본 프로토콜은 calcitonin gene-related peptide (CGRP)/receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1) 경로를 통해 폐 Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s)를 조절함으로써, Kechuanting Acupoint Sticking Therapy (KAST)가 제2형 기도 염증에 미치는 치료 메커니즘을 평가하기 위한 ovalbumen (OVA) 유도 알레르기성 천식 (AA) 마우스 모델 구축 방법을 설명합니다.
연구 논문
Kechuanting 혈위 부착 요법은 ILC2의 수를 조절함으로써 알레르기성 천식 마우스의 2형 기도 염증을 완화한다
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Kechuanting 혈자리 부착 요법(KAST)은 알레르기성 천식(AA) 환자의 기도 염증을 효과적으로 개선하는 것으로 나타났으나, 그 기저 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 본 연구는 신경-면역 관점에서 AA 마우스 모델에서 KAST의 치료 메커니즘을 조사하는 것을 목표로 하였습니다. ovalbumen (OVA)로 유도된 알레르기성 천식 마우스 모델을 구축하고, 마우스에 KAST를 처치하였습니다. 폐의 제2형 선천성 림프구(ILC2s) 및 제2형 기도 염증에 미치는 KAST의 효과를 유세포 분석, hematoxylin-eosin (HE) 염색 및 면역조직화학법을 사용하여 평가하였습니다. 폐 조직 내 calcitonin gene-related peptide (CGRP) 단백질 수준은 Western blotting (WB) 및 ELISA로 측정하였습니다. 알레르기성 천식 마우스에 CGRP 또는 CGRP 수용체 억제제인 BIBN-4096을 비강 내 투여하여, ILC2s 및 제2형 기도 염증에 대한 CGRP/receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1) 경로의 조절 역할을 조사하였습니다. KAST는 ILC2s의 수를 감소시키고 제2형 기도 염증을 완화하였으며, 이는 폐 조직 내 CGRP 발현 감소와 동반되었습니다. CGRP의 비강 내 투여는 폐 내 RAMP1+ILC2s 및 전체 ILC2s를 증가시키고 제2형 기도 염증을 악화시켰습니다. 반대로, BIBN-4096의 비강 내 투여는 폐 ILC2s를 감소시키고 제2형 기도 염증을 완화하였습니다. KAST는 알레르기성 천식에서 기도 염증을 감소시키며, 이는 약리학적 억제 실험을 통해 입증된 바와 같이 CGRP/RAMP1 경로의 하향 조절 및 그에 따른 폐 ILC2s의 억제와 밀접한 관련이 있습니다.
서론
알레르기성 천식(AA)은 가장 흔한 천식 표현형으로, 중국 내 전체 천식 사례의 60–80%를 차지합니다1. 이는 높은 유병률과 불충분한 질환 조절을 특징으로 하며, 환자의 삶의 질을 심각하게 저하시키고 상당한 경제적 부담을 초래합니다2,3,4,5. 흡입성 코르티코스테로이드(ICS)가 여전히 임상 치료의 주축을 이루고 있으나6, 일부 환자는 반응성이 제한적이며, 장기 사용은 종종 부작용 및 질병 진행 억제 불가와 관련이 있습니다7. 따라서 안전하고 효과적인 새로운 치료 전략의 개발은 임상 및 연구 환경 모두에서 우선순위로 남아 있습니다. 전통 중의학의 외용법인 커촨팅 혈위 부착 요법(KAST)은 활성 화합물을 경피적으로 전달하여 간의 초회 통과 효과를 잠재적으로 회피하고 전신 부작용을 최소화합니다8,9. 임상 연구를 통해 KAST가 천식 증상을 완화하고, 폐 기능을 부분적으로 회복시키며, 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있음이 입증되었습니다10,11,12. 이와 동시에, 혈청 대사체학, 네트워크 약리학 및 천식 모델을 이용한 동물 연구에서는 KAST가 IgE, IL-4, IL-13 발현의 하향 조절을 포함하여 혈청 및 기관지폐포 세척액(BALF) 내 염증 매개체 수치를 감소시킴으로써 기도 염증을 완화한다는 점을 시사합니다9,13,14. 종합적으로, 이러한 발견들은 천식에 대한 KAST의 치료 효능을 뒷받침하는 근거를 제공합니다. 그러나 정확한 작용 기전은 여전히 불분명한 상태입니다.
AA 재발을 유발하는 핵심 병리 기전 중 하나는 2형 기도 염증이며, 여기서 2군 선천성 림프구 세포(ILC2s)가 핵심적인 역할을 합니다15. 알레르겐 자극 시, ILC2s는 IL-5 및 IL-13과 같은 사이토카인을 분비하여 기도 염증을 유발합니다16,17. 여러 연구에 따르면 ILC2s를 고갈시키면 천식 쥐의 기도 염증이 유의하게 완화되는 것으로 나타났으며, 이는 질환 진행에서 ILC2s가 중심적인 역할을 한다는 점을 강조합니다18. 특히 ILC2s의 활성화와 기능은 여러 기전에 의해 엄격하게 조절되며, 최근 몇 년 동안 신경-면역 상호작용이 점점 더 많은 주목을 받고 있습니다. 새로운 증거에 따르면 calcitonin gene-related peptide (CGRP)가 ILC2s 표면의 receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1)에 결합하여 ILC2s의 활성화를 유도하고 이후 2형 사이토카인을 방출하게 함으로써 AA의 기도 염증을 악화시킬 수 있음이 나타났습니다19,20,21. 본 연구에서는 고처리량 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 스크리닝을 통해 CGRP가 KAST 중재에 의해 크게 조절되는 결정적인 반응성 신경펩타이드임을 확인했습니다. 이에 따라 CGRP/RAMP1 경로에 주목하여, AA 쥐 모델에 KAST 중재를 적용함으로써 ILC2 활성을 조절하고 2형 기도 염증을 완화하는 잠재적 기전을 조사하였습니다.
프로토콜
모든 동물 실험 절차는 국립과학원(National Academies of Sciences)에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행되었습니다. 해당 프로토콜은 난징 중의약대학교 부속병원 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 2023DW-059-01). 본 연구에 사용된 모든 재료, 시약, 도구 및 소프트웨어의 상세 목록은 재료 표에 기술되어 있습니다.
실험 동물 및 그룹화
건강한 암컷 BALB/c 마우스(SPF 등급, 8–10주령)를 난징 중의약대학교 실험동물센터(허가 번호 SYXK (Su) 2018-0049)에서 분양받았다. 동물은 24–26 °C 온도와 12시간 명/암 주기 조건의 표준 환경에서 사육되었다. 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 제공하였으며, 깔짚은 정기적으로 교체하고 케이지를 주기적으로 세척하였다. 7일간의 적응 기간 후, 마우스를 무작위로 6개 그룹(그룹당 n = 7)으로 나누었다: 정상군, 모델군, CGRP군, BIBN-4096군, KAST군, 그리고 KAST + CGRP군. 컴퓨터로 생성된 난수표를 사용하여 동물을 각 그룹에 무작위로 배정하였다. 중재가 할당될 때까지 연구자들은 그룹 배정 내용을 알 수 없도록 은폐하였다. 조직 활용도를 최적화하기 위해, 무작위 배정된 코호트(그룹당 n = 7)의 폐 샘플을 서로 다른 처리 경로로 체계적으로 할당하였으며, 특정 조직학적 및 분자 생물학적 분석에 사용된 정확한 분석 샘플 수(n = 5, 4 또는 3)는 각각의 그림 설명에 명시하였다. 분석에서 제외된 데이터는 없었다.
KAST 제형 조제
해당 제제는 난징중의약대학교 부속병원 약제부에서 조제되었습니다.229가지의 전통 중약재가 사용되었다: 개자(2부), 현호색(2부), 초제 대극(1부), 세신(1부), 마황(1부), 파극천(1부), 정향(1부), 계피(1부), 및 괴각자(1부). 각 약재는 미세한 분말로 분쇄한 후 80메쉬 체로 걸러냈다. 혼합 분말 100g마다 신선한 생강즙 70mL와 액체 파라핀 30mL를 첨가하여 충분히 혼합한 후, 0.3g으로 가공하였다. ± 직경 0.5 cm의 5% 패치. 구체적으로, 모든 생약 성분과 신선한 생강은 수석 약사 Lin-gang Zhao에 의해 인증되었으며 다음 장소에 보관되었습니다. 4 °C 사용 전 어둡고 건조한 환경에서9중재의 재현성과 배치 간 안정성을 보장하기 위해, 본 연구팀의 기성 UPLC-Q-TOF-MS 및 HPLC 방법을 기반으로 엄격한 품질 관리 표준을 시행하였으며, 이를 통해 sinapine thiocyanate와 같은 주요 활성 마커의 일관된 존재를 확인하였습니다.23실제로, 0.5 cm 패치는 2.5 cm를 사용하여 고정되었습니다. × 최적의 경피 전달을 보장하기 위해 5.5 cm 의료용 통기성 저자극성 접착 테이프를 사용하십시오.
AA 마우스 모델의 구축
AA 모델은 OVA 감작 및 비강 내 투여를 이용한 기존 문헌의 확립된 프로토콜에 따라 유도되었다24. 정상군을 제외한 모든 마우스는 0일과 12일에 100 µg OVA와 2 mg 수산화알루미늄이 포함된 200 µL 식염수를 복강 내 주사하여 감작시켰다. 18일부터 23일까지 마우스에 50 µL 식염수에 녹인 50 µg OVA를 매일 1회 비강 내 투여하여 자극을 주었다. 24일부터 53일까지는 격일로 OVA를 비강 내 투여하였다. 54일에 마우스의 체중을 측정한 후, 경추 탈구법으로 안락사를 실시하고 조직을 수집하였다. 이후 전체 폐 무게를 체중으로 나누어 폐 계수를 산출하였다.
중재
40일부터 53일까지, KAST 군과 KAST + CGRP 군의 마우스는 등 부위의 3 cm × 6 cm 영역을 제모하였습니다. 양측의 폐수(BL13), 격수(BL17), 비수(BL20), 신수(BL23) 혈위 위에 패치를 부착하고 접착 테이프로 고정한 후, 14일 연속으로 매일 1회 1.5 h 동안 유지하였습니다. CGRP 군과 KAST + CGRP 군의 마우스에는 40일부터 53일까지 격일로 10 µL의 Calcitonin/CALCA 용액(1 pg/µL)을 비강 내 투여하였습니다. BIBN-4096 군의 마우스에는 10 µL의 BIBN-4096 용액(0.3 mg/mL, CGRP 수용체 길항제)을 격일로 비강 내 투여하였습니다. 정상군과 모델군은 별도의 처치 없이 표준 급이를 실시하였습니다. KAST는 알레르기성 기도 염증이 유도된 후(18일차의 첫 OVA 유발 22일 후인 40일차부터 시작) 40일부터 53일까지 투여되었습니다. 따라서 본 연구에서 KAST는 예방적 중재가 아닌 치료적 중재로 작용하였습니다.
피부 준비를 위해 전기 클리퍼를 사용하여 지정된 등 부위의 털을 제거하였습니다. 혈위 선정은 중국 침구학회(Chinese Acupuncture-Moxibustion Society)에서 발행한 실험동물 혈위 명칭 및 위치 표준 - 제3부: 마우스(T/CAAM 0002-2020)를 엄격히 준수하였습니다. 양측 등 부위의 4쌍의 지점을 정확하게 표시하고 다음과 같이 정의하였습니다: 폐수(Feishu, BL13: 제3 흉추 극돌기 하단 늑골 사이, 후방 정중선에서 외측으로 3 mm), 격수(Geshu, BL17: 제7 흉추 극돌기 하단, 정중선에서 외측으로 3 mm), 비수(Pishu, BL20: 제12 흉추 극돌기 하단, 정중선에서 외측으로 3 mm), 그리고 신수(Shenshu, BL23: 제2 요추 극돌기 하단, 정중선에서 외측으로 3 mm). 3M 테이프를 단단히 감아 안정적인 접착을 유도함으로써, 1.5 h의 유지 기간 동안 패치의 이탈이나 2차 피부 침식이 발생하지 않도록 하였습니다.
CGRP/CALCA(1 pg/µL, 마우스당 10 µL) 및 BIBN-4096(0.3 mg/mL, 마우스당 10 µL)의 투여량은 기발표된 연구25를 바탕으로 선정하였다. 구체적으로, CGRP 처리를 위해 1 mg의 BSA를 1 mL의 ddH2O에 녹인 후 볼텍싱하여 최종 농도 1 mg/mL의 0.1% BSA 용액을 준비하였다. 재구성 전, 동결건조된 Calcitonin/CALCA 단백질 분말을 4 °C에서 12,000 × g로 30초 동안 원심분리하였다. 그 다음, 준비된 0.1% BSA 용액 20 µL를 첨가하여 1 µg/µL 스톡 용액을 제조하였다. 바이알을 볼텍싱 없이 여러 번 부드럽게 뒤집어 섞은 후, 몇 초간 스핀 다운하고 실온에서 몇 분간 방치하여 단백질이 완전히 재구성되도록 하였다. 단일 단계로 조제하기에 너무 많은 부피가 생성되는 것을 방지하기 위해, 표준 2단계 연속 희석법을 사용하여 1 pg/µL 작업 용액을 준비하였다. 먼저 1 µg/µL 스톡 용액 1 µL를 999 µL의 멸균 식염수에 희석하여 1 ng/µL 중간 용액을 만들고, 이 중간 용액 1 µL를 다시 999 µL의 멸균 식염수와 혼합하여 최종 1 pg/µL 작업 용액을 얻었다. 작업 용액은 4 °C에서 보관하였으며, 나머지 분주액은 -20 °C에서 최대 2~3개월 동안 보관하였다. BIBN-4096 그룹의 경우, 1 mg의 BIBN-4096 분말을 333 µL의 ddH2O에 녹여 3 mg/mL 스톡 용액을 얻었으며, 이를 바이알당 50 µL씩 분주하여 -80 °C에 보관하였다. 0.3 mg/mL 작업 용액을 준비하기 위해, 스톡 용액 분주액 50 µL를 멸균 식염수 450 µL와 충분히 혼합하였다. 40일부터 53일까지, 마취 없이 부드럽게 보정한 상태에서 1 pg/µL CGRP 용액 또는 0.3 mg/mL BIBN-4096 용액 10 µL를 이틀 간격으로 각 마우스의 비강 내에 투여하였다.
결과 측정 지표 및 검출 방법
행동 테스트
마지막 비강 내 자극 후 53일째에, 디지털 비디오 시스템을 사용하여 10분 동안 코 비빔 및 재채기 횟수를 모니터링하고 기록하였습니다. 비디오에 나타난 행동 빈도는 두 명의 연구자가 이중 맹검 방식으로 독립적으로 측정하였습니다. 측정값 사이에 상당한 차이가 있는 경우에는 세 번째 연구자가 비디오를 재평가하였으며, 일관성이 가장 높은 데이터를 최종적으로 선택하여 통계 분석에 사용하였습니다.
기관지 유발 시험
최종 자극 후 24시간 이내에 0, 5, 10, 20, 40 mg/mL 농도의 네뷸라이저 분무 아세틸콜린(ACh)을 사용하여 기도 반응성을 평가하였습니다(농도당 300 µL를 1분 동안 분무). 기도 수축을 경험적으로 나타내고 기도 과민반응(AHR)을 평가하는 데 사용되는 무차원 지수인 강화 일시 정지(Penh) 값은 비침습적 전신 플레티스모그래피를 사용하여 각 분무 후 5분 동안 기록되었습니다. 마우스는 기록 전 10분 동안 챔버에 적응시켰습니다. Penh은 호기/흡기 시간과 최대 유량의 균형을 맞춘 경험적 공식에 따라 통합 수동 저장/스트리밍 시스템 소프트웨어를 사용하여 자동으로 계산되었습니다.
조직병리학 (HE 염색)
4% 파라포름알데히드로 고정된 폐 조직을 단계별 알코올 시리즈를 통해 탈수하고, 자일렌으로 투명화한 후 자동 조직 처리기를 사용하여 파라핀 블록으로 포매하였습니다. 블록을 4 µm 두께로 절편하여 42 °C 항온수조에 띄운 뒤 유리 슬라이드에 부착하였습니다. 슬라이드를 80 °C에서 2시간 동안 가열하고 하룻밤 동안 건조시킨 후 상온으로 냉각하였습니다. 염색을 위해 절편을 자일렌(I 및 II, 각각 20분)으로 탈파라핀화하고, 단계별 에탄올 시리즈(100% I/II 및 75%, 각각 5분)를 통해 재수화한 후 수돗물로 세척하였습니다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 3–5분 동안 염색하고, 1% 산성 알코올로 분별한 뒤 블루잉 용액으로 청색화하였습니다. 세척 후, 절편을 85% 및 95% 에탄올(각각 5분)로 탈수하고 에오신으로 5분 동안 대조 염색하였습니다. 마지막으로 슬라이드를 절대 에탄올(I, II, III, 각각 5분)로 탈수하고, 자일렌(I 및 II, 각각 5분)으로 투명화한 후 중성 발삼으로 봉입하고 자연 건조하였습니다. 광학 현미경과 CaseViewer 시스템을 사용하여 200× 배율에서 무작위 시야의 이미지를 캡처하였습니다. 폐 염증과 상피 비후는 0–4 척도로 맹검 평가하였습니다: 0, 염증 없음; 1, 간헐적인 염증 세포; 2, 소수(<3)의 염증 초점; 3, 다수(≥3)의 염증 초점; 4, 폐 전반에 걸친 미만성 침윤. 상피 비후는 다음과 같이 점수를 매겼습니다: 0, 정상; 1, 눈에 보이는 비후; 2, 부분적인 기도 비후; 3, 거의 완전한 폐쇄; 4, 정상 구조 소실. 각 실험군에 대해 총 20개의 무작위 현미경 시야를 촬영하고 평가하여 기초 조직병리학적 점수를 얻었습니다. 매 4개 시야의 데이터를 평균하여 하나의 독립적인 데이터 포인트로 산출하였으며, 그 결과 통계 분석을 위해 그룹당 n = 5 반복수의 최종 샘플 크기를 확보하였습니다. 점수 산정은 맹검 방식으로 수행되었습니다.
RNA-seq
제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 생쥐 폐 조직에서 총 RNA를 추출하였다. 분광광도계와 미세유체 기반 플랫폼을 사용하여 RNA의 순도, 농도 및 무결성을 평가하였다. 상용 라이브러리 제작 키트를 사용하여 전사체 라이브러리를 구축하였으며, 고처리량 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱하여 150 bp paired-end 리드를 생성하였다. 적절한 필터링 소프트웨어를 사용하여 원천 데이터의 품질 관리를 수행하여 클린 리드를 확보하였으며, 이를 splice-aware 정렬 도구를 사용하여 참조 유전체에 매핑하였다. 유전자 발현 수준은 FPKM으로 계산하였으며, 리드 카운팅 유틸리티를 통해 리드 수를 집계하였다. 전문 통계 패키지를 사용하여 차등 발현 분석을 수행하였으며, 임계값은 |log2 Fold Change| ≥ 1 및 보정된 p < 0.05로 설정하였다.
효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)
신선한 마우스 폐 조직을 정밀하게 측정하여 조직 20 mg당 PBS 버퍼 200 µL의 엄격한 비율로 균질화하였다. 균질물을 4 °C에서 약 13,400 × g로 10분간 원심분리하여 단백질 상층액을 수집하였다. 정규화를 위해 BCA법을 이용하여 상층액의 총 단백질 함량을 보정하였다. ELISA 절차는 제조사의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 기술적 3반복으로 수행하였다. 간단히 설명하면, 표준 희석액 50 µL 또는 사전 희석된 시료 50 µL(단백질 시료 10 µL를 시료 희석액 40 µL와 혼합하여 최종 5배 희석)를 항체가 코팅된 96-well 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 30분간 배양하였다. 1:30으로 희석한 세척 버퍼로 5 TIMES 세척한 후, 각 웰(공백 웰 제외)에 효소 결합 컨쥬게이트 시약 50 µL를 첨가하고 혼합물을 37 °C에서 30분간 배양하였다. 다시 5회 세척한 후, 각 웰에 발색제 용액 A 50 µL와 발색제 용액 B 50 µL를 첨가하고 플레이트를 37 °C 암소에서 10분간 배양하였다. 정지 용액 50 µL를 첨가하여 반응을 중단시키면 색상이 청색에서 황색으로 변한다. 각 웰의 흡광도(OD 값)를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 15분 이내에 450 nm에서 측정하였다. 4-매개변수 로지스틱 또는 선형 회귀 모델(R2 > 0.99 보장)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였으며, 이를 통해 폐 조직 균질물 내의 표적 단백질 농도를 산출하였다.
유세포 분석법
폐 조직을 적출하여 잘게 다진 후, 10% FBS, 50 µL Liberase TM, 5 µL DNase I가 포함된 5 mL의 RPMI-1640에서 37 °C, 80 rpm으로 흔들어주며 45분 동안 소화시켰다. 소화된 현탁액을 400-mesh 셀 스트레이너에 통과시킨 후 4 °C에서 300 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 2 mL의 적혈구 용해 버퍼에 현탁하여 상온의 암소에서 10분 동안 처리하였다. 세척 후, 죽은 세포를 배제하기 위해 Ghost Dye Red 780(샘플당 1.25 µL)로 4 °C의 암소에서 20분 동안 염색하였다. 세척 후, 10 µL의 FcR Blocking Reagent를 사용하여 4 °C에서 10분 동안 블로킹하였다. 그 후, 다음과 같은 형광 표지 항체들을 사용하여 4 °C에서 30분 동안 세포 표면 염색을 수행하였다: FITC anti-mouse CD45 (0.5 µL), PE anti-mouse/human KLRG1 (1.25 µL), BB700 rat anti-mouse CD90.2 (0.5 µL), 그리고 anti-mouse CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (각각 0.5 µL) 및 anti-mouse CD19 (2 µL)를 포함하는 비오틴화 lineage mixture. 세척 후, Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL)과 함께 4 °C에서 30분 동안 배양하였다. 데이터는 BD 유세포 분석기 플랫폼에서 획득하였으며 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 형광 스필오버 보정 매트릭스는 장비의 캘리브레이션된 획득 소프트웨어에 의해 자동으로 모니터링 및 조정되었다. 폐 ILC2를 식별하기 위한 계층적 게이팅 전략은 다음과 같이 순차적으로 구현되었다: 먼저 전방/측방 산란광(FSC-A/SSC-A) 형태를 통해 총 림프구를 분리한 다음, 싱글렛 게이팅(FSC-H/FSC-A)을 통해 더블릿을 제거하였다. 이후 죽은 세포 배제(Ghost Dye-)를 통해 생존 세포를 식별하였으며, 표준 게이트를 점진적으로 적용하여 CD45+ 및 Lineage- 집단을 선택하였다. 생존한 CD45+ Lineage- 게이팅 창 내에서, CD90.2+ 및 KLRG1+ 클러스터의 후속 양성 순차 캐스케이딩 게이트를 기반으로 폐 ILC2를 명확하게 정의하고 정량화하였다.
면역형광법 (Immunofluorescence, IF)
냉동된 폐 절편을 상온에서 15–30분 동안 해동한 후, OCT 화합물을 제거하기 위해 PBST(0.05% Tween-20를 포함하는 PBS)로 각각 6분씩 3회 세척하였다. 과잉 액체를 닦아낸 후, 면역조직화학 펜을 사용하여 조직 주변에 소수성 장벽을 그렸다. 절편을 0.3% Triton X-100과 5% goat serum이 포함된 블로킹 및 투과화 버퍼에 넣고 37 °C에서 100분 동안 반응시킨 후, 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤(16–20시간) 동안 반응시켰다. 다음 날, 절편을 상온에서 30분 동안 평형화하고 PBST로 3회 세척한 후, 종 일치 형광체 결합 2차 항체와 함께 37 °C 암실에서 60–90분 동안 반응시켰다. PBST로 3회 추가 세척한 후, DAPI(PBS에 1:1 또는 2:1로 희석)를 사용하여 상온 암실에서 8분 동안 핵을 대조 염색하였다. 마지막 PBST 세척 단계(3 × 6분)를 거친 후, 절편을 anti-fade 마운팅 매질로 마운팅하고 기포 형성을 방지하기 위해 밀봉하여 암소에 보관하였다. 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 400× 배율로 캡처하였다. 시야당 양성 세포 수는 Leica LAS X 소프트웨어를 사용하여 수동으로 측정하였다. 각 실험군에 대해 총 15개의 무작위 현미경 시야를 촬영하여 가공되지 않은 세포 수를 얻었다. 매 3개 시야의 데이터를 평균하여 단일 독립 데이터 포인트로 산출하였으며, 그 결과 통계 분석을 위한 최종 표본 크기는 군당 n = 5 반복구가 되었다. 세포 수는 눈가림법(blinded manner)으로 측정하였다.
면역조직화학염색 (IHC)
파라핀 절편은 자일렌으로 3회 탈파라핀화(각 15분)하고, 단계별 에탄올 계열(100% 2회, 85%, 75%; 각 5분)을 통해 재수화시킨 후 증류수로 헹구었습니다. 항원 회복은 압력솥을 사용하여 시트르산 완충액(pH 6.0)에서 수행하였으며(끓기 시작한 후 고압에서 3분), 이후 냉각시킨 뒤 PBS(pH 7.4)로 5분씩 3회 세척하였습니다. 내인성 퍼옥시다제는 암실 상태의 실온에서 3% H2O2를 사용하여 15분 동안 차단하였습니다. 세척 후, 절편의 주변을 소수성 펜으로 둘러싸고 3% 염소 혈청으로 30분 동안 차단하였습니다. 그 다음, PBS에 희석한 1차 항체인 anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) 또는 anti-IL-13 (1:150)과 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하였습니다. 다음 날, 절편을 세척하고 HRP-결합 2차 항체(IL-4의 경우 anti-mouse, IL-5 및 IL-13의 경우 anti-rabbit)와 함께 실온에서 50분 동안 배양하였습니다. 신호는 현미경 제어 하에 갓 조제한 DAB 용액을 사용하여 시각화하였으며, 수돗물로 반응을 종료시켰습니다. 마지막으로 절편을 헤마톡실린으로 대조 염색하고, 분별 및 청색화 과정을 거친 뒤, 단계별 알코올과 자일렌으로 탈수시키고 중성 발삼으로 봉입하여 현미경으로 관찰하였습니다. 평균 광학 밀도(IOD/Area)는 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 200× 배율에서 정량화하였습니다. 각 실험군에 대해 총 15개의 무작위 현미경 시야를 촬영하여 원시 값을 얻었습니다. 3개 시야의 데이터를 평균 내어 하나의 독립적인 데이터 포인트로 산출하였으며, 결과적으로 통계 분석을 위해 군당 n = 5회의 반복 실험 샘플 크기를 확보하였습니다. 점수 산정은 두 명의 맹검 관찰자가 수행하였습니다.
웨스턴 블롯 (Western blot, WB)
시료 준비를 위해, 마우스 폐 조직(약 30 mg)을 잘게 다진 후 1% protease/phosphatase inhibitor cocktail이 첨가된 사전 냉각된 RIPA lysis buffer 300 µL에서 균질화하였습니다. 균질화는 조직 균질기를 사용하여 60 Hz에서 4회 반복(사이클당 60 s) 수행하였습니다. 이후 용해물을 4 °C에서 약 13,400 × g 로 15분간 원심분리하여 상층액을 수집하였습니다. 총 단백질 농도는 표준 BCA protein assay kit를 통해 측정하였습니다. 시료를 정량화한 후, 5x loading buffer와 4:1 부피 비율로 혼합하고 95 °C에서 7분간 변성시켰습니다. SDS-PAGE를 위해 단백질 시료(레인당 20 µg)를 pre-stained protein molecular weight marker와 함께 로딩하였으며, 80 V의 정전압에서 20분간 분리한 후 120 V로 조정하여 70분간 더 분리하였습니다. 그 후 단백질을 얼음 수조 내에서 300 mA의 정전류로 120분간 0.22 µm PVDF 막으로 습식 전이(wet-transfer)하였습니다. 막을 TBST 내 5% BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹한 후, CGRP (1:500) 및 GAPDH (1:2000)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤(최대 18 h) 동안 배양하였습니다. TBST로 3회(각 10분) 세척한 후, horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체(1:10000)와 함께 상온에서 1~2시간 동안 배양하였습니다. 다시 3회 세척한 후, VILBER Fusion FX 이미징 시스템 내에서 enhanced chemiluminescent (ECL) 기질을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하였습니다. 밴드 강도는 ImageJ 1.8을 사용하여 정량화하였으며, 표적 단백질 발현량은 GAPDH 내부 대조군을 기준으로 정규화하였습니다.
통계 분석
모든 실험 데이터는 평균값으로 표시한다. ± 표준편차(SD). 데이터 분석 및 통계적 도식화는 전문 통계 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 집단 간 비교에 앞서, 데이터 세트에 대해 체계적으로 정규성 검정을 실시하였다. 분산이 균일하고 정규 분포를 따르는 데이터의 경우, 일반 일원 또는 이원 분산 분석(ANOVA)을 시행하였으며, 이후 다중 쌍별 비교를 위해 Tukey, Šídák, Holm-Šídák 또는 Fisher의 LSD 사후 검정을 수행하였다. 여러 실험군을 단일 대조군과 비교할 때는 Dunnett 검정을 적용하였다. 분산이 균일하지 않은 데이터 세트의 경우 Brown-Forsythe ANOVA를 사용하였으며, 이후 Dunnett's T3 사후 검정을 수행하였다. 정규성을 따르지 않는 데이터 세트의 경우 비모수 검정인 Kruskal-Wallis 검정을 사용하였으며, 이후 다중 비교를 위해 Dunn의 사후 검정을 수행하였다. P 값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 차이를 나타내는 기준으로 간주하였다. 서로 다른 유의 수준은 *로 동적으로 표시하였다.p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 및 ****p < 조직학적 점수 산정, 유세포 분석 및 이미지 정량화를 포함한 모든 실험 결과 평가는 엄격한 눈가림 방식으로 수행되었습니다.
결과
KAST는 폐 ILC2를 감소시키고 제2형 기도 염증을 완화한다
KAST의 치료 효과를 조사하기 위해 OVA 유도 AA 마우스 모델을 구축하고 폐수(BL13), 격수(BL17), 비수(BL20), 신수(BL23) 혈위에 패치를 부착하여 처치하였다(그림 1A). 모델링 후 AA 마우스는 체중이 감소한 반면, KAST 처치 마우스는 모델 그룹에 비해 체중이 유의하게 증가하였다(그림 1B). 폐 염증의 지표인 폐 계수는 AA 마우스에서 상승하였으나, KAST 처치 후 현저히 감소하였다(그림 1C). 행동 평가 결과, AA 마우스에서 코 긁기와 재채기가 증가하였으나 KAST에 의해 유의하게 완화되었다(그림 1D–E). 전신 플레티스모그래피(Whole-body plethysmography) 결과, 기도 과민반응의 지표인 Penh 수치가 AA 마우스에서 상승하였으나 처치 후 감소하여 폐 기능이 개선되었음을 시사하였다(그림 1F). HE 염색을 이용한 조직병리학적 분석 결과, 정상 대조군에 비해 모델 그룹에서 기관지 주변 및 폐포 주변의 염증 세포 침윤이 확인되었다. 반면, KAST 그룹에서는 염증 침윤이 감소하였다(그림 2A–B). 면역조직화학 염색 결과, IL-4, IL-5 및 IL-13은 주로 침윤된 염증 세포와 일부 상피 세포의 세포질에 국소화되어 있었으며, 간질 공간에 축적되었을 가능성이 보였다. 정상 대조군과 비교하여 모델 그룹은 양성 신호와 평균 광학 밀도 값이 현저히 증가하였으나, KAST 그룹에서는 유의하게 감소하였다(그림 2C–H). 유세포 분석 결과, AA 마우스의 폐에서 ILC2 수가 정상 대조군에 비해 유의하게 증가하였으나, KAST 처치 후 ILC2 수가 현저히 감소하였다(그림 2I–J).
KAST는 CGRP/RAMP1 축을 억제함으로써 제2형 기도 염증을 완화한다
ILC2의 과활성화는 여러 요인에 의해 조절됩니다. RNA-seq 분석 결과, AA 마우스에서 CGRP 발현이 유의하게 상향 조절되었으며, KAST는 폐의 CGRP 수치를 현저히 하향 조절했습니다(그림 3A). Western blot 및 ELISA를 통해 대조군에 비해 모델군에서 CGRP 단백질 수치가 상승했음을 확인하였으며, 이는 KAST에 의해 감소되었습니다(그림 3B–D). 이러한 결과는 KAST가 AA 폐에서의 CGRP 발현을 약화시켜 ILC2 면역 반응을 조절함을 시사합니다. 종합적으로, 고처리량 시퀀싱 및 단백질 스크리닝에서 나타난 이러한 변화는 KAST 치료적 개입과 AA 마우스의 폐 CGRP 수치 하향 조절 사이에 강한 연관성이 있음을 보여줍니다.
CGRP의 역할을 더욱 자세히 탐구하기 위해, AA 마우스에 외인성 CGRP, CGRP 수용체 길항제인 BIBN-4096, 또는 KAST와 CGRP 병용 투여를 처리하였습니다. ELISA 결과, KAST 및 BIBN-4096 투여군에서는 CGRP 단백질 수준이 유의하게 감소했고, CGRP 투여군에서는 수준이 상승했으며, KAST + CGRP 투여군은 KAST 단독 투여군에 비해 더 높은 수준을 보였습니다(그림 4A). 유세포 분석 결과, 모델군과 비교하여 KAST 및 BIBN-4096 투여군에서는 ILC2 수가 감소한 반면, CGRP 및 KAST + CGRP 투여군에서는 증가한 것으로 나타났습니다(그림 4B–C). HE 염색 결과, KAST 및 BIBN-4096 투여군에서는 기도와 폐포 주변의 염증 세포 침윤이 감소한 반면, CGRP 및 KAST + CGRP 투여군에서는 침윤이 악화되었습니다(그림 4D–E). 또한 ELISA를 통해 KAST 및 BIBN-4096 투여군에서는 IL-4, IL-5, IL-13 수준이 감소했지만, CGRP 및 KAST + CGRP 투여군에서는 수준이 증가했음을 확인하였습니다(그림 4F–H).
다색 면역형광 염색을 통해 서로 다른 그룹 간의 폐 RAMP1+ILC2 수를 평가하였습니다. 결과적으로, 정상 대조군과 비교하여 모델군의 폐 조직 내 총 RAMP1+ILC2 수가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 모델군과 비교했을 때, CGRP 군에서는 폐 RAMP1+ILC2 수가 더욱 유의하게 증가한 반면, BIBN-4096 군과 KAST 군에서는 두드러지게 감소하였습니다. 특히, KAST 군과 비교하여 KAST + CGRP 군은 폐 RAMP1+ILC2 수가 유의하게 상승하였으며, 이는 외생적 CGRP 보충이 총 RAMP1+ILC2 세포군에 대한 KAST의 억제 효과를 성공적으로 역전시켰음을 나타냅니다 (Figure 5A–B).
데이터 가용성:
본 연구 중에 생성 및 분석된 전체 raw 데이터 세트는 공개 액세스 저장소에 저장되었습니다. 구체적으로, 이러한 포괄적 자료에는 Western blot (WB) 분석을 위한 모든 전체 원본 멤브레인 스캔, 조직학(HE 및 IHC) 및 면역형광(IF) 분석을 위한 모든 전체 raw 고해상도 현미경 이미지, 그리고 개별 반복 실험 데이터 세트와 정량화 Excel 시트가 포함됩니다. 모든 raw 데이터는 다음의 영구 DOI에서 공개적으로 이용 가능합니다: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. 유세포 분석을 위한 게이팅 순서는 Supplementary Figure 1에 제공되어 있습니다. 두 개의 전체 블롯 이미지는 Supplementary Figures 2–3으로 제출되었으며, 정량적 데이터는 Supplementary Table 1에 제출되었습니다.
그림 1: AA 마우스의 증상 및 폐 기능에 미치는 KAST의 효과. (A) OVA를 이용한 알레르기성 천식 유도 프로토콜. (B) 각 그룹 마우스의 체중 통계, n = 5. (C) 각 그룹 마우스의 폐 계수, n = 5. (D) 마지막 자극 후 10분 이내의 비강 마찰 횟수, n = 5. (E) 마지막 자극 후 10분 이내의 재채기 빈도, n = 5. (F) 서로 다른 농도의 아세틸콜린 자극 후 각 그룹 마우스의 Penh 값, n = 5. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 통계적 비교는 one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 수행되었으며, 필요한 경우 사후 다중 비교 테스트를 실시함. n = 생물학적 반복 횟수. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: AA 마우스에서 KAST에 의한 ILC2 수 및 제2형 기도 염증의 조절. (A) HE 염색으로 확인한 폐의 형태학적 변화. 스케일 바 = 50 µm. 배율: 200×. 염증 점수는 눈가림법으로 평가되었다. (B) 그룹 간 염증 점수의 통계적 분석, n = 5. (C–H) 서로 다른 그룹의 폐 조직에서 IL-4 (C, D), IL-5 (E, F), 및 IL-13 (G, H) 단백질 발현의 대표 IHC 이미지 및 평균 광학 밀도 값, n = 5. 스케일 바 = 50 µm. 배율: 200×. (I) Normal, Model, KAST 그룹 전체에서 폐 ILC2의 최종 게이팅을 보여주는 대표 유세포 분석 플롯. 싱글렛 생존 세포를 CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19) 순으로 게이팅한 후, CD90.2+를 통해 게이팅하였으며, 최종적으로 KLRG1+의 양성 발현으로 폐 ILC2를 식별하였다. 데이터는 고성능 유세포 분석 플랫폼에서 획득하였으며 전용 유세포 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. (J) 생존 세포 중 CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ 세포의 백분율로 나타낸 ILC2 분석, n = 5. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 통계적 비교는 one-way ANOVA 후 적절한 사후 다중 비교 검정을 사용하여 수행되었다. n = 생물학적 반복 횟수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: KAST는 AA 마우스의 폐 조직에서 CGRP 발현을 억제한다. (A) 그룹 간 유전자 발현의 히트맵, n = 4. (B) 각 그룹의 폐 조직에서 CGRP (10 kDa) 및 GAPDH (37 kDa) 발현의 대표적인 WB 이미지. (C) 폐 조직 내 CGRP 단백질 발현의 WB 분석, 상대적 CGRP 발현(CGRP/GAPDH 비율)으로 표시, n = 3. (D) 폐 조직 내 CGRP 단백질 발현의 ELISA 분석, n = 4. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 통계적 비교는 one-way ANOVA 후 사후 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었다. n = 생물학적 반복 횟수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: AA 마우스의 CGRP를 통한 ILC2 수 및 제2형 기도 염증에 미치는 KAST의 영향. (A) 여러 군의 폐 조직 내 CGRP 단백질 발현에 대한 ELISA 분석, n = 4. (B) 각 군의 ILC2(CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺)에 대한 대표적인 유세포 분석 도표. (C) 생존 세포 중 CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ 세포의 백분율로 나타낸 ILC2 분석, n = 5. (D) HE 염색으로 확인한 폐의 형태학적 변화. 스케일 바 = 50 µm. 배율: 200×. (E) 여러 군 간의 염증 점수에 대한 통계 분석, n = 5. (F–H) 여러 군의 폐 조직 내 IL-4 (F), IL-5 (G), 및 IL-13 (H) 단백질 발현에 대한 ELISA 분석, n = 4. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 통계적 비교는 one-way ANOVA를 실시한 후 적절한 사후 다중 비교 검정을 사용하여 수행됨. n = 생물학적 반복 횟수. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: CGRP/RAMP1 경로를 통한 폐 조직 내 ILC2 수에 미치는 KAST의 영향. (A) 폐 조직의 400× 시야당 RAMP1⁺ ILC2(KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ 삼중 양성 세포로 정의됨) 세포 수, n = 5. (B) 폐 조직의 대표적인 형광 염색 이미지. 핵은 DAPI(청색)로 염색하였으며, KLRG1(자색), GATA3(적색) 및 RAMP1(녹색)에 대해 면역염색을 수행하였다. 스케일 바 = 50 µm. 정량화: 전문 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 눈가림 방식으로 RAMP1⁺ ILC2(KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ 세포)를 수동으로 계수하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 통계적 비교는 one-way ANOVA 후 사후 다중 비교 검정을 사용하여 수행되었다. n = 생물학적 반복 횟수. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 폐 ILC2 분리를 위한 순차적 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포 분석 도표. 먼저, 전방 산란광(FSC-A)과 측방 산란광(SSC-A)을 사용하여 전체 이벤트를 게이팅하였습니다. 단일 세포를 얻기 위해 FSC-A vs. FSC-H를 통해 더블릿(doublets)을 제외하였습니다. 사멸 세포 집단을 제거하기 위해 Ghost Dye Red 780⁻를 통해 생존 세포를 식별하였습니다. 이후 CD45⁺에서 백혈구를 게이팅한 다음, lineage-negative(Lin⁻) 세포를 선택하였습니다. CD45⁺ Lin⁻ 서브셋 내에서 세포를 CD90.2⁺로 추가 게이팅하였으며, 최종적으로 KLRG1의 양성 발현(KLRG1⁺)을 통해 폐 ILC2를 정의하였습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 마우스 폐 조직 샘플에서 얻은 내부 표준 물질 GAPDH (37 kDa)의 대표적인 Western blot 이미지. 이후 정규화를 위해 ImageJ 소프트웨어로 밴드 통합 광학 밀도를 정량화하였다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
부록 그림 3: 마우스 폐 조직 샘플에서 표적 단백질 CGRP (10 kDa)의 대표적인 Western blot 이미지. 상대적 CGRP 발현량은 CGRP 밴드의 통합 광학 밀도를 해당 GAPDH 통합 광학 밀도 값으로 나누어 계산하였다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 로우 데이터 값. 그래프 작성에 사용된 로우 데이터 값입니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
AA 치료는 장기적인 약물 사용과 관련된 부작용, 불완전한 증상 조절, 빈번한 재발 등의 몇 가지 한계에 직면해 있습니다. 전통적인 약물 요법은 효과적이지만, 스테로이드 의존성과 같은 부정적인 결과가 동반되는 경우가 많습니다26,27. 이와 대조적으로, KAST는 AA 관리를 위한 안전하고 경제적이며 편리한 대안을 제공합니다. 임상적 근거에 따르면 KAST는 폐 면역 기능을 조절함으로써 천식 증상을 효과적으로 완화할 수 있음이 밝혀졌습니다28. 본 연구에서 우리는 KAST가 CGRP/RAMP1 경로를 억제하고 ILC2의 수를 감소시킴으로써 AA 마우스의 제2형 기도 염증을 완화한다는 것을 추가로 입증하였습니다.
선천 면역, 특히 ILC2는 알레르기성 천식(AA)에서 제2형 기도 염증의 개시, 증폭 및 유지에 필수적인 역할을 합니다29. 알레르겐에 노출되면 ILC2는 상피세포 유래 알라민(alarmins)에 빠르게 반응하여 수 시간 내에 다량의 IL-5와 IL-13을 분비함으로써 제2형 염증 반응을 유발합니다30,31. 또한, ILC2는 Th2 분화와 IgE 합성을 촉진하여 적응 면역 반응을 더욱 증폭시키고 기도 염증을 악화시킵니다32. 연구에 따르면 AA 모델에서 ILC2의 유전적 결손은 기도 염증의 지속 시간을 유의하게 단축시키며, 이는 제2형 염증을 유지하는 데 있어 ILC2의 핵심적인 역할을 강조합니다18. ILC2는 사이토카인(예: IL-25, IL-33, TSLP), 염증 매개체(예: 류코트리엔) 및 뉴로펩타이드(예: CGRP, VIP, NMU)에 의해 조절됩니다33. 이 중 뉴로펩타이드는 선천 면역 조절에서 중추적인 역할을 합니다. Neuromedin U (NMU)는 ILC2 활성을 직접적으로 강화하여 IL-5 및 IL-13 방출을 빠르게 유도합니다34. Vasoactive intestinal peptide (VIP)는 영양 섭취 및 생체 리듬 조절에 기여하며, ILC2의 IL-5 생성을 촉진하고 호산구 항상성을 유지합니다33. CGRP는 ILC2로부터의 IL-5 방출을 현저히 증가시켜 AA의 기도 염증을 촉진합니다. 특히, CGRP의 수용체 하위 단위인 RAMP1은 다른 뉴로펩타이드 수용체에 비해 ILC2에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되며, 이는 CGRP가 ILC2 활성화에 가장 강력한 리간드임을 시사합니다35. 본 연구에서는 전사체 분석을 통해 CGRP가 AA 마우스에서 가장 차등적으로 발현되는 뉴로펩타이드 중 하나임을 확인하였으며, 단백질 수준의 분석을 통해 폐 조직에서의 상향 조절을 확인하였습니다. CGRP의 외인성 투여는 ILC2 수와 제2형 사이토카인 방출을 더욱 증가시켜 기도 염증을 악화시켰습니다.
기전적으로, CGRP는 ILC2의 RAMP1에 결합하여 하위 면역 반응을 조절합니다. 일부 기존 문헌에서는 CGRP를 과염증을 방지하기 위해 ILC2의 확장을 제한하는 음성 조절자로 정의하고 있으나20,21, 반대되는 증거들은 CGRP가 특정 병리적 미세환경 내에서 알라민(alarmin)과 협력하여 2군 선천 면역을 강력하게 유발할 수 있음을 나타냅니다. 본 실험의 종점은 특히 후자의 연쇄 반응과 일치하며, OVA 유도 알레르기 미세환경에서 CGRP에 의한 폐 ILC2 침윤의 상향 조절을 입증합니다. 반대로, 수용체 길항제인 BIBN-4096으로 CGRP 경로를 차단하면 ILC2 매개 기도 염증이 유의하게 완화됩니다. 본 연구 결과는 직접적인 유전자 결손 증거를 제시하는 대신, 연관 전사체 변이와 병행 약리학적 중재 실험(외인성 CGRP 및 길항제 BIBN-4096 사용)을 활용하여 KAST의 치료적 보호 효과가 ILC2의 CGRP/RAMP1 신호 전달 클러스터 억제와 밀접하게 상관되어 있음을 보여줍니다.
이러한 유망한 결과에도 불구하고, 몇 가지 내재적인 한계점을 인정해야 합니다. 첫째, OVA 유도 마우스 모델은 가치 있는 기전적 통찰을 제공하지만, 종 간의 차이로 인해 인간 알레르기성 천식의 복잡한 병태생리학적 및 면역학적 양상을 완전히 재현하지 못할 수 있습니다. 둘째, 일부 탐색적 분석에서 표본 크기가 상대적으로 작았기 때문에, 보다 광범위한 통계적 일반화를 달성하기 위해서는 더 큰 코호트가 필요합니다. 셋째, 본 연구는 주로 CGRP/RAMP1/ILC2 신호 전달 축을 우선적으로 다루었으며, 이는 잠재적으로 관련이 있는 다른 신경-면역 상호작용 경로와 중첩된 사이토카인 네트워크에 대해 향후 더 심도 있는 탐구가 필요함을 의미합니다. 특히 가장 중요한 기술적 한계는 약물이 포함되지 않은 패치나 비혈위 지점을 이용한 전용 가짜 혈위 부착(sham acupoint sticking) 대조군이 없었다는 점입니다. 결과적으로, 제모로 인한 기계적 스트레스, 실험적 처치, 패치 자체의 접착 자극과 같은 잠재적인 비특이적 혼란 변수를 KAST의 특이적 치료 특성과 완전히 분리하여 분석할 수 없었습니다. 이러한 주의 사항을 해결하기 위해, 향후 연구 파이프라인에서는 엄격하게 설계된 가짜 대조군과 다중 경로 검증을 철저히 통합하여 본 결과의 특이성과 재현성을 더욱 공고히 할 것입니다. BIBN-4096 처치 후 관찰된 CGRP 단백질 수준의 감소와 관련하여, BIBN-4096은 직접적인 CGRP 합성 억제제라기보다 주로 RAMP1/CRLR 수용체 복합체를 표적으로 하는 경쟁적 길항제로 작용하지만, 체내 투여 시 국소 리간드의 조직 축적을 하향 조절할 수 있다는 점을 명확히 하는 것이 중요합니다. 이러한 이차적 현상은 신경-면역 양성 피드백 루프의 차단을 통해 매개될 가능성이 큽니다. ILC2와 같은 표적 면역 세포의 RAMP1을 차단함으로써 BIBN-4096은 하위 이펙터 사이토카인의 방출을 억제하며, 이는 다시 감각 신경 말단과 폐 신경내분비 세포(PNECs)의 역행성 염증 활성화를 감소시켜 결과적으로 하위 CGRP 합성 및 조직 잔류를 간접적으로 약화시킵니다.
요약하자면, 본 연구의 실증적 결과는 KAST가 신경 CGRP/RAMP1 축을 표적으로 하여 폐의 선천 면역 미세환경을 효과적으로 재구성한다는 것을 보여줍니다. 설치류와 인간 사이의 생물학적 차이를 고려할 때 직접적인 임상 적용에는 신중한 최적화가 필요함을 인지하고 있으나, 이러한 종점들은 기존의 전통적인 방식을 입증하는, 이전까지 누락되었던 결정적인 기전적 토대를 제공합니다. "비외허피모" (폐피모합) 이론. 본 프로토콜은 정교한 신경-면역 관점을 제공함으로써, 알레르기성 천식 관리를 위한 전통 약침 요법의 향후 전향적, 다기관 임상 적용을 안내하고 지원할 신뢰할 수 있는 과학적 기초를 수립한다.
공개 사항
저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.
감사의 글
본 연구는 중국 국가자연과학재단(No. 82274632), 강쑤성 중의학 선도 인재 양성 프로젝트(No. SLJ0309), 강쑤성 자연과학재단(No. BK20231381), 강쑤성 중의학 과학기술 발전 계획 프로젝트(No. ZT202205) 및 난징 중의학대학교 교육부 침구 및 의학 연구 중점 실험실(No. AML202304)의 지원을 받아 수행되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3M 메디컬 통기성 테이프 | 3M, USA | 1530C | 패치 고정 |
| 아세틸콜린 클로라이드 | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | 기관지 유발 시험 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, USA | G2939BA | RNA 품질 및 무결성 평가 |
| Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | (맞춤 주문) | 면역형광법 (2차) |
| 수산화알루미늄 | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | 면역증강제 |
| 항-CGRP 항체 (토끼) | Abcam, UK | ab81887 | 웨스턴 블롯 / 면역형광법 |
| BALB/c 마우스 (암컷, SPF, 8주령)–10주, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | 제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다. | 동물 모델 |
| BB700 rat anti-mouse CD90.2 (clone 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | 유세포 분석법 |
| BD FACSCanto II 유세포 분석기 | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | 유세포 분석법 |
| BIBN-4096 (Olcegepant hydrochloride) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | CGRP 수용체 길항제 |
| 비오틴-계통 칵테일 | BD Biosciences, USA | (설명된 대로 맞춤 제작된 클론) | 유세포 분석법 |
| Brilliant Violet 605 Streptavidin | BD Biosciences, USA | 563260 | 유세포 분석법 |
| BSA 알부민 분획 V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), 독일 | 4240GR100 | 블로킹 |
| 칼시토닌/CALCA 단백질 | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | CGRP 중재 |
| CD11c/ITGAX 항체 (토끼) | Abmart, 중국 상하이 | MU115408S | 면역형광법 |
| 시트르산 항원 회복 완충액 | Boster, 중국 | AR0024 | 면역조직화학법 |
| DAPI 염색액 | Beyotime, 중국 상하이 | C1006 | 핵 염색 |
| ddH2O (2중 증류수) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | 단백질 재구성 및 분말 용해 |
| DESeq2 | Bioconductor (R 패키지) | 버전 1.42.0 | 차등 발현 분석 소프트웨어 |
| DNase I | Roche Diagnostics, 독일 | 10104159001 | 폐 조직 소화 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, UK | ab150106 | 면역형광법 (2차) |
| ECL 기질 (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, 중국 | – | 웨스턴 블롯 화학발광법 |
| 강화된 BCA 단백질 분석 키트 | Beyotime, 중국 상하이 | P0010 | 단백질 정량 분석 |
| 에오신 Y 염색액 | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | 조직학 (HE 염색) |
| 에탄올 (절대 에탄올, 분석 등급) | Sinopharm Chemical Reagent, 중국 | 10009218 | 조직 탈수 및 조직학 |
| F4/80 항체 (마우스, 클론 C-7) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | 면역형광법 |
| fastp | 오픈 소스 (GitHub) | 버전 0.23.4 | RNA-seq raw 데이터 품질 관리 소프트웨어 |
| FITC 항-마우스 CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | 유세포 분석법 |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | 유세포 분석 |
| GAPDH 단클론 항체 (마우스) | Proteintech, 중국 우한 | 60004-1-Ig | 웨스턴 블롯 |
| GATA3 항체 (마우스, 클론 L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | 면역형광법 |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | 사세포 배제 |
| 염소 항-토끼 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체 | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | 면역형광법 (2차) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | 통계 분석 |
| 헤마토실린 용액 (Harris) | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | 조직학 (HE 염색) |
| HISAT2 | 존스 홉킨스 대학교 (오픈 소스) | 버전 2.2.1 | RNA-seq 참조 게놈 정렬 소프트웨어 |
| HRP-접합 염소 항-마우스 IgG (H+L) | Proteintech, 중국 우한 | SA00001-1 | 웨스턴 블롯 (2차) |
| HRP-접합 염소 항-토끼 IgG (H+L) | Proteintech, 중국 우한 | SA00001-2 | 웨스턴 블롯 (2차 항체 반응) |
| HTSeq-count | EMBL (Python 유틸리티) | 버전 2.0.3 | RNA-seq 유전체 특징 리드 카운팅 유틸리티 |
| 과산화수소(H2O2, 3% 용액) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | 내인성 퍼옥시다아제 차단 |
| iFluor™ 488 결합 염소 항-토끼 IgG 항체 | Huabio, 중국 | HA1121 | 면역형광법 (2차) |
| IL-4 단클론 항체 | Proteintech, 중국 우한 | 66142-1-Ig | 웨스턴 블롯 |
| IL13 항체 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | 웨스턴 블롯 |
| IL5 항체 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | 웨스턴 블롯 |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina, USA | – | RNA 시퀀싱 |
| ImageJ | 미국 국립보건원(NIH) | 1.8 | 웨스턴 블롯 정량 분석 |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | 버전 6.0 | 이미지 광학 밀도 정량 분석 |
| KAST 한약 제제 | 난징중의약대학교 부속병원 약제부 | – | 중재 |
| KLRG1 단클론 항체 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | 면역형광법 |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, 독일 | 4.5 | 면역형광 정량 분석 |
| Leica STELLARIS 8 DIVE 공초점 현미경 | Leica Microsystems, Germany | STELLARIS 8 | 면역형광 이미징 |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Germany | 5401119001 | 폐 조직 소화 |
| 마커 (사전 염색 단백질 래더) | NCM Biotech, 중국 쑤저우 | P9001 | 웨스턴 블롯 |
| 마우스 CGRP ELISA 키트 | Aifang Biotechnology, 중국 후난성 | AF2491-A | 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA) |
| 마우스 IL-13 ELISA 키트 | Aifang Biotechnology, 중국 후난성 | AF-02456M1 | 효소결합면역흡착분석법 (ELISA) |
| 마우스 IL-4 ELISA 키트 | Aifang Biotechnology, 중국 후난성 | AF-02448M1 | 효소결합면역흡착측정법(ELISA) |
| 마우스 IL-5 ELISA 키트 | Aifang Biotechnology, 중국 후난성 | AF-11729M1 | 효소결합면역흡착측정법(ELISA) |
| 중성 발삼 봉입제 | Sinopharm Chemical Reagent, 중국 | 10014061 | 조직학 슬라이드 마운팅 |
| 정상 염소 혈청 (블로킹용) | Abcam, 영국 | ab7481 | 면역조직화학/면역형광 염색 블로킹 |
| OCT 포매제 | 사쿠라, 미국 | 4583 | 동결절편 임베딩 |
| 원스텝 PAGE 겔 신속 조제 키트 | Vazyme, 중국 난징 | E303-01 | SDS-PAGE 겔 제작 |
| 오발부민 (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | 감작/유발 |
| 파라포름알데히드 (PBS 내 4%) | Biosharp, 중국 | BL539A | 조직 고정 |
| PE anti-mouse/human KLRG1 (clone 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | 유세포 분석법 |
| 포스파타제 억제제 칵테일 (50×) | Beyotime, 중국 상하이 | P1092 | 단백질 추출 |
| Poly-L-lysine 용액 | Boster, 중국 | AR0003 | 조직학 슬라이드 코팅 |
| 단백질 분해효소 및 탈인산화효소 억제제 | NCM Biotech, 중국 쑤저우 | P002 | 단백질 추출 |
| PVDF 막 (0.22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | 웨스턴 블롯 |
| RAMP1 다클론 항체 (토끼) | Proteintech, 중국 우한 | 10327-1-AP | 면역형광법 |
| 적혈구(RBC) 용해 버퍼 | Beyotime, 중국 상하이 | C3702 | 유세포 분석 시료 준비 |
| RIPA 용해 버퍼 (강력) | Beyotime, 중국 상하이 | P0013B | 단백질 추출 |
| RPMI-1640 배지 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | 조직 세포 소화 기본제 |
| SuperKine™ 강화된 항퇴색 마운팅 매질 | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | 면역형광 염색 표본 제작 |
| Triton X-100 (계면활성제) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | 면역형광 투과화 |
| TRIzol 시약 | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | RNA 추출 |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq 라이브러리 제작 키트 | Vazyme, 중국 난징 | NR605-01 | RNA-seq 라이브러리 구축 |
| 전신 플레티스모그래피 시스템 | 중국 베이징 Guangyuanda | WBP-4 | 폐 기능 (Penh) |
| 자일렌 (분석 등급) | Sinopharm Chemical Reagent, 중국 | 10023418 | 탈파라핀화 및 투명화 |
참고문헌
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