LncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 검증 가능한 확인을 위한 자외선 기반 ChIRP 방법 - 배양된 세포부터 마우스 고환까지"

요약

직접 lncRNA-단백질 상호작용을 식별하는 자외선 기반 ChIRP 방법.

초록

장기 비암호화 RNA(lncRNA)는 다양한 생물학적 과정을 조절하는 중요한 물질로 부상했습니다. 그러나 대부분의 lncRNA의 기능에 기반한 분자 기전은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 특히 RNA 결합 단백질(RBP)과 같은 상호작용 단백질을 식별하는 것은 lncRNA 기능을 규명하는 핵심 전략입니다. 사용 가능한 접근법 중에서, RNA 결합 단백질(ChIRP)의 포괄적 식별과 질량분석법은 단순한 프로브 설계와 간단한 작업 흐름 덕분에 널리 사용되고 있습니다. 기존 ChIRP는 파라포름알데히드(PFA) 가교결합에 의존하며, 이는 직접 RNA-단백질 접촉과 브리징 인자에 의해 매개되는 간접 상호작용을 모두 포착합니다. 반면, UV 가교결합과 엄격한 세척 조건을 결합하면 RNA-단백질 상호작용을 우선적으로 보존합니다. lncRNA Tug1 을 모델로 삼아 배양된 세포에서 ChIRP 프레임워크 내에서 UV 가교와 PFA 가교를 비교하여, UV 기반 ChIRP가 직접 lncRNA-단백질 상호작용에 대해 농축함을 입증하였습니다. 이 UV 기반 워크플로우는 이후 쥐 고환으로 확장되어, 조직을 단세포 현탁액으로 해리한 후 자외선 가교를 통해 Tug1 결합 단백질을 원래의 조직 맥락에서 식별할 수 있게 되었습니다. 세포주 유래 상호작용체와의 비교 결과, 공유된 상호작용체와 조직 특이적 상호작용체 모두가 밝혀졌습니다. 두 가지 공유된 직접 상호작용은 강화 가교 면역침전(eCLIP)을 통해 독립적으로 검증되었습니다. 이러한 UV 기반 ChIRP 접근법은 cPDiRT(RNA 표적과 직접 상호작용하는 단백질을 포획)라고 합니다. 함께 cPDiRT는 배양된 세포와 천연 조직 모두에서 lncRNA 결합 단백질을 식별할 수 있게 합니다. 조직 해리와 자외선 가교의 결합은 다양한 장기 시스템 전반에 걸쳐 lncRNA-단백질 상호작용을 연구하는 데 널리 적용 가능한 전략을 제공합니다.

서론

최근 고처리량 전사체 연구를 통해 염색질 조직부터 세포 신호전달에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에 참여하는 수천 개의 장기 비암호화 RNA(lncRNA)가 밝혀졌습니다 ^1,2. 광범위한 발현과 기능적 중요성에도 불구하고, 대부분의 lncRNA의 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 주요 장애물 중 하나는 물리적 단백질 파트너, 특히 RNA 결합 단백질(RBP^)의 식별입니다^3,4,5.

현재 RNA 중심 방법은 주로 화학적 가교결합에 의존하며, 이는 직접 및 간접적인 RNA-단백질 상호작용을 모두 포착합니다. 따라서 이러한 접근법은 진정한 직접^{접촉자를 식별}하기보다는 전역 상호작용체 매핑에 더 적합합니다. RNA 결합 단백질의 종합적 식별 후 질량분석(ChIRP-MS)은 간단한 프로브 설계와 효율적인 워크플로우 덕분에 lncRNA-RBP 상호작용 매핑에 널리 사용되는 기법입니다 ^7,8. 기존 ChIRP-MS는 파라포름알데히드(PFA) 가교결합을 사용하여 직접 RNA-단백질 접촉과 브리징 인자에 의해 매개되는 간접 결합을 모두 포착합니다 ^9,10.

반면, 254nm 자외선 가교는 중요한 이점을 제공합니다. RNA와 단백질이 거의 0 거리(일반적으로 <1 Å)에 있을 때만 공유 결합을 합니다¹¹. 이 과정은 수소 결합을 안정적인 공유 결합으로 전환하고, 비공유 결합 간접 상호작용자를 제거하는 엄격한 고염 세척 조건을 가능하게 합니다. 따라서 UV 기반 접근법은 화학적 가교 결합 방법보다 직접 RNA-단백질 상호작용에 더 높은 특이성을 제공합니다^12,13. 그럼에도 불구하고, 조직 유래 LNCNA 상호작용체 연구에서는 가교 효율과 제한된 자외선 투과에 대한 우려로 인해 자외선 기반 접근법이 여전히 활용되지 않고 있습니다.

생리학적으로 중요한 맥락에서 lncRNA-단백질 상호작용을 연구하기 위해 lncRNA Tug1이 모델 시스템으로 선정되었습니다. Tug1은 심각한 노크아웃 표현형과 고환 내 높은 농축 덕분에 조직 호환 직접 상호작용 워크플로우를 검증하는 이상적인 벤치마크입니다. Tug1의 유전적 소작술은 완전한 남성 불임, 정자 생성 저하, 정자 형태 이상을 초래합니다¹⁴. 또한 Tug1은 고지방 식이 쥐에서 세르톨리 세포 기능과 혈액 고환 장벽 무결성을 지원합니다¹⁵. 이러한 잘 확립된 표현형에도 불구하고, 최근 실험적으로¹⁶번 실험적으로 분석된 다수의 RBP를 발현하는 고환에서 Tug1 기능을 매개하는 직접적인 단백질 파트너는 아직 알려지지 않았습니다. 이 지식 격차는 대부분의 lncRNA-단백질 상호작용 매핑 방법이 배양 세포 시스템을 위해 개발되었기 때문이다.

이 한계를 해결하기 위해 ChIRP 프레임워크는 PFA 가교 대신 UV 가교결합으로 변경하여 Tug1과 직접 상호작용하는 단백질을 포획했습니다. 후보 상호작용은 강화된 가교 면역침전과 이어서 심층 시퀀싱(eCLIP-seq)¹⁷을 통해 독립적으로 검증되었습니다. 이 워크플로우는 UV 가교 전에 신선한 쥐 고환 조직을 단일 세포로 해리하여 조직 응용으로 확장되었습니다. 이 최적화된 접근법은 cPDiRT(RNA 표적과 직접 상호작용하는 단백질 포획)로 명명되었습니다.

cPDiRT를 쥐 고환에서 Tug1 에 적용함으로써 자연 조직 맥락에서 직접 상호작용 매핑이 가능해졌습니다. 배양 세포에서의 병행 실험은 PFA 기반과 자외선 기반 상호작용 프로필을 나란히 비교했습니다. 독립적인 eCLIP 검증과 결합하여, 이 접근법은 정자 생성 중 Tug1 기능에 기여할 수 있는 분자 파트너들의 높은 신뢰도를 얻었습니다. 여기서 제시된 프로토콜은 배양된 세포와 천연 조직 모두에서 표적 lncRNA와 직접 상호작용하는 단백질을 포획할 수 있게 합니다. 고환 내 Tug1 의 직접 상호작용을 정의함으로써 이 방법은 생식력 필수 lncRNA의 기전 연구를 진전시키고, 생식 및 기타 복잡한 조직에서 lncRNA-단백질 상호작용을 일반화할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

모든 용액은 뉴클레아제, 프로테아제가 없는 초순수수와 시약을 사용해 제조되었습니다. 모든 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

모든 동물 실험은 난징 의과대학 동물윤리위원회(승인 번호: IACUC-1812003-4)의 승인을 받았으며, 실험 동물 관리 및 이용 가이드 (국가연구위원회 8판)에 따라 수행되었습니다. 수컷 C57BL/6마리 쥐(4주 된 경우)는 12시간 빛/12시간 어둠 주기 안에 두고 자유롭게 먹이와 물을 섭취하세요. 통계적 유의성을 달성하기 위해 필요한 동물 수를 최소화하여 동물 고통을 최소화하세요. 승인된 기관 프로토콜에 따라 CO₂ 흡입 후 자궁경부 탈구를 시행하여 쥐를 안락사시킨다.

1. 완충 장치 준비

1. 세포 용해 완충제를 준비합니다
   1. 50 mM 트리스-HCl(pH 7.0), 10 mM EDTA, 1% SDS를 포함한 세포 용해 버퍼를 준비합니다.
   2. 사용 직전에 1 mM PMSF, 프로테아제 억제제 혼합물, 특수 RNase 억제제를 추가하세요.
      주의: SDS는 피부와 눈을 자극하는 물질입니다. 먼지나 에어로졸 흡입을 피하세요. PMSF는 매우 독성이 강하며, 콜린에스터라제 억제제 역할을 하며, 수용에서 불안정합니다. 사용 전에 즉시 PMSF를 준비하세요. 이 시약들을 다룰 때는 장갑과 안전안경을 착용하세요. PMSF는 화학 훈기 후드에서 다루세요.
2. 하이브리다이제이션 버퍼 준비
   1. 750 mM NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.0), 1 mM EDTA, 15% 포름아마이드를 포함한 하이브리다이저 버퍼를 준비합니다.
   2. 사용 직전에 1 mM PMSF, 프로테아제 억제제 혼합물, 특수 RNase 억제제를 추가하세요.
      참고: 포름아마이드는 4°C에서 빛으로부터 보호하여 보관하세요.
      주의: 포르마마이드는 기형유발 물질이자 생식 위험이 있습니다. 장갑, 실험복, 안전 안경을 착용한 채 화학 연기 후드에서 포름아마이드를 다루세요. 흡입과 피부 접촉을 피하세요.
3. 세척 완충제 준비
   1. 50 mM 트리스-HCl(pH 7.0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 나트륨 디옥시콜레이트를 포함한 워시 버퍼를 준비합니다.
   2. 보관 중에는 워시 버퍼를 빛으로부터 보호하세요.
4. 단백질분해효소 K(PK) 완충제를 준비합니다
   1. 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.0), 1 mM EDTA, 0.5% SDS를 포함한 PK 버퍼를 준비합니다.
   2. 사용 직전에 단백질효소 K를 최종 농도인 5%로 첨가하세요.

2. 프로브 설계 및 준비

1. 안티센스 프로브 설계
   1. singlemoleculefish.com¹⁸에서 제공되는 온라인 프로브 디자이너를 사용하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계합니다.
2. 비오티닐화 프로브를 얻으세요
   1. 3'-비오틴TEG 변형이 포함된 안티센스 DNA 프로브를 주문하세요.
3. 탐사 풀 준비해
   1. 각 프로브를 개별적으로 100 μM으로 희석합니다.
   2. 모든 프로브의 부피를 균등하게 섞어 프로브 풀을 생성하세요. 최종 복합 올리고뉴클레오타이드 농도를 100 μM으로 유지합니다.
   3. 프로브 풀은 -20°C에 보관하세요.
      참고: 권장 프로브 설계 매개변수는 다음과 같습니다: (i) 표적 RNA 100 bp당 1개의 프로브, (ii) 표적 GC 함량 45%, (iii) 프로브 길이 20 nt, (iv) 프로브 간 간격 60–80 nt.
      참고: RNA가 프로브 설계자가 허용하는 크기 제한을 초과하면, 설계 전에 서열을 더 작은 구간으로 나누세요. 반복 영역과 광범위한 서열 상환성을 가진 영역은 제외한다.

3. 세포 채취, 조직 해리 및 자외선 가교 수행

1. 자외선 없는 통제 준비
   1. 대조군 샘플과 실험 샘플을 병행하여 준비하세요.
   2. 대조군 샘플에서 자외선 가교 단계를 생략하세요.
   3. 이후 모든 절차(초음파 검사, RNA-단백질 풀다운, RNA 추출, 단백질 추출)를 두 그룹에 대해 동일하게 수행하세요.
      참고: 무자외선 대조를 사용해 UV 의존성 RNA-단백질 상호작용과 비특이적 배경 결합을 구분합니다.
2. 세포를 채취하고 UV 가교를 수행합니다
   1. 워시 배양 세포
      1. 잔류 배양지를 제거하기 위해 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
   2. 교차 결합 세포
      1. 3mL PBS를 15cm 배양 접시에 고르게 분포합니다.
      2. 254nm 자외선 가교 결합체에 4000 mJ/^{cm 2}의 선량으로 세포를 방사선으로 照射합니다.
   3. 교차 연결 세포 수집
      1. 가교 후 PBS에서 세포를 수집하세요.
      2. 현탁액을 원심분리하고 상원액을 버립니다.
      3. 펠릿을 재고 샘플당 최소 500mg의 펠릿 질량을 확인하세요.
3. 고환 조직을 해리시키고 자외선 가교 결합을 수행합니다
   1. 고환 준비
      1. 고환을 분리하세요.
      2. 휴지를 DMEM으로 두 번 세척하세요.
   2. 콜라겐제 소화 수행
      1. 37°C에서 1 mg/mL 콜라겐제 IV가 포함된 DMEM 조직을 5–15분간 배양합니다.
      2. 소화를 계속하여 세미관이 방출됩니다.
         참고: 소화 시간은 15분을 넘지 마세요.
   3. 세미세루를 씻어내세요
      1. 1000 × g 에서 4°C에서 1분간 현탁액을 원심분리합니다.
      2. 상정액을 제거하세요.
      3. 펠릿을 5–10 mL DMEM으로 세척하세요.
      4. 같은 조건에서 다시 원심분리기를 사용했습니다.
   4. 트립신 소화 수행
      1. 펠릿을 1 mg/mL DNase I가 함유된 0.25% 트립신에 재현탁합니다.
      2. 37°C에서 5–15분간 배양합니다.
         참고: 소화 시간은 15분을 넘지 마세요.
   5. 효소 소화 중단
      1. 같은 양의 DMEM에 10% FBS를 보완해 추가하세요.
   6. 단일 셀 현탁 생성
      1. 현탁액을 70μm 셀 스트레이너로 걸러냅니다.
   7. 워시 셀
      1. 원심분리기 셀은 2000 × g 에서 4 °C에서 5분간 사용.
      2. 상원액은 버리세요.
      3. 펠릿을 5–10mL PBS로 세척합니다.
      4. 같은 조건에서 다시 원심분리기를 사용했습니다.
   8. 교차 고환 세포
      1. PBS에서 단일 셀 현탁을 재현지하세요.
      2. 현탁액을 15cm 배양 접시에 고르게 분포하세요.
      3. 254nm 자외선 가교 결합체에 4000 mJ/^{cm 2}의 선량으로 세포를 방사선으로 照射합니다.
   9. 교차 연결 세포 수집
      1. 자외선 없는 제어는 노출을 생략하세요.
      2. PBS에서 세포를 수집하세요.
      3. 현탁액을 원심분리하고 상원액을 버립니다.
      4. 펠릿을 재고 샘플당 최소 500mg의 펠릿 질량을 확인하세요.
         참고: 약 500mg의 세포 펠릿을 얻기 위해 필요한 쥐 수는 나이와 조직 수량에 따라 달라집니다. 이 연구에는 약 10–12마리의 4주 된 쥐가 사용되었습니다.

4. 초음파 검사 수행

1. 용해체 준비
   1. 세포 펠릿을 세포 용해 버퍼에 100 mg 1 mL 완충액 비율로 재현탁합니다.
   2. 균일한 현탁액을 얻기 위해 충분히 혼합하세요.
2. 소닉케이트 샘플
   1. 소닉케이트는 수욕 초음파 또는 집중 초음파기를 사용하여 용해합니다.
   2. 용해액이 시각적으로 투명해질 때까지 초음파 검사를 계속하세요.
      참고: 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 단편을 검증합니다. 대부분의 DNA 조각이 1 kb에서 2 kb 사이가 될 때까지 초음파 검사를 계속합니다.

5. RNA-단백질 풀다운 수행

1. 입력 샘플 수집
   1. 입력 제어를 위해 분해액을 제거하세요.
   2. RNA 분석용으로 약 10 μL, 단백질 분석용으로 약 10 μL을 예약하세요.
   3. 하이브리드화 및 세척 과정에서 입력 샘플을 37 °C로 유지하세요.
2. 프리클리어 용해체
   1. 각 샘플에 미리 세척된 자기 구슬 30μL을 첨가합니다.
   2. 샘플을 37°C에서 30분간 부드럽게 혼합한 하이브리다이제이션 오븐에서 배양합니다.
      참고: 사용 전에 자석 구슬을 세탁하세요. 구슬 알리코트를 자석 스탠드 위에 1분 또는 용액이 맑아질 때까지 올려놓으세요. 저장 용액을 완전히 제거하세요. 500 μL 세포 용해 버퍼로 두 번 세척합니다.
3. 프리클리어링 비즈를 제거하세요
   1. 샘플을 자석 스탠드에 올려놓으세요.
   2. 상정액을 새 튜브로 옮기세요.
   3. 잔여 비즈가 완전히 제거되도록 한 번 옮기세요.
4. 하이브다이즈 프로브
   1. 각 샘플에 하이브리드 버퍼 2부피를 추가하세요.
   2. 100 μM 프로브 스톡 1 μL 당 용해액 1 mL 비율로 프로브를 추가합니다(보충표 1).
5. 인큐베이트 하이브리드화 반응
   1. 샘플을 37°C에서 종끝으로 회전시키며 하이브리드화 오븐에서 12–16시간 배양합니다.
6. 포획 구슬 준비
   1. 하이브리다이제이션 종료 직전에 100 μL 자기 구슬을 세포 용해 버퍼로 세 번 세척합니다.
   2. 최종 세척 후에는 잔여 버퍼를 모두 제거하세요.
7. 포획 프로브 바운드 복합체
   1. 간단히 원심분리기 혼합 반응.
   2. 세척된 비즈를 1mL의 하이브리드 샘플에 재현탁합니다.
8. 복합체를 구슬에 결합한다
   1. 비드 서스펜션을 원래 튜브로 돌려놓으세요.
   2. 37°C에서 30–40분 혼합 상태로 배양합니다.
9. 구슬 회수
   1. 간단히 원심분리기 샘플을 사용했습니다.
   2. 튜브를 자석 스탠드 위에 1–2분 또는 용액이 맑아질 때까지 올려두세요.
   3. 상원액은 버리세요.
   4. 피펫 팁으로 잔여 액체를 제거합니다.
      참고: 액체를 제거할 때 자기 구슬 펠릿을 건드리지 않도록 주의하세요.
10. 워시 점령 복합체
    1. 세척 완충제 1mL를 추가하세요.
    2. 37°C에서 5분간 연속 혼합하며 비즈를 세척합니다.
    3. 세탁 과정을 다섯 번 반복하세요.
       참고: 워시 버퍼에는 1 M NaCl이 들어 있어 비공유 공유 단백질-단백질 및 단백질-RNA 상호작용을 방해하면서 공유 자외선에 의해 유도된 교차결합을 보존합니다. 이러한 엄격한 조건은 간접 상호작용자와 비특이적 배경을 제거하여 직접 단백질 파트너를 풍부하게 만듭니다¹⁹.
11. RNA 분석을 위한 예비 물질
    1. 세척된 구슬의 1%–10%를 RNA 분석을 위해 신선한 튜브로 옮깁니다.
    2. 남은 비즈는 즉시 단백질 추출을 위해 사용하거나 -80°C에서 보관하세요.
       참고: 필요하다면 여기서 프로토콜을 일시정지하세요. 구슬 샘플은 단백질 추출 전까지 -80 °C에서 보관하세요.
12. 유루트 단백질
    1. 비즈에 SDS 샘플 버퍼를 추가하세요.
    2. 샘플을 95°C에서 30분간 끓여 단백질을 용출하고 역가교관을 만듭니다.
    3. 질량분석법 분석으로 진행하세요.

6. RNA 추출

1. 단백질 소화
   1. 비드 결합된 RNA 샘플을 100 μL PK 버퍼에 재현탁합니다.
   2. PK 버퍼를 사용하여 RNA 입력 샘플을 최종 부피 100 μL로 조정합니다.
2. 단백질효소 K와 함께 배양하세요
   1. 샘플을 50°C에서 45분간 배양하며 연속 혼합합니다.
3. 불활성화 단백질효소 K
   1. 95°C에서 10분간 가열합니다.
4. TRIzol 시약 첨가
   1. 각 샘플에 500 μL TRIzol 시약을 첨가합니다.
   2. 완전히 소용돌이.
   3. 실온에서 5분간 배양하세요.
      주의: TRIzol 시약에는 페놀과 구아니딘 티오시아네이트가 포함되어 있습니다. 장갑, 실험복, 안전 안경을 착용한 채 화학 연기 후드에서 시약을 다루세요. 흡입과 피부 접촉을 피하세요. 피부 접촉이 발생하면 즉시 비누와 물로 씻으세요.
5. 위상 분리 수행
   1. 각 샘플에 100 μL의 클로로포름을 첨가합니다.
   2. 완전히 소용돌이.
   3. 실온에서 5분간 배양하세요.
6. 수상 복원
   1. 원심분리기는 4°C에서 15분간 샘플링합니다.
   2. 상부 수상을 신선한 튜브로 옮기세요.
7. RNA를 정제 컬럼에 결합합니다
   1. 수상에 100% 에탄올을 같은 부피로 추가하세요.
   2. 충분히 섞으세요.
   3. 샘플을 RNA 정제 컬럼에 적재하세요.
8. RNA 정제
   1. 제조사 지침에 따라 RNA 정화를 수행하세요.
   2. 30 μL 무핵효소 물에서 RNA를 용출합니다.
9. qRT-PCR로 RNA 농축 확인
   1. 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)을 위해 반응당 1 μL 용출 RNA를 사용합니다.
   2. 대조군에 비해 표적 RNA 풍부도를 평가합니다.

7. LC-MS/MS 분석 수행

1. SDS-PAGE에 의한 단백질 분리
   1. Step 5.12에서 얻은 단백질을 4× LDS 샘플 버퍼와 혼합합니다.
   2. 단백질을 4%–12% Bis-Tris 젤에 분리해 사용합니다.
   3. 은색 스테인 키트로 젤을 스테인하세요.
   4. 단백질 레인 전체를 하나의 밴드로 제거하세요.
2. 소비세 젤 조각
   1. 깨끗한 메스로 단백질 밴드를 절제하세요.
   2. 젤의 과도한 양을 최소화하세요.
   3. 젤을 약 1 mm 크기의³ 조각으로 잘라냅니다.
   4. 젤 조각을 0.5mL 튜브에 옮깁니다.
3. 디스테인 젤 조각
   1. 염색액 100 μL를 추가하세요.
   2. 10분간 소용돌이.
   3. 원심분리기 14,000 g × 1분간 돌립니다.
   4. 상정액을 제거하세요.
   5. 젤 조각이 투명해질 때까지 염색 과정을 반복합니다.
4. 단백질 환원
   1. 환원 용액 100 μL을 추가하세요.
   2. 56°C에서 30분간 배양하세요.
   3. 샘플을 실온까지 냉각하세요.
   4. 원심분리기를 잠시 하고 상청액을 제거하세요.
5. 알킬레이트 단백질
   1. 알킬화 용액 100 μL을 추가합니다.
   2. 실온에서 20분간 어두운 환경에서 부양하세요.
   3. 상정액을 제거하세요.
   4. 젤 조각을 100 μL 소화 완충제로 5분간 세척합니다.
6. 단백질 소화
   1. 젤 조각을 완전히 덮을 만큼 충분한 트립신 용액을 추가하세요.
   2. 37°C에서 16–18시간 배양합니다.
7. 펩타이드 추출
   1. 추출액 30μL을 추가하세요.
   2. 소닉테이트를 15분 또는 보텍스에서 30분을 사용하세요.
   3. 원심분리기 14,000 g × 1분간 돌립니다.
   4. 상정액을 새 튜브로 옮기세요.
   5. 추출 과정을 두 번 반복하세요.
   6. 모든 추출물을 모으세요.
   7. 진공 농축기에서 약 1시간 동안 농축된 추출물을 건조합니다.
8. StageTip으로 펩타이드를 정화하기
   1. 건조 펩타이드를 0.1% 개미산(FA) 20 μL에 재현탁합니다.
   2. 샘플을 C18 StageTip에 로드하세요.
   3. 원심분리기는 1,000 g× 2분간 돌립니다.
   4. 스테이지 팁을 0.1% FA 20 μL로 세척하세요.
   5. 60% 아세토니트릴/0.1% FA 20 μL의 펩타이드를 LC-MS 바이알에 유루트 펩타이드를 추출합니다.
   6. 리루액트를 말리세요.
   7. 펩타이드를 0.1% FA 10 μL 용액에 재현탁합니다.
      참고: 필요하다면 여기서 프로토콜을 일시정지하세요. 정제 펩타이드는 LC-MS/MS 분석 전에 -80 °C에 저장합니다.
9. LC-MS/MS 데이터 획득
   1. 0.1% 개상산 내에서 펩타이드를 재구성합니다.
   2. 75 μm × 250 mm C18 분석 컬럼에 분리된 펩타이드를 300 nL/min의 유량으로 배치합니다.
   3. 다음 용매 B 기울기(아세토니트릴에 0.1% 개미산)를 적용합니다:
      0–40분 동안 2%–25% B
      40–48분 동안 25%–40% B
      50–57분 동안 40%–99% B
      99% B를 3분간 유지하세요
   4. 질량분석기를 데이터 의존 획득 모드로 작동시키세요.
   5. 350–1200 m/z 범위에서 해상도 70,000의 전면(fulls, s) MS 스펙트럼을 획득할 수 있습니다.
   6. 17,500 해상도의 연속 고에너지 충돌 해리(HCD) MS/MS 스캔 15장을 획득합니다.
   7. 스캔당 마이크로스캔 한 번씩 기록하세요.
   8. 동적 배제를 30초로 설정하세요.
10. 공정 질량분석법 데이터
    1. 원시 데이터를 MaxQuant(v2.1.0.0)로 처리합니다.
    2. UniProt에서 다운로드한 마우스 단백질 서열과 비교해 스펙트럼을 검색하세요.
    3. 트립신을 소화 효소로 지정하세요.
    4. 최대 두 번의 절벽 놓치는 것을 허용하세요.
    5. 메티오닌 산화를 변수 변형으로 지정하세요.
    6. 시스테인 카바미도메틸화를 고정 변형으로 지정하세요.
    7. 전구체와 조각 질량 허용 범위를 각각 15 ppm과 20 ppm으로 설정하세요.
    8. 펩타이드와 단백질 수준 모두에서 1%의 거짓 발견률을 통제합니다.
    9. iBAQ 기반 라벨 없는 정량을 사용하여 단백질 풍부도를 추정합니다.

8. 유전자 온톨로지 풍부화 분석 수행

1. 기능 풍부 분석
   1. clusterProfiler R 패키지(v4.6.0)를 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 풍부화 분석을 수행합니다.
   2. GO 데이터베이스(v2024-09-20)를 참고 주석 소스로 사용하세요.
   3. 다중 검사에 벤자미니-호흐버그 보정을 적용하세요.
   4. 통계적 유의성을 조정 P 값(FDR) 0.05<로 정의합니다.

9. eCLIP-seq 검증 수행

1. eCLIP 샘플 준비
   1. 앞서 설명한 것처럼 강화 가교 면역침전(eCLIP)을 수행한다¹⁷.
   2. PABPC1과 CCT3의 면역침전을 위해 UV 가교결합 세포 샘플을 준비합니다.
   3. eCLIP 용해 버퍼를 사용한 용해체 샘플.
2. 면역침전물 RNA-단백질 복합체
   1. 각 샘플에 10 μg의 항체를 첨가합니다.
   2. RNA-단백질 복합체를 자기 구슬에 포착합니다.
   3. 면역 침전 전에 입력 샘플을 수집하세요.
3. RNA 라이브러리 준비
   1. 탈인산화 단백질 결합 RNA입니다.
   2. 3피트 길이의 RNA 어댑터를 회수된 RNA에 연결하세요.
   3. 면역침전과 투입 샘플을 엄격한 조건에서 세척합니다.
   4. 구슬을 끓여 복합물을 용출합니다.
   5. 샘플을 4%–12% Bis-Tris 그라데이션 젤로 분리합니다.
   6. 분리된 복합물을 니트로셀룰로오스 막으로 옮깁니다.
4. RNA 회수
   1. 크기가 맞는 막 영역을 절제합니다.
   2. 요소와 단백질분해효소 K를 사용해 단백질을 소화합니다.
   3. 막에서 RNA를 회수하세요.
5. 시퀀싱 라이브러리 생성
   1. 역전사는 RNA를 cDNA로 회수했습니다.
   2. 엑소뉴클레아제 I와 새우 알칼리성 인산효소 혼합물을 사용하여 cDNA를 정제합니다.
   3. T4 RNA 리가아제를 사용해 cDNA의 3' 말단에 DNA 어댑터를 연결합니다.
   4. 고충실도 DNA 중합효소를 사용하여 라이브러리를 증폭합니다.
   5. 3% 저용융점 아가로스 겔 위에 별도의 증폭 라이브러리를 배치했습니다.
   6. 겔 추출 키트를 사용해 크기가 선택된 라이브러리를 정제합니다.
   7. 일루미나 플랫폼에서의 시퀀스 라이브러리.
6. eCLIP-seq 데이터 분석
   1. ENCODE eCLIP 파이프라인²⁰을 사용하여 시퀀싱 데이터를 분석하세요.
   2. 컷 어댑터와 3피트 어댑터 다이머를 사용해 cutadapt(v1.14)을 사용합니다.
   3. 정렬은 STAR(v2.7.6a)를 사용하여 UCSC 반복 요소에 읽습니다.
   4. 반복 요소에 대한 리드 매핑을 제거하세요.
   5. 남은 리드를 mm10 참조 게놈(GENCODE vM23)에 정렬합니다.
   6. PCR 중복 검사를 제거하세요.
   7. CLIPPER를 사용하여 농축된 결합 부위를 식별합니다.
   8. 유의미 피크를 폴드 풍부≥ 8이고 조정 P ≤ 0.001인 피크를 정의합니다.
   9. 재현 불가능한 발견률(IDR) 임계값 0.01을 사용하여 재현 가능한 피크를 식별합니다.

결과

Tug1 결합 단백질을 식별하기 위해 자외선 가교결합이 ChIRP 워크플로우에 통합되어 cPDiRT라는 방법을 확립했습니다(그림 1). 기존 ChIRP는 처음으로 GC2 세포에서 Tug1-상호작용 단백질을 풍부하게 하기 위해 수행되었습니다(그림 2A, B). 질량분석법 분석 결과, 음성 대조군에 비해 190개 이상의 단백질이 농축된 것으로 확인되었습니다(그림 2C; 보충표 2). 반면, 최적화된 자외선 선량 4000 mJ/^{cm 2}에서 수행된 cPDiRT-MS는 보다 선택적인 단백질 집합을 확인했습니다(그림 2C; 보충표 2

토론

cPDiRT는 파라포름알데히드(PFA) 가교를 UV 가교결합으로 대체하여 LNCRNA-단백질 상호작용을 선택적으로 포착하는 수정된 ChIRP 기반 프로토콜로 개발되었습니다. 신선한 고환 조직을 단일 세포로 효소 해리시키는 것과 자외선 가교결합을 결합함으로써, 배양된 세포주에서 자연 조직으로의 직접 상호작용 매핑이 확장되었습니다. 배양 세포에서의 병렬 실험을 통해 PFA 기반 접근법과 자외선 기반 접근법을 나란히 비교할 수 있었고, 자외선 유도 상호작용은 eCLIP-seq로 독립적으로 검증되었습니다. 이 결과들은 UV 가교결합이 조직 유래 샘플의 ChIRP 워크플로우에 성공적으로 통합되면서 높은 특이도를 유지할 수 있음을 보여줍니다.

조직 침투, 분자 간 가교 인공물, 간접 연관성으로 인한 높은 배경 현상과 관련된 어려움 때문에 ChIRP와 같은 PFA 기반 RNA 중심 접근법을 조직 샘플에 적용한 연구는 거의 없습니다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	조직 분리 및 단일 세포 현탕액 준비용
100% 에탄올	Sigma-Aldrich	459844	RNA 정제용
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	eCLIP cDNA 합성용
Anti-CCT3 항체	Abcam	Ab225878	eCLIP용 항체
Anti-PABPC1 항체	Abcam	Ab312314	eCLIP용 항체
클로로폼	Sigma-Aldrich	C2432	RNA 추출용
콜라겐제 Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	고환 조직의 효소 분리용
탈인산화 시약 (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	eCLIP RNA 탈인산화용
DMEM 고당 배지	Gibco	11965092	세포 배양 및 조직 분리 버퍼용
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 자기 비드	Thermo Fisher Scientific	65001	바이오틴화된 프로브-RNA-단백질 복합체 포획용
DynaMag-15 자석	Thermo Fisher Scientific	12301D	자기 비드 분리용
DynaMag-2 자석	Thermo Fisher Scientific	12321D	자기 비드 분리용
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	용해 및 세척 버퍼의 이가 양이온 킬레이트용
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S	eCLIP cDNA 정제용
우태 탄소 혈청 (FBS)	Gibco	10099141C	트립신 소화 중지용
포름아마이드	Thermo Fisher Scientific	AM9342	하이브리드 버퍼 제조용
하이브리드 오븐	TUOHE	LF-I	프로브 하이브리드화 및 비드 세척용
저용융 온도 아가로즈	Sigma-Aldrich	A9414	eCLIP 라이브러리 크기 선택용
MinElute 겔 추출 키트	Qiagen	28604	eCLIP 라이브러리 크기 선택용
miRNeasy 미니 키트	Qiagen	217004	RNA 정제용
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	고염 세척 버퍼 준비용
니트로셀룰로오스 멤브레인	GE Healthcare / Amersham	10600002	eCLIP 웨스턴 블롯 전이용
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	세척 버퍼 세제용
핵산분해효소 및 단백질분해효소 무첨가 수	Thermo Fisher Scientific	10977035	핵산분해효소 없는 용액 준비용
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	eCLIP 크기 선택용
NuPAGE Bis-Tris 프리캐스트 겔	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	SDS-PAGE 단백질 분리용
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	세포 세척 및 재현용
페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	세포 용해 버퍼용 세린 단백질분해효소 억제제; 사용 전 신선하게 첨가
단백질분해효소 억제제 콕테일	Roche	4693132001	세포 용해 버퍼용 광범위 단백질분해효소 억제제; 사용 전 신선하게 첨가
프로테이나제 K	Sigma-Aldrich	P4850	RNA 추출에서 단백질 소화용
qRT-PCR 마스터 믹스	Thermo Fisher Scientific	11704044	RNA 농축 확인을 위한 정량적 RT-PCR용
RNase/단백질분해효소 없는 DNase I 용액	Thermo Fisher Scientific	EN0521	조직 분리용
RNeasy 미니 키트	Qiagen	74104	RNA 정제용
SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼	Beyotime	P0286	단백질 샘플 준비용
새우 알칼리성 포스파타제	New England Biolabs	M0371S	eCLIP cDNA 정제용
실버 스테인 키트	Beyotime	P00175	SDS-PAGE 겔에서 단백질 시각화용
소듐 데옥시콜레이트	Sigma-Aldrich	D6750	세척 버퍼 세제용
소듐 도데실 설페이트 (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	세포 용해 및 단백질 변성용
Superase-in RNase 억제제	Thermo Fisher Scientific	AM2694	특수 RNase 억제제; 사용 전 신선하게 첨가
T4 RNA 리가제	New England Biolabs	M0204	eCLIP 어댑터 접합용
Tris–HCl (pH 7