 생물학 및 재생, 그리고 치주 조직의 생리 병리학을 탐구하는 데 핵심적이었습니다3,4.

이러한 방법론들이 광범위하게 사용되고 있음에도 불구하고, 현재의 약물 개발 파이프라인은 여전히 높은 실패율을 보이고 있으며, 많은 약물 후보 물질들이 전임상 실험실 환경 및 동물 모델에서 효능과 안전성을 입증했음에도 불구하고 임상 시험 단계에서 실패하고 있습니다5. 이러한 불일치는 종 간의 해부학적, 유전적, 생리학적 차이로 인해 동물 모델의 중개 예측 가능성을 제한할 수 있는 종간 차이와 관련이 있습니다6. 또한, 새로운 치료 접근법의 개발은 여전히 많은 시간과 비용이 소요됩니다7. 더욱이, 기존의 in vitro 모델은 주로 비생리적인 플라스틱 기질 상의 단순한 2차원(2D) 단층 배양을 이용하므로, 인체 구강 내에 존재하는 생화학적 및 물리적 신호, 세포 간 상호작용 및 세포외 기질(ECM) 신호를 재현하지 못합니다8,9. 2D 모델은 특정한 실험적 장점을 제공하지만, 바이오필름, 생체 재료, 상아질 및 치수 세포와 같은 다수의 구성 요소 사이에서 동시에 일어나는 복잡한 상호작용을 본질적으로 재현할 수 없습니다10. 결과적으로, 인간의 생물학적 반응을 더 정확하게 재현할 수 있는 대체 실험 플랫폼 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 2022년, FDA 현대화법 2.0(FDA Modernization Act 2.0)은 약물 승인 과정에서 동물 실험의 필수 요구 사항을 제거하였으며, 전임상 연구에서 장기 칩(organ-on-a-chip, OoC) 기술을 포함한 대체 플랫폼의 활용 가능성을 인정하였습니다11.

OoC는 특정 장기나 조직 구성 요소의 구조, 기능 및 미세환경을 복제하도록 설계된 미세유체 장치입니다12. 이러한 장치에는 세포가 자연적으로 노출되는 생리학적 미세환경의 핵심 측면을 재현하도록 설계된 미세채널 내에서 배양된 살아있는 세포와 조직이 배치됩니다. 구조적 모방을 넘어, 미세채널은 세포 환경에 대한 시공간적 제어를 가능하게 하고 조직 특이적 기능의 유지를 지원함으로써, 기존의 배양 시스템보다 생체 내(in vivo) 생리학에 더 가까운 실험 조건을 제공합니다12. 특히, OoC 장치의 미세채널은 배양액의 제어된 흐름을 촉진하며, 이는 거주 세포에 전단 응력(shear stress)을 가합니다13. 이러한 기계적 자극은 부착, 증식, 이동, 유전자 발현 및 세포 간 상호작용을 포함한 세포 반응에 영향을 미칩니다14,15. 또한, 지속적인 배양액의 흐름은 영양분 공급과 대사 폐기물 제거를 통해 미세환경 유지에 기여합니다16. 더욱이, 일부 OoC 플랫폼은 기존의 2D 배양과 비교하여 3차원(3D) 온칩 모델에서 세포 내 활성 산소종 및 세포 생존율을 포함한 산화 스트레스 관련 판독값의 제어 능력이 향상되었다고 보고되었습니다17. 따라서 OoC 시스템은 제어된 실험 조건 하에서 조직 생리학, 생체 재료 상호작용 및 질병 과정을 연구하기 위한 유망한 플랫폼으로 부상했습니다18. 치과 연구에서 OoC 기술은 점점 더 복잡한 구강 조직 인터페이스를 모델링하는 데 점진적으로 적용되어 왔습니다19. 초기 치아-온-어-칩(tooth-on-a-chip) 플랫폼은 생체 재료-상아질-치수 인터페이스를 모방했으며20, 이후 더 발전된 버전에서는 치수-상아질 복합체의 구조적 및 기능적 복잡성을 더 충실하게 복제하기 위해 혈관 및 삼차신경 분포를 통합했습니다21. 치수를 넘어, 미성숙 근관의 3D 모델을 통해 근관 세척제 평가와 치근단 유두 유래 줄기세포의 혈관 신생 발아(angiogenic sprouting) 연구가 가능해졌습니다22,23. 치주 수준에서는 잇몸-온-어-칩(gum-on-a-chip) 플랫폼이 숙주-미생물 상호작용을 조사하고 치료제로서 프로바이오틱스의 면역 조절 잠재력을 평가하는 데 사용되었으며24, 치주인대-온-어-칩(periodontal ligament-on-chip) 장치는 간질액의 흐름이 혈관 네트워크 형성 및 치주인대 줄기세포 스페로이드의 골분화에 어떻게 영향을 미치는지 입증했습니다25,26. 이러한 모델들을 보완하여, 특수 구강점막-온-어-칩 및 치과 임플란트-온-어-칩 시스템은 생리학적으로 유의미한 조건 하에서 숙주-재료 상호작용과 치과용 모노머의 세포 독성을 특성화함으로써 치과 미세유체 연구의 범위를 더욱 확장했습니다27,28.

OoC 시스템이 치과, 구강 및 두개안면 연구에 점점 더 많이 적용되고 있지만, 제작 워크플로우의 표준화와 재현성을 위한 지속적인 노력은 여전히 중요합니다. 문헌에는 다양한 장치 구성과 실험적 응용을 보여주는 여러 치아-온-어-칩(tooth-on-a-chip) 모델이 보고되었습니다20,29,30,31. 그러나 장치 구조, 제작 방법, 상아질 통합 방식 및 실험 매개변수 보고의 차이로 인해 재현성과 연구 간의 직접적인 비교가 제한될 수 있습니다. 특히, 마이크로채널 기하학적 구조, 상아질 통합 전략 및 제작 방식의 차이는 장치 내의 생물학적 및 기계적 미세환경에 영향을 줄 수 있습니다. 일부 보고된 모델은 상아질-치수 인터페이스의 특성을 재현하기 위해 상아질을 통합한 반면20,29,30, 다른 모델들은 대안적인 구성을 사용합니다31. 또한, 포토리소그래피, 레이저 커팅, 마이크로밀링 및 3D 프린팅과 같은 제작 방법은 의도한 장치 설계와 응용 분야에 따라 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다. 더욱이, 생물학적 유용성을 결정짓는 결정적인 요인은 장치의 구조적 방향, 구체적으로 채널과 상아질 절편이 수평 또는 수직 구성으로 배치되었는지 여부입니다19,32. 수평 적층 구성에서는 나란히 배치된 구획들이 측면 구획화와 세포의 실시간 시각화를 용이하게 하여, 치주 복합체와 같이 본질적으로 측면 공간 조직을 가진 조직을 모델링하는 데 특히 적합합니다24,32. 그러나 이러한 설계는 구획의 측면 배치가 와동과 치수 사이의 상아질 장벽의 생체 내 방향을 충실히 복제하지 못하므로, 생체 재료-상아질-치수 복합체와 같은 수직 생물학적 인터페이스를 재현하는 능력에 본질적인 한계가 있습니다20,32. 수직 적층 구성은 천연 상아질 절편으로 분리된 두 구획을 y축을 따라 중첩함으로써 이러한 한계를 해결하며, 이를 통해 온전한 상아질을 통한 분자 이동의 동시 정량화와 배출 배지에서 측정되는 치수 세포 반응의 실시간 모니터링이 가능해집니다30. 하지만 이 방향의 알려진 한계는 상아질-세포 인터페이스의 단면 이미징에 관한 것입니다. 세포와 세포외 기질이 측면으로 배치된 수평 적층 구성에 비해, 동일 초점 평면 내에서 상아질-세포 인터페이스의 단면 이미지를 획득하는 것은 기술적으로 더 어렵기 때문입니다. 문헌에 여러 상아질-치수 복합체-온-어-칩 모델이 보고되었으나, 대다수는 구획이 동일 평면상에 나란히 배치된 수평 적층 구성을 채택하고 있으며10,20,21,29, 수직 적층 구성 내에 천연 상아질 절편을 통합한 경우는 상대적으로 적습니다30. 그럼에도 불구하고, 이러한 모델들 전반에 걸친 제작 방식과 보고 매개변수의 차이는 여전히 재현성과 연구 간 비교를 제한하고 있습니다33. 본 논문은 수직 적층 치아-온-어-칩 장치의 상세한 제작 프로토콜을 제공함으로써 방법론적 재현성을 개선하고, 이를 통해 치과 연구 커뮤니티 내에서 해당 플랫폼의 광범위한 도입을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

본 원고는 포토리소그래피로 제작된 몰드를 이용해 제작된 3층 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체 플랫폼 내에 인간 상아질 디스크를 포함하는 수직 적층형 상아질-치수 복합체 OoC 장치의 단계별 제작 및 조립 프로토콜을 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 정적 조건에서 장치 내에 치수 줄기세포를 파종하고 배양하는 방법을 설명합니다.

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프로토콜

본 연구는 헬싱키 선언을 준수하여 수행되었으며, 인간 샘플을 포함하는 연구에 대해 Universidad de La Frontera 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 상아질 디스크 획득

참고: 프로토콜을 시작하기 전에 장치 설계를 준비하십시오(그림 1A–1C).

  1. 치아 수집 및 보관
    1. 환자의 고지된 동의를 얻은 후 건강한 사람의 대구치 또는 소구치를 수집합니다.
    2. 상아질의 탈수와 단백질 변성을 방지하기 위해 모든 표본을 4°C의 0.5% 클로라민 용액에 보관합니다.
    3. 보관 기간 동안 일주일에 한 번 클로라민 용액을 교체합니다.
  2. 상아질 디스크 제작
    1. 원통형 다이아몬드 버(직경 1 mm, 입도 100–150 µm)가 장착되고 350,000 rpm으로 작동하는 고속 핸드피스를 사용하여 각 치아의 치관 중앙 1/3 지점을 수평으로 절단합니다.
    2. 약 50 mL/min의 속도로 물을 지속적으로 공급하며 절단을 수행합니다.
    3. 치수강과 교합면의 구 및 fissure에 존재하는 법랑질을 피하기 위해 치관의 중앙 1/3 지점에 절단면을 위치시켜, 주로 상아질 조직으로 구성된 디스크를 얻습니다.
      주의: 지속적인 관수 상태에서 치아 절단을 수행하고 장갑, 마스크, 보호 안경을 포함한 적절한 개인 보호 장구를 착용하십시오.
  3. 상아질 디스크 마무리 작업
    1. 입도가 점차 낮은 마무리 디스크를 사용하여 상아질 디스크를 연마합니다.
    2. 최종 상아질 두께가 약 0.8 mm (±± 0.3 mm)가 되고 측면 크기가 약 5 mm × 5 mm (±± 0.3 mm)가 될 때까지 연마를 계속합니다 (그림 1D).
  4. 상아질 디스크 보관
    1. 제작된 상아질 디스크를 OoC 장치 조립 전까지 4°C의 0.5% 클로라민 용액에 보관합니다.

미세유체 장치 조립 도식; 핀셋, 펀치 툴, 액체 채널링을 이용한 제작 단계.
그림 1: 상아질-치수 복합체 장기 칩(OoC) 장치의 설계 및 제작 워크플로우. (A) 3층 구조를 보여주는 장치의 3차원 설계. (B) 주요 치수가 표시된 장치 설계의 평면도. (C) 3층 장치 구성의 측면도. (D) 두께 약 0.8 mm, 가로 세로 크기 약 5 mm × 5 mm로 준비된 대표적인 상아질 디스크. (E) 포토리소그래피로 제작되어 상단 및 하단 polydimethylsiloxane (PDMS) 층의 캐스팅에 사용된 실리콘 마스터 몰드. (F) 열 중합 후 실리콘 몰드에서 경화된 PDMS 층을 제거하는 과정. (G) 층 결합 전 PDMS 표면의 플라즈마 처리. (H) 플라즈마 본딩으로 조립되고 상아질 인터페이스가 통합된 최종 3층 상아질-치수 복합체 OoC 장치. (I) 누출 테스트 및 미세유체 실험 준비를 위해 튜빙에 연결된 조립된 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 상아질-치수 복합체 OoC 장치 제작

  1. 작업 공간 및 재료 준비
    1. 재료 및 장비 준비
      1. 목록에 기재된 모든 재료와 장비를 준비하십시오. 재료 표 소자 제작을 시작하기 전에.
      2. 장치 조립 전에 생검 펀치를 준비하십시오.
      3. 모든 제작 과정은 깨끗하고 먼지가 없는 환경에서 수행하십시오.
      4. 장치 제작 및 조립 전 과정 동안 장갑, 보호 안경 및 적절한 개인 보호 장구를 착용하십시오.
        참고: 프로토콜을 시작하기 전에 포토리소그래피(photolithography)로 제작된 몰드를 준비하십시오.그림 1E).
  2. 미세구조 몰드의 제작
    1. 실리콘 웨이퍼의 준비
      1. 4인치 단면 연마 실리콘 웨이퍼(N형, As 도핑, CZ 성장법) 위에 몰드를 제작하십시오. <100> 배향, 500 ±± 25 µm 두께, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, 비저항 0.001–0.005 Ω·cm).
      2. 웨이퍼를 아세톤, 이소프로판올, 초순수 순으로 각각 10분 동안 초음파 세척하십시오.
      3. 압축 공기로 웨이퍼를 건조하십시오.
      4. 웨이퍼를 다음 온도에서 베이킹하십시오. 200°C 잔류 수분을 제거하기 위해 핫플레이트에서 10분간 가열합니다.
      5. 웨이퍼를 상온(RT)으로 식히십시오. 20°C–25°C).
    2. 표면 활성화 및 포토레지스트 코팅
      1. 공기 플라즈마 레벨 7에서 120초 동안 작동하는 진공 플라즈마 세척기를 사용하여 실리콘 웨이퍼 표면을 활성화합니다.
      2. GM 1060 에폭시 기반 음성 포토레지스트를 300 rpm에서 10초 동안 스핀 코팅하여 도포하십시오.
      3. 200 rpm/s의 가속도를 사용하여 565 rpm에서 100초 동안, 이어서 965 rpm에서 1초 동안 스핀 코팅을 계속한다.
      4. 코팅된 웨이퍼를 10분 동안 그대로 둡니다.
      5. 다음 온도에서 사전 베이킹(pre-bake)을 수행하십시오. 65°C 10분 동안.
      6. 다음 온도에서 사전 베이킹(pre-bake)을 계속하십시오. 95°C 1시간 동안.
      7. 웨이퍼를 실온으로 식히십시오.
    3. 노광 및 현상
      1. 다이렉트 레이저 리소그래피 시스템을 사용하여 1,950 mJ/cm²의 조사량으로 포토레지스트를 노광하십시오.2.
      2. 다음 온도에서 후경화(post-bake)를 수행하십시오. 65°C 10분 동안.
      3. 다음 온도에서 후경화(post-bake)를 계속하십시오. 95°C 30분 동안.
      4. 웨이퍼를 상온(RT)까지 식힙니다.
      5. 웨이퍼를 10분 동안 그대로 둡니다.
      6. PGMEA에서 4분 동안 패턴을 현상하십시오.
      7. 잔류 감광액이 남아 있는 경우, 현상 시간을 30초 간격으로 연장하십시오.
      8. 이소프로판올로 헹구어 현상을 중단하십시오.
      9. 압축 공기를 사용하여 웨이퍼를 건조하십시오.
    4. 하드 베이크(Hard bake)
      1. 다음 온도에서 하드 베이크(hard bake)를 수행하십시오. 135°C 2시간 동안.
      2. 폭 1mm의 미세채널이 포함된 미세구조 마스터 몰드를 준비한다. 50 µm 높이에서.
  3. PDMS 혼합물의 준비 및 탈기
    1. PDMS 혼합물 준비
      1. PDMS 베이스와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합하십시오.
      2. 플라스틱 비커에 담긴 혼합물을 유리 막대로 약 5분 동안 수동으로 저어 줍니다.
      3. 혼합하는 동안 느리고 지속적인 원형 운동을 유지하십시오.
        참고: 혼합 과정에서 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
    2. 탈기
      1. PDMS 혼합물을 진공 펌프에 연결된 진공 데시케이터에 넣으십시오.
      2. 혼합물을 약 700 mmHg에서 5분 동안 탈기하십시오.
      3. 표면의 기포가 터질 수 있도록 진공 상태를 잠시 해제하십시오.
      4. 진공을 다시 가하십시오.
      5. 눈에 보이는 기포가 더 이상 남지 않을 때까지 이 과정을 반복하십시오.
        참고: 총 탈기 시간은 일반적으로 약 30분입니다.
  4. 몰드 위 PDMS 캐스팅
    1. 몰드 준비
      1. 몰드를 평평한 표면에 놓으십시오.
      2. 압축 공기를 사용하여 몰드를 세척하십시오.
      3. 패턴 표면에 직접 접촉하지 마십시오.
      4. 몰드에 먼지나 오염 물질이 없는지 확인하십시오.
    2. PDMS 분주
      1. 상아질 매립층을 제작하기 위해 상아질 디스크 주변에 약 8g의 PDMS를 분주하십시오.
      2. PDMS 높이를 상아질 디스크 두께(0.8 ± 0.3 mm)에 맞게 조정하십시오.
      3. PDMS가 상아질 표면을 덮지 않도록 하십시오.
      4. 각 마이크로채널 층을 제작하기 위해 몰드 단위당 약 0.26 g의 PDMS를 분주하십시오.
      5. 몰드를 가볍게 두드리거나 진동을 가하여 미세 구조 내부가 잘 채워지도록 합니다.
      6. PDMS가 가장 작은 미세 구조 내부까지 완전히 안착되도록 둡니다.
      7. PDMS 표면에 닿지 않도록 뚜껑이나 평평한 덮개로 몰드를 덮어주십시오.
        참고: 상아질 매몰 층의 두께는 약 0.8mm이며, 각 미세유로 층의 두께는 약 0.4mm로, 장치의 총 두께는 약 1.6mm입니다.
        참고: 공초점 이미징을 계획하는 경우, 공초점 대물렌즈의 작동 거리(working distance)에 따라 층 두께를 조정하십시오.
  5. 경화
    1. 몰드를 다음 온도의 오븐에 넣으십시오. 50°C.
    2. PDMS를 4시간 동안 경화시킵니다.
  6. PDMS 층의 제거
    1. 경화된 PDMS의 제거
      1. 경화된 PDMS 층을 몰드에서 조심스럽게 떼어냅니다 (그림 1F).
      2. 미세 구조가 손상되지 않도록 PDMS 층을 주의해서 다루십시오.
  7. PDMS 층의 접합 및 입구와 출구 포트의 제작
    1. 입구 및 출구 포트의 제작
      1. 1mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 지정된 유입구와 유출구 위치에 천공을 만듭니다.
      2. 펀칭 시 마이크로채널 면이 위를 향하도록 배치하십시오.
        참고: 구조적 손상을 방지하기 위해 PDMS 층을 커팅 매트 위에 놓으십시오.
      3. 상단 마이크로채널에 해당하는 상층부에 두 개의 천공을 만듭니다.
    2. PDMS 층의 세척
      1. 이소프로필 알코올 또는 에탄올을 사용하여 PDMS 층을 세척하십시오.
      2. 멸균 접착 테이프를 사용하여 잔류 먼지 입자를 제거하십시오.
      3. 조립 전 모든 접합 표면에 오염 물질이 없는지 확인하십시오.
    3. PDMS 표면의 플라스마 활성화
      1. 플라스마 처리를 위해 상단 및 중간 PDMS 층을 배치합니다(그림 1G).
      2. 주변 공기를 작동 가스로 하여 약 25W로 작동하는 휴대용 코로나 플라즈마 처리기로 표면을 활성화하십시오.
      3. 플라스마 소스와 PDMS 표면 사이의 작동 거리를 약 1mm로 유지하십시오.
        주의: 플라스마 처리는 적절한 환기 시설 내에서 수행하고, 플라스마 발생 오존에 직접 노출되지 않도록 주의하십시오.
      4. 플라스마 처리 장치를 작동시키고 5초 동안 안정화합니다.
      5. 처치 전 균일한 플라즈마 빔의 생성을 확인하십시오.
      6. 약 5 mm/s의 속도로 계속해서 앞뒤로 움직이며 상단 PDMS 층을 10초 동안 처리하십시오.
      7. 동일한 동작과 거리로 중간 PDMS 층을 10초 동안 처리하십시오.
      8. 본딩 직전에 상층부에 1초간 추가 플라즈마 처리를 수행하십시오.
    4. 상층 및 중층의 접합
      1. 플라스마 처리 직후 상단 마이크로채널을 상아질 디스크에 맞춥니다.
      2. 상단 층과 중간 층을 서로 결합하십시오.
      3. 결합된 조립체를 다음 온도의 오븐에 넣으십시오. 75°C 5분 동안.
      4. 배양 중에 결합을 공고히 합니다.
        참고: 상아질 디스크와 미세 채널은 육안으로 확인 가능하며, 별도의 정렬 도구 없이도 정렬할 수 있습니다.
    5. 하부 마이크로채널 포트 제작
      1. 접합된 상단 층과 중간 층을 통해 하단 미세유체 채널에 해당하는 두 개의 천공 구멍을 뚫습니다.
      2. 정렬을 보장하기 위해 두 층을 동시에 펀칭하십시오.
        참고: 이 절차를 통해 상층에 4개의 천공이, 중층에 2개의 천공이 생성됩니다.
      3. 본딩된 조립체를 펀칭하기 전, 단단한 커팅 매트 위에 놓으십시오.
      4. 단 한 번의 동작으로 일정한 하향 압력을 가하십시오.
        주의: 층분리(delamination) 위험을 최소화하기 위해 회전력이나 측면 힘이 가해지지 않도록 하십시오.
      5. 이소프로필 알코올을 적신 보풀 없는 멸균 거즈를 사용하여 천공 부위의 잔해물을 제거하십시오.
      6. 적절한 조명 아래에서 천공 부위와 주변 접합 영역을 검사하십시오.
      7. 다음 단계로 진행하기 전, 층 분리, 찢어짐 또는 불완전한 천공이 없는지 확인하십시오.
    6. 하층 결합
      1. 단계 2.7.4에 설명된 대로 하단 레이어에 플라스마 처리를 수행하십시오.
      2. 하단 마이크로채널의 유입구 및 유출구 포트를 상단 및 중간 층의 천공 부위와 맞추십시오.
      3. 하단 층을 접합하여 소자 조립을 완료합니다.
        참고: 정렬을 용이하게 하기 위해 본딩 전 하단 층의 외부 표면에 입구와 출구 위치를 표시하십시오.
        참고: 문헌에 보고된 바와 같이, 플라스마 챔버가 플라스마 펜보다 더 강력한 접합력을 제공할 수 있습니다.36.
        참고: 완성된 장치는 상아질 인터페이스가 포함된 3층 구조의 미세유체 플랫폼으로 구성됩니다.그림 1H). 하단 상아질 표면은 모델의 치수 측을 나타내며, 상단 상아질 표면은 치과용 생체 재료 또는 세균 제제에 노출되는 치관 측을 나타냅니다.
  8. 미세유체 장치의 누수 테스트
    1. 조립된 장치의 점검
      1. 조립된 장치의 정렬 상태를 점검하십시오.
      2. 결합 부위의 불완전한 접착 및 가시적인 누출 여부를 검사하십시오.
    2. 누설 시험
      1. 19G Luer-lock 바늘을 유입구 포트에 연결합니다.그림 1E).
      2. 니들을 미세유체 펌프 튜브에 연결하십시오.
      3. 바늘 허브를 뚫린 포트에 부드럽게 눌러 넣어 공기가 새지 않도록 밀착시킵니다.
      4. 멸균된 PBS 또는 배양액을 다음의 유속으로 주입하십시오. 10 µL/min.
      5. 최소 5분 동안 유체 흐름을 유지하십시오.
      6. 유동 중에 모든 접착 계면, 채널 마진 및 상아질 디스크 경계부를 검사하십시오.
      7. 주입 중 및 주입 후에 적절한 조명 하에서 장치를 관찰하십시오.
      8. 액체 축적, 젖음 또는 액적 형성이 없는지 확인하십시오.
      9. 누출이 감지되지 않으면 해당 장치를 누출 없음으로 분류하십시오.
      10. 누출이 발생하는 장치는 폐기하십시오.
        주의: 세포 파종 또는 실험적 사용 전, 제작된 모든 장치에 대해 누출 테스트를 수행하십시오.
  9. 미세유체 장치의 멸균 및 보관
    1. 멸균
      1. 조립된 장치의 상단 표면을 층류 작업대(laminar flow cabinet) 내부에서 UV 광선(254 nm)에 30분 동안 노출시키십시오.
      2. 바닥면을 UV 광선에 30분 더 노출시키십시오.
      3. 마이크로채널을 70% 에탄올로 20분 동안 세척하십시오.
      4. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 멸균 PBS로 마이크로채널을 3회 세척하십시오.
    2. 보관
      1. 멸균된 장치를 세포 배양 실험에 즉시 사용하십시오.
      2. 또는, 장치를 멸균된 PBS에 담가 다음 온도에서 보관하십시오. 4°C 사용 전까지 멸균 용기 내에 보관하십시오.
        주의: 장치 조립 후에는 클로라민 또는 기타 소독제 용액을 사용하지 마십시오. PDMS가 이러한 화합물을 흡수하여 세포 생존율을 저하시킬 수 있습니다.

3. 치수 줄기세포의 부착 및 생존력 평가

  1. 상아질 표면의 전처리
    1. 장치에 10% EDTA를 주입한다.
    2. EDTA 용액과 상아질 표면이 15분 동안 접촉하도록 유지한다.
    3. 마이크로채널 내의 유체 흐름을 유지하기 위해 3분마다 0.5 mL EDTA를 주입한다.
    4. 초순수로 상아질 디스크를 3회 세척한다.
    5. 각 세척 과정을 5분 동안 유지한다.
      참고: EDTA 처리는 도말층(smear layer)을 제거하고 상아질 기질 단백질을 노출시킨다.
      주의: 피부 및 눈 자극을 방지하기 위해 장갑과 보호 안경을 착용하고 EDTA 용액을 취급한다.
  2. 치수 줄기세포의 파종
    1. 치수 줄기세포의 증식
      1. 치수 줄기세포를 T75 플라스크당 1 × 106 cells의 밀도로 파종한다.
      2. 세포가 약 80%의 합생도(confluency)에 도달할 때까지 37°C, 5% CO2 조건에서 배양한다.
      3. 트립신을 사용하여 세포를 분리한다.
      4. 완전 배양 배지를 사용하여 트립신을 중화시킨다.
      5. 세포 현탁액을 원심 분리하여 세포 펠릿을 얻는다.
      6. 트리판 블루를 사용하여 세포 생존율을 평가한다.
      7. 생존율이 90% 이상인 세포 현탁액을 사용한다.
    2. 세포 현탁액의 준비
      1. 37°C로 예열된 세포 현탁액을 준비한다.
      2. 완전 배양 배지 내의 세포 농도를 100,000 cells/mL로 조정한다.
      3. 최종 현탁액 부피를 1–2 mL로 준비한다.
        참고: 본 연구에서는 계대 배양 5세대의 세포를 사용하였다.
    3. 세포 파종
      1. 하단 마이크로채널의 입구 포트에 세포 현탁액을 주입한다.
      2. 세포 파종 후 장치를 뒤집는다.
        참고: 장치를 뒤집으면 세포가 상아질 표면으로 침강하는 것을 촉진하여 세포 접착을 향상시킨다.
    4. 배양
      1. 뒤집힌 장치를 페트리 접시 안에 놓는다.
      2. 증발을 최소화하기 위해 페트리 접시에 배양 배지 1 mL를 추가한다.
      3. 장치를 37°C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한다.
      4. 배양 기간 내내 정적 배양 조건을 유지한다.
        참고: 본 연구에서는 동적 흐름 검증을 수행하지 않았다.
        참고: 본 프로토콜은 초기 장치 검증 및 세포 접착 평가를 위한 정적 배양 조건을 설명한다.
    5. 초기 장치 검증
      1. 주사 전자 현미경을 사용하여 세포 접착을 평가한다.
      2. 분석 전, 장치를 분해하여 상아질 디스크를 회수한다.
  3. 주사 전자 현미경 분석을 위한 시료 준비
    1. 시료 회수 및 세척
      1. 24시간 배양 후 장치를 분해한다.
      2. 상아질 디스크를 회수하여 배양 플레이트나 페트리 접시로 옮긴다.
      3. 세포가 파종된 상아질 표면이 위를 향하도록 배치한다.
      4. 1 mL PBS를 사용하여 상아질 디스크를 2회 세척한다.
    2. 고정
      1. 0.1 M Sorensen 인산염 완충액에 희석된 2.5% 글루타르알데히드 2 mL를 추가한다.
      2. 시료를 실온(RT)에서 30분 동안 배양한다.
        주의: 글루타르알데히드는 독성이 있으며 피부, 눈 및 호흡기에 자극을 일으킬 수 있다. 고정 절차는 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태로 화학 흄 후드 내에서 수행한다.
    3. 고정 후 세척
      1. 글루타르알데히드 용액을 제거한다.
      2. 실온에서 초순 증류수로 상아질 디스크를 3회 세척한다.
    4. SEM 분석
      1. 환경 주사 전자 현미경을 사용하여 시료를 분석한다.
      2. 현미경을 저진공 조건(25 Pa)에서 작동시킨다.
      3. 가속 전압 10.0 kV 및 작동 거리 7.0 mm를 사용한다.
      4. 후방 산란 전자 3D 검출 모드(BSE-3D)를 사용하여 이미지를 획득한다.
      5. ×200 배율에서 이미지를 캡처한다(그림 2A).
  4. 공초점 현미경을 통한 세포 생존율 평가
    1. 시료 준비
      1. 단계 3.2에 설명된 대로 세포를 파종하고 배양한다.
      2. 장치를 37°C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한다.
      3. 장치를 분해하여 상아질 표면을 노출시킨다.
      4. 상아질 디스크를 Ca2+ 및 Mg2+가 첨가된 예열된 HBSS+/+가 담긴 웰 플레이트로 옮긴다.
    2. 시료 세척
      1. HBSS+/+로 상아질 디스크를 2회 세척한다.
      2. 염색 전 잔류 혈청과 페놀 레드를 제거한다.
        참고: 잔류 혈청과 페놀 레드는 배경 자가 형광을 증가시킬 수 있다.
    3. 생존 세포 염색
      1. HBSS+/+에서 2 µM 농도의 신선한 Calcein AM 작업 용액을 준비한다.
      2. 상아질 표면을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 양의 염색액을 추가한다.
      3. 시료를 37°C 암실에서 20분 동안 배양한다.
      4. 배양 후 염색액을 제거한다.
    4. 사멸 세포 염색
      1. Propidium Iodide 작업 용액(HBSS+/+ 내 1–2 µg/mL)을 추가한다.
      2. 시료를 37°C 암실에서 5–8분 동안 배양한다.
      3. 배양 시간이 10분을 초과하지 않도록 한다.
      4. HBSS+/+로 시료를 2회 세척한다.
      5. 이미징 전까지 시료를 완충액에 잠긴 상태로 유지한다.
    5. 공초점 현미경 이미지 획득
      1. 염색 후 30분 이내에 공초점 이미지를 획득한다.
      2. 녹색 및 적색 채널에서 순차적으로 이미지를 획득한다.
      3. 생존 세포 이미징에는 λex 490 nm 및 λem 515 nm를 사용한다.
      4. 사멸 세포 이미징에는 λex 535 nm 및 λem 617 nm를 사용한다.
        참고: 배양 및 이미징 절차 동안 형광 염색액과 염색된 시료가 빛에 노출되지 않도록 보호한다(그림 2B).

전자현미경과 형광현미경의 비교, 세포 구조 분석.
그림 2: 상아-치수 복합체 OoC 장치 내 치수 줄기세포의 부착 및 생존능에 대한 대표 평가. (A) OoC 장치 내에서 24시간 동안 정적 배양한 후, 상아질 표면에 부착된 치수줄기세포(흰색 별표)를 보여주는 주사전자현미경 이미지. 배양 24시간 후, 부착된 세포가 마이크로채널에 노출된 상아질 표면의 54.35 ± 0.92%를 덮고 있었다. PDMS로 덮인 상아질 영역(검은색 별표)에서는 세포가 관찰되지 않았으며, 이는 장치 층 간의 밀봉이 효과적으로 이루어졌음을 나타낸다. 스케일 바 = 200 µm. (B) 정적 배양 24시간 후, 상아질 표면에 부착되어 녹색으로 염색된 생존 치수줄기세포를 보여주는 공초점 현미경 이미지(흰색 화살표). 적색으로 염색된 비생존 세포 또한 관찰됨(파란색 화살표). 스케일 바 = 50 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

치아-온-어-칩 장치의 성공적인 제작은 다음의 워크플로우를 따랐습니다. 그림 1A–1I, 상아질 디스크 준비를 포함하여 (그림 1D), 포토리소그래피 유래 몰드의 제작 (그림 1E), 경화된 PDMS 층의 제거 (그림 1F), 본딩 전 플라스마 활성화 (그림 1G), 최종 장치의 조립 (그림 1H), 그리고 장치를 미세유체 셋업에 연결하는 과정(그림 1I). 결과물인 장치는 3층 PDMS 조립체로 구성되었으며, 상부 및 하부 미세유체 채널이 상아질 표면의 양측에 배치되고 상아질 디스크가 중간층 내에 완전히 통합되었습니다.

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토론

본 연구는 상아질과 치수 줄기세포를 포함하는 수직 적층형 tooth-on-a-chip 장치 제작을 위한 단계별 프로토콜을 기술하며, 정적 배양 조건 하에서 장치 내의 대표적인 세포 부착 및 생존능을 입증합니다. 이 프로토콜은 상아질 계면의 in vitro 연구에 적합한 상아질-치수 복합체 OoC 플랫폼의 제작 및 조립을 위한 재현 가능한 워크플로를 제공하기 위해 개발되었습니다. 이러한 워크플로의 구축은 특히 중요한데, 최근의 체계적 문헌고찰에서 상아질-치수 복합체용 미세유체 모델 분야가 여전히 초기 단계에 머물러 있으며, 장치 구조와 재료의 방법론적 이질성이 높아 현재의 tooth-on-a-chip 모델의 재현성과 표준화를 심각하게 저해하고 있음을 강조했기 때문입니다34. 본 연구는 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제공함으로써 이러한 한계를 해결하고, 보다 명확하게 정의된 생물학적 모델의 개발에 기여합니다. 구강 생물학에 적용된 OoC 개발의 더 넓은 맥락에서, França 등

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공개 사항

저자들은 공개할 경쟁적 재정적 이해관계나 이해상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

본 연구는 Universidad de La Frontera의 Dirección de Investigación의 Project DIM24-0004 및 Project PP24-0031, 칠레 국가연구개발청(ANID)의 FONDECYT Regular No. 1260116 및 FONDECYT de Iniciación No. 11230701의 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생물학 및 화학 재료
아세톤ExpertQSOLV 8실리콘 웨이퍼 세척
Alpha MEM 배양액CytivaSH30265.02치수질 줄기세포 배양액
클로라민 (0.5%)Merck7080-50-4상아질 디스크 보존액
치수질 줄기세포해당 없음해당 없음1차 세포 배양. 단계 3.2.1 및 3.2.2 참조
EDTA (10%)WinklerN2222158E스미어 층 제거
에폭시 기반 음성 감광제GersteltecGM1060포토리소그래피 몰드 제작
0.1 M Sorensen’s 인산염 완충액 내 글루타르알데하이드 (2.5%)Sigma-Aldrich210908-06SEM 고정
건강한 사람의 치아 (대구치 또는 소구치)해당 없음해당 없음인체 시료
이소프로판올ExpertQSOLV 16웨이퍼 세척, 현상 중지 및 PDMS 세척
LIVE/DEAD 생존능 분석 키트Sigma-Aldrich451형광 생존능 염색. 
PBS (인산염 완충 식염수)Corning46-013-CM세척 및 누출 테스트
PDMS 베이스 및 경화제 (폴리디메틸실록산)DowSylgard 184장치 제작
PGMEASigma Aldrich484431감광제 현상
트리판 블루Sigma Aldrich T8154-100ml세포 생존능 평가
트립신Corning25-053-CI세포 분리
초순수CytivaSH30529.01세척액
소모품 및 실험실 기구
19G 주사바늘VmaticVCB19050장치와 마이크로펌프 또는 주사기 연결
생검 펀치 (직경: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073입구 및 출구 포트 제작
커팅 매트Nicecool해당 없음펀칭 중 표면 보호
치과용 마감 디스크 (예: Sof-Lex)3MSof-Lex상아질 연마
암컷 루어-바브 어댑터Runze FluidicsRH-M016튜브 연결
유리 또는 플라스틱 혼합 스틱Duran해당 없음PDMS 혼합
피하 주사기Cranberrypc-12246세포 파종 및 누출 테스트
보풀 없는 멸균 거즈Linderson해당 없음펀칭 잔해 제거
수컷 루어 어댑터Runze FluidicsRH-G016튜브 연결
혼합 용기Duran해당 없음PDMS 준비
페트리 접시 (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219세포 배양/배양
폴리테트라플루오로에틸렌 베이스CCTVal해당 없음중간 상아질 층 제작
실리콘 웨이퍼Jiaozuo Commercial FineWin해당 없음몰드 제작
실리콘 튜브Runze Fluidics96421유체 연결
T75 플라스크Corning 353136치수질 줄기세포 증식
웰 플레이트SPL Life Sciences30006공초점 염색 및 이미징 준비
장비 및 기구
에어 드라이어METALPLANTITAN-040압축 공기 건조
압축 공기원SCHULZCSD-18.1몰드 및 표면 세척
공초점 현미경Olympus해당 없음모델: FV1000
직접 레이저 리소그래피 시스템HeidelberguPG 101감광제 노광
환경 주사 전자 현미경Hitachi해당 없음모델: Quanta 400 
고속 핸드피스Nakanishi해당 없음모델: Pana-max2
핫 플레이트LabTechEH20A Plus웨이퍼 및 감광제 베이킹
층류 작업대BioBaseBBS8V1708313D장치 멸균
미세 유체 펌프New Era해당 없음모델: 1002X-ES. 10 µL/min에서 누출 테스트
미세 구조 몰드 (포토리소그래피로 제작)CCTVal해당 없음몰드 제작 사양은 단계 2.2 참조
오븐 또는 배양기MemmertUN11050°C에서 PDMS 경화 및 75°C에서 접합 강화
진공 플라즈마 세척 챔버Fari PlasmaGD-5웨이퍼 플라즈마 활성화
휴대용 코로나 플라즈마 Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACPDMS 플라즈마 활성화
초음파 세척기Elma SonicS 10 (H)웨이퍼 세척
진공 챔버 또는 데시케이터 (250 mm)Winglass해당 없음PDMS 탈기
진공 펌프ROCKER300PDMS 탈기

참고문헌

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