방법 논문

수술 후 인지 기능 장애 모델 구축을 위한 고령 C57BL/6J 마우스의 L5 요추 척추후궁절제술

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DOI:

10.3791/71733

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2026년 9월 22일

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1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 운동 장애를 최소화하면서 수술 후 인지 기능 장애 모델을 구축하기 위해 노령 C57BL/6J 마우스를 대상으로 표준화된 L5 요추 층판 절제술을 수행하는 방법을 설명하며, 이를 통해 수술 전후 신경인지 장애에 대한 행동학적, 조직학적 및 기전적 연구를 지원합니다.

초록

수술 후 인지 기능 장애(POCD)는 수술 및 마취 후 발생하는 흔한 신경학적 합병증으로, 특히 고령자에게서 빈번하게 나타나며 회복 지연, 입원 기간 연장 및 삶의 질 저하와 관련이 있습니다. 정형외과 및 척추 수술은 POCD 발생 위험이 상대적으로 높은 것으로 알려져 있으나, 척추 수술의 주술기 특성을 밀접하게 반영하는 전임상 모델은 여전히 제한적입니다. 개복술이나 경골 골절을 포함하여 흔히 사용되는 모델들은 지속적인 운동 능력 손상과 장기적인 말초 염증을 유발하여 인지 행동 결과의 해석에 혼란을 줄 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 18개월령 수컷 C57BL/6J 마우스를 대상으로 세보플루란 마취 하에 L5 요추 척추궁 절제술을 시행하여 POCD를 모델링하는 표준화된 저비용 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 일반적인 수술 도구를 사용하여 수행되며, 지속적인 운동 결손을 최소화하면서 제어된 수술적 손상을 유도합니다. 인지 기능은 신규 객체 인식 테스트, 신규 암 Y-미로 및 반스 미로를 통해 평가하며, 해마의 신경세포 손상과 신경 염증 변화는 각각 Nissl 염색과 Iba1 면역형광 염색으로 측정합니다. 대표적인 결과에 따르면 수술 후 운동 능력은 유지되는 반면, 인지 성능 저하, 해마 신경세포 무결성 감소 및 해마 신경 염증 증가가 나타납니다. 이 표준화되고 접근 가능한 모델은 척추 수술 관련 인지 기능 장애의 기저 기전을 조사하고 주술기 신경 보호 후보 중재법을 평가하기 위한 임상적으로 유의미한 플랫폼을 제공합니다.

서론

수술 후 인지 기능 장애(POCD)는 마취 및 수술 후 학습 및 기억력, 주의력, 처리 속도 및 실행 기능의 저하로 정의되며1, 주로 고령 환자에게 영향을 미치며, 보고된 발생률은 수술 상황과 환자 집단에 따라 다양한 것으로 나타납니다2,3. POCD는 선택적 정형외과 수술을 받는 고령층에서 빈번하게 발생하는 것으로 보고되었습니다4. 임상적으로 POCD는 수술 후 수주에서 수개월 동안 지속될 수 있으며, 입원 기간 연장 및 사망률 증가와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다5,6,7. 전 세계적인 인구 고령화와 수술 건수의 증가로 인해 POCD는 중요한 공중 보건 및 수술 전후 관리 문제가 되었습니다.

병태생리학적으로 POCD는 수술 외상과 마취제 노출에 의해 유발되는 다요인성 증후군으로 간주되며, 해마와 같이 인지 관련 영역에서의 신경세포 기능 장애를 일으키는 기전으로 신경 염증, 산화 스트레스, 자가포식 조절 장애 및 시냅스 기능 장애 등이 제시되고 있습니다8. 이러한 기전들을 분석하고 후보 중재법을 평가하기 위해 다양한 전임상 POCD 패러다임이 개발되었습니다. 전임상 패러다임에는 마취 단독 모델, 복부 수술 기반 모델, 그리고 경골 골절과 같은 정형외과적 손상 모델 등이 포함됩니다9. 이러한 모델들이 해당 분야를 발전시켰으나, 척추 수술과 관련된 수술 전후의 특징을 완전히 재현하지 못할 수 있으며, 일부 모델은 지속적인 운동 능력 저하 및 장기적인 조직 염증과 같은 교란 변수를 도입하여 인지 결과 판독과 기전 해석을 어렵게 만들 수 있습니다.

가용한 수술 전략 중에서, 우리는 표준화되고 척추와 관련이 있는 수술적 맥락에서 조기 수술 후 인지 장애를 조사하기 위해 L5 요추 척추궁 절제술 모델을 선택했습니다. 이 절차는 흡입 마취 하에 제어된 국소적 수술 손상을 제공하여, 뚜렷한 운동 장애를 일으키지 않으면서 수술 후 신경 염증 반응과 인지 기능 장애를 조사할 수 있게 합니다. 주요 수술 단계의 개선을 통해, 본 프로토콜은 척추 수술 관련 인지 장애를 조사하고 주술기 신경 보호 전략을 평가하기 위한 표준화되고 실용적이며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 실험동물 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행되었으며, 절강대학교 동물실험윤리위원회(윤리 승인 번호: ZJU20260153)의 승인을 받았습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 실험 동물, 그룹 배정, 진통제 투여 및 눈가림법
    1. 체중 30–34 g의 18개월령 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용한다. 마우스는 12시간 명/암 주기 조건에서 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 사육한다.
    2. 수술 전 최소 7일 동안 마우스가 사육 환경에 적응하도록 한다. 적응 기간 후 마우스를 L5 척추궁 절제술 그룹 또는 대조군 그룹에 무작위로 배정한다.
    3. 실험 절차 시작 전 각 마우스에 암호화된 식별 번호를 부여한다. 행동 평가를 처치 내용에 대해 눈가림 상태로 수행할 수 있도록 그룹 배정 코드를 유지한다.
    4. L5 척추궁 절제술 그룹의 마우스에 세보플루란 마취를 시행한 후 L5 요추 척추궁 절제술을 수행한다. 대조군 그룹의 마우스에는 세보플루란 마취, 수술 부위 준비 또는 수술적 개입을 하지 않는다.
    5. 두 그룹의 마우스 모두에게 meloxicam을 2 mg/kg으로 피하 투여한다. L5 척추궁 절제술 그룹은 마취 유도 후 첫 번째 용량을 투여하고, 대조군 그룹은 수술 종료 시점에 해당하는 시점에 투여한다.
    6. 두 그룹의 마우스 모두에게 48시간 동안 24 h마다 meloxicam 2 mg/kg을 피하 투여한다. 실험 기간 내내 두 그룹을 동일한 조건에서 사육, 핸들링 및 모니터링한다.
    7. 모든 행동 평가는 두 그룹에 대해 동일한 실험 일정에 따라 수행한다. 행동 평가를 수행하는 연구자가 그룹 배정 내용을 알지 못하도록 눈가림 상태를 유지한다.
  2. 모든 수술 기구를 멸균하고 수술 작업 공간을 소독한다. 마취 중 체온 유지를 위해 가열 패드를 미리 데워둔다. 수술 전후 투여를 위한 meloxicam을 준비한다.
  3. 가스 마취기를 켜고 마우스를 유도 챔버에 넣는다. 산소 유량을 1 L/min으로 유지하면서 3–5% sevoflurane으로 3–5분 동안 전신 마취를 유도한다.
  4. 마취된 마우스를 수술 플랫폼으로 옮긴다. 산소 유량 0.5–0.8 L/min에서 마취 마스크를 통해 1.5–3% sevoflurane을 공급하여 마취를 유지한다. meloxicam을 2 mg/kg으로 피하 투여한다. sevoflurane 유도 시작부터 측정된 총 마취 시간은 약 4 h이다. 안정적인 수술 마취 평면을 유지하기 위해 필요에 따라 sevoflurane 농도를 조절한다.
  5. 마우스의 요추가 위를 향하도록 복와위로 배치한다. 동물을 고정하고 L5 수술 부위에 방해 없이 접근할 수 있도록 앞다리를 테이프로 가볍게 고정한다.
  6. 발Withdrawal 반사가 없는 것을 확인하여 마취 깊이가 적절한지 확인한다. 각막 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포한다.
  7. 소동물용 트리머를 사용하여 요추 정중선 부위(약 L3–S1)의 털을 제거한다. 노출된 피부를 75% ethanol, 이어서 povidone-iodine으로 소독하며, 무균 상태를 확보하기 위해 이 과정을 2–3회 반복한다.

2. L5 요추 척추후궁절제술

참고: 본 프로토콜에서 모든 수술 단계는 실체현미경이나 확대 루페 없이 직접 시야 하에 수행되었습니다.

  1. 마취된 마우스를 미리 데워둔 수술 플랫폼 위에 복와위로 배치합니다. 몸을 고정하고 요추 부위를 완전히 노출시키기 위해 앞다리를 테이프로 고정합니다(그림 1).
  2. 표면 지표를 사용하여 L5 척추 수준을 확인합니다. 양측의 장골능을 촉진하고 그 최고점을 연결하는 가상의 횡선을 긋습니다.
  3. 이 횡선을 L5–L6 추간 공간의 대략적인 지표로 사용합니다. L5 척추궁판을 타겟으로 하기 위해, 이 선보다 약간 머리 쪽(cranial)에 계획된 피부 절개 부위의 중심을 잡습니다.
  4. 수술 부위를 소독합니다. L4–L6 영역을 노출시키기 위해 미리 결정된 L5 수준 위로 약 1.5–2.0 cm 길이의 정중선 종절개 피부 절개를 실시합니다.
  5. 멸균 핀셋으로 피부 가장자리를 견인합니다. 등쪽 근막을 노출시키고 정중선 근막 융선을 확인합니다.
  6. 척추를 노출시킨 후 척추 수준을 다시 확인합니다. 요천추 접합부와 가장 꼬리 쪽(caudal)의 요추를 확인합니다.
  7. C57BL/6 마우스는 일반적으로 6개의 요추를 가지고 있으므로, L6 바로 머리 쪽에 위치한 척추를 L5로 식별합니다. 요천추 접합부에서 머리 쪽으로 척추 두 개를 세어 수준을 확인합니다.
  8. 정중선 근막 융선을 따라 작은 구멍을 냅니다. 직접 시야 하에 척추 주변 근육을 양측으로 견인합니다.
  9. L5 극돌기 인접 근육을 분리하여 아래의 척추궁판을 노출시킵니다. L4 극돌기부터 L6 극돌기까지 세 개의 극돌기가 모두 명확하게 보일 때까지 노출 범위를 머리 쪽과 꼬리 쪽으로 확장합니다.
  10. 면봉이나 미세 핀셋을 사용하여 주로 뼈 인접 부위에서 둔성 박리를 수행합니다. 근막 유착을 제거하고 출혈을 최소화하기 위해 필요한 경우에만 예리한 박리를 사용합니다.
  11. 면봉으로 측면 견인을 유지하여 L5 척추궁판과 L5–L6 추궁간 공간을 완전히 노출시킵니다. 다음 단계로 진행하기 전에 척추 수준을 다시 확인합니다.
  12. 핀셋으로 L5 극돌기를 부드럽게 잡고, L5–L6 추궁간 공간을 넓히기 위해 극돌기와 인접 요추를 수술 플랫폼에 대해 약 30° 각도로 들어 올립니다.
  13. 직접 시야 하에 안과용 가위의 닫힌 끝부분을 L5–L6 추궁간 공간에 삽입합니다. L5 척추궁판의 꼬리 쪽 가장자리 바로 아래의 얕은 평면을 따라 가위를 전진시킵니다.
  14. 가위를 약간 벌려 초기 골 개구부를 만듭니다. 척추궁판 가장자리를 따라 작은 뼈 조각들을 순차적으로 제거하여 척추궁판 절제창을 확장합니다. 뼈 제거는 L5 척추궁판의 등쪽으로 제한하며, 골 창이 양측 후관절까지 측면으로 확장되지 않도록 주의합니다.
  15. 경막 손상을 방지하기 위해 가위의 과도한 삽입 깊이와 과도한 절단력을 피합니다.
  16. 골 창을 통해 경막이 명확하게 보일 때까지 단계적으로 척추궁판을 계속 제거합니다.
  17. 수술 부위를 주의 깊게 살핍니다. 활동성 출혈이 없는지 확인하고 경막이 손상되지 않고 온전한지 확인합니다.
  18. 따뜻한 멸균 식염수로 수술 부위를 세척합니다. 부드럽게 압박하여 지혈합니다.
  19. 상처를 층별로 봉합합니다. 6-0 나일론 봉합사로 피부를 봉합하고 절개 부위를 소독합니다.
  20. 상처 봉합 후, 총 마취 시간이 약 4 h에 도달할 때까지 세보플루란 마취를 유지합니다. 그 후 세보플루란 투여를 중단하고 술 후 관리를 진행합니다.

3. 수술 후 관리

  1. laminectomy 군의 수술 종료 시점에 맞춰, 대조군 마우스에게 meloxicam 2 mg/kg을 피하 투여한다. laminectomy 군의 각 마우스를 온도 조절 가열 패드 위에 두고, 마우스가 의식을 회복하고 안정적인 자발적 호흡 및 운동 활동을 보일 때까지 체온을 유지한다.
  2. 마취에서 완전히 회복된 후 laminectomy 군의 각 마우스를 원래의 케이지로 돌려보낸다. 이후 정상적인 보행이 관찰될 때까지 동물을 모니터링한다. 두 군의 마우스 모두에게 48시간 동안 24시간마다 meloxicam 2 mg/kg을 피하 투여한다.
  3. 수술 후 3일까지 매일 수술 절개 부위와 봉합 상태를 점검한다. 필요한 경우 마우스를 다시 마취시키고 헐거워지거나 끊어진 봉합사를 교체한다.
  4. 매일 절개 부위에 부종, 출혈, 분비물 또는 국소 염증 징후가 있는지 확인한다.
  5. 수술 후 기간 동안 체중, 그루밍 행동, 자발적 활동, 음식 및 물 섭취량을 모니터링한다.
  6. 다음과 같이 미리 정의된 인도적 종료 기준 중 어느 하나라도 충족되는 경우, 예정된 실험 종료 시점 전에 마우스를 인도적으로 안락사시킨다: 수술 전 체중의 20% 이상 감소, 24시간 동안의 완전한 식욕 부진 또는 3일 연속으로 정상 섭취량의 50% 미만으로 음식 섭취, 마취 회복 후 24시간 동안 지속되는 기립 불능 또는 음식 및 물 섭취에 대한 현저한 거부, 또는 37 °C 미만의 체온을 동반한 현저한 쇠약 상태의 임종 단계.

4. POCD의 행동 평가

  1. 오픈 필드 테스트 (운동 제어; 수술 후 3일 차)
    1. 조도 20 lux 아래에서 벽 높이가 40 cm인 45 cm × 45 cm 아레나에서 오픈 필드 테스트를 수행한다. 비디오 카메라를 아레나 중심 바로 위에 배치하여 전체 테스트 영역이 시야 내에 들어오게 한다.
    2. 마우스를 아레나 중앙에 놓고 배치 직후 비디오 트래킹을 시작한다. 마우스가 5분 동안 자유롭게 탐색하도록 한다. 전체 5분 세션을 분석하고, 비디오 트래킹 시스템을 사용하여 총 이동 거리와 평균 이동 속도를 계산한다.
  2. 보행 분석
    1. 수술 후 3일 차에 자동 보행 분석 시스템을 사용하여 보행 분석을 수행한다.
    2. 각 마우스를 보행로의 한쪽 끝에 두고 보행로를 자유롭게 가로지르게 한다. 보행 분석 시스템에 통합된 고속 카메라를 사용하여 이동 중 발자국을 기록한다.
    3. 각 마우스의 보행 시도를 기록하고, 이후 분석을 위해 보행로를 따라 연속적으로 전진 이동한 유효한 주행 3회를 수집한다.
    4. 보행 분석 소프트웨어를 사용하여 기록된 발자국 데이터를 분석한다. 자동으로 식별된 발자국을 검토하고, 보행 파라미터를 추출하기 전 필요한 경우 우측 앞발, 좌측 앞발, 우측 뒷발, 좌측 뒷발의 분류를 수동으로 수정한다.
    5. 보폭, 지지 시간, 스윙 속도 및 발자국 면적을 정량화하고, 통계 분석을 위해 각 마우스의 유효한 주행 3회에서 얻은 평균값을 계산한다.
  3. 반즈 미로 (공간 학습 및 기억; 수술 후 4~6일 차)
    참고: 수술 후 4일 차부터 시작하여 3일 연속으로 매일 한 번씩 반즈 미로 테스트를 수행한다. 일주기 변동성을 최소화하기 위해 매일 동일한 시간대에 테스트를 진행한다.
    1. 지정된 목표 구멍 아래에 탈출 상자를 배치한다. 실험 전체 기간 동안 동일한 목표 위치를 유지한다.
    2. 각 시도를 시작할 때 마우스를 미로 중앙에 놓는다. 마우스가 최대 3분 동안 탈출 상자를 찾도록 한다. 마우스가 탈출 상자에 들어가면 시도를 종료한다.
    3. 마우스가 3분 이내에 탈출 상자를 찾지 못한 경우, 마우스를 목표 구멍으로 부드럽게 안내한다. 과제 학습을 강화하기 위해 마우스가 탈출 상자 안에 잠시 머물게 한다.
    4. 비디오 트래킹 시스템을 사용하여 탈출 잠복기와 이동 거리를 기록한다. 마우스가 3분 이내에 탈출 상자에 들어가지 못한 시도의 경우, 탈출 잠복기를 180 s로 할당한다. 3일 차 마지막 세션에서 기록된 탈출 잠복기와 이동 거리만 통계 분석에 포함한다.
  4. 신규 물체 인식 (인식 기억; 수술 후 3~4일 차)
    참고: 오픈 필드 테스트에서 설명한 것과 동일한 아레나와 비디오 트래킹 시스템을 사용한다. 신규 물체 인식 훈련 전, 수술 후 3일 차의 오픈 필드 세션을 통해 마우스를 테스트 아레나에 적응시킨다.
    1. 훈련 세션 동안 아레나의 대칭적인 위치에 동일한 원통형 물체 두 개를 배치한다. 마우스가 5분 동안 자유롭게 탐색하도록 한다.
    2. 1시간의 유지 간격 후, 익숙한 원통형 물체 하나를 새로운 입방체 모양의 물체로 교체한다. 잠재적인 측면 선호도를 최소화하기 위해 마우스마다 신규 물체의 위치를 균형 있게 배치한다. 마우스가 5분 동안 탐색하도록 한다.
    3. 비디오 트래킹 시스템을 사용하여 익숙한 물체와 신규 물체의 탐색 시간을 기록한다. 총 물체 탐색 시간이 최소 3 s 이상인 마우스만 분석에 포함한다.
    4. 선호 지수(PI)를 다음과 같이 계산한다:
      선호 지수 공식: PI = T_novel / (T_novel + T_familiar) × 100%.
      Tnovel과 Tfamiliar를 각각 테스트 세션 동안 신규 물체와 익숙한 물체를 탐색하는 데 소비한 시간으로 정의한다.
  5. 신규 암 Y-미로 (공간 인식 기억; 수술 후 5일 차)
    1. 120° 간격으로 분리된 세 개의 동일한 암으로 구성된 Y자형 미로에서 테스트를 수행한다. 불투명한 문으로 암 하나를 무작위로 막고, 이 암을 신규 암으로 지정한다.
    2. 열려 있는 두 개의 암 중 하나를 무작위로 시작 암으로 선택한다. 나머지 열려 있는 암을 익숙한 암으로 지정한다. 마우스를 시작 암의 끝에 놓고 접근 가능한 두 암을 5분 동안 자유롭게 탐색하게 한다.
    3. 1시간의 시도 간격 후, 불투명한 문을 제거하고 마우스를 동일한 시작 암의 끝으로 되돌린다.
    4. 마우스가 세 개의 암을 모두 5분 동안 자유롭게 탐색하도록 한다.
    5. 암 진입은 추적된 신체 중심이 중앙 구역에서 미리 정의된 암 구역으로 들어가는 것으로 정의한다. 비디오 트래킹 시스템을 사용하여 각 암의 진입 횟수와 체류 시간을 기록한다.
    6. 시간 기반 신규 암 선호 지수를 다음과 같이 계산한다:
      행동 연구를 위한 시간 계산 공식; 신규 암 체류 시간 백분율을 나타내는 식.
      Tnovel, Tstart, Tfamiliar를 각각 신규 암, 시작 암, 익숙한 암에서 보낸 시간으로 정의한다.
    7. 진입 횟수 기반 선호 지수를 다음과 같이 계산한다:
      신규 암 진입 공식, E_novel/E_total, 행동 실험 분석 식.
      Enovel을 신규 암으로의 진입 횟수로, Etotal을 테스트 시도 동안 세 개의 모든 암으로의 총 진입 횟수로 정의한다.

5. 조직 처리, Nissl 염색 및 면역형광 염색

  1. 조직 처리
    1. 지정된 실험 종료 시점에 2 L/min의 산소 유량으로 3% sevoflurane을 투여하여 마우스를 깊게 마취시킨다.
    2. 발바닥 철회 반사가 없는 것을 통해 마취 깊이가 충분한지 확인한다. 깊은 마취 상태를 유지하며 심정지가 일어나기 전, 20 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 관류하여 혈관 내 혈액을 제거한다.
    3. 즉시 20 mL의 4% paraformaldehyde(PFA)로 마우스를 관류한다.
    4. 전뇌를 조심스럽게 적출한다. 후고정을 위해 뇌를 4% PFA에 담가 4 °C에서 24시간 동안 보관한다.
    5. 조직이 완전히 가라앉을 때까지 뇌를 30% sucrose로 옮긴다.
    6. 뇌를 optimal cutting temperature(OCT) 화합물에 매립한다.
    7. 매립된 조직을 급속 냉각하고 동결 절편 제작 전까지 −80 °C에 보관한다.
  2. Nissl 염색
    1. 16 µm 동결 절편을 실온으로 맞춘다. 슬라이드를 20분 동안 공기 건조시킨다.
    2. 슬라이드를 PBS로 2분 동안 헹군다.
      참고: 염색 전 조직 절편이 슬라이드에 단단히 부착되어 있는지 확인한다.
    3. 절편 전체를 toluidine blue 염색액으로 덮는다. 55 °C에서 30분 동안 배양한다.
      참고: 과염색을 방지하기 위해 16 µm 절편에 대한 염색 시간을 경험적으로 최적화한다.
    4. 슬라이드를 증류수로 10~30초 동안 짧게 헹군다.
    5. 95%, 85%, 75% 에탄올 순으로 각각 2분 동안 절편을 순차적으로 분별 염색한다.
      참고: 염색 강도를 최적화하기 위해 필요한 경우 분별 염색 시간을 조정한다.
    6. 신선한 xylene으로 5분씩 두 번 슬라이드를 투명화한다.
      참고: 모든 xylene 단계는 화학 흄 후드 내에서 수행한다.
    7. 중성 발삼으로 절편을 마운팅한다. 각 절편 위에 커버슬립을 조심스럽게 덮는다.
    8. 20× 대물렌즈가 장착된 광학 현미경을 사용하여 염색된 절편을 촬영한다. 관상면 해마 절편에서 특징적인 조밀한 피라미드 세포층을 기반으로 CA1 영역을 식별한다. 마우스당 하나의 관상면 절편을 분석하고, 각 해마 반구의 CA1 영역에서 겹치지 않는 두 개의 시야를 확보한다.
    9. 이미지 분석 소프트웨어의 세포 계수 플러그인을 사용하여 형태학적으로 온전한 Nissl 양성 뉴런과 Nissl 소체를 수동으로 계수한다. 온전한 세포체, 핵소체가 보이는 둥근 핵, 풍부한 세포질 Nissl 물질이 있는 경우 온전한 뉴런으로 식별하며, 뉴런 세포질 내의 강한 염기성 과립형 또는 덩어리 구조를 Nissl 소체로 식별한다.
    10. 분석된 모든 시야에서 얻은 값의 평균을 내어 동물당 단일 값을 생성한다. 계수를 수행하는 관찰자가 그룹 배분을 알지 못하도록 맹검 상태를 유지한다.
  3. Iba1 면역형광 염색
    1. 염색 전 뇌 절편을 실온으로 평형화한다.
    2. 슬라이드를 sodium citrate 항원 회복 용액에 담그고 80 °C 항온수조에서 25분 동안 항원 회복을 수행한다. 항원 회복 후, 슬라이드와 항원 회복 용액을 실온에서 자연 냉각시킨다.
    3. 인산염 완충 식염수(PBS)로 절편을 3분씩 세 번 세척한다.
    4. PBS에 희석된 0.2% Triton X-100로 실온에서 30분 동안 절편을 투과화한 후, PBS로 3분씩 세 번 세척한다.
    5. 습윤 챔버 내 실온에서 PBS에 희석된 3% bovine serum albumin(BSA)으로 1시간 동안 절편을 배양하여 비특이적 결합을 차단한다.
    6. PBS로 절편을 3분씩 세 번 세척한다.
    7. ionized calcium-binding adaptor molecule 1(Iba1)에 대한 1차 항체(1:100)를 차단 용액(PBS 내 3% BSA)으로 희석하고, 희석된 1차 항체와 함께 절편을 습윤 챔버 내 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한다.
    8. PBS로 절편을 3분씩 세 번 세척한다.
    9. 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) (1:1000)로 실온의 암실에서 90분 동안 절편을 배양한다.
    10. 암실에서 PBS로 절편을 3분씩 세 번 세척한다.
    11. 암실에서 DAPI (1:8000)로 5분 동안 핵을 대조 염색한다.
    12. 암실에서 PBS로 절편을 3분씩 세 번 세척한다.
    13. antifade 마운팅 매질로 절편을 마운팅하고 커버슬립을 덮은 후, 촬영 전까지 절편을 빛으로부터 보호한다.
    14. 20× 대물렌즈가 장착된 공초점 형광 현미경을 사용하여 해마 CA1 영역의 형광 이미지를 획득한다. 정량적 비교에 포함된 모든 절편에 대해 동일한 이미지 획득 설정을 사용한다. 마우스당 하나의 관상면 절편을 분석하고, 각 해마 반구의 CA1 영역에서 겹치지 않는 두 개의 시야를 확보한다.
    15. 모든 이미지에서 동일한 임계값 설정을 적용하여 해마 CA1 영역의 Iba1 평균 형광 강도를 정량화한다. 모든 시야의 값을 평균하여 동물당 단일 값을 얻는다.

6. 통계 분석

  1. 모든 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타낸다.
  2. Shapiro–Wilk 검정을 통해 데이터의 정규성을 평가한다. F 검정을 통해 분산의 동일성을 평가한다.
  3. 분산 가정을 충족하는 경우, 비쌍체 양측 Student’s t-test를 사용하여 대조군과 L5 척추궁 절제술 군을 비교한다. 분산 가정을 충족하지 않는 경우에는 Welch’s t-test를 사용한다.
  4. n을 각 분석에 포함된 동물의 수로 정의한다. P 값 < 0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.

결과

모든 마우스는 예정된 실험 종료 시점까지 생존하였으며, 사전에 정의된 인도적 종료 기준에 도달한 개체는 없었으며, 모든 개체가 최종 분석에 포함되었습니다. 운동 기능은 수술 후 3일에 오픈필드 및 보행 분석을 통해 평가되었습니다. 오픈필드 테스트에서 총 이동 거리와 평균 속도 모두 그룹 간에 차이가 없었으며, 이는 자발적 운동 능력이 유사함을 나타냅니다(그림 2A). 보행 분석에서도 보폭, 지지 시간, 스윙 속도 또는 발자국 면적에서 그룹 간 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다(그림 2B). 종합적으로, 이러한 결과는 L5 척추궁 절제술 절차가 이후의 인지 행동 성능 차이를 설명할 만큼 뚜렷한 운동 기능 장애를 유발하지 않았음을 보여줍니다.

인지 능력은 신물질 인식(NOR) 테스트, 새로운 암 Y-미로 및 Barnes 미로를 사용하여 평가되었습니다. NOR 테스트에서 L5 척추궁 절제술 그룹은 대조군보다 신물질 선호 지수(PI)가 유의하게 낮았습니다(그림 3A). 새로운 암 Y-미로에서 L5 척추궁 절제술 그룹은 새로운 암에서 보낸 시간과 진입 횟수 모두에서 유의하게 낮은 PI를 보였습니다(그림 3B). Barnes 미로에서는 L5 척추궁 절제술 그룹이 Barnes 미로 테스트 3일 차에 더 긴 탈출 잠복기와 더 긴 이동 거리를 보였습니다(그림 3C). 종합적으로, 이러한 행동 분석 결과는 L5 척추궁 절제술 이후 수술 후 인지 능력이 손상되었음을 나타냅니다.

해마 CA1 영역에서, L5 층절제술 군은 대조군에 비해 Nissl 양성 뉴런과 Nissl 소체 수가 유의하게 적었으며, 이는 뉴런의 구조적 손상을 나타낸다(그림 4A, B). 또한, L5 층절제술 군에서 Iba1 평균 형광 강도가 유의하게 증가하였으며, 이는 미세아교세포 활성화의 증가와 일치한다(그림 4C, D).

L4, L5, L6 척추 식별 과정을 보여주는 마우스 요추 박리 도식 및 절차.
그림 1마우스의 수술 후 인지 기능 장애(POCD) 모델링을 위한 L5 요추 척추궁 절제술 절차. (A) L5 층판의 수술 목표 부위와 인접 척추 레벨(L4–L6)에 걸친 노출 범위를 나타낸 도식. (B) L5 요추 층판 절제술 과정의 주요 단계를 보여주는 수술 중 이미지. (a) 제모 후 척추 정중선이 확인된 요추 부위; 화살표는 계획된 피부 절개 방향을 나타냄. (b) 요추 부위의 정중선 피부 절개. (c) 근막 절개 및 척추 주변 근육의 단계적 분리를 통해 극돌기를 노출시키고, L5 극돌기와 층판 주변 조직을 추가로 정리하여 L5 층판을 완전히 노출시키는 과정. (d) L5 층판 제거 후의 L5 층판 절제 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

척추궁 절제술 대 대조군 연구; 이동 경로, 막대 그래프, 보행 데이터 비교, 실험 결과.
그림 2: L5 요추 척추궁 절제술 후 운동 능력 및 보행 평가. (A) 총 이동 거리와 평균 속도를 나타내는 오픈 필드 테스트 (n = 10). (B) 보폭, 입각 시간, 유각 속도 및 접지 면적을 나타내는 보행 분석 (n = 6). 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. 통계적 유의성은 ns(유의하지 않음)로 표시됨. 약어: Control = 대조군; Laminectomy = L5 척추궁 절제술군. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

미로 도식과 막대 그래프를 통해 인지 과제 수행 시 대조군과 척추궁 절제술의 효과를 분석함.
그림 3: L5 요추 척추궁 절제술 후 인지 행동 평가. (A) 새로운 물체 인식 테스트 (n = 10). (B) 새로운 팔 Y-미로 테스트 (n = 10). (C) Barnes 미로 테스트 (n = 10). 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. 통계적 유의성은 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001로 나타냄. 약어: Control = 대조군; Laminectomy = L5 척추궁 절제술 군. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

척추궁절제술 결과; 대조군과 척추궁절제군에서 IBA1 강도의 조직학적 이미지 및 막대 그래프.
그림 4: L5 요추 척추궁절제술 후 해마 CA1 영역의 조직학적 평가. (A) 해마 CA1 영역의 Nissl 염색 대표 이미지. (B) Nissl 양성 뉴런(왼쪽) 및 Nissl 소체(오른쪽)의 정량 분석(n = 5). (C) 해마 CA1 영역의 Iba1 면역형광염색 대표 이미지. 스케일 바 = 100 µm. (D) Iba1 평균 형광 강도의 정량 분석(n = 6). 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. 통계적 유의성은 **P < 0.01 및 ***P < 0.001로 표시됨. 약어: Control = 대조군; Laminectomy = L5 척추궁절제군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

척추 수술을 받는 고령층에서 수술 후 인지 기능 장애가 보고된 바 있습니다10. 실험적 근거에 따르면 노화는 수술 관련 인지 저하 및 신경 염증 반응에 대한 민감도를 높이는 것으로 나타났습니다11,12. 본 프로토콜은 노화된 마우스에서 약 4시간의 세보플루란 마취와 L5 척추궁 절제술을 병행하여 초기 수술 후 인지 저하 모델을 구축합니다. 이 방법의 주요한 방법론적 가치는 척추 수술 후의 행동 및 해마 조직학적 변화를 조사하기 위한 실용적이고 접근 가능한 절차를 제공한다는 점에 있습니다.

전임상 POCD 모델에는 마취 단독 노출, 복부 수술 및 정형외과적 손상 패러다임이 포함됩니다13. 마취 단독 패러다임은 수술적 외상이 없는 상태에서 마취제의 효과를 평가할 수 있게 하지만14, 마취와 조직 손상의 복합적인 노출을 재현하지는 못합니다. 복부 수술 및 경골 골절 모델은 수술적 손상을 포함하며 수술 관련 인지 장애를 연구하는 데 사용되어 왔습니다15,16. 그러나 이러한 모델의 수술 부위와 조직 손상 패턴은 척추 수술의 경우와는 다릅니다. 수술적 외상의 종류와 강도가 수술 후 인지 결과와 중추성 염증 반응에 영향을 미칠 수 있으므로9, 전임상 모델을 선택할 때 수술적 맥락을 고려해야 합니다. 따라서 본 L5 층판절제술 프로토콜은 고령 쥐에서 수술 후 조기 인지 장애를 조사하기 위한 척추 수술 관련 실험 패러다임을 제공합니다.

이 프로토콜의 핵심 기술적 과제는 경막 손상을 피하면서 경막을 명확하게 노출시키기 위해 L5 층판에서 충분한 뼈를 제거하는 것입니다. 직접 시각화 하에 층판절제술을 수행하는 동안, 기구의 깊이, 절단력, 그리고 안과용 가위의 삽입 각도를 세심하게 제어해야 합니다. 뼈는 층판의 가장자리를 따라 작고 제어된 절단을 통해 단계적으로 제거해야 합니다. 포셉으로 L5 극돌기를 잡고 수술 부위의 요추 분절을 수술 플랫폼에 대해 약 30° 각도로 들어 올리면 L5-L6 층간 공간이 넓어집니다. 이 조작을 통해 가위 끝을 뼈 가장자리 아래로 얕게 삽입할 수 있으며, 경막 접촉 위험을 줄일 수 있습니다. 뼈 제거가 불충분하면 수술적 노출이 제한될 수 있으며, 반대로 너무 공격적인 절단이나 과도한 삽입 깊이는 경막 손상을 유발할 수 있습니다. 통제되지 않은 출혈은 수술 시야를 가려 수술 후 회복을 저해하고 행동 결과의 변동성을 증가시킬 수 있습니다. 가위 끝을 안전하게 삽입하기에 층간 공간이 부족한 경우, 삽입 깊이를 늘리기보다는 수술 부위 요추 분절의 위치와 거상 각도를 재조정해야 합니다. 출혈로 인해 수술 시야가 가려지면 적절한 시각화가 회복될 때까지 뼈 제거를 일시 중단한 후, 남은 뼈를 점진적으로 제거해야 합니다.

척추 주변 근육 분리와 L5 층판절제술은 일시적인 수술 후 통증의 원인이 될 수 있으며, 마우스의 실험적 층판절제술 후 기계적 과민증이 보고된 바 있습니다17. Meloxicam은 사전에 정의된 진통제 투여 계획에 따라 투여되었습니다. 마우스의 수술 후 통증 관련 안면 표정은 약 36–48 h 동안 지속되는 것으로 보고되었습니다18. 48 h의 진통제 투여 계획은 이러한 수술 초기 기간을 포함하도록 설정되었으며, 즉각적인 수술 후 통증의 잠재적 영향을 줄이기 위해 진통제 투여가 완료된 후인 수술 후 3일째에 인지 행동 테스트를 시작했습니다. 오픈 필드 테스트는 실험적 POCD 연구에서 자발적인 운동 활동을 평가하고, 운동 능력 감소가 인지 행동 성능에 혼란을 줄 수 있는지 판단하기 위해 사용되어 왔습니다19,20. 이에 따라, 인지 평가 전인 수술 후 3일째에 오픈 필드 테스트와 보행 분석을 수행했습니다. 오픈 필드 운동 활동이나 보행 파라미터에서 그룹 간 유의미한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 이후의 인지 행동적 차이가 주로 명백한 운동 장애로 인해 설명될 가능성이 낮음을 시사합니다. 다만, 자발적인 수술 후 통증과 상처로 인한 불편함을 직접적으로 평가하지 않았기 때문에, 행동 성능에 미치는 잔류 효과를 완전히 배제할 수는 없습니다. 향후 연구에서는 자발적인 수술 후 통증에 대한 직접적인 평가를 포함할 수 있을 것입니다.

전반적으로, 본 프로토콜은 L5 척추궁 절제술을 받은 노령 마우스에서 수술 후 조기 인지 기능 저하를 조사하기 위한 실용적인 실험적 접근법을 제공합니다. 이는 척추 수술 관련 인지 기능 저하의 행동학적 결과와 그 기저 메커니즘을 조사하는 것뿐만 아니라, 수술 후 인지 기능 저하를 예방하거나 감소시키기 위한 중재법을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 더 큰 코호트와 독립적인 실험실에서의 검증을 통해 본 모델의 안정성과 재현성을 더욱 확립할 수 있을 것입니다.

공개 사항

저자들은 이해상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

기술 지원을 제공해 주신 Zhejiang University School of Medicine의 핵심 시설 플랫폼 소속 Sanhua Fang 님과 Zhejiang University 동물 센터의 Yanhong Chen 님, Xuliang Zhang 님께 감사드립니다. 본 연구는 다음의 기금을 통해 지원받았습니다: National Natural Science Foundation of China (Nos. 82575196, 82074535, 및 U23A20508).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL/6J 수컷 마우스Suzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-05동물 모델
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA600행동 비디오 추적 및 분석
Erythromycin 안연고Beijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H1021270안구 건조 방지
미세 핀셋NANA피부 집기
가열 패드NANA온도 제어
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Iba1 면역형광 염색
흡입 마취 장비RWD Life Science Co., Ltd.R581S마취
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY202512704보행 분석
미세 안과용 가위NANA골 제거
Nissl 염색액Haoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Nissl 염색
가위Shang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY0030피부 절개
SevofluraneShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.2506231마취
일회용 수술포Jiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.2021214021수술 조작 플랫폼
소동물용 트리머Yiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-0310제모
봉합사 포함 수술용 봉합 바늘Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603피부 봉합
Veet 제모 크림RECKITT BENCKISER (India) LtdNA제모

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