SMART(슈이무 자동 재구성 기술): 냉동 전자현미경 작업 흐름을 간소화하는 통합 계산 플랫폼

요약

이 프로토콜은 통합 소프트웨어 플랫폼(SMART)을 사용하여 데이터 수집, 3차원 재구성, 원자 모델 구축을 단일 브라우저 기반 인터페이스로 연결하는 단계별 냉동전자현미경 워크플로우를 시연합니다. 대표적인 예로, 인간의 TRPML1 구조는 2.38 Å 해상도에서 결정됩니다.

초록

냉동 전자현미경(cryo-EM)은 구조생물학의 중심 도구가 되었지만, 현재의 워크플로우는 데이터 수집, 3차원(3D) 재구성, 원자 모델 구축을 위해 여러 전문 소프트웨어 패키지를 요구하여 파이프라인이 분산되고 수작업 개입이 잦아지는 현상을 초래합니다. 여기서는 SMART(Shuimu 자동 재구성 기술)라는 통합 소프트웨어 플랫폼을 소개합니다. 이 플랫폼은 자동화된 데이터 수집을 위한 DataSmart, 이미지 처리 및 3D 재구성을 위한 CryoSmart, 딥러닝 기반 원자 모델 구축을 위한 ModelSmart를 통합된 브라우저 인터페이스 내에 결합합니다. 이 프로토콜은 세 모듈 모두를 작동시키는 단계별 지침을 제공합니다. 워크플로우는 자동 시료 탐색 및 데이터 수집, 모션 보정, 대비 전달 함수(CTF) 추정, 입자 선택, 2차원(2D) 분류, 3D 정제, 지도 향상, 원자 모델 생성 등을 포함합니다. 대표적인 예로, 우리는 Ca²⁺ 투과성 리소좀 양이온 채널인 인간 TRPML1의 구조를 결정하기 위해 전체 워크플로우를 적용했으며, 0.143 기준에서 금표준 푸리에 셸 상관(FSC)으로 2.38 Å의 전 지구 해상도를 달성했습니다. 이 연구 내 동일한 TRPML1 데이터셋에 세 모듈(DataSmart, CryoSmart, ModelSmart)이 순차적으로 적용되었습니다. 이 프로토콜은 다양한 수준의 냉동 전자기(cryo-em) 경험이 있는 사용자에게도 접근 가능하도록 설계되었습니다.

서론

냉동 전자현미경: 기술 진화와 생물학적 영향. 3차원 단백질 구조의 규명은 분자생물학에서 중심적인 과제로 남아 있는데, 생물학적 기능이 아미노산 잔기의 공간적 배열과 밀접하게 연결되어 있기 때문입니다. 이러한 구조적 구성을 밝히는 것은 원자 해상도로 효소 메커니즘, 리간드 상호작용, 세포 신호 전달 경로를 해독하는 데 필수적입니다. 이러한 필요성은 냉동전자기(cryo-em) 분야의 혁신적인 발전을 이끌었으며, 구조생물학 기법 ^1,2로 널리 채택되었습니다.

극저온 전자기(Cryo-EM) 단일 입자 분석(SPA)은 고해상도 복^합체의 고해상도 구조를 해명하여 다양한 샘플 유형에서 생물학적 통찰을 얻는 강력한 접근법입니다. 여기에는 바이러스, 막 단백질, 나선 조립체 및 약 50 kDa에서 수십 메가달톤에 이르는 다양한 분자 크기를 아우르는 동적이고 이질적인 고분자 복합체가 포함됩니다.

Cryo-EM SPA는 생물학적 거대분자의 3차원(3D) 구조를 해결하는 핵심 기법으로 자리 잡았으며, 데이터 수집, 3D 재구성, 원자 모델 구축이라는 세 가지 상호 의존적인 계산 단계를 포함합니다(그림 1).

데이터 수집 과정에서 유리화 샘플을 저선량 조건에서 영상화하여 수천 개의 입자 투영을 거의 원유 상태에서 포착하는 미세사진 영상을 생성합니다. 이 원시 데이터셋은 이후 반복적인 정렬 및 분류 알고리즘을 통해 처리되어 체적 밀도 지도를 재구성합니다. 마지막으로, 밀도에 맞게 원자 모델을 구축하고 정제하여 분자 간 상호작용을 거의 원자 해상도로 밝힙니다.

위 분석은 냉동 전자기의 출력이 단지 구조 파이프라인의 출발점에 불과함을 보여줍니다. 이 원시 데이터를 해석 가능한 원자 모델로 변환하려면 전문화된 계산 소프트웨어 도구들이 연쇄적으로 필요합니다. 따라서 소프트웨어는 원시 데이터를 원자 모델로 전환하는 중요한 다리 역할을 합니다.

단편화된 냉동 전자기(cryo-em) 소프트웨어 생태계: 현재 도구와 한계. 현대 냉동 전자기(cryo-em) 워크플로우는 각 단계별로 전문 소프트웨어 도구들의 조각보에 의존합니다:

데이터 수집. Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰, Auto-EMation¹¹ 등 수많은 냉동 전자기 데이터 수집 소프트웨어 패키지가 공개되어 있지만, 이들 도구들은 주로 제한된 수집 후 처리 능력을 가진 원시 영화 데이터를 출력합니다. 매개변수 설정, 템플릿 맞춤화와 같은 중요한 워크플로우 단계들은 여전히 노동 집약적인 수작업 작업을 요구하며, 데이터셋당 너무 많은 매개변수를 요구하는 경우가 많습니다. 이러한 전문가 개입 의존은 특히 고처리량 시나리오에서 재현성 문제와 워크플로우 비효율성을 초래합니다.

3D 재구성. 크라이오-EM은 3D 재구성 소프트웨어에서 중요한 발전을 이루었으며, 생물학적 거대분자의 거의 원자 해상도를 가능하게 했습니다. 가장 널리 사용되는 도구로는 RELION, cryoSPARC, EMAN2가 있으며, 각각 고유한 장점과 한계를 제공합니다. RELION은 반복적 정제를 위해 베이지안 접근법을 사용하며, 이기종 데이터셋 처리와 고해상도 재구성을 달성하는 데 뛰어납니다¹². 하지만 계산 강도가 크고 학습 곡선이 가파르기 때문에 전문가의 개입이 자주 필요합니다. GPU 가속과 딥러닝을 활용한 cryoSPARC는 처리 시간을 크게 단축하고^{사용자 친화적입니다}. EMAN2는 입자 피킹과 3D 재구성을 위한 포괄적인 제품군을 제공하지만, 광범위한 수동 조정이 필요하고 실시간 피드백 기능이 부족합니다¹⁴. 이 도구들은 3D 재구성의 특정 측면에서 뛰어나지만, 상위 데이터 수집이나 하위 원자 모델링과의 통합이 부족해 단일 기능에 국한되어 있습니다. 예를 들어, RELION과 cryoSPARC는 현미경 제어 소프트웨어에서 수동 데이터 전송이 필요해 비효율과 잠재적 오류를 초래합니다. 더불어, 이들 도구는 데이터 수집 중 실시간 품질 평가를 제공하지 않으며, 원자 모델 구축으로의 원활한 전환 과정에서 워크플로우가 분산되어 처리량과 재현성을 저해합니다.

극저온 전자기(cryo-em) 기반 구조 결정의 마지막 계산 단계는 원자 모델 구축으로, 분자 좌표를 재구성된 밀도 지도에 반복적으로 맞추어 원자 수준의 상호작용을 밝힙니다.

기존의 모델 구축 접근법은 정전기 퍼텐셜, 반데르발스 상호작용, 공유 결합 기하학적 제약을 포함한 물리 기반 에너지 최소화 알고리즘을 사용하지만, 초기 모델 배치, 밀도 해석, 입체화학 검증을 위해 여전히 수동 개입에 크게 의존하고 있습니다 15,16,17,18. 전문가의 큐레이션에 대한 이러한 의존은 처리량을 제한할 뿐만 아니라, 특히 저해상도(< 4 Å) 환경에서 밀도 특징이 모호한 주관적 편향을 초래합니다.

이러한 제약을 극복하기 위해 딥러닝(DL) 기반 방법론이 혁신적인 해결책으로 등장했으며, 신경망을 활용해 특징 추출, 모델 초기화, 정제화를 자동화하고 있습니다. 이 방법들은 노이즈 또는 불완전한 밀도 맵 처리 성능이 향상되면서도 수동 개입을 크게 줄여준다는 것을 보여주며, 최근 벤치마크에서 기존 파이프라인^{19, 20, 21, 22}에 비해 사용자 의존적 단계가 40–60% 감소한 것으로 입증됩니다.

하지만 이러한 방법들은 항상 3D 재구성 소프트웨어에서 밀도 지도를 내보내 모델 구축 시스템에 가져와야 합니다. 가져오기 전에 밀도 맵을 최적화하기 위해 종종 서드파티 도구를 포함한 추가 전처리 단계가 필요할 수 있습니다. 이 단편화된 워크플로우는 반복적인 데이터 전송과 포맷 변환을 필요로 하여 비효율을 초래합니다. 더불어, 초기 모델 구축 결과가 만족스럽지 않을 경우, 연구자들은 재계산을 위해 재구성 단계로 돌아가야 하며, 그 후 또 다른 모델 구축과 검증을 진행해야 합니다. 이러한 반복 주기는 극저온 EM 구조 결정 파이프라인의 처리량과 운영 효율성을 크게 저해합니다.

1.3 SMART: 종단 간 냉동 전자기(CRM)를 위한 통합 솔루션

냉동 전자기(cryo-em) SPA의 상당한 발전에도 불구하고, 완전 통합 계산 솔루션의 부족은 고처리량 구조생물학 잠재력을 계속 저해하고 있습니다. 기존 소프트웨어 패키지는 데이터 수집이나 3D 재구성과 같은 고립된 워크플로우 구성 요소 자동화에는 뛰어나지만, 원시 미세그래프 수집, 밀도 지도 정제, 원자 모델 구축 간의 중요한 간극을 메우는 데는 실패하고 있습니다. 이러한 단편화는 수작업으로 데이터 전송, 형식 변환, 중복 매개변수 조정을 필요로 하며, 이는 데이터셋 규모와 함께 비효율을 초래합니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 전체 냉동 EM SPA 파이프라인을 통합하는 AI 기반 워크플로우로 통합한 통합 계산 플랫폼인 통합 냉동 EM 워크플로우 플랫폼을 소개합니다. 통합 플랫폼은 세 가지 핵심 모듈을 통합합니다: DataSmart(자동 데이터 수집), CryoSmart(하이브리드 신경망 기반 3D 재구성), ModelSmart(딥러닝 기반 원자 모델링).

플랫폼의 세 가지 계산 모듈은 표준화된 데이터 스트림을 통해 상호 연결되어 있어, 한 모듈에서 출력된 값이 이후 처리 단계에서 매개변수 조정에 영향을 주는 효율적인 데이터 흐름을 가능하게 합니다. 이 통합은 기존 냉동 전자기(CRM) 워크플로우에서 필요한 수작업 단계와 데이터 전송 수를 줄여 구조생물학 실험실의 접근성과 효율성을 향상시킬 수 있는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

인간 TRPML1 단백질 발현에 사용되는 Expi293F 세포주는 후난 펑후이 바이오테크놀로지 유한회사(카탈로그 번호: SC0236058)에서 구입하였습니다. 세포주의 정체성은 Short Tandem Repeat(STR) 프로파일링을 통해 적절히 인증되었습니다(보완 파일 1).

윤리적 선언
이 연구는 인간 참가자, 동물, 또는 인간이나 동물로부터 직접 얻은 샘플을 포함하지 않았습니다. 인간 TRPML1 단백질은 재조합 발현으로 생성되어 시험관 내에서 정제되었습니다. 재조합 단백질 발현에 사용되는 Expi293F 세포주는 상업적으로 이용 가능하고 확립된 불멸화 세포주입니다. 따라서 기관의 윤리적 승인과 서면 동의는 필요하지 않았습니다.

참고: 통합 냉동 전자기(cryo-em) 워크플로우 플랫폼은 세 가지 핵심 모듈로 구성되어 있습니다: 자동 데이터 수집 모듈, 하이브리드 신경망 기반 3D 재구성 모듈, 그리고 딥러닝 기반 원자 모델링 모듈로, 이 소프트웨어 구성 요소들 간의 통신 인터페이스 역할을 하는 데이터는 그림 2에 나타난 바와 같습니다. 통합 냉동 전자기기 워크플로우 플랫폼 시스템은 브라우저-서버(B/S) 아키텍처를 채택하여 사용자가 모든 작업을 웹 인터페이스를 통해 수행할 수 있게 하여 사용성과 운영 접근성을 보장합니다.

1. 자동 데이터 수집

참고: 통합 냉동 전자기(CR) 워크플로우 플랫폼은 자동 데이터 수집 모듈, 하이브리드 신경망 기반 3D 재구성 모듈, 그리고 딥러닝 기반 원자 모델링 모듈의 세 가지 핵심 모듈로 구성됩니다. 데이터는 이러한 소프트웨어 구성 요소들 간의 통신 인터페이스 역할을 합니다(그림 2). 이 시스템은 모든 작업을 웹 인터페이스를 통해 가능하게 하는 브라우저-서버(B/S) 아키텍처를 사용합니다.

1. 프로젝트 초기화
   1. 자동화된 데이터 수집 모듈 소프트웨어 플랫폼에서 새로운 프로젝트를 생성하세요.
   2. 원한다면 최근 프로젝트에서 설정 설정을 상속하는 옵션을 선택하세요. 새로운 구성을 만드는 대신 전자현미경 세팅에 상속받은 파라미터를 재사용하세요.
2. 빔 시프트 검사
   참고: 투과 전자현미경(TEM) 제어 소프트웨어 내에서 빔 시프트 조정을 수행하세요.
   1. 저배율 검사 (아틀라스 및 그리드스퀘어)
      1. 스크리닝 모듈을 열어. Atlas와 GridSquare 배율로 이미지를 획득하세요.
      2. 이미지가 제대로 조명되어 있고 빔 이동이 없는지 확인하세요. 이미지 센터가 그리드 바 위에 위치하지 않도록 하세요.
   2. 데이터 수집 확대 검사
      1. 데이터 수집 배율(예: 60K 또는 100K)으로 이미지를 획득합니다. 빔 정렬을 평가하세요.
      2. 이미지 획득에 실패하거나 상당한 빔 이동이 관찰되면 진행 전에 빔 시프트를 보정하세요.
   3. 구멍 유심 확대 검사
      1. 구멍/유심 배율(보통 8K)으로 이미지를 획득하세요. 빔이 중심에 있지 않다면 조명 스포트가 중앙에 맞출 때까지 빔 시프트를 조정하세요.
      2. 조리개 위치를 바꾸지 마세요. 조리개 크기가 데이터 수집 시 사용된 조리개 크기와 일치하는지 확인하세요.
3. Z-높이 조정
   1. 자동-유심 조정
      1. 스크리닝 페이지로 이동하세요. 스테이지를 구멍/유심 높이 확대 렌즈의 깨끗한 탄소 필름 구역으로 옮기세요. AutoFunction 페이지에서 Auto-Eucentric 모듈을 열어보세요.
      2. 시작을 클릭하세요. 로그 패널에서 피드백을 모니터링하세요. 다른 구역으로 이동해 수술이 실패하면 같은 절차를 반복하세요.
   2. 자동 초점 조정
      1. AutoFunction 페이지에서 AutoFocus 모듈을 열어보세요. 시작을 클릭하세요.
      2. 로그 메시지를 검토하세요. 자동초점이 실패하면 매개변수를 조정하거나 1.3.1절을 반복하세요.
4. 확대 정렬 검사
   1. 정렬 점검
      1. 데이터 배율에서 구별할 수 있는 특징을 찾아 이미지를 획득합니다. Hole/EucentricHeight 확대 비율로 이미지를 획득하세요.
      2. 두 이미지의 중심 영역을 비교해 보세요. 데이터 배율과 홀 배율 사이에 정렬이 불맞으면 교정을 진행하세요.
      3. 데이터와 홀 배율이 일치하면 홀과 그리드스퀘어 배율 간의 정렬을 점검하세요. 모든 배율 레벨이 맞으면 보정 없이 진행하세요.
   2. 배율 시프트 보정
      1. 보정 페이지로 이동하세요. 확대 변속 모듈을 열어. 데이터 배율 또는 가장 낮은 미스정렬 배율부터 시작하세요.
      2. 뚜렷한 특징을 포함한 고배율 이미지를 획득하세요. 저배율 이미지를 획득하세요. 두 이미지 사이의 변위를 평가하세요.
      3. 저배율 이미지에서 특징 중심에 해당하는 위치를 우클릭하세요. 여기서 이동을 선택하세요. 고배율 이미지를 다시 확보하고 정렬을 확인하세요.
      4. 필요하면 조정을 반복하세요. 정렬이 완료된 후 다음 배율 쌍으로 넘어가려면 다음을 클릭하세요. 남아 있는 모든 정렬이 맞지 않는 배율 쌍에 대해 보정 절차를 반복합니다.
5. 데이터 수집 준비
   1. 아틀라스 획득, 정사각형 선택, 정사각 영상 측정, 구멍 선택 수행
      1. 아틀라스 모듈을 열어. 타일 필드를 비워두면 81개의 모든 타일을 얻거나, 원하는 타일 수를 입력하면 모두 획득할 수 있습니다.
      2. Square Selection 인터페이스로 이동하세요. 적절한 칸을 선택하려면 우클릭하세요.
      3. 홀 선택 페이지로 이동하세요. 모두 준비 버튼을 클릭하세요. 이미지 획득이 완료될 때까지 로그 창을 모니터링하세요.
      4. 이미지 목록에서 캡처한 정사각형 이미지를 선택하세요. 구멍이 명확히 보이면 ' 구멍 찾기 ' 기능을 사용해 자동으로 구멍 선택을 하세요.
         주의: 두꺼운 얼음이나 표면 오염이 있는 격자에서는 자동 구멍 감지가 실패할 수 있습니다. 획득 전에 검출된 구멍을 육안으로 확인하고, 자동 탐지가 신뢰할 수 없을 때는 반자동 구멍 선택 방법을 사용하세요.
      5. 두꺼운 얼음이나 오염으로 인해 신뢰할 수 있는 자동 선택이 어려울 때는 씨앗 기반 선택 기능을 사용하세요(그림 3).
         1. 중앙 구멍을 선택하세요. 직각을 이루는 인접한 두 개의 구멍을 선택하세요.
         2. 두 번째와 세 번째 구멍이 정의한 방향을 따라 두 개의 먼 구멍을 선택하세요.
         3. 제출을 클릭하세요. 다른 칸을 처리할 때 Move All을 활성화하세요. 다섯 개의 씨앗 구멍 중 하나를 투명한 구멍으로 끌고 가세요. 제출을 클릭하세요.
   2. 템플릿 정의
      1. 템플릿 정의 페이지로 이동하세요. 이미지를 받으려면 'Acquire'를 클릭하세요. 이미지에 완전한 구멍이 있는지 확인하세요.
      2. 완전한 구멍이 보이지 않으면 대상 영역을 우클릭하고 MoveStageTo 를 선택하세요. 템플릿 이미지를 다시 확보하세요. 해당 마커를 드래그하여 이미지 위치와 자동 초점 위치를 지정합니다.
      3. 여기서 구멍당 프레임 수가 입력됩니다. 원하는 초점 차값(예: −1.5 μm)을 입력합니다. 모든 획득 매개변수를 검증하세요(그림 4).
6. 빔 시프트 재확인
   1. 모든 준비 절차를 완료한 후 섹션 1.2를 반복하세요.
7. 난시와 혼수 교정
   1. 난시 교정
      1. 무대를 깨끗한 탄소 필름 구역으로 옮기세요. 오토포커스를 사용해 원하는 디포커스 값(예: −1.5 μm)으로 높이를 조절합니다. AutoFunction 페이지에서 Autostigmate 모듈을 열어보세요.
      2. 시작을 클릭하세요. 로그 패널에서 Ctffind 출력을 모니터링하세요. 난시와 해상도 적합 값을 검토하세요. 난시가 여전히 높으면 다른 부위에서 같은 절차를 반복하세요.
   2. 혼수 교정
      1. 여러 번 시도했음에도 오토스티그메이트 결과가 최적이 아니면 오토코마 모듈을 열어라. 시작을 클릭하세요.
8. 자동 데이터 수집
   1. AutoCollect 페이지로 이동하세요. 시작을 클릭하세요. 시스템이 AutoEmission 및 AutoZLP 보정을 자동으로 수행할 수 있도록 허용합니다.
   2. 스크리닝, 데이터 수집, 준비 설정에서 정의된 매개변수를 사용하여 데이터를 획득하세요. 자동 수집 과정을 모니터링하세요(그림 5).
      일시정지: 데이터 수집이 완료된 후, 획득한 영화 스택을 저장하고 이후 이미지 처리 단계에서 프로토콜을 재개할 수 있으며, 후속 결과에 영향을 주지 않습니다.
9. 즉각적인 원격 모니터링
   1. 원격 모니터링 모듈을 사용해 수집 진행 상황을 모니터링하세요. MotionCor2²³을 사용해 생성된 실시간 모션 보정 결과를 검토하세요. 실시간 난시와 초점 불안정 측정값을 복습하세요.
   2. 모니터링 URL을 권한 있는 사용자와 공유하세요. 컴퓨터나 모바일 기기에서 수집 상태 및 데이터 품질 정보를 접속할 수 있습니다. 그림 6의 원격 모니터링 기능 예시를 검토해 보세요.

2. 3차원 재구성

참고: 3D 재구성 모듈을 사용하여 이전에 획득한 이미지 데이터셋에서 3차원 재구성을 수행하세요. 워크플로우에는 프로젝트 생성, 미세관 가져오기, 대비 전달 함수(CTF) 추정, 입자 선택, 입자 추출, 2D 분류, 초기 모델 생성, 3D 정제가 포함됩니다(그림 7).

1. 프로젝트 창설
   1. 3D 재구성 모듈 홈페이지로 이동하세요. 프로젝트 관리 페이지를 열려면 '프로젝트' 를 클릭하세요. 새 프로젝트를 클릭하세요.
   2. 프로젝트 이름을 입력하고 저장 위치를 지정하세요. 프로젝트 생성 버튼을 클릭 하세요. 새로 생성된 프로젝트 옆에서 열기를 클릭하세요. 새 실험을 생성하려면 새 실험 을 클릭하세요.
      참고: 프로젝트는 전체 데이터 처리 세션을 나타내는 반면, 실험은 프로젝트 내 개별 처리 워크플로우를 나타냅니다. 하나의 프로젝트 내에서 여러 실험을 만들 수 있습니다.
2. 파일 가져오기
   1. 새 직장을 클릭하세요. 가져오기를 선택하고 생성을 클릭하세요. 적절한 파일 형식을 선택하세요. 데이터 수집 중에 생성된 .mrc 파일을 가져오세요. 여기서 픽셀 크기, 가속 전압, CPU 수가 입력됩니다. 대기 작업을 클릭하세요.
      참고: 실행 중인 작업을 종료하려면 Kill을 클릭한 후 Clear 를 눌러 작업을 건설 상태로 되돌려 주세요. 완료되었거나 대기열에 있는 작업의 경우, 작업 상태를 초기화하려면 '지우기'를 클릭하세요.
3. CTF 추정
   1. 새 직장을 클릭하세요. CTF 추정을 선택하고 생성을 클릭하세요.
      참고: 3D 재구성 모듈은 여러 CTF 추정 알고리즘을 지원합니다. 이 프로토콜은 CTFFIND4를 사용합니다.
   2. 노출을 위해 Connect 버튼을 클릭하세요. 수입된 미세사진을 선택하세요. 진폭 대비를 0.1, 최소 적합 해상도를 30 Å로 설정하고, 최대 적합 해상도를 4 Å, 최소 디포커스 탐색 값은 5,000 Å, 최대 디포커스 탐색 값은 50,000 Å, 디포커스 탐색 단계 크기를 500 Å로 설정합니다.
   3. 대 기 작업을 클릭하세요.
4. 수동 입자 피킹
   1. 새 직장을 클릭하세요. 파티클 픽킹을 선택한 후 블롭 픽커를 선택하세요. 생성 버튼을 클릭하세요. 미세사진(노출)을 보려면 Connect 버튼을 클릭하세요.
   2. 수입된 미세사진을 선택하세요. 필요한 매개변수를 입력하세요. 대 기 작업을 클릭하세요. 대표적인 현미경사진 3–4장을 점검하세요. 왼쪽 마우스 버튼으로 입자를 선택하세요.
   3. 오른쪽 마우스 버튼으로 파티클 선택 해제. 선택한 입자에서 입자 직경 범위를 결정합니다. 피킹 완료 버튼을 클릭하세요! 입자를 추출하세요.
      참고: 최소 세 장의 마이크로그래프에서 입자를 측정하세요.
5. 블롭 픽커
   1. 새 직장을 클릭하세요. 파티클 픽킹을 선택한 후 블롭 픽커를 선택하세요. 생성 버튼을 클릭하세요. 미세사진(노출) 입력을 연결하세요.
   2. 수입된 미세사진을 선택하세요. 필요한 매개변수를 입력하세요. 대 기 작업을 클릭하세요.
6. 입자 픽 검사
   1. 새 직장을 클릭하세요. '입자 픽 검사'를 선택하세요. 생성 버튼을 클릭하세요. 미세사진(노출) 입력을 연결하세요. Particles 입력을 연결하세요.
   2. 해당 파일을 선택하세요. 필요한 매개변수를 입력하세요. 대 기 작업을 클릭하세요. 작업 완료 후 대표적인 이미지 3–4장을 점검하세요.
   3. 올바른 입자 선택을 확인하세요. 피킹 완료 버튼을 클릭하세요! 출력 장소.
7. 현미경사진에서 입자 추출
   1. 새 직장을 클릭하세요. 미세사진에서 추출물을 선택하세요. 생성 버튼을 클릭하세요. 미세사진(노출) 입력을 연결하세요. Particles 입력을 연결하세요. 해당 파일을 선택하세요.
   2. 추출 박스 크기를 입자 직경의 2–3배로 설정하세요. TRPML1에는 400픽셀의 추출 박스 크기를 사용하세요. 푸리에 크롭 크기를 추출 박스 크기의 1/4에서 1/2로 설정하세요.
   3. TRPML1에는 100픽셀의 푸리에 크롭 크기를 사용하세요. 대 기 작업을 클릭하세요.
      참고: 푸리에 크롭 크기를 줄이면 GPU 계산 수요가 감소합니다.
8. 2차원 분류
   1. 새 직장을 클릭하세요. 2D 분류를 선택하세요. 생성 버튼을 클릭하세요. Particles 입력을 연결하세요.
   2. 파티클 스택을 가져오세요. 필요한 매개변수를 입력하세요. 대 기 작업을 클릭하세요.
      참고: 50–200개 수업을 선택하세요. 작은 데이터셋에는 클래스를 적게 쓰고, 큰 데이터셋에는 더 많은 클래스를 사용하세요.
9. 선택된 2차원 클래스
   1. 새 직장을 클릭하세요. 선택 2D 클래스. 생성 버튼을 클릭하세요. Particles 입력을 연결하세요. 템플릿 입력을 연결하세요.
   2. 필요한 파일을 가져오세요. 대 기 작업을 클릭하세요. 작업이 대기 상태에 들어갈 때까지 기다리세요. ' 기다리기'를 클릭하세요.
   3. 명확하고 명확하게 정의된 2D 클래스를 선택하세요. 완료 버튼을 누르 세요.
10. 초기 모델 생성
    1. 새 직장을 클릭하세요. 아비트 재건을 선택하세요. Particles 입력을 연결하세요. 선택한 입자를 가져오세요.
    2. 여기서 초기 수업 수가 등장합니다. 대칭 매개변수가 등장합니다. 대 기 작업을 클릭하세요.
11. 이종 정제화
    참고: 이질시료에는 이질적 정제를, 동종 시료에는 동종적 정제를 사용하세요.
    1. 새 직장을 클릭하세요. 이질적 정제 작업을 만드세요. Particles 입력을 연결하세요. 볼륨 입력을 연결하세요.
    2. 해당 파일을 선택하세요. 정제 매개변수를 입력하세요. 적절한 대칭(예: C1)을 지정하세요. 대 기 작업을 클릭하세요.
12. 균질 정제(homogeneous refinement)
    1. 새 직장을 클릭하세요. 동종 정제(Homogeneous Refinement) 작업을 만드세요. Particles 입력을 연결하세요. 볼륨 입력을 연결하세요.
    2. 선택적으로 마스크 입력을 연결하세요. 파티클 스택과 이전 정제 단계에서 가장 성능이 좋은 볼륨 클래스를 가져오세요. 필요한 매개변수를 입력하세요.
    3. 적절한 대칭성을 지정하세요(예: O 또는 C1). 대 기 작업을 클릭하세요. 작업 완료 후 출력 을 클릭하세요. 브라우저 인터페이스에서 재구성된 밀도 맵을 점검하세요(그림 8).
13. 지도 향상
    참고: 맵 인핸서는 DeepEMhancer²⁴를 사용합니다. 가능하면 반 맵을 사용하세요. 번역 후 변형과 리간드 분자는 DeepEMhancer 훈련 세트에 포함되지 않았으며, 정확하게 증강되지 않을 수 있습니다. 맵 인핸서는 로컬 샤프닝, 자동 마스킹, 노이즈 제거를 수행합니다.
    1. 새 직장을 클릭하세요. 맵 인핸서 직업을 생성하세요. 균질 정제 과정에서 생성된 볼륨을 가져오세요.
    2. 해당 가면을 가져오세요. 필요하다면 지도 데이터 경로 옵션을 통해 지도 파일을 가져오세요. 일을 실행하세요.

3. 딥러닝 기반 원자 모델링

참고: 딥러닝 기반 원자 모델링 모듈은 이전에 개발된 SMARTFold 프레임워크²⁵ 를 기반으로 하며, 크라이오-EM 밀도 지도를 기반으로 단백질과 핵산(RNA/DNA)의 원자 모델 구축을 지원합니다.

1. 딥러닝 기반 원자 모델링 모듈 출시
   1. 딥러닝 기반 원자 모델링 모듈 시스템에 로그인하세요. 작업 제출 인터페이스를 열어보세요. 왼쪽 패널에 냉동 전자기 밀도 맵을 업로드하세요.
   2. 필요한 입력 매개변수를 입력하세요. 모델링 과제를 제출하세요.
2. 크라이오-EM 밀도 지도를 업로드하세요
   1. 밀도 지도를 .mrc, .ccp4, 또는 .map 형식으로 업로드하세요. 파일 크기가 100MB 미만인지 확인하세요.
      참고: 밀도 맵이 100MB를 초과하면 업로드 전에 파일 크기를 줄여야 합니다.
      1. UCSF ChimeraX²⁶ 을 사용해 관심 영역에 맞게 밀도 지도를 자르고, 명령어: volume zone을 사용하세요. 맵을 더 큰 픽셀 크기로 재샘플링하세요.
      2. 용매 부분을 제거하기 위해 부드러운 마스크를 적용하세요.
         참고: 업로드 전에 밀도 지도를 꼼꼼히 확인하여 최적의 모델 성능을 확인하고 처리 오류 위험을 줄이세요.
3. 밀도 지도를 점검하고 준비하세요
   1. 밀도 맵 크롭을 수행하세요. 이 크롭에서는 밀도 맵을 사용해 불필요한 영역을 제거합니다. 잘린 지도가 모델 구축에 필요한 지역만 포함하는지 확인하세요.
      참고: 크롭은 파일 크기를 줄이고 모델 생성 중 메모리 오버플로우를 방지하는 데 도움이 됩니다.
   2. 그다음 미러 인버전(Mirror Inversion)을 확인하세요.밀도 지도를 확인해 미러 반전 가능성을 확인하세요. 지도 내 α 나선형 영역을 살펴보세요. α 나선이 우측 배열을 보이며 반시계 방향으로 나선형으로 올라가는지 확인해 보세요. 거울 구조가 감지되면 밀도 지도를 뒤집습니다.
4. 시퀀스 파일 업로드
   1. 해당 시퀀스 파일을 업로드하세요. 또는 수동으로 순서를 입력할 수도 있습니다. 재구성에 포함된 모든 단백질 또는 핵산 서열을 제공하세요.
   2. 해당되는 경우 이종 서열 또는 동분해 서열 정보를 명시하세요. 원한다면 단백질 이름을 입력하세요(선택 단계).
5. 지도 해상도를 지정하세요. 여기서 보고된 극저온 전자기(cryo-em) 밀도 지도의 해상도가 등장합니다. 컴퓨팅 파티션을 선택하세요. 모델 생성에 사용할 GPU 컴퓨팅 노드를 선택하세요.
6. CPU 리소스를 지정하려면 할당할 CPU 수를 입력하세요. 8개를 초과하지 마세요. 업로드된 모든 파일과 매개변수를 검토하세요. 모델 생성을 시작하려면 제출을 클릭하세요.
7. 예측된 원자 모델을 점검하세요
   1. 작업 완료 후 인터랙티브 시각화 창을 열어보세요. 모델을 회전시켜 구조적 특징을 점검하세요. 지역 및 전 지구적 구조 세부사항을 확대하고 축소할 수 있습니다.
   2. 모델을 여러 방향에서 점검하세요. 모델의 품질, 공간적 구조, 원자 수준의 특징을 평가합니다. 생성된 모델을 하위 분석 및 검증에 활용하세요.
   3. 시각화 인터페이스의 예 시는 그림 9를 참고하세요.

결과

TRPML1은 뮤콜리핀-1(MCOLN1)으로도 알려져 있으며, 이온 항상성 유지, 소포 수송 조절, 포유류 세포 내 자가포식 지원에 필수적인 리소좀 양이온 채널입니다^27,28. 유전적 돌연변이로 인한 TRPML1 기능 장애는 비정상적인 신경발달, 망막 변행, 철분 결핍 빈혈을 특징으로 하는 중증 신경퇴행성 리소좀 저장 장애인 점액지질증 IV형과 직접적으로 연관되어 있습니다 ^29,30,31,32. 따라서 TRPML1 기능의 구조적 기초를 이해하는 것은 그 생리적·병리학적 역할을 명확히 하는 데 매우 중요합니다.

총 1,034개의 영화 스택이 명목 배율...

토론

크라이오전자현미경(cryo-EM)을 통한 생물학적 고분자의 구조 결정은 본질적으로 계산 도구의 긴밀한 통합과 전문가의 개입에 의존해야 하는 장기적이고 다단계적인 작업 흐름을 포함합니다. 통합 플랫폼은 데이터 수집, 3D 재구성, 원자 모델링을 하나의 수직 통합 프레임워크로 통합하여 이 문제를 해결하며, 보다 간소화된 냉동 EM 워크플로우를 향한 한 걸음입니다. 파이프라인 전반에 AI 기반 알고리즘(예: 밀도 유도 모델 구축을 위한 기하학적 딥러닝)을 내장함으로써, 각 처리 단계별 별도의 소프트웨어 패키지에 의존하는 워크플로우에 비해 수동 데이터 전송과 포맷 변환 횟수를 줄이는 것을 목표로 합니다. 현재 학술 실험실에서 제약 파이프라인에 이르기까지 극저온 전자기(cryo-EM) 처리 수요가 급격히 증가하는 상황에서 통합 소프트웨어 환경은 실질적인 이점을 제공할 수 있습니다.

플랫...

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMART 플랫폼의 3D 재구성 모듈; 하이브리드 신경망 지원
Cryo-electron microscope	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	데이터 수집에 사용; 에너지 필터 장착
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMART 플랫폼의 자동화된 데이터 수집 모듈
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Cryo-EM 볼륨 후처리를 위한 딥러닝; CryoSmart Map Enhancer에 통합
Direct electron detector	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	영화 녹화에 사용되는 카메라
Grid	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Cryo-EM 시편 그리드
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	SMART 플랫폼의 딥러닝 기반 원자 모델링 모듈; SMARTFold 프레임워크를 확장
SMART Platform	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	통합 cryo-EM 플랫폼; 브라우저-서버(B/S) 아키텍처; DataSmart, CryoSmart, 및 ModelSmart 모듈 포함
TEM control software	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	빔 시프트 조정을 위한 전자 현미경 제어 소프트웨어
Topaz	Open source	V 2.5	입자 피킹을 위한 딥러닝 기반 도구; CryoSmart에 플러그인으로 통합
TRPML1 protein sample	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	인간 TRPML1(mucolipin-1); 단백질 및 결정학 부서에서 사내 준비
Vitrification device	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	cryo-EM 시편 준비용
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	목적 일반 소프트웨어 표시, 분석 등
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	통합 cryo-EM 워크플로 플랫폼
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	ModelSmart의 기반 딥러닝 프레임워크
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	자동화된 cryo-EM 데이터 수집 소프트웨어
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	자동화된 TEM/cryo-EM 획득 소프트웨어
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	자동화된 cryo-EM 데이터 수집 소프트웨어
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	다중 그리드 자동화된 cryo-EM 획득
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	전자 현미경 획득 소프트웨어
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	자동화된 cryo-EM 획득 시스템
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	자동화된 cryo-EM 획득 소프트웨어
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	베이지안 cryo-EM 재구성 소프트웨어
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Cryo-EM 이미지 처리 및 재구성
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Cryo-EM 이미지 처리 스위트
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	CTF 추정 소프트웨어
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	GPU 가속 CTF 추정
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	동작 보정 소프트웨어
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	딥러닝 cryo-EM 맵 향상
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	딥러닝 입자 피킹
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	분자 시각화 소프트웨어
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	CryoSmart 워크플로에 사용되는 CTF 피팅
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	인간 TRPML1 참조 맵
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	β-galactosidase 벤치마크 데이터세트
Transmission Electron Microscope (TEM)	Not specified	N/A	cryo-EM 데이터 획득에 사용
FEI Tecnai Electron Microscope	FEI (now Thermo Fisher Scientific)	Not specified	인용된 워크플로에 언급됨
Energy Filter	Not specified	N/A	자동화된 수집 중 사용
GPU Computing Node	Not specified	N/A	ModelSmart 계산에 사용

```