방법 논문

수술 후 인지 기능 장애 모델 구축을 위한 고령 C57BL/6J 마우스의 L5 요추 척추후궁절제술

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DOI:

10.3791/71733

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2026년 9월 22일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 운동 장애를 최소화하면서 수술 후 인지 기능 장애 모델을 구축하기 위해 노령 C57BL/6J 마우스를 대상으로 표준화된 L5 요추 층판 절제술을 수행하는 방법을 설명하며, 이를 통해 수술 전후 신경인지 장애에 대한 행동학적, 조직학적 및 기전적 연구를 지원합니다.

초록

수술 후 인지 기능 장애(POCD)는 수술 및 마취 후 발생하는 흔한 신경학적 합병증으로, 특히 고령자에게서 빈번하게 나타나며 회복 지연, 입원 기간 연장 및 삶의 질 저하와 관련이 있습니다. 정형외과 및 척추 수술은 POCD 발생 위험이 상대적으로 높은 것으로 알려져 있으나, 척추 수술의 주술기 특성을 밀접하게 반영하는 전임상 모델은 여전히 제한적입니다. 개복술이나 경골 골절을 포함하여 흔히 사용되는 모델들은 지속적인 운동 능력 손상과 장기적인 말초 염증을 유발하여 인지 행동 결과의 해석에 혼란을 줄 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 18개월령 수컷 C57BL/6J 마우스를 대상으로 세보플루란 마취 하에 L5 요추 척추궁 절제술을 시행하여 POCD를 모델링하는 표준화된 저비용 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 일반적인 수술 도구를 사용하여 수행되며, 지속적인 운동 결손을 최소화하면서 제어된 수술적 손상을 유도합니다. 인지 기능은 신규 객체 인식 테스트, 신규 암 Y-미로 및 반스 미로를 통해 평가하며, 해마의 신경세포 손상과 신경 염증 변화는 각각 Nissl 염색과 Iba1 면역형광 염색으로 측정합니다. 대표적인 결과에 따르면 수술 후 운동 능력은 유지되는 반면, 인지 성능 저하, 해마 신경세포 무결성 감소 및 해마 신경 염증 증가가 나타납니다. 이 표준화되고 접근 가능한 모델은 척추 수술 관련 인지 기능 장애의 기저 기전을 조사하고 주술기 신경 보호 후보 중재법을 평가하기 위한 임상적으로 유의미한 플랫폼을 제공합니다.

서론

수술 후 인지 기능 장애(POCD)는 마취 및 수술 후 학습 및 기억력, 주의력, 처리 속도 및 실행 기능의 저하로 정의되며1, 주로 고령 환자에게 영향을 미치며, 보고된 발생률은 수술 상황과 환자 집단에 따라 다양한 것으로 나타납니다2,3. POCD는 선택적 정형외과 수술을 받는 고령층에서 빈번하게 발생하는 것으로 보고되었습니다4. 임상적으로 POCD는 수술 후 수주에서 수개월 동안 지속될 수 있으며, 입원 기간 연장 및 사망률 증가와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다5,6,7. 전 세계적인 인구 고령화와 수술 건수의 증가로 인해 POCD는 중요한 공중 보건 및 수술 전후 관리 문제가 되었습니다.

병태생리학적으로 POCD는 수술 외상과 마취제 노출에 의해 유발되는 다요인성 증후군으로 간주되며, 해마와 같이 인지 관련 영역에서의 신경세포 기능 장애를 일으키는 기전으로 신경 염증, 산화 스트레스, 자가포식 조절 장애 및 시냅스 기능 장애 등이 제시되고 있습니다8. 이러한 기전들을 분석하고 후보 중재법을 평가하기 위해 다양한 전임상 POCD 패러다임이 개발되었습니다. 전임상 패러다임에는 마취 단독 모델, 복부 수술 기반 모델, 그리고 경골 골절과 같은 정형외과적 손상 모델 등이 포함됩니다9. 이러한 모델들이 해당 분야를 발전시켰으나, 척추 수술과 관련된 수술 전후의 특징을 완전히 재현하지 못할 수 있으며, 일부 모델은 지속적인 운동 능력 저하 및 장기적인 조직 염증과 같은 교란 변수를 도입하여 인지 결과 판독과 기전 해석을 어렵게 만들 수 있습니다.

가용한 수술 전략 중에서, 우리는 표준화되고 척추와 관련이 있는 수술적 맥락에서 조기 수술 후 인지 장애를 조사하기 위해 L5 요추 척추궁 절제술 모델을 선택했습니다. 이 절차는 흡입 마취 하에 제어된 국소적 수술 손상을 제공하여, 뚜렷한 운동 장애를 일으키지 않으면서 수술 후 신경 염증 반응과 인지 기능 장애를 조사할 수 있게 합니다. 주요 수술 단계의 개선을 통해, 본 프로토콜은 척추 수술 관련 인지 장애를 조사하고 주술기 신경 보호 전략을 평가하기 위한 표준화되고 실용적이며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 실험동물 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행되었으며, 절강대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호: ZJU20260153).

1. 수술 전 준비

  1. 실험 동물, 군 할당, 진통 처치 및 블라인딩
    1. 체중 30–34 g의 18개월령 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용한다. 마우스는 12시간 명/암 주기 하에 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육한다.
    2. 수술 전 최소 7일 동안 마우스가 사육 환경에 적응하도록 한다. 적응 기간 후, 마우스를 L5 척추궁 절제술(laminectomy) 군 또는 대조군에 무작위로 할당한다.
    3. 실험 절차 시작 전 각 마우스에 암호화된 식별 번호를 부여한다. 치료 내용을 모르는 상태에서 행동 평가를 수행할 수 있도록 군 할당 코드를 유지한다.
    4. L5 척추궁 절제술 군의 마우스에 세보플루란(sevoflurane) 마취를 실시한 후 L5 요추 척추궁 절제술을 시행한다. 대조군 마우스는 세보플루란 마취, 수술 부위 준비 또는 수술적 처치를 하지 않는다.
    5. 두 군의 마우스 모두에 meloxicam을 2 mg/kg으로 피하 투여한다. L5 척추궁 절제술 군은 마취 유도 후에 첫 번째 용량을 투여하고, 대조군은 수술 종료 시점에 해당하는 시점에 투여한다.
    6. 두 군의 마우스 모두에 48시간 동안 24 h마다 meloxicam 2 mg/kg을 피하로 추가 투여한다. 실험 기간 전반에 걸쳐 두 군을 동일한 조건에서 사육, 취급 및 모니터링한다.
    7. 모든 행동 평가는 두 군에 대해 동일한 실험 일정에 따라 수행한다. 행동 평가를 수행하는 연구자가 군 할당 내용을 알 수 없도록 블라인딩 상태를 유지한다.
  2. 모든 수술 기구를 멸균하고 수술 작업 공간을 소독한다. 마취 중 체온 유지를 위해 가열 패드를 예열한다. 수술 전후 투여를 위한 meloxicam을 준비한다.
  3. 가스 마취기를 켜고 마우스를 유도 챔버에 넣는다. 산소 유량을 1 L/min으로 유지하면서 3–5% 세보플루란으로 3–5분 동안 전신 마취를 유도한다.
  4. 마취된 마우스를 수술 플랫폼으로 옮긴다. 산소 유량 0.5–0.8 L/min으로 마취 마스크를 통해 1.5–3% 세보플루란을 공급하여 마취를 유지한다. meloxicam을 2 mg/kg으로 피하 투여한다. 세보플루란 유도 시작부터 측정된 총 마취 시간은 약 4 h이다. 안정적인 수술 마취 평면을 유지하기 위해 필요에 따라 세보플루란 농도를 조절한다.
  5. 마우스를 요추가 위를 향하도록 엎드린 자세로 배치한다. 동물을 고정하고 L5 수술 부위에 방해 없이 접근할 수 있도록 전지(forelimbs)를 테이프로 부드럽게 고정한다.
  6. 발Withdrawal reflex(발 withdrawal reflex)가 없는 것을 확인하여 마취 깊이가 적절한지 확인한다. 각막 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포한다.
  7. 소동물용 트리머를 사용하여 요추 중앙 부위(약 L3–S1)의 털을 제거한다. 노출된 피부를 75% 에탄올, 이어서 포비돈-요오드(povidone-iodine)로 소독하며, 무균 상태를 보장하기 위해 이 과정을 2–3회 반복한다.

2. L5 요추 척추후궁절제술

참고: 본 프로토콜의 모든 수술 단계는 실체 현미경이나 확대 루페 없이 직접 시각화 하에 수행되었습니다.

  1. 마취된 마우스를 예열된 수술 플랫폼 위에 복와위로 배치합니다. 앞다리를 테이프로 고정하여 신체를 안정시키고 요추 부위를 완전히 노출시킵니다(그림 1).
  2. 표면 지표를 사용하여 L5 척추 수준을 확인합니다. 양측 장골능을 촉진하고 그 가장 높은 지점들을 연결하는 가상의 횡선을 긋습니다.
  3. 이 횡선을 L5-L6 추간 공간의 대략적인 지표로 사용합니다. L5 척추궁판을 타겟팅하기 위해 이 선보다 약간 두측(cranial)에 계획된 피부 절개 중심을 잡습니다.
  4. 수술 부위를 소독합니다. L4-L6 부위를 노출시키기 위해 미리 결정된 L5 수준 위로 약 1.5-2.0 cm 길이의 정중선 종절개 피부 절개를 실시합니다.
  5. 멸균 핀셋으로 피부 가장자리를 견인합니다. 등쪽 근막을 노출시키고 정중선 근막 랩헤(fascial raphe)를 확인합니다.
  6. 척추를 노출시킨 후 척추 수준을 재확인합니다. 요천추 접합부와 가장 미측(caudal) 요추를 확인합니다.
  7. C57BL/6 마우스는 일반적으로 6개의 요추를 가지고 있으므로, L6 바로 두측에 있는 척추를 L5로 식별합니다. 요천추 접합부에서 두측으로 척추 두 개를 세어 수준을 확인합니다.
  8. 정중선 근막 랩헤를 따라 작은 구멍을 냅니다. 직접 시야 하에서 척추 주변 근육을 양측으로 견인합니다.
  9. L5 극돌기 인접 근육을 분리하여 하부의 척추궁판을 노출시킵니다. 노출 범위를 두측으로는 L4 극돌기까지, 미측으로는 L6 극돌기까지 확장하여 세 개의 극돌기가 모두 명확하게 보일 때까지 진행합니다.
  10. 면봉이나 미세 핀셋을 사용하여 주로 둔성 뼈 인접 박리를 수행합니다. 예리한 박리는 근막 유착을 제거하고 출혈을 최소화하기 위해 필요한 경우에만 사용합니다.
  11. 면봉으로 측방 견인을 유지하여 L5 척추궁판과 L5-L6 층간 공간을 완전히 노출시킵니다. 다음 단계로 진행하기 전에 척추 수준을 다시 확인합니다.
  12. 핀셋으로 L5 극돌기를 조심스럽게 잡고, 극돌기와 인접 요추를 수술 플랫폼에 대해 약 30° 각도로 들어 올려 L5-L6 층간 공간을 넓힙니다.
  13. 직접 시야 하에서 안과용 가위의 닫힌 팁을 L5-L6 층간 공간에 삽입합니다. L5 척추궁판의 미측 가장자리 바로 아래의 얕은 평면을 따라 가위를 전진시킵니다.
  14. 가위를 약간 벌려 초기 골 개구부를 만듭니다. 척추궁판 가장자리를 따라 작은 뼈 조각들을 순차적으로 제거하여 척추궁판 절제창을 확장합니다. 뼈 제거는 L5 척추궁판의 등쪽으로 제한하며, 골 창이 양측 후관절(facet joints) 쪽으로 측방 확장되지 않도록 주의합니다.
  15. 경막 손상을 방지하기 위해 과도한 삽입 깊이와 과도한 절단력을 피하십시오.
  16. 골 창을 통해 경막이 명확하게 보일 때까지 단계적으로 척추궁판을 계속 제거합니다.
  17. 수술 부위를 주의 깊게 살펴봅니다. 활동성 출혈이 없는지 확인하고 경막이 온전한지 검증합니다.
  18. 따뜻한 멸균 식염수로 수술 부위를 세척합니다. 부드러운 압박을 통해 지혈을 실시합니다.
  19. 상처를 층별로 봉합합니다. 6-0 나일론 봉합사로 피부를 봉합하고 절개 부위를 소독합니다.
  20. 상처 봉합 후, 총 마취 시간이 약 4h에 도달할 때까지 세보플루란 마취를 유지합니다. 그 후 세보플루란 투여를 중단하고 수술 후 관리를 진행합니다.

3. 수술 후 관리

  1. laminectomy 그룹의 수술 종료 시점에 맞춰 대조군 쥐에게 meloxicam을 2 mg/kg으로 피하 투여합니다. laminectomy 그룹의 각 쥐를 온도 조절 가열 패드 위에 두고, 쥐가 의식을 회복하고 안정적인 자발적 호흡 및 운동 활동을 보일 때까지 체온을 유지합니다.
  2. 마취에서 완전히 회복된 후 laminectomy 그룹의 각 쥐를 홈 케이지로 돌려보냅니다. 그 후, 정상적인 보행이 관찰될 때까지 동물을 모니터링합니다. 두 그룹의 쥐 모두에게 meloxicam을 2 mg/kg으로 24시간마다 48시간 동안 추가로 피하 투여합니다.
  3. 수술 후 3일까지 매일 수술 절개 부위와 봉합 상태를 점검합니다. 필요한 경우 쥐를 다시 마취시킨 후 헐거워지거나 끊어진 봉합사를 교체합니다.
  4. 매일 절개 부위에 부종, 출혈, 분비물 또는 국소 염증 징후가 있는지 확인합니다.
  5. 수술 후 전 기간 동안 체중, 그루밍 행동, 자발적 활동, 사료 및 음수 섭취량을 모니터링합니다.
  6. 다음의 사전 정의된 인도적 종료 기준 중 어느 하나라도 충족되는 경우, 예정된 실험 종료 시점 전이라도 해당 쥐를 인도적으로 안락사시킵니다: 수술 전 체중의 20% 이상 감소, 24시간 동안의 완전한 식욕 부진 또는 3일 연속으로 사료 섭취량이 정상량의 50% 미만인 경우, 마취 회복 후 24시간 동안 기립 불능 또는 사료 및 물 섭취에 심한 거부감이 지속되는 경우, 또는 37 °C 미만의 체온을 동반한 심한 쇠약 상태의 임종 전 단계인 경우.

4. POCD의 행동 평가

  1. 오픈 필드 테스트 (운동 조절 능력; 수술 후 3일째)
    1. 45 cm 크기의 오픈 필드에서 오픈 필드 테스트를 수행하십시오. × 조도 20 lux 하에 벽 높이가 40 cm인 45 cm 아레나를 준비한다. 비디오 카메라를 아레나 중심 바로 위에 배치하여 전체 테스트 영역이 시야 내에 들어오도록 한다.
    2. 마우스를 아레나 중앙에 두고 배치 직후 즉시 비디오 추적을 시작한다. 마우스가 5분 동안 자유롭게 탐색하도록 한다. 5분 세션 전체를 분석하여 비디오 추적 시스템을 이용해 총 이동 거리와 평균 이동 속도를 계산한다.
  2. 보행 분석
    1. 자동 보행 분석 시스템을 사용하여 수술 후 3일째에 보행 분석을 수행하십시오.
    2. 각 마우스를 보행로의 한쪽 끝에 두고 보행로를 자유롭게 가로지르게 한다. 보행 분석 시스템에 통합된 초고속 카메라를 사용하여 이동 중의 발자국을 기록한다.
    3. 각 마우스의 보행 시험을 기록하고, 이후 분석을 위해 보행로를 따라 계속해서 앞으로 이동한 유효한 주행 3회를 수집하십시오.
    4. 보행 분석 소프트웨어를 사용하여 기록된 발자국 데이터를 분석하십시오. 자동으로 식별된 발자국을 검토하고, 보행 파라미터를 추출하기 전 필요에 따라 오른쪽 앞발, 왼쪽 앞발, 오른쪽 뒷발, 왼쪽 뒷발의 분류를 수동으로 수정하십시오.
    5. 보폭(stride length), 지지 시간(stand time), 스윙 속도(swing speed) 및 접지 면적(print area)을 정량화하고, 통계 분석을 위해 각 생쥐당 3회의 유효 실험 결과로부터 평균값을 산출한다.
  3. Barnes 미로 (공간 학습 및 기억; 수술 후 4~6일차)
    ​참고: 수술 후 4일째부터 3일 연속으로 하루에 한 번 Barnes maze 테스트를 수행하십시오. 일주기 변동성을 최소화하기 위해 매일 동일한 시간대에 테스트를 실시하십시오.
    1. 탈출 상자를 지정된 타겟 구멍 아래에 배치하십시오. 실험 전반에 걸쳐 동일한 타겟 위치를 유지하십시오.
    2. 각 시행을 시작하려면 마우스를 미로 중앙에 둡니다. 마우스가 탈출 상자를 찾는 시간을 최대 3분까지 허용합니다. 마우스가 탈출 상자에 들어가면 시행을 종료합니다.
    3. 마우스가 3분 이내에 탈출 상자를 찾지 못할 경우, 대상 구멍으로 조심스럽게 안내하십시오. 과제 학습을 강화하기 위해 마우스가 탈출 상자 내에 잠시 머물 수 있도록 하십시오.
    4. 비디오 추적 시스템을 사용하여 탈출 잠복기와 이동 거리를 기록한다. 마우스가 3분 이내에 탈출 상자에 진입하지 못한 시험의 경우, 탈출 잠복기를 180초로 지정한다. 통계 분석에는 3일 차 마지막 세션 동안 기록된 탈출 잠복기와 이동 거리만 포함한다.
  4. 신물체 인식 (인식 기억; 수술 후 3~4일차)
    ​참고: 오픈 필드 테스트(open-field test)에서 설명한 것과 동일한 아레나 및 비디오 추적 시스템을 사용하십시오. 새로운 물체 인식 훈련 전, 수술 후 3일째에 오픈 필드 세션을 진행하여 마우스가 테스트 아레나에 적응하도록 하십시오.
    1. 훈련 세션 동안 동일한 원통형 물체 두 개를 아레나의 대칭되는 위치에 배치하십시오. 생쥐가 5분 동안 자유롭게 탐색하도록 하십시오.
    2. 1시간의 유지 간격을 둔 후, 익숙한 원통형 물체 하나를 새로운 정육면체 모양의 물체로 교체하십시오. 잠재적인 측면 선호도를 최소화하기 위해 새로운 물체의 위치를 마우스 간에 균형 있게 배치(counterbalance)하십시오. 마우스가 5분 동안 탐색하도록 하십시오.
    3. 비디오 추적 시스템을 사용하여 익숙한 물체와 새로운 물체에 대한 탐색 시간을 기록하십시오. 총 물체 탐색 시간이 최소 3초 이상인 마우스만 분석에 포함하십시오.
    4. 선호 지수(preference index, PI)를 다음과 같이 계산합니다:
      figure-protocol-1
      T를 정의하십시오새로운 및 T익숙한 테스트 세션 동안 각각 새로운 물체와 익숙한 물체를 탐색하는 데 소비한 시간으로 정의하였다.
  5. 새로운 암 Y-미로 (공간 인식 기억; 수술 후 5일째)
    1. 세 개의 동일한 경로가 특정 각도로 분리된 Y자형 미로에서 테스트를 수행하십시오. 120°불투명한 문으로 한쪽 통로를 무작위로 차단하고, 이 통로를 새로운 통로 지정합니다.
    2. 두 개의 오픈 암(open arm) 중 하나를 무작위로 선택하여 시작 암으로 설정합니다. 나머지 오픈 암은 친숙 암(familiar arm)으로 지정합니다. 마우스를 시작 암의 끝에 두고, 접근 가능한 두 암을 5분 동안 자유롭게 탐색하도록 합니다.
    3. 1시간의 시행 간격을 둔 후, 불투명한 문을 제거하고 마우스를 동일한 시작 암의 끝으로 되돌려 놓는다.
    4. 마우스가 5분 동안 세 개의 암(arm) 전체를 자유롭게 탐색하도록 합니다.
    5. 중앙 구역(central zone)에서 미리 정의된 암 구역(arm zone)으로 추적된 신체 중심이 진입하는 것을 암 진입(arm entry)으로 정의한다. 비디오 추적 시스템을 사용하여 진입 횟수와 각 암에서 보낸 시간을 기록한다.
    6. 시간 기반의 새로운 팔 선호 지수를 다음과 같이 계산하십시오:
      figure-protocol-2
      T를 정의하십시오.새로운, T제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요., 및 T익숙한 각 새로운 구역, 시작 구역, 그리고 익숙한 구역에서 보낸 시간으로 정의한다.
    7. 항목 기반 선호 지수(entries-based preference index)를 다음과 같이 계산하십시오:
      figure-protocol-3
      E를 정의하십시오새로운 새로운 군으로 배정된 피험자 수를 n, E를합계 테스트 시험 동안 세 가지 암(arm) 모두로 진입한 총 횟수.

5. 조직 처리, Nissl 염색 및 면역형광 염색

  1. 조직 처리
    1. 지정된 실험 종료 시점에서 산소 유량을 2 L/min으로 설정하여 3% sevoflurane을 투여함으로써 마우스를 깊게 마취합니다.
    2. 발Withdrawal reflex(발제거 반사)가 없는 것을 통해 마취 깊이가 적절한지 확인합니다. 깊은 마취 상태를 유지하며 심정지 전, 20 mL의 phosphate-buffered saline (PBS)으로 관류하여 혈관 내 혈액을 제거합니다.
    3. 즉시 20 mL의 4% paraformaldehyde (PFA)로 마우스를 관류합니다.
    4. 전뇌를 조심스럽게 적출합니다. 뇌를 4% PFA에 담가 4 °C에서 24시간 동안 후고정합니다.
    5. 조직이 완전히 가라앉을 때까지 뇌를 30% sucrose로 옮깁니다.
    6. 뇌를 optimal cutting temperature (OCT) 화합물에 매립합니다.
    7. 매립된 조직을 급속 동결시키고 cryosectioning 전까지 −80 °C에서 보관합니다.
  2. Nissl 염색
    1. 16 µm 두께의 동결 절편을 실온으로 맞춥니다. 슬라이드를 20분간 자연 건조합니다.
    2. 슬라이드를 PBS로 2분간 헹굽니다.
      참고: 염색 전 조직 절편이 슬라이드에 단단히 부착되어 있는지 확인하십시오.
    3. 절편 전체를 toluidine blue 염색액으로 덮습니다. 5 °C에서 30분간 배양합니다.
      참고: 과염색을 방지하기 위해 16 µm 절편에 맞게 염색 시간을 경험적으로 최적화하십시오.
    4. 증류수로 슬라이드를 10–30초간 짧게 헹굽니다.
    5. 95%, 85%, 75% ethanol 순으로 절편을 각각 2분간 순차적으로 탈색합니다.
      참고: 염색 강도를 최적화하기 위해 필요한 경우 탈색 시간을 조정하십시오.
    6. 새 xylene으로 슬라이드를 5분씩 2회 투명화합니다.
      참고: 모든 xylene 단계는 화학 흄 후드 내에서 수행하십시오.
    7. neutral balsam으로 절편을 마운팅합니다. 각 절편 위에 커버슬립을 조심스럽게 덮습니다.
    8. 20× 대물렌즈가 장착된 광학 현미경을 사용하여 염색된 절편을 촬영합니다. 해마 관상 절편에서 특징적인 조밀한 피라미드 세포층을 기준으로 CA1 영역을 식별합니다. 마우스당 하나의 관상 절편을 분석하며, 각 해마 반구의 CA1 영역에서 겹치지 않는 두 개의 시야를 확보합니다.
    9. 이미지 분석 소프트웨어의 세포 계수 플러그인을 사용하여 형태학적으로 온전한 Nissl 양성 뉴런과 Nissl 소체를 수동으로 계수합니다. 온전한 세포체, 핵소체가 보이는 둥근 핵, 풍부한 세포질 Nissl 물질이 확인되면 온전한 뉴런으로 식별하고, 뉴런 세포질 내의 강한 염기성 과립형 또는 응집형 구조를 Nissl 소체로 식별합니다.
    10. 분석된 모든 시야에서 얻은 값의 평균을 내어 동물당 하나의 값을 생성합니다. 계수를 수행하는 관찰자는 그룹 할당 내용을 알 수 없도록 눈가림 상태를 유지해야 합니다.
  3. Iba1 면역형광 염색
    1. 염색 전 뇌 절편을 실온과 평형을 맞춥니다.
    2. 슬라이드를 sodium citrate 항원 회복 용액에 담그고 80 °C 항온수조에서 25분간 항원 회복을 수행합니다. 항원 회복 후, 슬라이드와 항원 회복 용액을 실온으로 자연 냉각시킵니다.
    3. phosphate-buffered saline (PBS)로 절편을 3분씩 3회 세척합니다.
    4. PBS에 희석된 0.2% Triton X-10로 실온에서 30분간 절편을 투과화한 후, PBS로 3분씩 3회 세척합니다.
    5. 가습 챔버 내 실온에서 PBS에 희석된 3% bovine serum albumin (BSA)으로 1시간 동안 절편을 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
    6. PBS로 절편을 3분씩 3회 세척합니다.
    7. ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1; 1:10)에 대한 1차 항체를 차단 용액(PBS 내 3% BSA)으로 희석하고, 가습 챔버 내 4 °C에서 하룻밤 동안 절편을 배양합니다.
    8. PBS로 절편을 3분씩 3회 세척합니다.
    9. 암실에서 48-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) (1:10)로 90분간 실온에서 절편을 배양합니다.
    10. 암실에서 PBS로 절편을 3분씩 3회 세척합니다.
    11. 암실에서 DAPI (1:80)로 5분간 핵을 대조 염색합니다.
    12. 암실에서 PBS로 절편을 3분씩 3회 세척합니다.
    13. antifade 마운팅 매질로 절편을 마운팅하고 커버슬립을 덮은 뒤, 이미징 전까지 빛으로부터 절편을 보호합니다.
    14. 20× 대물렌즈가 장착된 공초점 형광 현미경을 사용하여 해마 CA1 영역의 형광 이미지를 획득합니다. 정량적 비교에 포함된 모든 절편에 대해 동일한 이미지 획득 설정을 사용합니다. 마우스당 하나의 관상 절편을 분석하며, 각 해마 반구의 CA1 영역에서 겹치지 않는 두 개의 시야를 확보합니다.
    15. 모든 이미지에 동일한 임계값 설정을 적용하여 해마 CA1 영역의 Iba1 평균 형광 강도를 정량화합니다. 모든 시야의 값들을 평균하여 동물당 하나의 값을 얻습니다.

6. 통계 분석

  1. 모든 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하십시오. 데이터는 평균값으로 제시하십시오. ± 표준편차(SD).
  2. Shapiro–Wilk 검정을 사용하여 데이터의 정규성을 평가하십시오. F 검정을 사용하여 분산의 동일성을 평가하십시오.
  3. 분산 가정이 충족되는 경우에는 비쌍체 양측 Student's t-검정을 사용하여 대조군과 L5 척추후궁절제술군을 비교하십시오. 분산 가정이 충족되지 않는 경우에는 Welch's t-검정을 사용하십시오.
  4. n을 각 분석에 포함된 동물의 수로 정의하십시오. a를 고려하십시오. P 값 < 0.05 수준에서 통계적으로 유의함.

결과

모든 생쥐가 예정된 실험 종료 시점까지 생존하였으며, 사전에 정의된 인도적 종료 기준에 도달한 개체는 없었으며, 모든 개체가 최종 분석에 포함되었습니다. 운동 기능은 수술 후 3일째에 오픈 필드 및 보행 분석을 통해 평가되었습니다. 오픈 필드 테스트에서 총 이동 거리와 평균 속도 모두 그룹 간 차이가 없었으며, 이는 자발적 운동 능력이 유사함을 나타냅니다(그림 2A). 보행 분석에서도 보폭, 지면 접촉 시간, 유각기 속도 또는 발자국 면적에서 그룹 간 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다(그림 2B). 종합적으로 이러한 결과는 L5 척추궁 절제술 절차가 이후의 인지 행동 성능 차이를 설명할 만큼 뚜렷한 운동 장애를 유발하지 않았음을 시사합니다.

인지 기능은 신물질 인식(NOR) 테스트, 신규 암 Y-미로 및 Barnes 미로를 사용하여 평가되었습니다. NOR 테스트에서 L5 척추궁 절제술 그룹은 대조군보다 신물질 선호 지수(PI)가 유의하게 낮게 나타났습니다(그림 3A). 신규 암 Y-미로에서 L5 척추궁 절제술 그룹은 신규 암에서 보낸 시간과 진입 횟수 모두에서 유의하게 낮은 PI를 보였습니다(그림 3B). Barnes 미로의 경우, L5 척추궁 절제술 그룹은 테스트 3일 차에 탈출 잠복기가 더 길어지고 이동 거리가 더 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3C). 종합적으로, 이러한 행동학적 결과는 L5 척추궁 절제술 후 수술 후 인지 기능이 저하되었음을 나타냅니다.

해마 CA1 영역에서 L5 층절제술 군은 대조군에 비해 Nissl 양성 신경세포와 Nissl 소체가 유의하게 적게 나타나 신경세포의 구조적 손상을 나타냈다(Figure 4A, B). 또한, L5 층절제술 군에서 Iba1의 평균 형광 강도가 유의하게 증가하였으며, 이는 미세아교세포 활성화의 증가와 일치한다(Figure 4C, D).

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그림 1마우스의 수술 후 인지 기능 장애(POCD) 모델링을 위한 L5 요추 척추궁 절제술 절차. (A) L5 추궁판의 수술 표적 및 인접 척추 분절(L4–L6)에 걸친 노출 범위의 모식도. (B) L5 요추 척추후궁절제술 과정의 주요 단계를 보여주는 수술 중 영상. (a) 제모 후 척추 정중선을 확인한 요추 부위; 화살표는 계획된 피부 절개 방향을 나타냄. (b) 요추 상부의 정중선 피부 절개. (c) 근막 절개 및 척추 주변 근육의 단계적 분리를 통해 극돌기를 노출시키고, L5 극돌기와 척추후궁 주변 조직을 추가로 제거하여 L5 척추후궁을 완전히 노출시킨 모습. (d) L5 척추후궁 제거 후의 L5 척추후궁절제술 상태. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2L5 요추 척추궁 절제술 후 운동 능력 및 보행 평가. (A) 총 이동 거리와 평균 속도를 나타내는 오픈 필드 테스트(n = 10). (B) 보폭, 입각 시간, 유각 속도 및 접지 면적을 나타내는 보행 분석(n = 6). 데이터는 평균값을 나타냄 ± SD. 통계적 유의성은 ns(유의하지 않음)로 표시하였다. 약어: Control = 대조군; Laminectomy = L5 척추궁 절제술군. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3L5 요추 척추후궁절제술 후 인지 행동 평가. (A) 신물질 인식 검사 (n = 10). (B) 새로운 암 Y-미로 테스트(n = 10). (C) Barnes 미로 테스트 (n = 10). 데이터는 평균을 나타냄 ± SD. 통계적 유의성은 *로 표시함P < 0.05, **P < 0.01, 그리고 ***P < 0.01. 약어: Control = 대조군; Laminectomy = L5 척추궁 절제술군. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4L5 요추 척추궁 절제술 후 해마 CA1 영역의 조직학적 평가. (A) 해마 CA1 영역의 니슬 염색(Nissl staining) 대표 이미지. (B) Nissl 양성 뉴런(왼쪽) 및 Nissl 소체(오른쪽)의 정량화 (n = 5). (C) 해마 CA1 영역의 Iba1 면역형광 염색 대표 이미지. 스케일 바 = 100 µm. (D) Iba1 평균 형광 강도의 정량화 (n = 6). 데이터는 평균값을 나타냄 ± SD. 통계적 유의성은 **로 표시하였다.P < 0.01, 그리고 ***P < 0.01. 약어: Control = 대조군; Laminectomy = L5 척추궁 절제술군. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

토론

척추 수술을 받는 고령층에서 수술 후 인지 기능 장애가 보고된 바 있습니다10. 실험적 근거에 따르면 노화는 수술 관련 인지 저하 및 신경 염증 반응에 대한 민감도를 높이는 것으로 나타났습니다11,12. 본 프로토콜은 노화된 마우스에서 약 4시간의 세보플루란 마취와 L5 척추궁 절제술을 병행하여 초기 수술 후 인지 저하 모델을 구축합니다. 이 방법의 주요한 방법론적 가치는 척추 수술 후의 행동 및 해마 조직학적 변화를 조사하기 위한 실용적이고 접근 가능한 절차를 제공한다는 점에 있습니다.

전임상 POCD 모델에는 마취 단독 노출, 복부 수술 및 정형외과적 손상 패러다임이 포함됩니다13. 마취 단독 패러다임은 수술적 외상이 없는 상태에서 마취제의 효과를 평가할 수 있게 하지만14, 마취와 조직 손상의 복합적인 노출을 재현하지는 못합니다. 복부 수술 및 경골 골절 모델은 수술적 손상을 포함하며 수술 관련 인지 장애를 연구하는 데 사용되어 왔습니다15,16. 그러나 이러한 모델의 수술 부위와 조직 손상 패턴은 척추 수술의 경우와는 다릅니다. 수술적 외상의 종류와 강도가 수술 후 인지 결과와 중추성 염증 반응에 영향을 미칠 수 있으므로9, 전임상 모델을 선택할 때 수술적 맥락을 고려해야 합니다. 따라서 본 L5 층판절제술 프로토콜은 고령 쥐에서 수술 후 조기 인지 장애를 조사하기 위한 척추 수술 관련 실험 패러다임을 제공합니다.

이 프로토콜의 핵심 기술적 과제는 경막 손상을 피하면서 경막을 명확하게 노출시키기 위해 L5 층판에서 충분한 뼈를 제거하는 것입니다. 직접 시각화 하에 층판절제술을 수행하는 동안, 기구의 깊이, 절단력, 그리고 안과용 가위의 삽입 각도를 세심하게 제어해야 합니다. 뼈는 층판의 가장자리를 따라 작고 제어된 절단을 통해 단계적으로 제거해야 합니다. 포셉으로 L5 극돌기를 잡고 수술 부위의 요추 분절을 수술 플랫폼에 대해 약 30° 각도로 들어 올리면 L5-L6 층간 공간이 넓어집니다. 이 조작을 통해 가위 끝을 뼈 가장자리 아래로 얕게 삽입할 수 있으며, 경막 접촉 위험을 줄일 수 있습니다. 뼈 제거가 불충분하면 수술적 노출이 제한될 수 있으며, 반대로 너무 공격적인 절단이나 과도한 삽입 깊이는 경막 손상을 유발할 수 있습니다. 통제되지 않은 출혈은 수술 시야를 가려 수술 후 회복을 저해하고 행동 결과의 변동성을 증가시킬 수 있습니다. 가위 끝을 안전하게 삽입하기에 층간 공간이 부족한 경우, 삽입 깊이를 늘리기보다는 수술 부위 요추 분절의 위치와 거상 각도를 재조정해야 합니다. 출혈로 인해 수술 시야가 가려지면 적절한 시각화가 회복될 때까지 뼈 제거를 일시 중단한 후, 남은 뼈를 점진적으로 제거해야 합니다.

척추 주변 근육 분리와 L5 층판절제술은 일시적인 수술 후 통증의 원인이 될 수 있으며, 마우스의 실험적 층판절제술 후 기계적 과민증이 보고된 바 있습니다17. Meloxicam은 사전에 정의된 진통제 투여 계획에 따라 투여되었습니다. 마우스의 수술 후 통증 관련 안면 표정은 약 36–48 h 동안 지속되는 것으로 보고되었습니다18. 48 h의 진통제 투여 계획은 이러한 수술 초기 기간을 포함하도록 설정되었으며, 즉각적인 수술 후 통증의 잠재적 영향을 줄이기 위해 진통제 투여가 완료된 후인 수술 후 3일째에 인지 행동 테스트를 시작했습니다. 오픈 필드 테스트는 실험적 POCD 연구에서 자발적인 운동 활동을 평가하고, 운동 능력 감소가 인지 행동 성능에 혼란을 줄 수 있는지 판단하기 위해 사용되어 왔습니다19,20. 이에 따라, 인지 평가 전인 수술 후 3일째에 오픈 필드 테스트와 보행 분석을 수행했습니다. 오픈 필드 운동 활동이나 보행 파라미터에서 그룹 간 유의미한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 이후의 인지 행동적 차이가 주로 명백한 운동 장애로 인해 설명될 가능성이 낮음을 시사합니다. 다만, 자발적인 수술 후 통증과 상처로 인한 불편함을 직접적으로 평가하지 않았기 때문에, 행동 성능에 미치는 잔류 효과를 완전히 배제할 수는 없습니다. 향후 연구에서는 자발적인 수술 후 통증에 대한 직접적인 평가를 포함할 수 있을 것입니다.

전반적으로, 본 프로토콜은 L5 척추궁 절제술을 받은 노령 마우스에서 수술 후 조기 인지 기능 저하를 조사하기 위한 실용적인 실험적 접근법을 제공합니다. 이는 척추 수술 관련 인지 기능 저하의 행동학적 결과와 그 기저 메커니즘을 조사하는 것뿐만 아니라, 수술 후 인지 기능 저하를 예방하거나 감소시키기 위한 중재법을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 더 큰 코호트와 독립적인 실험실에서의 검증을 통해 본 모델의 안정성과 재현성을 더욱 확립할 수 있을 것입니다.

공개 사항

저자들은 이해상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

기술 지원을 제공해 주신 Zhejiang University School of Medicine의 핵심 시설 플랫폼 소속 Sanhua Fang 님과 Zhejiang University 동물 센터의 Yanhong Chen 님, Xuliang Zhang 님께 감사드립니다. 본 연구는 다음의 기금을 통해 지원받았습니다: National Natural Science Foundation of China (Nos. 82575196, 82074535, 및 U23A20508).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL/6J 수컷 마우스Suzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-05동물 모델
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA600행동 비디오 추적 및 분석
Erythromycin 안연고Beijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H1021270안구 건조 방지
미세 핀셋NANA피부 집기
가열 패드NANA온도 제어
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Iba1 면역형광 염색
흡입 마취 장비RWD Life Science Co., Ltd.R581S마취
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY202512704보행 분석
미세 안과용 가위NANA골 제거
Nissl 염색액Haoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Nissl 염색
가위Shang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY0030피부 절개
SevofluraneShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.2506231마취
일회용 수술포Jiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.2021214021수술 조작 플랫폼
소동물용 트리머Yiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-0310제모
봉합사 포함 수술용 봉합 바늘Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603피부 봉합
Veet 제모 크림RECKITT BENCKISER (India) LtdNA제모

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