자폐 관련 경로에서 공성전중단의 기전: 네트워크 약리학, 분자 도킹 및 실험적 검증에 기반한 연구입니다

요약

본 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹, 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 통합하여 자폐 스펙트럼 장애(ASD)에서 콩성전중단(KSZZD)의 핵심 활성 성분과 치료 표적을 밝히고, 알라닌 스캔을 통해 키 결합 잔기를 확인하며, 발프로산 유도 ASD 쥐 모델에서의 효과를 검증합니다.

초록

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 복잡한 신경발달 장애이며, 그 발병 기전은 만성 신경염증과 밀접한 관련이 있습니다. 고전적인 전통 중의학(TCM) 처방으로서, 공생전중단(KSZZD)은 신경발달 및 기억장애에 신경 보호 효과가 보고되어 사용되지만, ASD에서 구체적인 분자 기전은 명확하지 않습니다. 본 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹 분석, MD 시뮬레이션을 통합하여 ASD에 대한 KSZZD의 핵심 활성 성분과 후보 치료 표적을 전신 및 원자 수준 모두에서 체계적으로 밝히는 것을 목표로 합니다. 이후 알라닌 유연 스캔을 통해 키 결합 잔기를 확인하고, 생물학적 효과를 발프로산(VPA) 유도 ASD 쥐 모델을 사용해 평가합니다. 네트워크 약리학 분석 결과, KSZZD의 핵심 성분인 쿼세틴이 TNF α 매개 염증 신호 경로를 조절함으로써 부분적으로 작용할 수 있음이 밝혀졌습니다. 분자 결합 결과는 KSZZD의 핵심 성분들이 표적에 결합하는 에너지가 모두 -5.0 kcal/mol 미만이었으며, 그중 쿼세틴이 TNF에 가장 강한 결합 친화력(-8.52 kcal/mol)을 보였음을 보여주었다. MD 시뮬레이션은 퀘르세틴이 TNF-α의 활성 주머니에 안정적인 결합을 유지할 수 있음을 시사했으며, 알라닌 스캔 결과 GLU104와 GLN102가 복합체의 구조적 안정성을 유지하는 핵심 아미노산 잔기임을 확인했습니다. 생체 내 실험에서 퀘르세틴 개입이 VPA 유발 ASD 쥐에서 운동 및 탐색 행동을 유의미하게 개선하고, 혈청과 뇌 조직에서 TNF-α 발현 수준을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났습니다. 이 발견들은 쿼세틴이 적어도 부분적으로 TNF-α 신호 경로를 억제함으로써 KSZZD의 예측 효과에 기여할 수 있음을 시사합니다.

서론

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 의사소통 장애, 관심사 제한, 반복적인 고정관념 행동이 특징인 복잡한 신경발달 장애입니다^. ASD의 병리학적 기전은 매우 복잡하며, 유전적 변이, 후생유전학적 조절, 환경 요인의 상호작용이 얽혀 있어 궁극적으로 시냅스 가소성 저하와 비정상적인 신경 회로 연결성을 초래합니다 ^2,3. 중추신경계(CNS)의 만성 염증은 ASD 발병 기전에서 중심적인 역할을 하며, 신경염증을 겨냥한 중재법이 유망한 치료 전략으로 떠오르고 있습니다.

고전적인 중의학 공식인 공성전중단(KSZZD)은 『응급 상황을 위한 천 금의 필수 처방전』에 처음 기록되었다. 이 약초는 네 가지 약초로 구성되어 있습니다: 거북이 등껍질, 오스 드라코니스, 폴리갈라에 라딕스, 그리고 아코리 타타리노위 리조마. KSZZD는 전통적으로 심장과 신장을 토화시키고, 마음을 진정시키며, 영혼을 안정시키는 데 사용됩니다. 임상적으로는 지적 발달 지연과 기억력 저하 치료에 흔히^{사용됩니다.} 현대 약리학 연구들은 KSZZD와 그 활성 성분이 신경 보호, 항염증, 항산화 효과를 발휘하며, 신경발달장애 모델에서 학습, 기억, 불안 유사 행동을 개선할 수 있음을 시사했습니다⁵. 우리의 식물화학적 분석 결과, 쿼세틴과 기타 플라보노이드가 이 공식의 핵심 활성 성분임이 밝혀졌으며, 이는 혈액-뇌 장벽을 침투하고 상당한 항염증 활성을 보인다⁶. 그러나 이러한 활성 성분들이 ASD에서 KSZZD의 치료 효과를 매개하는 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않습니다.

계산생물학의 급속한 발전과 함께, 네트워크 약리학, 분자 도킹, 분자 역학 시뮬레이션, 양자 화학 계산과 같은 기법들은 전통 중의학의 활성 성분과 질병 표적 간의 원자 수준 상호작용을 규명하는 강력한 도구를 제공했습니다 7,8,9,10,11 . 이질적인 데이터 소스를 통합함으로써, 네트워크 약리학은 시스템 생물학 관점에서 복잡하고 상호작용하는 '구성 요소-표적-경로' 네트워크를 구축할 수 있게 하여, 전통 중의학이 질병 개입을 위한 핵심 생물학적 노드를 예비적으로 식별할 수 있게 합니다.

이를 바탕으로 분자 도킹은 성분과 표적 단백질 간의 기하학적 매칭과 에너지 적합을 시뮬레이션하고, 결합 모드와 잠재적 활성을 예측하는 데 활용될 수 있습니다. 이후 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 수행하여 수중 및 생리학적 조건에서 복합체의 구조적 변동과 결합 안정성을 조사합니다. 알라닌 스캔과 결합하여 부위 지향 돌연변이 유발 시뮬레이션을 적용하여 결합 친화력을 유지하는 핵심 핫스팟 잔기의 위치를 정확히 찾고 아미노산 수준에서 약물 포어의 기여 무게를 명확히 합니다. 마지막으로, 잘 설계된 약리학적 실험에 기반한 검증을 통해 전통 중의학 화합물이 특정 질병에 미치는 치료 효과의 분자 메커니즘을 효과적으로 밝혀낼 수 있습니다.

따라서 본 연구는 먼저 네트워크 약리학을 통해 ASD 치료에서 KSZZD의 핵심 구성 요소와 표적을 스크리닝하는 것을 목표로 합니다. 이후 분자 도킹, 분자 동역학 시뮬레이션, 알라닌 유연 스캐닝을 결합하여 복합체 안정성을 유지하는 '핫스팟 잔기'를 확인하고, 쿼세틴과 TNF-α 간의 동적 상호작용 패턴을 평가할 것입니다. 마지막으로, VPA 유도 ASD 쥐 모델에서 동물 행동, 뇌 조직병리학, 염증 인자 발현 수준 평가를 통해 계산 결과를 실험적으로 검증할 예정입니다. 본 연구는 KSZZD 유래 성분이 자폐 관련 염증 경로에 영향을 미칠 수 있는 잠재적 기전을 다스케일 관점에서 탐구하여, 신경발달장애에 대한 전통 중의학 개입의 추가 연구를 위한 기초를 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

네트워크 약리학 분석

"Autism"은 GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/)에서 자폐 관련 대상^{12, 13, 14}를 검색할 때 키워드로 사용되었습니다. 데이터베이스에서 검색한 목표물은 중복 항목이 제거된 후 병합되었습니다. 데이터베이스 예측에 포착되지 않은 활성 성분의 알려진 표적은 문헌 보고를 기반으로 보충되었다¹⁵. 질병 표적과 약물 성분의 잠재적 표적은 UniProt 단백질 데이터베이스(https://www.uniprot.org/)를 사용하여 유전자 심볼로 균일하게 표준화되었으며, 이 두 표적 집합을 매핑하여 자폐증¹⁶에 대한 KSZZD의 잠재적 치료 표적을 식별하였습니다.

전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)을 기반으로 KSZZD의 잠재적 생리활성 화합물과 해당 표적은 경구 생체이용률(OB ≥ 0.30)과 약물 유사성 지수(DL ≥ 0.18)의 기준에 따라 선별되었습니다¹⁷. 화합물의 SMILES 식별자는 PubChem 데이터베이스(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 가져왔으며, TCMSP 플랫폼¹⁸에 포함되지 않은 잠재적 표적을 탐색하기 위해 Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)을 추가로 활용했습니다. 이후 HERB 데이터베이스(http://herb.ac.cn)는 리핀스키의 5가지 법칙에 따라 보조 스크리닝에 사용되었으며, 기준은 다음과 같았습니다: 분자량(MW ≤ 500 Da), 옥탄올-물 분배계수(AlogP ≤ 5), 수소 결합체 수(Hdon ≤ 5), 수소 결합체 수(Hacc ≤ 10), 회전 가능한 결합 수(RBN ≤ 10). 그 후 BATMAN-TCM 데이터베이스(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)를 사용하여 다음 기준으로 표적 선별이 수행되었습니다: 점수 컷오프(≥0.84), 약물 적합성 점수(≥0.10), P 값(≤0.05). 마지막으로 UniProt 데이터베이스(https://www.uniprot.org)를 사용하여 선택된 표적 이름을 표준 유전자 심볼로 변환하였습니다.

약물 표적과 자폐증 표적 간의 겹치는 표적은 온라인 Draw Venn Diagram 도구(http://bioinformatics.psb.ugent.be)를 사용하여 확인되었습니다. 이 겹치는 표적들은 STRING 데이터베이스(https://string-db.org/)로 가져와 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축했다¹⁹. 종은 호모 사피엔스로 설정되었고, 신뢰도가 0.40 미만인 단백질-단백질 상호작용은 걸러냈다. 결과물인 네트워크는 시각 분석¹⁶을 위해 Cytoscape 3.10.0 소프트웨어로 임포트되었으며, 약물, 화합물, 표적은 각각 빨간 다이아몬드, 파란 원, 초록 삼각형으로 표현되었고, 가장자리 가중치는 노드의 정도 중심성을 반영했습니다. 이후 CytoNCA 플러그인을 사용해 정도 중심성 값을 계산하고, 핵심 화합물을 순위 매기며, 주요 핵심 화합물을 식별했습니다. 표적 유전자의 생물정보학 풍부 분석은 Metascape 플랫폼²⁰을 사용하여 수행되었으며, 여기에는 GO 분석(생물학적 과정, BP; 분자 기능, MF; 세포 성분, CC)과 KEGG 경로 분석이 포함되었습니다.

분자 도킹

위에서 확인된 자폐증 관련 수용체 단백질은 결합 전에 누락된 잔기를 수리하고, 프로톤화 상태를 최적화하며, 수용체 구조적 완전성을 유지하기 위해 결정물 분자를 제거하는 방식으로 사전 처리되었습니다. 이후 CDOCKER 모듈²¹ 에서 반유연 도킹 방식이 적용되었습니다. 공결정 리간드에서 10 Å 이내의 잔기는 활성 주머니로 정의되었으며, 이 영역 내에서 리간드-수용체 결합이 시뮬레이션되었습니다.

도킹 결과는 CDOCKER 상호작용 에너지를 주요 지표로 평가했으며, 에너지 값이 낮을수록 리간드와 수용체 간 결합 예측이 더 안정적임을 나타냈습니다. 도킹 모드의 신뢰성은 코어 성분의 공간적 결합 구조와 활성 주머니 내 공결정 리간드의 구조를 비교하여 평가하였다. 최적의 결합 에너지와 가장 강한 상호작용을 가진 복합체가 이후 분자 동역학 시뮬레이션의 초기 구조로 선택되었습니다.

분자 역학 시뮬레이션

분자 결합 결과를 바탕으로 쿼세틴 복합체와 TNF-α 간의 결합 메커니즘을 탐구하기 위한 분자 동역학 시뮬레이션이 수행되었습니다. 이 접근법은 원자 수준에서 분자 운동과 상호작용을 시뮬레이션하고, 단백질, 리간드 및 주변 환경의 동적 변화를 분석하여 분자 구조 변화, 결합 안정성, 단백질-리간드 역학에 관한 정보를 제공합니다. 수용체-리간드 복합체는 TIP3P 수분 모델을 사용하여 용해화되었으며, 복합체와 시스템 경계 사이에 최소 12 Å의 완충 거리를 두어 완전한 용해화와 경계 효과를 줄였습니다. 이온 농도는 0.154 M로 설정되었고, 시스템 전하를 중화하기 위해 Na⁺ 이온과 Cl⁻ 이온이 첨가되었다. 시뮬레이션 정확도를 높이기 위해 Amber14SB 단백질 힘장²² 가 채택되었으며, 이는 비결합 분자 간 상호작용과 결합 모드를 효과적으로 설명하며 단백질-리간드 복합체 연구에 특히 적합하다²³.

초기 에너지 최소화를 위해 가장 가파른 하강 방법을 5000단계 동안 실행하여 불합리한 접촉과 고에너지 구조를 제거했으며, 수렴 임계값은 10 kJ/mol/nm로 설정되어 힘장 매개변수의 완화를 보장했습니다. 그 후 2,000단계 동안 켤레 구배 방법이 실행되어 열역학적 상태를 더욱 최적화하고 시스템 안정성을 보장^했다.

평형 상태에서 NVT 앙상블 시뮬레이션은 처음으로 100 ps에서 2 fs 타임스텝으로 수행되었습니다. 시스템은 초기 구조의 영향을 줄이고 열역학적 평형에 도달하기 위해 점차 300 K로 가열되었습니다. 그 후 앙상블은 NPT로 전환되었고, 밀도와 압력을 안정시키기 위해 1바 일정 압력에서 추가로 100 ps 평형을 수행했습니다. 이 단계는 생산 시뮬레이션²⁵ 전에 시스템을 안정적인 열역학 상태로 전환하는 데 사용되었습니다. 공식적인 분자 동역학 시뮬레이션은 20 ns 동안 수행되었으며, 온도는 300 K, 압력은 1 bar, 시간 단계는 2 fs 정도로 유지되었습니다. 탄도는 10ps마다 저장되었습니다. 시뮬레이션의 안정성과 정확성을 보장하기 위해 온도, 압력, 부피 등 물리적 매개변수가 정기적으로 모니터링되어 예상 범위 내에 있는지 확인했습니다.

알라닌 유연 스캐닝

분자 동역학 시뮬레이션에서 얻은 안정적인 구조를 바탕으로, 리간드 결합 경계면 반경 3 Å 내 모든 아미노산 잔기에 대해 알라닌 스캐닝이 수행되었습니다. 이 절차에서는 표적 잔기를 체계적으로 알라닌으로 대체하여 측사슬을 절단하면서 주사슬 구조를 보존하고 측사슬 매개 특이적 상호작용을 제거합니다. 각 잔기의 결합 친화력 기여 중량은 야생형과 돌연변이 복합체 간 결합 자유 에너지 변화를 계산하여 정량화하였다. 전통적인 정적 모델과 달리, 이 연구는 사이드체인 유연한 이완 메커니즘을 도입하여 돌연변이 부위 주변 환경이 구조적 이완을 겪고 결합 인터페이스의 동적 반응을 보다 현실적으로 시뮬레이션할 수 있게 했습니다. 이 분석은 복합체 안정성을 유지하는 후보 핫스팟 잔기를 식별하여 자폐 관련 단백질을 표적으로 하는 리드 화합물 최적화에 에너지 지문을 제공하는 것을 목표로 했습니다.

동물 실험

실험 동물

건강한 SPF 등급 Sprague-Dawley(SD) 쥐(3개월기 수컷 3마리, 암컷 3마리)를 동일한 조건에서 태어나고 자란 쥐를 선정하였습니다. 실내 온도는 18–22°C로 조절되었고, 상대습도는 60%–70%로 유지되었으며, 빛 주기는 12시간: 12시간(밝음: 어둠)이었습니다. 모든 동물 실험 수술은 준이 제1인민병원 실험동물윤리위원회(승인 번호: LunShen (2025)-2-362)의 승인을 받았습니다.

동물 교미, 임신 식별 및 집단 분류

모든 쥐는 구매 후 1주일간 SPF 환경에서 적응적으로 먹이를 주었습니다. 암컷 쥐 한 마리와 수컷 쥐 한 마리가 매일 오후 18시에 함께 우리에 갇혀 있었습니다. 질 플러그 검사는 다음 날 아침 8시(케이지 착용 후 12시간)에 시행되었습니다. 질 플러그의 존재는 성공적인 교미로 간주되었으며, 같은 날을 임신 0.5일(GD0.5)으로 지정하였다. 임신한 쥐는 각각 별도의 우리에 보관되었습니다. 임신한 쥐의 체중을 매일 측정하고 기록했습니다. 임신한 쥐의 체중은 지속적으로 증가했으며, 하루 평균 2–5g의 증가가 있었고, 출산 전까지 총 체중은 약 30% 증가할 수 있었습니다. 임신 약 10일 후, 복부에 전형적인 배 모양의 비대칭 돌출이 보였고, 촉진으로 단단한 태아 덩어리를 만질 수 있었는데, 이는 비만으로 인한 균일하고 부드러운 복부 둘레와는 구별되었다.

모델 설립 및 대조군 설정:

모델 그룹에서는 임신한 쥐 2마리를 무작위로 선정하여 임신 12.5일(GD12.5)에 VPA 용액(600 mg/kg)을 복강내 주입하였습니다. VPA는 임신 12.5일에 복강내 주사 600 mg/kg의 단일 주사로 투여되었습니다. 이 치료법은 Schneider와 Przewłocki(²⁶)의 기념비적인 연구를 바탕으로 선택되었으며, 이들은 이 특정 임신 시점에 VPA 노출이 인간 ASD의 신경해부학적 및 행동적 특징을 모두 재현한다는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜은 이후 표준 모델이 되었으며, 동일한 매개변수를 사용하여 최근 약리학 연구에서 일관되게 검증되었습니다²⁷. 빈 대조군에서는 임신한 쥐 한 마리를 선정하여 같은 시점에 0.9% 정상 식염수로 복강 내 주사를 투여하였습니다. 임신한 쥐는 자연분만했으며, 새끼의 출생일은 출생 후 0일(PND0)으로 기록되었습니다. 모든 새끼 쥐는 NPD21에서 성별별로 분리되어 이유 및 입양되었습니다.

자손 그룹 분류와 개입

PND28에서는 VPA 노출 임신 쥐의 새끼 중에서 12마리의 수컷 새끼가 무작위로 선정되었으며(모델 그룹 6마리, 퀘르세틴 중재군 6마리), 정상 식염수 노출 임신 쥐 자손 중 6마리가 무작위로 선정되었습니다(빈 그룹 6마리). 각 그룹의 새끼들 간에 체중에 유의미한 차이가 없도록 보장되었습니다. 정상식염수 치료를 받은 임신 쥐에게서 태어난 자손은 빈 그룹에, VPA 치료를 받은 임신 쥐에게서 태어난 자손은 모델 그룹에, VPA 치료를 받은 임신 쥐에게서 태어난 자손은 퀘르세틴 중재 그룹에 배정되었습니다.

PND28부터 4주간 연속 개입이 시행되었습니다. 퀘르세틴 중재군의 경우, 케르세틴 현탁액은 매일 정해진 시간에 하루 100 mg/kg/일의 용량으로 위내 투여되었습니다. 이 용량은 다음과 같은 통합 근거를 바탕으로 선택되었습니다: (i) 이전 용량 범위 연구에서 LPS 유도 신경염증 쥐 모델에서 불안 유사 행동 완화와 염증성 사이토카인 감소에 최적 용량으로 100 mg/kg이 확인되었습니다²⁸; (ii) 50 mg/kg의 퀘르세틴은 산전 VPA 유도 자폐증 쥐 모델에서 사회적 상호작용 결핍과 산화성 뇌 손상을 예방하는 것으로 입증되었다²⁹; 그리고 (iii) 경구 퀘르세틴은 최근 프로피온산 유발 자폐증 쥐 모델에서 뇌 TNF-α 수치를 낮추고 자폐 유사 행동을 완화하는 것으로 입증되었다³⁰. 이러한 독립적인 검증 결과는 현재 출생 후 VPA 유도 ASD 모델에서 TNF-α 매개 염증 경로의 견고한 참여를 보장하기 위해 100 mg/kg 선정을 지지합니다. 빈 그룹과 모델 그룹에 대해, 0.5% CMC-Na 생리식염수 용액의 동일한 부피를 매일 위내로 투여하였다. 모든 동물은 개입 기간 동안 자유롭게 음식과 물을 섭취할 수 있었고, 체중을 매주 측정하여 투여량을 체중에 맞게 조정했습니다.

오픈 필드 테스트

4주간의 개입(약 PND56) 후, 자발적 활동과 불안 수준을 평가하기 위해 개방 필드 검사가 수행되었습니다. 개방 필드 테스트(OFT)는 실험동물에서 불안 관련 행동을 평가하기 위한 고전적인 행동 실험입니다. 측정된 지표는 쥐가 개방된 환경에서 자발적으로 움직이는 능력과 개방된 들판 중앙에서 머무는 시간이었습니다. 쥐용 OFT 장치는 바닥 높이 30cm, 길이 50cm, 너비 50cm였으며, 내부 벽은 흰색이고, 인위적으로 16개의 작은 격자로 나뉘었으며, 내부에는 4개의 격자, 외부 지역에는 12개의 격자로 구성되어 있었습니다. 실험 현장은 결과 정확도에 영향을 줄 수 있는 음향 자극을 피하기 위해 조용히 유지되었다. 각 쥐는 상자 바닥 중앙에 놓였고, 비디오 녹화와 타이밍 측정이 동시에 이루어졌습니다. 카메라 시야는 전체 개방 지역을 덮었고, 쥐들의 자발적인 움직임과 격자 간 교차 횟수를 기록했습니다. 각 검사는 5분간 진행되었고, 이후 영상 녹화가 중단되었습니다. 열린 상자의 내벽과 바닥은 75% 알코올로 닦아, 한 동물이 남긴 배설물과 체취가 다음 동물의 검사 결과에 영향을 미치지 않도록 했다. 이 수술은 모든 쥐가 검사를 완료할 때까지 쥐를 교체한 후 반복되었습니다.

병리학적 검출 방법

4% 파라포름알데히드 고정 후, 뇌 조직은 완전 자동 탈수기를 이용해 구배 탈수를 시켰습니다: 75% 에탄올 2시간, 85% 에탄올 1시간, 95% 에탄올 1시간, 절대 에탄올 I-IV 각각 20분씩. 조직은 클리어링 에이전트 I로 25분, 클리어링 에이전트 II로 30분간 정화한 후 파라핀 임베딩을 했습니다. 두께 5 μm의 절편은 각각 30분간 탈왁싱 용액 I과 II로 탈왁싱한 후 그라데이언트 에탄올로 재수화했습니다. 절면들은 헤마톡실린으로 5–10분간 염색하고, 염산 알코올로 3초간 분별한 뒤, 알칼리성으로 반입하여 파란색으로 변색했다. 그 후 알코올 용성 에오신으로 3분간 교환 염색을 하고, 그라디언트 에탄올로 탈수한 뒤 투명화를 하고, 중성 마운팅 매체로 커버슬립한 후 현미경으로 관찰했습니다.

혈청과 뇌 조직 내 TNF-α 수치 검출

마지막 투여 후에는 쥐에서 복부 대동맥 혈액을 채취하여 3,000 r/min, 4 °C 온도에서 15분간 원심분리한 후 혈청 상원액을 채취하였습니다. 한편, 해마와 피질 조직을 해부하고, 기계적 균질화를 위해 1:9 비율로 미리 냉각된 PBS를 첨가했다. 균질액은 4°C에서 분당 12,000 r/분으로 20분간 원심분리하여 상원액을 수집했습니다. 조직 단백질 정량에는 BCA 방법이 사용되었습니다. ELISA 키트 지침에 따라 검사할 샘플과 바이오틴화 항체가 순차적으로 마이크로플레이트에 추가되었습니다. 배양 및 세척 후, 아비딘-과산화효소 복합체가 첨가되어 배양되었습니다. 또 한 번 세척한 후, 색소 현상을 위해 기판 용액을 추가하고, 반응을 멈추는 용액으로 종료했으며, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450nm 깊이에서 흡광도를 측정했습니다. 혈청(pg/mL)과 뇌 조직(pg/mg 프로트) 내 TNF-α 농도는 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.

통계 분석

Microsoft Excel의 RANDBETWEEN 함수를 사용해 쥐를 무작위화하고 쥐 할당을 위한 난수 생성을 했습니다. 본 연구의 모든 실험 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었습니다. 통계 분석 전에 각 그룹의 데이터에 대해 정규성 검정(샤피로-윌크 검정)과 분산 균질 검정(레벤 검정)이 먼저 수행되었습니다. 정규분포와 분산의 균일성을 준수하는 데이터의 경우, 일방향 분산분석(일방향 ANOVA)이 사용되었습니다. 차이가 통계적으로 유의미할 경우, 다중 비교에는 LSD 방법이 추가로 사용되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 정도는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

자폐증 치료에서 KSZZD에 대한 네트워크 약리학 연구 결과 분석

GeneCards 데이터베이스에서 총 15,770개의 자폐 관련 표적이 검색되었습니다. 관련성 점수 4.21≥ 자폐증 잠재적 표적으로 선정되어 1014개의 질병 표적이 나왔습니다. KSZZD의 827개 목표는 1,014개의 자폐 대상 대상과 교차했으며, 125개의 공통 목표가 확보되었습니다. 시각화는 SRplot 플랫폼³¹ (https://www.bioinformatics.com.cn/)을 사용하여 수행되었고, 그림 1A에 나타나는 벤 다이어그램이 그려졌습니다. 이 125개 목표는 KSZZD가 자폐 관련 효과를 발휘할 수 있는 잠재적 부위로 간주되었습니다.

KSZZD Pill의 활...

토론

중요한 질문은 왜 다른 핵심 성분 대신 케르세틴이 실험적 검증에 선택되었는지, 그리고 그것이 KSZZD의 전체적인 효과를 대표할 수 있는지입니다. 이 선정은 다음과 같은 수렴 증거 라인에 근거했습니다: (i) 산전 VPA 유도 쥐 모델에서 퀘르세틴은 사회적 상호작용 결핍과 산화성 뇌 손상을 유의미하게 예방했으며²⁹; (ii) 프로피온산 유도 자폐 모델에서 경구용 쿼세틴은 뇌의 TNF-α 수치를 낮추고 자폐 유사 행동을 개선했습니다³⁰; 그리고 (iii) LPS 유도 신경염증 모델에서 쿼세틴은 불안 유사 행동을 완화하고 염증성 사이토카인을 용량 의존적으로 감소시켰다²⁸. 이 결과들은 ASD 관련 모델에서 퀘르세틴이 신경보호 및 항염증제로서 존재함을 지지합니다. 둘째, 퀘르세틴은 혈액-뇌 장벽³²를 침투...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5% CMC-Na 정상 식염수 용액	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	블랭크/모델 그룹 및 케르세틴 현탁액에 사용되는 베클.
0.9% 정상 식염수	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	블랭크 대조군 산모 주사에 사용되는 베클.
PBS에 4% 파라포르말데하이드	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK	뇌 조직의 고정에 사용됨.
75% 알코올	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	동물 간 오픈 필드 장치를 청소하는 데 사용됨.
절대 에탄올	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	임베딩 전 조직 탈수에 사용됨.
알칼리성 물	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	헤마톡실린 염색된 섹션을 파란색으로 만드는 데 사용됨.
Amber14SB 단백질 힘 필드	원고에 지정되지 않음	해당 없음	분자 동역학 시뮬레이션에 사용되는 단백질 힘 필드.
BATMAN-TCM 데이터베이스	원고에 지정되지 않음	해당 없음	온라인 표적 스크리닝 데이터베이스: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23225	조직 균질화액의 단백질 정량화에 사용됨.
푸른 염색제	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7301	헤마톡실린 염색 후 핵을 푸른색으로 만드는 데 사용됨.
CDOCKER 모듈	원고에 지정되지 않음	해당 없음	분자 도킹에 사용되는 반 유연한 도킹 모듈.
클리어링 / 탈백제	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	Clear-Rite 3, 6901	조직학 워크플로우에서 클리어링 및 탈파라핀화에 사용할 수 있음.
CytoNCA 플러그인	원고에 지정되지 않음	해당 없음	Cytoscape 플러그인, 정도 중심성 분석에 사용됨.
Cytoscape 소프트웨어	원고에 지정되지 않음	버전 3.10.0	네트워크 시각화 및 단백질-단백질 상호작용 분석에 사용됨.
Discovery Studio 소프트웨어	원고에 지정되지 않음	버전 2019 및 2021	수용체 전처리, 도킹 및 알라닌 스캐닝에 사용됨.
드로우 벤 다이어그램 온라인 도구	원고에 지정되지 않음	해당 없음	벤 다이어그램 온라인 도구: http://bioinformatics.psb.ugent.be
에오신-Y(알콜)	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7111	H&E 염색에서 세포질 반염색에 사용됨.
완전 자동 탈수기	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	고정된 뇌 조직의 경사 탈수에 사용됨.
GeneCards 데이터베이스	원고에 지정되지 않음	해당 없음	자폐증 관련 표적을 검색하는 데 사용되는 온라인 데이터베이스: https://www.genecards.org/
GraphPad Prism 소프트웨어	원고에 지정되지 않음	버전 9.5	통계 분석 및 그래핑에 사용됨.
헤마톡실린 염색 용액	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7211	H&E 염색에서 핵 염색에 사용됨.
HERB 데이터베이스	원고에 지정되지 않음	해당 없음	보충 화합물 스크리닝에 사용되는 온라인 데이터베이스: http://herb.ac.cn
염산 알코올	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	H&E 염색 중 분화에 사용됨.
Metascape 플랫폼	원고에 지정되지 않음	해당 없음	GO 및 KEGG 농축 분석에 사용되는 온라인 플랫폼.
마이크로플레이트 리더	Thermo Scientific	Multiskan FC, 51119000	450 nm에서의 흡광도 측정에 사용됨.
현미경	원고에 지정되지 않음	지정되지 않음	H&E 염색된 뇌 섹션을 관찰하는 데 사용됨.
Microsoft Excel 소프트웨어	Microsoft	지정되지 않