인간 상아질 디스크를 이용한 수직 적층형 상아질-치수 복합체 장기 칩 소자의 제작

요약

인간 상아질 디스크와 포토리소그래피로 제작된 미세 채널을 포함하는 수직 적층형 상아질-치수 복합체 칩-온-어-칩(organ-on-a-chip) 장치의 제작 및 조립 과정과, 이어서 진행되는 치수 줄기세포의 파종 및 배양 방법을 설명합니다.

초록

동물 모델 및 정적 세포 배양을 포함하여 치과 연구에 사용되는 기존의 전임상 모델은 상아질-치수 계면의 생리적 조건을 재현하고 치과용 생체 재료에 대한 인간의 생물학적 반응을 예측하는 데 있어 중요한 한계가 있습니다. 장기 칩(Organ-on-a-chip, OoC) 기술은 제어된 미세 유체 시스템 내에서 조직 특이적 미세 환경을 재현함으로써 대안적인 접근 방식을 제공합니다. 본 논문은 3층 구조의 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세 유체 플랫폼 내에 인간 상아질 디스크를 통합한 상아질-치수 복합체 OoC 장치의 제작 및 조립을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 상아질 디스크 준비, 포토리소그래피를 이용한 미세 구조 몰드 제작, PDMS 캐스팅 및 경화, 플라스마 보조 층 결합, 장치 조립, 누수 테스트, 그리고 정적 배양 조건에서의 치수 줄기세포 파종을 포함합니다. PDMS 층 두께 제어, 플라스마 표면 처리, 누수를 최소화하기 위한 장치 내 상아질 디스크 통합 등 장치 성능에 영향을 미치는 핵심 제작 파라미터에 대해 논의합니다. 장치 내 세포 부착 및 생존능은 주사전자현미경과 공초점 생사 염색법을 사용하여 평가되었습니다. 대표적인 결과는 미세 유체 조립체 내 상아질 디스크의 성공적인 통합, 누수 없는 상태의 유지, 그리고 상아질 표면에 생존 가능한 치수 줄기세포의 부착을 보여줍니다. 본 프로토콜은 치과용 생체 재료 및 미세 환경 자극에 대한 세포 반응을 조사하는 향후 연구를 지원할 수 있는 상아질-치수 복합체 OoC 플랫폼 제작을 위한 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다.

서론

동물 실험은 병리학적 및 생리학적 과정에 대한 이해를 증진하는 데 오랫동안 중요한 도구였으며, 약물 개발의 초기 단계에서 중심적인 역할을 해왔습니다¹. 20세기에 걸쳐 인간의 기대 수명은 상당히 증가했으며, 이러한 개선이 오직 동물 연구 덕분이라고 정확히 정량화할 수는 없으나, 많은 현대적 의료 처치들이 동물 모델을 사용하여 개발되었거나 검증되었다는 점은 널리 인정되고 있습니다². 주목할 만한 사례로는 소아마비, 홍역, B형 간염 백신의 개발, 페니실린의 안전성과 효능 평가, 그리고 인슐린 생산 등이 있습니다. 치과 및 생체 재료 연구 분야에서 이러한 모델들은 치아 우식 과정, 상아질-치수 복합체의 생물학 및 재생, 그리고 치주 조직의 생리 병리학을 탐구하는 데 핵심적이었습니다^3,4.

이러한 방법론들이 광범위하게 사용되고 있음에도 불구하고, 현재의 약물 개발 파이프라인은 여전히 높은 실패율을 보이고 있으며, 많은 약물 후보 물질들이 전임상 실험실 환경 및 동물 모델에서 효능과 안전성을 입증했음에도 불구하고 임상 시험 단계에서 실패하고 있습니다⁵. 이러한 불일치는 종 간의 해부학적, 유전적, 생리학적 차이로 인해 동물 모델의 중개 예측 가능성을 제한할 수 있는 종간 차이와 관련이 있습니다⁶. 또한, 새로운 치료 접근법의 개발은 여전히 많은 시간과 비용이 소요됩니다⁷. 더욱이, 기존의 in vitro 모델은 주로 비생리적인 플라스틱 기질 상의 단순한 2차원(2D) 단층 배양을 이용하므로, 인체 구강 내에 존재하는 생화학적 및 물리적 신호, 세포 간 상호작용 및 세포외 기질(ECM) 신호를 재현하지 못합니다^8,9. 2D 모델은 특정한 실험적 장점을 제공하지만, 바이오필름, 생체 재료, 상아질 및 치수 세포와 같은 다수의 구성 요소 사이에서 동시에 일어나는 복잡한 상호작용을 본질적으로 재현할 수 없습니다¹⁰. 결과적으로, 인간의 생물학적 반응을 더 정확하게 재현할 수 있는 대체 실험 플랫폼 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 2022년, FDA 현대화법 2.0(FDA Modernization Act 2.0)은 약물 승인 과정에서 동물 실험의 필수 요구 사항을 제거하였으며, 전임상 연구에서 장기 칩(organ-on-a-chip, OoC) 기술을 포함한 대체 플랫폼의 활용 가능성을 인정하였습니다¹¹.

OoC는 특정 장기나 조직 구성 요소의 구조, 기능 및 미세환경을 복제하도록 설계된 미세유체 장치입니다¹². 이러한 장치에는 세포가 자연적으로 노출되는 생리학적 미세환경의 핵심 측면을 재현하도록 설계된 미세채널 내에서 배양된 살아있는 세포와 조직이 배치됩니다. 구조적 모방을 넘어, 미세채널은 세포 환경에 대한 시공간적 제어를 가능하게 하고 조직 특이적 기능의 유지를 지원함으로써, 기존의 배양 시스템보다 생체 내(in vivo) 생리학에 더 가까운 실험 조건을 제공합니다¹². 특히, OoC 장치의 미세채널은 배양액의 제어된 흐름을 촉진하며, 이는 거주 세포에 전단 응력(shear stress)을 가합니다¹³. 이러한 기계적 자극은 부착, 증식, 이동, 유전자 발현 및 세포 간 상호작용을 포함한 세포 반응에 영향을 미칩니다^14,15. 또한, 지속적인 배양액의 흐름은 영양분 공급과 대사 폐기물 제거를 통해 미세환경 유지에 기여합니다¹⁶. 더욱이, 일부 OoC 플랫폼은 기존의 2D 배양과 비교하여 3차원(3D) 온칩 모델에서 세포 내 활성 산소종 및 세포 생존율을 포함한 산화 스트레스 관련 판독값의 제어 능력이 향상되었다고 보고되었습니다¹⁷. 따라서 OoC 시스템은 제어된 실험 조건 하에서 조직 생리학, 생체 재료 상호작용 및 질병 과정을 연구하기 위한 유망한 플랫폼으로 부상했습니다¹⁸. 치과 연구에서 OoC 기술은 점점 더 복잡한 구강 조직 인터페이스를 모델링하는 데 점진적으로 적용되어 왔습니다¹⁹. 초기 치아-온-어-칩(tooth-on-a-chip) 플랫폼은 생체 재료-상아질-치수 인터페이스를 모방했으며²⁰, 이후 더 발전된 버전에서는 치수-상아질 복합체의 구조적 및 기능적 복잡성을 더 충실하게 복제하기 위해 혈관 및 삼차신경 분포를 통합했습니다²¹. 치수를 넘어, 미성숙 근관의 3D 모델을 통해 근관 세척제 평가와 치근단 유두 유래 줄기세포의 혈관 신생 발아(angiogenic sprouting) 연구가 가능해졌습니다^22,23. 치주 수준에서는 잇몸-온-어-칩(gum-on-a-chip) 플랫폼이 숙주-미생물 상호작용을 조사하고 치료제로서 프로바이오틱스의 면역 조절 잠재력을 평가하는 데 사용되었으며²⁴, 치주인대-온-어-칩(periodontal ligament-on-chip) 장치는 간질액의 흐름이 혈관 네트워크 형성 및 치주인대 줄기세포 스페로이드의 골분화에 어떻게 영향을 미치는지 입증했습니다^25,26. 이러한 모델들을 보완하여, 특수 구강점막-온-어-칩 및 치과 임플란트-온-어-칩 시스템은 생리학적으로 유의미한 조건 하에서 숙주-재료 상호작용과 치과용 모노머의 세포 독성을 특성화함으로써 치과 미세유체 연구의 범위를 더욱 확장했습니다^27,28.

OoC 시스템이 치과, 구강 및 두개안면 연구에 점점 더 많이 적용되고 있지만, 제작 워크플로우의 표준화와 재현성을 위한 지속적인 노력은 여전히 중요합니다. 문헌에는 다양한 장치 구성과 실험적 응용을 보여주는 여러 치아-온-어-칩(tooth-on-a-chip) 모델이 보고되었습니다^20,29,30,31. 그러나 장치 구조, 제작 방법, 상아질 통합 방식 및 실험 매개변수 보고의 차이로 인해 재현성과 연구 간의 직접적인 비교가 제한될 수 있습니다. 특히, 마이크로채널 기하학적 구조, 상아질 통합 전략 및 제작 방식의 차이는 장치 내의 생물학적 및 기계적 미세환경에 영향을 줄 수 있습니다. 일부 보고된 모델은 상아질-치수 인터페이스의 특성을 재현하기 위해 상아질을 통합한 반면^20,29,30, 다른 모델들은 대안적인 구성을 사용합니다³¹. 또한, 포토리소그래피, 레이저 커팅, 마이크로밀링 및 3D 프린팅과 같은 제작 방법은 의도한 장치 설계와 응용 분야에 따라 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다. 더욱이, 생물학적 유용성을 결정짓는 결정적인 요인은 장치의 구조적 방향, 구체적으로 채널과 상아질 절편이 수평 또는 수직 구성으로 배치되었는지 여부입니다^19,32. 수평 적층 구성에서는 나란히 배치된 구획들이 측면 구획화와 세포의 실시간 시각화를 용이하게 하여, 치주 복합체와 같이 본질적으로 측면 공간 조직을 가진 조직을 모델링하는 데 특히 적합합니다^24,32. 그러나 이러한 설계는 구획의 측면 배치가 와동과 치수 사이의 상아질 장벽의 생체 내 방향을 충실히 복제하지 못하므로, 생체 재료-상아질-치수 복합체와 같은 수직 생물학적 인터페이스를 재현하는 능력에 본질적인 한계가 있습니다^20,32. 수직 적층 구성은 천연 상아질 절편으로 분리된 두 구획을 y축을 따라 중첩함으로써 이러한 한계를 해결하며, 이를 통해 온전한 상아질을 통한 분자 이동의 동시 정량화와 배출 배지에서 측정되는 치수 세포 반응의 실시간 모니터링이 가능해집니다³⁰. 하지만 이 방향의 알려진 한계는 상아질-세포 인터페이스의 단면 이미징에 관한 것입니다. 세포와 세포외 기질이 측면으로 배치된 수평 적층 구성에 비해, 동일 초점 평면 내에서 상아질-세포 인터페이스의 단면 이미지를 획득하는 것은 기술적으로 더 어렵기 때문입니다. 문헌에 여러 상아질-치수 복합체-온-어-칩 모델이 보고되었으나, 대다수는 구획이 동일 평면상에 나란히 배치된 수평 적층 구성을 채택하고 있으며^10,20,21,29, 수직 적층 구성 내에 천연 상아질 절편을 통합한 경우는 상대적으로 적습니다³⁰. 그럼에도 불구하고, 이러한 모델들 전반에 걸친 제작 방식과 보고 매개변수의 차이는 여전히 재현성과 연구 간 비교를 제한하고 있습니다³³. 본 논문은 수직 적층 치아-온-어-칩 장치의 상세한 제작 프로토콜을 제공함으로써 방법론적 재현성을 개선하고, 이를 통해 치과 연구 커뮤니티 내에서 해당 플랫폼의 광범위한 도입을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

본 원고는 포토리소그래피로 제작된 몰드를 이용해 제작된 3층 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체 플랫폼 내에 인간 상아질 디스크를 포함하는 수직 적층형 상아질-치수 복합체 OoC 장치의 단계별 제작 및 조립 프로토콜을 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 정적 조건에서 장치 내에 치수 줄기세포를 파종하고 배양하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

본 연구는 헬싱키 선언을 준수하여 수행되었으며, 인간 시료를 포함하는 연구에 대해 Universidad de La Frontera 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 상아질 디스크 획득

참고: 프로토콜을 시작하기 전에 장치 설계를 준비하십시오(그림 1A–1C).

1. 치아 수집 및 보관
   1. 환자의 고지된 동의를 얻은 후 건강한 인간의 대구치 또는 소구치를 수집한다.
   2. 상아질의 탈수 및 단백질 변성을 방지하기 위해 모든 시료를 0.5% chloramine 용액에 담가 4°C에서 보관한다.
   3. 보관 기간 동안 chloramine 용액을 매주 한 번 교체한다.
2. 상아질 디스크 제작
   1. 350,000 rpm으로 작동하며 원통형 다이아몬드 버(직경 1 mm; 입자 크기 100–150 µm)가 장착된 고속 핸드피스를 사용하여 각 치아의 치관 중앙 1/3 지점을 수평으로 절단한다.
   2. 약 50 mL/min의 지속적인 수냉 관수를 하며 절단 과정을 수행한다.
   3. 치수강과 교합면 구 및 fissure에 존재하는 법랑질을 피하기 위해 치관의 중앙 1/3 지점에서 절단하여, 주로 상아질 조직으로 구성된 디스크를 얻는다.
      주의: 지속적인 관수 하에 치아 절단을 수행하고 장갑, 마스크, 보호 안경을 포함한 적절한 개인 보호 장구를 착용한다.
3. 상아질 디스크 마무리 작업
   1. 입자 크기가 순차적으로 감소하는 마무리 디스크를 사용하여 상아질 디스크를 연마한다.
   2. 최종 상아질 두께가 약 0.8 mm (±± 0.3 mm)가 되고 측면 치수가 약 5 mm × 5 mm (±± 0.3 mm)가 될 때까지 연마를 계속한다 (Figure 1D).
4. 상아질 디스크 보관
   1. 제작된 상아질 디스크를 OoC 장치 조립 전까지 0.5% chloramine 용액에 담가 4°C에서 보관한다.

그림 1: 상아질-치수 복합체 장기-온-어-칩 (OoC) 장치의 설계 및 제작 워크플로우. (A) 3층 구조를 보여주는 장치의 3차원 설계. (B) 주요 치수가 표시된 장치 설계의 상단 뷰. (C) 3층 장치 구성의 측면 뷰. (D) 두께 약 0.8 mm, 가로세로 크기 약 5 mm × 5 mm로 제작된 대표적인 상아질 디스크. (E) 포토리소그래피로 제작되어 상단 및 하단 polydimethylsiloxane (PDMS) 층의 캐스팅에 사용된 실리콘 마스터 몰드. (F) 열 중합 후 실리콘 몰드에서 경화된 PDMS 층을 제거하는 과정. (G) 층 결합 전 PDMS 표면의 플라즈마 처리. (H) 플라즈마 본딩으로 조립되어 상아질 인터페이스가 포함된 최종 3층 상아질-치수 복합체 OoC 장치. (I) 누수 테스트 및 미세유체 실험 준비를 위해 튜브에 연결된 조립된 장치. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

2. 상아질-치수 복합체 OoC 장치 제작

1. 작업 공간 및 재료 준비
   1. 재료 및 장비 준비
      1. 다음에 나열된 모든 재료와 장비를 준비하십시오. 재료 목록 소자 제작을 시작하기 전에.
      2. 장치 조립 전에 생검 펀치를 준비하십시오.
      3. 모든 제작 절차는 깨끗하고 먼지가 없는 환경에서 수행하십시오.
      4. 장치 제작 및 조립 전 과정 동안 장갑, 보호 안경 및 적절한 개인 보호 장구를 착용하십시오.
         참고: 프로토콜을 시작하기 전에 포토리소그래피로 제작된 몰드를 준비하십시오.그림 1E).
2. 미세구조 몰드의 제작
   1. 실리콘 웨이퍼의 준비
      1. 4인치 단면 연마 실리콘 웨이퍼(N형, As 도핑, CZ 성장법) 상에 몰드를 제작하십시오. <100> 오리엔테이션, 500 ±± 25 µm 두께, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, 비저항 0.001–0.005 Ω·cm).
      2. 웨이퍼를 아세톤, 이소프로판올, 초순수 순으로 각각 10분 동안 초음파 세척하십시오.
      3. 압축 공기로 웨이퍼를 건조하십시오.
      4. 웨이퍼를 다음 온도에서 베이크하십시오. 200°C 잔류 수분을 제거하기 위해 핫플레이트에서 10분 동안 가열합니다.
      5. 웨이퍼를 실온(RT)으로 냉각하십시오. 20°C–25°C).
   2. 표면 활성화 및 포토레지스트 코팅
      1. 공기 플라즈마 레벨 7에서 120초 동안 작동하는 진공 플라즈마 세척기를 사용하여 실리콘 웨이퍼 표면을 활성화합니다.
      2. GM 1060 에폭시 기반 음성 포토레지스트를 300 rpm에서 10초 동안 스핀 코팅하여 도포합니다.
      3. 200 rpm/s의 가속도를 사용하여 565 rpm에서 100초 동안, 그리고 965 rpm에서 1초 동안 스핀 코팅을 계속하십시오.
      4. 코팅된 웨이퍼를 10분 동안 그대로 둡니다.
      5. 다음 온도에서 사전 베이킹(pre-bake)을 수행하십시오. 65°C 10분 동안.
      6. 다음 온도에서 프리베이킹(pre-bake)을 계속하십시오. 95°C 1시간 동안.
      7. 웨이퍼를 실온으로 냉각하십시오.
   3. 노광 및 현상
      1. 직접 레이저 리소그래피 시스템을 사용하여 1,950 mJ/cm²의 조사량으로 포토레지스트를 노광합니다.².
      2. 다음 온도에서 후소성(post-bake)을 수행하십시오. 65°C 10분 동안.
      3. 다음 온도에서 후경화(post-bake)를 계속하십시오. 95°C 30분 동안.
      4. 웨이퍼를 실온(RT)까지 냉각하십시오.
      5. 웨이퍼를 10분 동안 그대로 둡니다.
      6. PGMEA에서 4분 동안 패턴을 현상하십시오.
      7. 잔류 감광액(photoresist)이 남아 있는 경우, 30초 간격으로 현상 시간을 연장하십시오.
      8. 이소프로판올로 헹구어 현상을 중단합니다.
      9. 압축 공기를 사용하여 웨이퍼를 건조하십시오.
   4. 하드 베이크
      1. 다음 온도에서 하드 베이크(hard bake)를 수행하십시오. 135°C 2시간 동안.
      2. 폭 1mm 및 50 µm 높이에서.
3. PDMS 혼합물의 준비 및 탈기
   1. PDMS 혼합물 준비
      1. PDMS 베이스와 경화제를 10:1의 중량비로 혼합하십시오.
      2. 플라스틱 비커에 담긴 혼합물을 유리 막대로 약 5분 동안 수동으로 저어줍니다.
      3. 혼합하는 동안 천천히 지속적인 원형 운동을 유지하십시오.
         주의: 혼합 과정에서 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.
   2. 탈기
      1. PDMS 혼합물을 진공 펌프가 연결된 진공 데시케이터에 넣습니다.
      2. 혼합물을 약 700 mmHg에서 5분 동안 탈기하십시오.
      3. 표면의 기포가 터질 수 있도록 진공 상태를 잠시 해제하십시오.
      4. 진공을 다시 가하십시오.
      5. 눈에 보이는 기포가 더 이상 남지 않을 때까지 이 과정을 반복하십시오.
         참고: 총 탈기 시간은 일반적으로 약 30분입니다.
4. 몰드 위에 PDMS 캐스팅하기
   1. 몰드 준비
      1. 몰드를 평평한 표면에 놓으십시오.
      2. 압축 공기를 사용하여 몰드를 세척하십시오.
      3. 패턴 처리된 표면에 직접 접촉하지 마십시오.
      4. 몰드에 먼지나 오염 물질이 없는지 확인하십시오.
   2. PDMS 분주
      1. 상아질 매몰층을 제작하기 위해 상아질 디스크 주변에 약 8g의 PDMS를 분주합니다.
      2. PDMS 높이를 상아질 디스크 두께(0.8)에 맞게 조정하십시오. ±± 0.3 mm).
      3. PDMS가 상아질 표면을 덮지 않도록 하십시오.
      4. 각 마이크로채널 층을 제작하기 위해 몰드 단위당 약 0.26 g의 PDMS를 분주하십시오.
      5. 미세 구조의 충전이 원활하게 이루어지도록 몰드를 가볍게 두드리거나 진동을 가합니다.
      6. PDMS가 가장 미세한 구조까지 완전히 안착되도록 둡니다.
      7. PDMS 표면에 닿지 않도록 뚜껑이나 평평한 덮개로 몰드를 덮으십시오.
         참고: 상아질 매립층의 두께는 약 0.8 mm이고, 각 마이크로채널 층의 두께는 약 0.4 mm로, 전체 장치의 총 두께는 약 1.6 mm입니다.
         참고: 공초점 이미징을 계획하는 경우, 공초점 대물렌즈의 작동 거리(working distance)에 따라 층 두께를 조절하십시오.
5. 경화
   1. 몰드를 오븐에 넣고 다음 온도에서 처리하십시오. 50°C.
   2. PDMS를 4시간 동안 경화하십시오.
6. PDMS 층의 제거
   1. 경화된 PDMS의 제거
      1. 경화된 PDMS 층을 몰드에서 조심스럽게 벗겨냅니다 (그림 1F).
      2. 미세 구조가 손상되지 않도록 PDMS 층을 주의해서 다루십시오.
7. PDMS 층의 본딩 및 입구와 출구 포트 제작
   1. 입구 및 출구 포트 제작
      1. 1mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 지정된 유입구 및 유출구 위치에 천공을 만드십시오.
      2. 펀칭 시 마이크로채널 면이 위를 향하도록 배치하십시오.
         참고: 구조적 손상을 방지하기 위해 PDMS 층을 커팅 매트 위에 놓으십시오.
      3. 상단 마이크로채널에 해당하는 위치의 상층부에 두 개의 천공을 만듭니다.
   2. PDMS 층의 세척
      1. 이소프로필 알코올 또는 에탄올을 사용하여 PDMS 층을 세척하십시오.
      2. 멸균 접착 테이프를 사용하여 잔류 먼지 입자를 제거하십시오.
      3. 조립 전 모든 접합 표면에 오염 물질이 없는지 확인하십시오.
   3. PDMS 표면의 플라즈마 활성화
      1. 플라즈마 처리를 위해 상단 및 중간 PDMS 층을 배치합니다 (그림 1G).
      2. 주변 공기를 작동 가스로 사용하고 약 25W에서 작동하는 휴대용 코로나 플라즈마 처리기로 표면을 활성화합니다.
      3. 플라스마 소스와 PDMS 표면 사이에 약 1mm의 작동 거리를 유지하십시오.
         주의: 플라즈마 처리는 적절한 환기 시설 하에서 수행하고, 플라즈마로 인해 발생한 오존에 직접 노출되지 않도록 주의하십시오.
      4. 플라스마 처리 장치를 작동시키고 5초 동안 안정화하십시오.
      5. 처치 전 균일한 플라즈마 빔의 생성을 확인하십시오.
      6. 약 5 mm/s의 속도로 지속적으로 왕복 운동하며 상단 PDMS 층을 10초 동안 처리합니다.
      7. 동일한 동작과 거리로 중간 PDMS 층을 10초 동안 처리합니다.
      8. 본딩 직전에 상층부에 1초간 추가 플라스마 처리를 수행하십시오.
   4. 상층 및 중층의 접합
      1. 플라스마 처리 직후 상단 마이크로채널을 상아질 디스크에 정렬하십시오.
      2. 상층과 중간층을 서로 결합하십시오.
      3. 결합된 조립체를 다음 온도/조건의 오븐에 넣으십시오. 75°C 5분 동안.
      4. 배양 중에 결합을 공고히 하십시오.
         참고: 상아질 디스크와 마이크로채널은 육안으로 확인 가능하며, 별도의 정렬 도구 없이도 정렬할 수 있습니다.
   5. 하단 마이크로채널 포트 제작
      1. 결합된 상층과 중층을 통해 하단 마이크로채널에 해당하는 두 개의 천공을 뚫습니다.
      2. 정렬 상태를 유지하기 위해 두 층을 동시에 펀칭하십시오.
         참고: 이 절차를 통해 상층에는 4개의 천공이, 중간층에는 2개의 천공이 생성됩니다.
      3. 펀칭 전, 접합된 어셈블리를 단단한 커팅 매트 위에 놓으십시오.
      4. 한 번의 동작으로 일정한 하향 압력을 가하십시오.
         참고: 층분리 위험을 최소화하기 위해 회전력이나 측면 힘이 가해지지 않도록 주의하십시오.
      5. 이소프로필 알코올을 적신 보풀 없는 멸균 거즈를 사용하여 천공 부위의 이물질을 제거하십시오.
      6. 적절한 조명 아래에서 천공 부위와 주변 접합 영역을 검사하십시오.
      7. 다음 단계로 진행하기 전에 층분리, 찢어짐 또는 불완전한 천공이 없는지 확인하십시오.
   6. 하층 접합
      1. 단계 2.7.4에 설명된 대로 하단층을 플라스마 처리하십시오.
      2. 하단 마이크로채널의 유입구 및 유출구 포트를 상단 및 중간 층의 천공 부위와 일치시키십시오.
      3. 하단 층을 접합하여 장치 조립을 완료합니다.
         참고: 정렬을 용이하게 하기 위해, 접합 전 하층의 외측 표면에 입구와 출구 위치를 표시하십시오.
         참고: 문헌에 보고된 바와 같이, 플라스마 챔버가 플라스마 펜보다 더 강력한 결합력을 제공할 수 있습니다.³⁶.
         참고: 완성된 장치는 상아질 인터페이스가 통합된 3층 미세유체 플랫폼으로 구성됩니다.그림 1H). 하단 상아질 표면은 모델의 치수 측을 나타내며, 상단 상아질 표면은 치과용 생체 재료 또는 세균 제제에 노출되는 치관 측을 나타냅니다.
8. 미세유체 장치의 누출 테스트
   1. 조립된 장치의 검사
      1. 조립된 장치의 정렬 상태에 이상이 없는지 확인하십시오.
      2. 결합 부위의 불완전한 접합 및 가시적인 누출 여부를 점검하십시오.
   2. 누출 시험
      1. 19G 루어락(Luer-lock) 바늘을 유입구 포트에 연결하십시오(그림 1E).
      2. 니들을 미세유체 펌프 튜빙에 연결하십시오.
      3. 니들 허브를 펀칭된 포트에 살짝 눌러 넣어 공기가 새지 않도록 밀착시킵니다.
      4. 멸균된 PBS 또는 배양액을 다음의 유속으로 주입하십시오. 10 µL/min.
      5. 최소 5분 동안 유체 흐름을 유지하십시오.
      6. 유동 과정 동안 모든 접착 계면, 채널 마진 및 상아질 디스크 경계를 검사하십시오.
      7. 주입 중 및 주입 후에 적절한 조명 아래에서 장치를 관찰하십시오.
      8. 액체 축적, 습기 또는 액적 형성이 없는지 확인하십시오.
      9. 누설이 검출되지 않은 경우, 해당 장치를 누설 없음으로 분류하십시오.
      10. 누설이 발생하는 장치는 폐기하십시오.
          참고: 세포 파종 또는 실험적 사용 전에 제작된 모든 장치에 대해 누출 테스트를 수행하십시오.
9. 미세유체 장치의 멸균 및 보관
   1. 멸균
      1. 조립된 장치의 상단 표면을 층류 작업대(laminar flow cabinet) 내부에서 UV 광선(254 nm)에 30분 동안 노출시킵니다.
      2. 바닥면을 UV 광선에 30분 동안 추가로 노출시키십시오.
      3. 마이크로채널을 70% 에탄올로 20분 동안 세척하십시오.
      4. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 멸균 PBS로 마이크로채널을 3회 세척하십시오.
   2. 보관
      1. 멸균된 장치를 세포 배양 실험에 즉시 사용하십시오.
      2. 또는, 장치를 멸균된 PBS에 담근 상태로 다음 온도에서 보관하십시오. 4°C 사용 전까지 멸균 용기 내에 보관하십시오.
         ​주의: 장치 조립 후에는 클로라민이나 다른 소독액을 사용하지 마십시오. PDMS가 이러한 화합물을 흡수하여 세포 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다.

3. 치수줄기세포의 부착 및 생존능 평가

1. 상아질 표면의 전처리
   1. 장치 내에 10% EDTA를 주입한다.
   2. EDTA 용액과 상아질 표면의 접촉 상태를 15분 동안 유지한다.
   3. 마이크로채널 내의 유체 이동을 유지하기 위해 3분마다 0.5 mL EDTA를 주입한다.
   4. 초순수로 상아질 디스크를 3회 세척한다.
   5. 각 세척 단계를 5분 동안 유지한다.
      참고: EDTA 처리는 도말층(smear layer)을 제거하고 상아질 기질 단백질을 노출시킨다.
      주의: 피부 및 눈 자극을 방지하기 위해 장갑과 보호 안경을 착용하고 EDTA 용액을 취급한다.
2. 치수 줄기세포 파종
   1. 치수 줄기세포의 증식
      1. T75 플라스크당 1 × 10⁶ cells의 밀도로 치수 줄기세포를 파종한다.
      2. 세포가 약 80%의 합류도(confluency)에 도달할 때까지 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양한다.
      3. 트립신을 사용하여 세포를 탈착시킨다.
      4. 완전 배지를 사용하여 트립신을 중화시킨다.
      5. 세포 현탁액을 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는다.
      6. 트리판 블루(trypan blue)를 사용하여 세포 생존율을 평가한다.
      7. 생존율이 90% 이상인 세포 현탁액을 사용한다.
   2. 세포 현탁액 준비
      1. 37°C로 예열된 세포 현탁액을 준비한다.
      2. 완전 배지 내 세포 농도를 100,000 cells/mL로 조정한다.
      3. 최종 현탁액 부피를 1–2 mL로 준비한다.
         참고: 본 연구에서는 계대 배양 5대(passage 5)의 세포를 사용하였다.
   3. 세포 파종
      1. 하부 마이크로채널의 입구 포트로 세포 현탁액을 주입한다.
      2. 세포 파종 후 장치를 뒤집는다.
         참고: 장치를 뒤집으면 세포가 상아질 표면으로 침전되어 세포 접착이 촉진된다.
   4. 배양
      1. 뒤집힌 장치를 페트리 접시 안에 넣는다.
      2. 증발을 최소화하기 위해 페트리 접시에 배양액 1 mL를 추가한다.
      3. 장치를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한다.
      4. 배양 기간 동안 정적 배양 조건을 유지한다.
         참고: 본 연구에서는 동적 흐름 검증을 수행하지 않았다.
         참고: 본 프로토콜은 초기 장치 검증 및 세포 접착 평가를 위한 정적 배양 조건을 설명한다.
   5. 초기 장치 검증
      1. 주사 전자 현미경을 사용하여 세포 접착을 평가한다.
      2. 분석 전, 장치를 분해하여 상아질 디스크를 회수한다.
3. 주사 전자 현미경 분석용 시료 준비
   1. 시료 회수 및 세척
      1. 24시간 배양 후 장치를 분해한다.
      2. 상아질 디스크를 회수하여 배양 플레이트 또는 페트리 접시로 옮긴다.
      3. 세포가 파종된 상아질 표면이 위를 향하도록 배치한다.
      4. 1 mL PBS를 사용하여 상아질 디스크를 2회 세척한다.
   2. 고정
      1. 0.1 M Sorensen 인산 완충액에 희석된 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 2 mL를 첨가한다.
      2. 시료를 실온(RT)에서 30분 동안 배양한다.
         주의: 글루타르알데히드는 독성이 있으며 피부, 눈 및 호흡기에 자극을 줄 수 있다. 고정 절차는 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태로 화학 흄 후드 내에서 수행한다.
   3. 고정 후 세척
      1. 글루타르알데히드 용액을 제거한다.
      2. 초순 증류수를 사용하여 실온에서 상아질 디스크를 3회 세척한다.
   4. SEM 분석
      1. 환경 주사 전자 현미경을 사용하여 시료를 분석한다.
      2. 저진공 조건(25 Pa)에서 현미경을 작동시킨다.
      3. 가속 전압 10.0 kV, 작동 거리 7.0 mm를 사용한다.
      4. 후방 산란 전자 3D 검출 모드(BSE-3D)를 사용하여 이미지를 획득한다.
      5. ×200 배율에서 이미지를 캡처한다(그림 2A).
4. 공초점 현미경을 통한 세포 생존율 평가
   1. 시료 준비
      1. 단계 3.2에 설명된 대로 세포를 파종하고 배양한다.
      2. 장치를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한다.
      3. 장치를 분해하여 상아질 표면을 노출시킨다.
      4. 상아질 디스크를 Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 보충된 예열된 HBSS⁺/+가 담긴 웰 플레이트로 옮긴다.
   2. 시료 세척
      1. HBSS⁺/⁺를 사용하여 상아질 디스크를 2회 세척한다.
      2. 염색 전 잔류 혈청과 페놀 레드를 제거한다.
         참고: 잔류 혈청과 페놀 레드는 배경 자동 형광을 증가시킬 수 있다.
   3. 생세포 염색
      1. HBSS⁺/⁺ 내에 2 µM 농도의 신선한 Calcein AM 작업 용액을 준비한다.
      2. 상아질 표면을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 양의 염색 용액을 첨가한다.
      3. 시료를 37°C 암실에서 20분 동안 배양한다.
      4. 배양 후 염색 용액을 제거한다.
   4. 사세포 염색
      1. Propidium Iodide 작업 용액(HBSS⁺/⁺ 내 1–2 µg/mL)을 첨가한다.
      2. 시료를 37°C 암실에서 5–8분 동안 배양한다.
      3. 배양 시간이 10분을 초과하지 않도록 한다.
      4. HBSS⁺/⁺로 시료를 2회 세척한다.
      5. 이미징 전까지 시료를 완충액에 잠긴 상태로 유지한다.
   5. 공초점 현미경 이미지 획득
      1. 염색 후 30분 이내에 공초점 이미지를 획득한다.
      2. 녹색 및 적색 채널에서 순차적으로 이미지를 획득한다.
      3. 생세포 이미징에는 λ_ex 490 nm 및 λ_em 515 nm를 사용한다.
      4. 사세포 이미징에는 λ_ex 535 nm 및 λ_em 617 nm를 사용한다.
         ​참고: 배양 및 이미징 과정 동안 형광 염색 용액과 염색된 시료를 빛에 노출되지 않도록 보호한다(그림 2B).

그림 2: 상아-치수 복합체 OoC 장치 내 치수 줄기세포의 부착 및 생존능력에 대한 대표적인 평가. (A) OoC 장치 내에서 24시간 동안 정적 배양 후 상아질 표면에 부착된 치수 줄기세포(흰색 별표)를 보여주는 주사 전자 현미경 이미지. 24시간 배양 후, 부착된 세포는 마이크로채널에 노출된 상아질 표면의 54.35 ± 0.92%를 덮었다. PDMS로 덮인 상아질 영역(검은색 별표)에서는 세포가 관찰되지 않았으며, 이는 장치 층 사이의 밀봉이 효과적이었음을 나타낸다. 스케일 바 = 200 µm. (B) 24시간 정적 배양 후 상아질 표면에 부착되어 녹색으로 염색된 살아있는 치수 줄기세포(흰색 화살표)를 보여주는 공초점 현미경 이미지. 적색으로 염색된 생존하지 않은 세포도 관찰된다(파란색 화살표). 스케일 바 = 50 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

결과

치아-온-어-칩(tooth-on-a-chip) 장치의 성공적인 제작은 상아질 디스크 준비(그림 1D), 포토리소그래피 기반 몰드 제작(그림 1E), 경화된 PDMS 층 제거(그림 1F), 본딩 전 플라스마 활성화(그림 1G), 최종 장치 조립(그림 1H), 그리고 장치와 미세유체 셋업의 연결(그림 1I)을 포함하여 그림 1A–1I에 예시된 워크플로우를 따라 진행되었습니다. 결과물인 장치는 3층의 PDMS 조립체로 구성되었으며, 상아질 디스크가 중간 층에 완전히 통합되고 상단 및 하단 미세유로가 상아질 표면의 양측에 배치되었습니다(그림 1H).

이 단계에서의 긍정적인 결과는 눈에 보이는 기포나 박리가 없으며, 입구 포트를 통해 PBS 또는 배양액을 주입했을 때 액체가 누출 없이 통과하는 것으로 정의되었습니다(그림 1I). 마이크로채널 포트의 정렬 불량, 불완전한 플라즈마 본딩 또는 상아질-PDMS 계면에서의 누출은 조립 실패를 나타내며, 이 경우 제작 절차를 반복해야 했습니다.

총 30개의 장치를 제작했으며, 그 중 약 20%가 제작 또는 테스트 과정에서 실패했습니다. 실패의 주된 원인은 불완전한 플라즈마 본딩으로 인해 마이크로채널 경계 밖으로 유체가 누출된 것이었으며, 적은 비율의 실패는 장치의 다른 영역에서 발생한 박리로 인해 나타났습니다. 상아질-PDMS 인터페이스에서의 누출이나 마이크로채널 입구 및 출구 포트의 정렬 불량으로 인한 실패는 없었습니다.

24시간 동안의 정적 배양 후, 상아질 표면에서 섬유아세포 형태를 보이는 부착성 치수줄기세포의 존재를 통해 세포 파종이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다. 주사전자현미경을 사용하여 세포 부착과 장치의 무결성을 모두 평가하였다(Figure 2A). 본 프로토콜을 사용했을 때, 배양 24시간 후 부착된 세포는 마이크로채널에 노출된 상아질 표면의 54.35 ± 0.92%를 덮고 있었다. 양성 결과는 부착된 세포가 오직 마이크로채널 영역 내에만 존재하는 것으로 증명되었으며, PDMS로 덮인 상아질 표면에는 세포 부착이 일어나지 않았다(Figure 2A). 이러한 공간적 분포는 장치 층 사이의 성공적인 밀봉과 적절한 장치 조립을 뒷받침한다. 반대로, 마이크로채널 경계 외부에서 세포가 발견되는 것은 누출을 나타내며, 이는 부정적인 결과로 간주해야 한다.

live/dead 염색을 이용한 공초점 현미경 분석을 통해 장치 내 세포 생존도를 비파괴적으로 평가할 수 있었습니다. 성공적인 결과는 녹색 형광을 띠며 섬유아세포 형태를 보이는 생존 세포가 지배적이고, 적색으로 염색된 비생존 세포가 간헐적으로만 관찰되는 것으로 특징지어집니다(그림 2B). 반대로, 비생존 세포의 비율이 높게 나타난다면 이는 상아질 전처리가 최적화되지 않았거나, 세척이 불충분했거나, 또는 배양 조건이 부적절했음을 나타냅니다.

프로토콜 최적화 과정에서, 미리 정의된 리세스(recess)가 포함된 고정 몰드를 사용하여 중간 PDMS 층 내에 상아질 디스크를 배치하는 초기 제작 전략을 평가하였습니다(그림 3A). 이 접근 방식은 디스크 배치를 표준화하고 디스크-PDMS 인터페이스에서의 누수를 줄이기 위한 것이었으나, 실제로는 비효율적인 것으로 나타났습니다. 상아질 디스크 리세스에 해당하는 영역을 경화된 PDMS 층에서 수동으로 절단해야 했기 때문에, 디스크 가장자리와 절단된 PDMS 모서리 사이의 정밀한 적합을 안정적으로 달성할 수 없었으며, 이로 인해 발생한 인터페이스 간극으로 인해 제작된 장치의 약 50%에서 누수가 발생하였습니다(그림 3A).

그림 3: 상아질-치수 복합체 OoC 장치 최적화 과정에서 확인된 실패한 제작 접근법을 보여주는 대표 이미지. (A) 표준화된 상아질 디스크 배치를 위해 고정된 홈이 설계된 실리콘 몰드(흰색 화살표). 수동 시편 준비로 인한 상아질 디스크 크기의 내재적 변동성 때문에 고정된 몰드 형상에 안정적인 적합을 구현할 수 없었으며, 이로 인해 제작된 장치의 약 50%에서 계면 간극 및 누출이 발생함. (B) 디스크-PDMS 계면에 밀봉재를 도포한 후의 상아질 표면 주사 전자 현미경 이미지. 노출된 상아질(검은색 별표)과 밀봉재 침전물(흰색 별표)이 표시됨. 밀봉재가 상아질 표면으로 의도치 않게 퍼져 세포 접착이 저해되었으며, 세포 군집 형성을 위한 유효 표면적이 감소함. 스케일 바 = 100 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이러한 한계를 해결하기 위해 디스크와 PDMS 계면에 밀봉 재료를 적용하였습니다. 그러나 주사 전자 현미경(그림 3B)에서 확인된 바와 같이, 밀봉 재료가 상아질 표면으로 퍼져 덮인 영역의 세포 부착을 방해하는 추가적인 단점이 발생했습니다. 이러한 미흡한 결과는 초기 제작 전략의 두 가지 결정적인 한계를 부각시켰습니다. 즉, 수동으로 절단된 PDMS 리세스(recess)와 상아질 디스크 사이의 부적절한 적합성과 밀봉 재료로 인한 세포 부착 감소입니다.

토론

본 연구는 상아질과 치수 줄기세포를 포함하는 수직 적층형 tooth-on-a-chip 장치 제작을 위한 단계별 프로토콜을 기술하며, 정적 배양 조건 하에서 장치 내의 대표적인 세포 부착 및 생존능을 입증합니다. 이 프로토콜은 상아질 계면의 in vitro 연구에 적합한 상아질-치수 복합체 OoC 플랫폼의 제작 및 조립을 위한 재현 가능한 워크플로를 제공하기 위해 개발되었습니다. 이러한 워크플로의 구축은 특히 중요한데, 최근의 체계적 문헌고찰에서 상아질-치수 복합체용 미세유체 모델 분야가 여전히 초기 단계에 머물러 있으며, 장치 구조와 재료의 방법론적 이질성이 높아 현재의 tooth-on-a-chip 모델의 재현성과 표준화를 심각하게 저해하고 있음을 강조했기 때문입니다³⁴. 본 연구는 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제공함으로써 이러한 한계를 해결하고, 보다 명확하게 정의된 생물학적 모델의 개발에 기여합니다. 구강 생물학에 적용된 OoC 개발의 더 넓은 맥락에서, França 등¹⁵은 상아질 디스크와 상아질모세포 유사 세포를 포함하는 미세유체 tooth-on-a-chip 모델로 이 분야를 개척하여, 동적 미세유체 환경에서 상아질-치수 계면을 재현하고 치과 재료에 대한 세포독성 반응을 평가할 수 있는 가능성을 입증했습니다. 이 획기적인 기여 이후, 치과 조직 생물학, 생체 재료 상호작용, 구강 미생물학의 다양한 측면을 다루는 점점 더 많은 구강 OoC 플랫폼이 문헌에 보고되었으며³⁴, 이 접근 방식은 활발하고 빠르게 확장되는 연구 분야로 자리 잡았습니다. 본 프로토콜은 표준 미세유체 기술을 보유한 연구 그룹이 접근 가능한 수직 적층형 tooth-on-a-chip 플랫폼의 상세하고 재현 가능한 제작 워크플로를 제공함으로써 이러한 연구 지형에 기여합니다.

장치의 성공적인 제작과 성능 구현을 위해서는 프로토콜의 여러 단계가 매우 중요합니다. 특히, 몰드 위에 PDMS를 부을 때는 균일한 층 두께와 적절한 미세 채널 형성을 위해 정밀한 제어가 필요합니다. PDMS 층의 두께는 의도한 후속 응용 분야에 따라 선택해야 합니다. 예를 들어, 공초점 현미경 분석을 위해서는 상아질 표면에 부착된 세포의 광학적 시각화를 가능하게 할 만큼 PDMS 층이 충분히 얇아야 합니다. 하지만 층이 너무 얇으면 제작 및 조립 과정에서 조작하기가 더 어려울 수 있습니다. 따라서 PDMS 두께의 최적화는 이미징 접근성과 장치 제작 중의 실질적인 취급 편의성 사이의 중요한 균형을 맞추는 과정입니다. 또한, 본 연구에서는 세포 위에 덮인 PDMS 층의 두께가 0.4 mm로, 사용 가능한 공초점 현미경의 침투 깊이(0.2 mm)를 초과했기 때문에 조립된 상태의 장치로는 공초점 현미경 관찰이 불가능했습니다. 결과적으로, 공초점 이미징은 장치를 분해하여 상아질 표면에 직접 노출시킨 후 수행되었습니다. 아울러, 상아질 고유의 불투명성으로 인해 표면에 부착된 세포의 직접적인 광학적 시각화가 불가능하므로, 본 장치에서는 형광 현미경을 적용할 수 없었습니다.

이러한 제한 사항은 특히 세포가 포함된 마이크로채널이 상아질 디스크 아래에 위치하는 수직 적층형 OoC 구성에서 두드러지는데, 이 경우 상단의 PDMS 층과 상아질 자체의 불투명성으로 인해 광학적 접근이 방해받게 됩니다. 이러한 제한은 마이크로채널이 상아질 아래가 아닌 측면으로 나란히 배치되는 수평 적층형 칩 설계에서는 나타나지 않으며, 이를 통해 상아질의 불투명성이나 PDMS 두께의 방해 없이 세포가 파종된 표면에 직접적으로 광학적 접근이 가능합니다. 따라서 수직 및 수평 적층 구성의 선택 시에는 유체 및 생물학적 요구 사항뿐만 아니라 실험실에서 사용 가능한 이미징 방식도 함께 고려해야 합니다. OoC 시스템에서 장치 설계는 중요한 역할을 하며, 미세환경은 가능한 한 in vivo 조건과 가깝게 유지되어야 합니다. 대부분의 조직과 마찬가지로 치아는 기계적 자극을 받으며 이방성 거동³⁵을 보이는데, 이는 가해지는 자극의 방향에 따라 특성이 달라짐을 의미합니다. 또한, 상아질과 조상세포가 수직으로 배열된 상아질-치수 복합체의 관상 부분과 조상세포가 상아질에 인접하여 위치한 측면 부분 사이에는 조직학적 차이가 존재하며, 세포 수, 조직 구성 및 상아세관의 방향에서 뚜렷한 차이를 보입니다. 따라서 수직 적층형 칩 설계는 상아질-치수 복합체의 관상 부분에 영향을 미치는 우식성 병소 및 수복 재료의 해부학적 형상을 더욱 충실하게 재현할 수 있습니다.

정밀한 플라스마 표면 처리는 성공적인 장치 조립에 필수적이며, 칩 생산의 주요 과제 중 하나로 남아 있다³⁶. 본 연구에서는 제작된 장치의 20%에서 박리가 발생했다. 이러한 결과는 예상 가능했는데, 본 연구에서 사용한 핸드헬드 플라스마 펜으로 구현한 PDMS-PDMS 결합은 진공 기반의 플라스마 챔버 시스템보다 반응성 산소종의 농도가 낮기 때문이다. 진공 시스템은 대기압 이상의 산소 농도를 가능하게 하여 결합에 이용 가능한 공유 표면 그룹을 더 많이 생성한다³⁶. 결과적으로 플라스마 펜을 사용하여 얻은 결합 강도는 전용 플라스마 챔버를 사용했을 때보다 본질적으로 낮고 재현성이 떨어지며, 이것이 관찰된 박리율의 원인이 된 것으로 보인다. 상아질 통합 전략의 최적화 또한 누출을 최소화하면서 상아질 디스크와 중간 PDMS 층 사이의 밀착 접촉을 달성하기 위해 여러 번의 제작 반복 과정이 필요했다. 초기 접근 방식으로는 상아질 배치를 위해 중간 층에 미리 정의된 홈을 제작하는 방법이 사용되었다. 그러나 홈을 수동으로 절단하는 과정에서 상아질 디스크와 PDMS 가장자리 사이의 일관된 적합성을 확보하지 못해 배양액 주입 중 누출이 발생했으며, 결과적으로 전체 제작 성공률은 약 50%에 그쳤다.

이후 상아질–PDMS 인터페이스의 밀봉력을 높이기 위해 틀니 접착제를 평가하였으나, 주사전자현미경 관찰 결과 세포 부착을 방해하고 상아질 표면의 세포 가시성을 저하시키는 것으로 나타났다. 이에 따라 상아질 디스크를 몰드 내에 직접 배치한 후 시편 주변에 PDMS를 주의 깊게 캐스팅하여 최적화된 최종 프로토콜을 수립함으로써, 장치 내 상아질 디스크의 통합성을 높이고 추가적인 밀봉 재료의 필요성을 줄였다. 이러한 접근 방식은 상아질 디스크 가장자리와 주변 PDMS 사이의 긴밀하고 정합한 접촉을 보장함으로써, 상아질 표면의 세포 부착을 방해할 수 있는 2차 밀봉제 없이도 상아질–PDMS 인터페이스의 누출을 효과적으로 제거하였다. 본 방법의 몇 가지 한계점 또한 고려되어야 한다. 미세유체 장치의 제작은 여전히 수동 조작 절차에 부분적으로 의존하고 있으며, 이는 장치 간 또는 작업자 간의 변동성을 유발할 수 있다. 포토리소그래피는 미세 채널 형상 제작에 있어 높은 정밀도와 재현성을 제공하지만, 이 공정에는 전문 장비와 기술적 전문 지식이 필요할 수 있다. 3D 프린팅 기술을 포함한 대안적인 제작 방식은 일부 연구실에서 장치 프로토타이핑과 접근성을 용이하게 할 수 있으나, 프린팅 해상도, 잔류 단량체 및 재료의 생체 적합성과 같은 요인들에 대해 세심한 최적화가 필요하다³⁷.

배지의 지속적인 공급은 세포에 안정적인 환경을 제공하며, 노폐물 축적이나 칼슘/인산 불균형으로부터 세포를 보호합니다¹⁶. 여러 연구에 따르면 지속적인 흐름으로 인해 유도된 전단 응력은 생체 내 신호 전달과 유사한 기계적 자극 전달 과정을 모사할 수 있으며, 이는 세포 행동의 핵심 결정 요인으로서^38,39 세포 분화 및 성숙에 기여하고 세포 형태, 유전자 발현 및 기능에 유의미한 변화를 유도합니다³⁹. 본 연구에서는 장치의 제작 및 초기 검증 내용을 보고하며, 정적 배양 조건하에 24 h 후의 세포 부착 및 생존력을 입증하였습니다. 따라서 동적 흐름의 영향은 평가되지 않았습니다. 동적 흐름 조건의 구현은 향후 연구의 중요한 방향이며 후속 연구에서 다룰 예정입니다. 본 프로토콜은 3층 PDMS 미세유체 플랫폼 내에 상아질을 포함하는 수직 적층형 상아질-치수 복합체 OoC 장치 제작을 위한 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다. 이 모델의 잠재적 응용 분야로는 상아질-생체 재료 간의 상호작용 조사, 치과 재료에 대한 세포 반응 연구, 그리고 통제된 실험 조건하에서의 상아질-치수 계면의 in vitro 평가 등이 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
생물학 및 화학 재료
아세톤	ExpertQ	SOLV 8	실리콘 웨이퍼 세척
Alpha MEM 배양액	Cytiva	SH30265.02	치수질 줄기세포 배양액
클로라민 (0.5%)	Merck	7080-50-4	상아질 디스크 보존액
치수질 줄기세포	해당 없음	해당 없음	1차 세포 배양. 단계 3.2.1 및 3.2.2 참조
EDTA (10%)	Winkler	N2222158E	스미어 층 제거
에폭시 기반 음성 감광제	Gersteltec	GM1060	포토리소그래피 몰드 제작
0.1 M Sorensen’s 인산염 완충액 내 글루타르알데하이드 (2.5%)	Sigma-Aldrich	210908-06	SEM 고정
건강한 사람의 치아 (대구치 또는 소구치)	해당 없음	해당 없음	인체 시료
이소프로판올	ExpertQ	SOLV 16	웨이퍼 세척, 현상 중지 및 PDMS 세척
LIVE/DEAD 생존능 분석 키트	Sigma-Aldrich	451	형광 생존능 염색.
PBS (인산염 완충 식염수)	Corning	46-013-CM	세척 및 누출 테스트
PDMS 베이스 및 경화제 (폴리디메틸실록산)	Dow	Sylgard 184	장치 제작
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	감광제 현상
트리판 블루	Sigma Aldrich	T8154-100ml	세포 생존능 평가
트립신	Corning	25-053-CI	세포 분리
초순수	Cytiva	SH30529.01	세척액
소모품 및 실험실 기구
19G 주사바늘	Vmatic	VCB19050	장치와 마이크로펌프 또는 주사기 연결
생검 펀치 (직경: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	입구 및 출구 포트 제작
커팅 매트	Nicecool	해당 없음	펀칭 중 표면 보호
치과용 마감 디스크 (예: Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	상아질 연마
암컷 루어-바브 어댑터	Runze Fluidics	RH-M016	튜브 연결
유리 또는 플라스틱 혼합 스틱	Duran	해당 없음	PDMS 혼합
피하 주사기	Cranberry	pc-12246	세포 파종 및 누출 테스트
보풀 없는 멸균 거즈	Linderson	해당 없음	펀칭 잔해 제거
수컷 루어 어댑터	Runze Fluidics	RH-G016	튜브 연결
혼합 용기	Duran	해당 없음	PDMS 준비
페트리 접시 (140 mm × 20 mm)	Deltalab	2000219	세포 배양/배양
폴리테트라플루오로에틸렌 베이스	CCTVal	해당 없음	중간 상아질 층 제작
실리콘 웨이퍼	Jiaozuo Commercial FineWin	해당 없음	몰드 제작
실리콘 튜브	Runze Fluidics	96421	유체 연결
T75 플라스크	Corning	353136	치수질 줄기세포 증식
웰 플레이트	SPL Life Sciences	30006	공초점 염색 및 이미징 준비
장비 및 기구
에어 드라이어	METALPLAN	TITAN-040	압축 공기 건조
압축 공기원	SCHULZ	CSD-18.1	몰드 및 표면 세척
공초점 현미경	Olympus	해당 없음	모델: FV1000
직접 레이저 리소그래피 시스템	Heidelberg	uPG 101	감광제 노광
환경 주사 전자 현미경	Hitachi	해당 없음	모델: Quanta 400
고속 핸드피스	Nakanishi	해당 없음	모델: Pana-max2
핫 플레이트	LabTech	EH20A Plus	웨이퍼 및 감광제 베이킹
층류 작업대	BioBase	BBS8V1708313D	장치 멸균
미세 유체 펌프	New Era	해당 없음	모델: 1002X-ES. 10 µL/min에서 누출 테스트
미세 구조 몰드 (포토리소그래피로 제작)	CCTVal	해당 없음	몰드 제작 사양은 단계 2.2 참조
오븐 또는 배양기	Memmert	UN110	50°C에서 PDMS 경화 및 75°C에서 접합 강화
진공 플라즈마 세척 챔버	Fari Plasma	GD-5	웨이퍼 플라즈마 활성화
휴대용 코로나 플라즈마	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	PDMS 플라즈마 활성화
초음파 세척기	Elma Sonic	S 10 (H)	웨이퍼 세척
진공 챔버 또는 데시케이터 (250 mm)	Winglass	해당 없음	PDMS 탈기
진공 펌프	ROCKER	300	PDMS 탈기