급성 백혈병에서 측정 가능한 잔여 질환 평가를 위한 표준화된 다색 유세포검사 프로토콜

요약

이 프로토콜은 급성 백혈병에서 측정 가능한 잔여 질환 평가를 위한 표준화된 다색 유세포 검사 워크플로우를 설명하며, 통제된 표본 처리, 조화로운 채취 매개변수, 순차적 게이팅 전략, 분모 조정 해석을 통합하여 일상 임상 실험실에서 분석 재현성을 향상시킵니다.

초록

측정 가능한 잔존질환(MRD)은 급성 백혈병 관리에서 중요한 예후 지표입니다. 그러나 일상적인 다색 유세포계(MFC) 평가는 혈액 방출, 불일치한 획득 깊이, 주관적 해석 등 사전 분석 및 분석 변동성에 취약합니다. 본 글은 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL)과 급성 골수성 백혈병(AML)에서 일상적인 MRD 평가를 위한 표준화된 운영 워크플로우를 제시합니다. 프로토콜은 엄격한 검체 수용 기준과 통합 적혈 융합 평가를 포함하고, 골수 및 말초혈 검체에 대해 대량 적혈구 용해 방법을 사용합니다. 분석 표준화는 질병 특이적 2튜브, 8색 항체 패널, 최소 50만 건의 CD45 양성 이벤트가 필요한 조화 획득 표적, 고정된 순차적 게이팅 전략을 통해 이루어집니다. 또한, 워크플로우는 분모 조정 탐지 한계(LOD)와 정량화(LOQ)를 적용하여 객관적인 3단계 보고 시스템을 지원합니다. 197개의 임상 표본에 대한 검증 결과, 강한 반복성, 견고한 희석 선형성, 쌍으로 된 직교 분자 분석과의 높은 일치성이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 표준화된 MRD 모니터링을 위한 실용적인 틀을 제공합니다. 일상적인 임상 실험실에서 제어된 사전 분석 처리와 조화로운 분석 매개변수를 통합하여 표준화된 MRD 모니터링을 위해.

서론

형태학적 관해를 달성한 후에도 급성 백혈병 환자는 재발 위험을 정확히 평가하기 위해 측정 가능한 잔존질환(MRD)에 대한 지속적인 모니터링이 필요합니다. 기존의 형태학적 및 세포병리학적 검사는 저수준 잔류 백혈병 집단을 감지하는 데 필요한 민감도가 부족합니다. 따라서 MRD 평가는 급성 골수성 백혈병(AML)과 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 모두에서 질병 모니터링의 필수 요소가 되었습니다. 유럽 백혈병넷(European LeukemiaNet)의 최근 권고는 AML에서 신뢰할 수 있는 MRD 평가가 단순한 분석법 가용성보다는 기술적 표준화와 관측자 간 재현성에 의존한다고 강조합니다 ^1,2. B-ALL에서는 다색 유세포검사(MFC)가 안정적인 분자 표적이 없는 환자들에게 특히 중요합니다. 이전 연구들은 구조화된 항체 패널 설계를 이용한 표준화된 다색 유세포계 접근법이 재현 가능하고 민감한 잔류 질환 검출을 제공할 수 있음을 입증했습니다^. 유세포검사는 광범위한 적용 가능성, 빠른 처리 시간, 비용 효율성 덕분에 널리 사용됩니다. 분석의 성능은 표준화된 시료 준비, 채취 매개변수 및 데이터 해석에 크게 의존^합니다.

유세포계 MRD 평가에서 주요 기술적 과제 중 하나는 획득 깊이와 총 사건 수에 크게 영향을 받는 희귀 사건 검출입니다. 동일한 항체 패널이 분모 크기가 일정하지 않은 경우 분석 감도가 달라질 수 있습니다. 따라서 표준화는 항체 선택을 넘어 조화로운 표본 처리, 적혈구 대량 용해, 기기 보상, 획득 표적, 게이팅 전략을 요구합니다. 골수 표본에서 혈액 희출은 말초혈 오염이 인위적으로 남은 백혈병 부담을 인위적으로 줄일 수 있어 중요한 사전 분석 변수이기도 합니다 ^6,7. 또한, 저주파 사건 해석에는 표본별 채취 깊이에 기반한 명확한 보고 임계값이 필요합니다. 최근 연구들은 분모 조정 검출한계(LOD) 및 정량화(LOQ)가 유세포 MRD 해석의 일관성 향상에 매우 중요하다는 점을 강조^{했습니다.}

이 프로토콜의 전반적인 목표는 B-ALL 및 AML에서 일상적인 MFC 기반 MRD 평가를 위한 표준화된 워크플로우를 제공하는 것입니다. 프로토콜은 표본 수용 기준, 적혈 희출 평가, 질병 특이적 항체 패널 설계, 대량 용해 샘플 준비, 조화로운 채취 표적, 고정된 순차 게이팅 전략, 분모 조정 보고 기준을 하나의 운영 프레임워크로 통합합니다 ^9,10. 표준화된 사전 분석 및 분석 절차를 결합함으로써, 이 방법은 MRD 모니터링의 일상적인 임상 실험실 구현에 실용적이고 재현 가능한 접근법을 제공합니다. 그림 1은 이 연구에서 구현된 전반적인 표준화된 사전 분석 및 분석 워크플로우를 보여줍니다. 표 1은 검증 기간 동안 등록된 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 코호트 및 표체 특성을 요약하였으며, 이는 사전 유도 종료, 통합 및 전-HSCT 기간 동안 검증 기간 동안 적용된 것입니다.

그림 1: 일상적인 다색 유세포 MRD 평가를 위한 표준화된 워크플로우. (A) 사전 분석 워크플로우: 미리 정해진 모니터링 기간 동안 검체 선별 및 품질 평가를 보여주는 것. (B) 대량 적혈구 용해와 항체 염색부터 순차적 게이팅, 분모 조정 해석, 최종 MRD 보고를 거치는 분석 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 통합 환자 인구통계, 임상 표본 특성 및 일상적인 채취 지표. 이 단일 수정 표는 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 사례로 구성된 등록 코호트의 기초 임상 특징을 요약하며, 환자 수준 인구통계와 표본 수준 특성, 치료 모니터링 간격, 생존 가능성, 혈액 희출 점수, 획득 깊이, 분모 조정 가능한 잔여 질환 분류를 결합합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

인간 표본을 포함한 모든 절차는 기관 지침에 따라 수행되었으며, 네이장 제2인민병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: PXTS887192). 이 연구는 정기 진단 검사 후 얻은 식별이 해제된 잔여 임상 표본을 활용했습니다. 연구가 환자 치료, 치료 배정 또는 샘플 수집 절차에 영향을 미치지 않았기 때문에 사전 동의는 포기되었습니다. 프로토콜에 사용되는 화학물질, 시약 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 표본 수집 및 사전 분석 평가

1. 측정 가능한 잔존 질환(MRD) 평가를 위해 골수 흡인체를 선호하는 표본 유형으로 채취합니다. 골수 흡인이 임상적으로 금기이거나 선택된 감시 및 비교 분석 중에만 말초혈 검체를 사용하십시오.
2. 가능한 한 첫 번째 흡인 채취 시 골수 샘플을 채취하세요. 말초혈 오염과 저수준 잔존 질환 과소평가를 최소화하기 위해 후속 흡인혈 채취를 피하세요.
3. 채취 직후 이칼륨 에틸렌디아미네테트라아세트산(K2-EDTA) 또는 나트륨-헤파린 항응고제 튜브로 표본을 옮기십시오. 표본은 실온(18–25 °C)에서 보관 및 운송하며, 직사광선으로부터 보호하세요.
   주의: 표본은 냉장 보관하지 마세요.
4. 모든 표본은 채집 후 24시간 이내에 처리하세요. 안정성 연구를 위해서는 상온 보관 조건을 유지하면서 24시간 및 48시간 반복 분석을 위해 알리코트를 보관합니다.
5. 환자 식별자, 항응고제 종류, 검체 무결성 및 채취 시간을 확인하여 검체 수령 시점에 확인하세요. 광범위한 응고, 심한 용혈, 또는 뚜렷한 세포 퇴행을 보이는 시료를 거부합니다
6. 최종 해석 전에 골수 표본에서 혈액 융합 여부를 평가하세요. 말초혈 오염 추정을 위해 0.00에서 1.00 사이의 반정량적 혈액 희출 점수를 계산합니다.
7. 성숙한 림프구의 비율을 CD34 양성 전구, 미성숙 과립구, 성숙 림프구의 합으로 나누어 이 값을 결정하는데, 몫이 높을수록 희석 효과가 더 커집니다.
   참고: 다음 공식으로 점수를 계산합니다:
    
   점수가 높을수록 말초혈 오염이 더 심해졌음을 나타냅니다.
8. 혈액 희출 점수는 다음과 같이 분류합니다: <0.20, 허용; 0.20–0.39, 약간 헤모랴트; 그리고 ≥0.40은 상당히 혈액 조절이 되었다.
   참고: 충분한 분모 크기와 보존된 골수 전구체 구조가 확인되지 않는 한, 현저히 혈액 분량이 많은 표본에 대해 명확한 MRD 음성 해석을 부여하지 마십시오.

2. 질병 특이적 항체 패널 준비

1. B-ALL 및 AML 분석을 위한 표준화된 질환 특이적 2관, 8색 항체 패널을 준비합니다. 모든 튜브에서 고정된 백본 마커를 엄격히 준수하여 안정적인 인구 게이팅을 위해 패널 표준화를 달성합니다.
2. 해당 계통 항원에 대해 일관된 형광색 접합체를 사용하고, 제조사가 권장하는 적정 부피를 엄격히 준수하여 로트 간 형광 변동성을 최소화하세요.
3. 마커 조합, 플루오로크롬 할당, 항체 클론, 염색 부피, 획득 매개변수는 보충 표 1 을 참조하십시오.
4. B-ALL 평가를 위해서는 두 튜브에서 CD19, CD45, CD34, CD10, CD20을 골격 마커로 사용하여 전구체 집단과 성숙 패턴을 정의합니다. CD38, CD58, CD81을 튜브 1에 추가하세요.
5. 기저 평가에서 확립된 진단용 백혈병 관련 면역표현형에 따라 CD66c, CD123, CD73 또는 CD304를 튜브 2에 추가합니다.
6. AML 평가를 위해서는 두 튜브에서 CD45, CD34, CD117, CD13, CD33, HLA-DR을 백본 마커로 사용하여 모반포 및 미성숙 골수계 집단을 정의합니다.
7. CD7과 CD56을 튜브 1에 추가하여 교차 계통 항원 발현을 평가합니다. CD11b와 CD15를 2번 튜브에 추가하여 골수성 성숙 이상을 평가합니다.

3. 벌크 분해 준비 및 염색

1. 잘 혼합된 골수 또는 말초혈 샘플 2.0 mL를 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다. 시료 부피가 제한되어 있다면 최소 입력 부피를 1.0 mL로 설정하세요.
2. 예열된 염화암모늄 용해 완충제 10mL를 시료에 추가합니다. 현탁액을 상온에서 10분간 인큐베이팅하여 적혈구를 용해합니다.
3. 시료를 500 × g 에서 5분간 원심분리합니다. 상정액은 핵화된 세포 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 버리세요.
4. 펠릿을 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)과 2 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)이 포함된 인산 완충 생리식염수(PBS) 2mL에 재현탁합니다. 잔여 헤모글로빈 오염이 여전히 보이면 세척 단계를 한 번 반복하세요.
5. 자동 혈액학 분석기나 수동 혈구계 계수(트리판 블루 배제)를 사용하여 핵 세포 농도를 측정합니다. 표준 획득을 위한 최소 핵 세포 농도를 5 ×^{10 6} cells/mL로 고려하라.
   참고: 세포 수율이 이 임계값 이하로 떨어지면 5분간 500 × g 에서 추가 원심분리를 하여 시료를 농축하고, 세포 밀도를 극대화하기 위해 부유 완충 부피를 조심스럽게 줄이세요.
6. 일상적인 염색을 위해 튜브당 5개 × 10^{개 6개의} 핵 세포를 할당합니다. 고감도 분석을 위해 샘플 회수가^{허용되는 경우 입력} 투입량을 최대 1× 10^{7 셀로} 늘^{려야 합니다}.
7. 검증된 염색 패널 구성에 따라 개별 조절된 항체 혼합물과 재료표에 명시된 고정 가능한 생존성 염료를 각 튜브에 추가합니다. 검증된 일상 패널은 제조사가 권장하는 용량 조절이 다른 항체 특이적 부피를 나타내지 않는 한 플루오로크롬 결합 항체당 5 μL을 사용합니다.
8. 최적의 항체-항원 화학양론을 유지하기 위해 최종 염색 반응량을 100 μL로 엄격히 유지해야 합니다. 표본을 어두운 실온에서 15분간 부화시킵니다.
9. 염색된 세포를 워시 버퍼로 한 번 세척한 후 최종 펠릿을 500 μL 획득 버퍼에 재현탁합니다.
10. 표본 채취 당일에 보상 비즈를 사용한 단일 염색 보상 방제제를 준비하세요.

4. 기기 설정 및 데이터 수집

1. 환자 검체를 수집하기 전에 플로우 사이토미터의 매일 시작 품질 관리를 수행하세요. 제조사의 지침에 따라 보정 비드를 사용해 유체학, 레이저 정렬, 검출기 성능, 형광 타겟값을 검증하세요.
2. 항체 패널에 포함된 동일한 형광색소를 사용하여 단일 염색 보상 대조군을 준비합니다. 환자 획득 전에 보상 매트릭스를 조정하고, 백본 마커가 미리 정해진 형광 표적 범위 내에 있는지 확인하세요.
3. 검증 기간 동안 분석된 모든 표본에 대해 동일한 획득 템플릿, 검출기 설정, 보상 전략, 게이팅 계층 구조를 사용하세요.
   참고: 특수 보정 비즈를 사용하여 모든 검출기의 표준화된 표적 중앙 형광 강도 값을 설정하여 기기 간 적절한 조화를 보장하고, 임상 데이터 수집 전에 동일한 샘플이 플랫폼 간 유사 형광 프로파일을 산출하는지 확인합니다.
4. 동시 현상을 줄이고 희귀 사건 탐지 정확도를 유지하기 위해 저에서 중간 정도의 유량으로 데이터를 수집합니다. 획득 중에도 사건 발생률을 지속적으로 모니터링하세요.
5. 각 보고된 MRD 결과에 대해 최소 500,000건의 CD45 양성 핵 사건을 확보하세요. 표본의 품질과 사건 안정성이 허용되면, 특히 저수준 잔존 병이 의심될 경우 총 100만에서 150만 건의 사건까지 채취를 확대합니다.
6. 유체 불안정, 시료 막힘, 급격한 사건 발생률 변화, 산란 품질의 눈에 띄는 악화가 발생하면 획득을 일시정지하거나 중단하세요. 적절할 경우 시료를 재여과하거나 재혼합하고, 안정적인 흐름이 회복된 후에만 샘플을 다시 채취합니다.

5. 순차적 게이팅 및 분모 조정 해석

1. 검증된 유세포분석 소프트웨어를 사용하여 유세포측 데이터를 분석하세요. 모든 시료에 동일한 순차적 게이팅 전략을 사용하여 연산자 간 변동성을 줄이십시오.
2. 정상 또는 재생 중인 골수 표본 최소 20개를 독립적으로 수집 및 분석하여 정상 및 재생 성숙 패턴을 설정하여 기준선 발현 템플릿으로 활용합니다.
3. 전방 산란과 측면 산란 매개변수를 사용하여 잔해를 배제합니다. 전방 산란 면적 대 전방 산란 높이 게이팅을 적용하여 단일 셀을 분리합니다.
4. 재료 표에 나열된 생존 염료 게이트를 사용하여 생존 불가능한 세포를 제외합니다. 비생존 세포는 비특이적 항체 결합을 보이고 배경 소음을 인위적으로 증가시키거나 희귀한 이상 개체군을 모방할 수 있으므로 일상적으로 제거해야 합니다.
   참고: 최적의 하위 분석을 위해 최소 생존 임계값을 75%로 요구하며, 이 값 이하로 떨어지는 표본은 희귀 사건 유물에 대해 신중한 해석이 필요함을 명시합니다. 적절한 측면 산란 특성을 가진 생존 가능한 CD45 양성 이벤트에 게이트하여 백혈구 분모를 정의합니다.
5. B-ALL 표본의 경우, 분석은 CD19 양성 전구체 구획으로 제한합니다. 항CD19 표적 치료를 받는 환자를 위한 대체 게이팅 프레임워크를 도입하세요.
6. CD19 발현과 독립적으로 백혈병 집단을 포착하기 위해 1차 평가를 CD22, CD24, CD34 양성 구획으로 전환합니다. CD34, CD10, CD20의 성숙 패턴을 평가하고 CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123, CD73 또는 CD304 발현 패턴을 사용하여 이상 개체군을 식별합니다.
7. AML 시료의 경우, CD45, 측면 산란, CD34, CD117 발현을 사용하여 폭발 또는 전구체 영역을 정의합니다.
8. CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b, CD15 등 골수계 및 교차 계통 마커의 비정상 또는 비동기 발현을 평가합니다.
9. 획득 가능한 생존 가능한 CD45 양성 사건의 총 수를 분모로 사용하여 검체 특이적 검출 한계(LOD)와 정량 한계(LOQ)를 계산합니다:
    
    
10. 최종 MRD 해석을 세 가지 범주 중 하나로 분류합니다: MRD 양성, LOD 이하, 또는 분석적으로 제한적.
    1. 명확하고 연속적인 이상 사건 군집이 표본 특이적 LOD를 초과하고, 정상 또는 재생 중인 조혈 집단과 구별되는 내부 일관된 면역표현형을 보일 때, 결과를 MRD 양성으로 분류합니다.
       참고: 산재적이고 군집이 아닌 사건을 MRD 양성으로 분류하지 마십시오. 기초 진단 샘플에서 추적한 백혈병 관련 면역표현형(LAIP)과 정상과 다른 패턴 인식(DfN) 패턴 인식 전략을 결합한 통합 분석 접근법을 활용합니다.
    2. 드물게 의심스러운 사건이 존재하지만 표본 특이적 보고 기준에 미치지 못할 경우, 결과를 LOD 이하로 할당합니다.
    3. 분모 크기가 부족하거나, 적혈 희석이 심하거나, 시료 품질이 낮거나, 사전 분석 또는 분석적 한계로 인해 확신 있는 부정적 해석이 어려울 경우 결과를 분석적으로 제한된 것으로 할당합니다.
11. 두 번째 자격을 갖춘 분석가가 독립적으로 모든 MRD 양성 및 경계 저경 사례를 검토하세요.
12. 정량적 중합효소 연쇄반응 또는 차세대 시퀀싱 결과를 포함한 쌍 분자 비교기 데이터를 검토하기 전에 유세포분석 해석을 최종 확정하세요.

6. 분석 검증 방법론

1. 동일한 용해 후 세포 현탁액에서 복제된 알리코트를 준비하여 분석 반복성을 평가합니다. 최소 30개의 짝을 독립적으로 수집하여 분석하세요.
2. 기대되는 저부하 범위 내에서 6개 수준에 걸쳐 연속 희석을 준비하여 희석 선형성을 평가합니다. 희석 시리즈 전반에 걸친 관측된 MRD 값과 예상 MRD 값을 비교합니다.
3. 여러 자격을 갖춘 운영자와 조화로운 유세포계에 걸친 참조 시료를 분석하여 운영자 간 및 기기 간 재현성을 평가합니다.
4. 통계적 비교 전에 log10 변환을 사용하여 형질전환 유세포계 및 쌍 분자 MRD 백분율을 변환합니다. 상관분석과 블랜드-알트만 분석을 사용하여 정량적 일치를 평가합니다.

결과

일상 구현 데이터셋의 특성

연구 기간 동안 197개의 연속 표본이 자격 심사 및 사전 분석 품질 평가를 통과하여 보고 대상 작업 흐름에 진입했습니다. 연구 코호트에는 98명의 환자가 포함되었으며, 이 중 62명(63.3%)은 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 36명(36.7%)은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자였습니다. 코호트는 남성 64명(65.3%)과 여성 34명(34.7%)으로 구성되었으며, 중위 연령은 32세(4분위 범위[IQR], 13–49세; 범위 2–73세)였습니다. 중간 기준 폭발 비율은 67.2%(IQR, 56.9% – 80.2%)였습니다.

분석 대상 표본 대부분은 골수 흡인(174/197, 88.3%)이었고, 말초혈액 표본은 23/197(11.7%)을 차지했습니다. 미리 정해진 모니터링 간격에 따르면, 유도 치료 종료 시에는 86점(43.7%), 통합 치료 중 65점(33.0%), 조혈 줄기세포 이식(HSCT) 전 46점(23.4%)이 채취되었습니다(표 1).

표본 중앙값 생존율은 88.3%(IQR, 84.4% – 92.6%)였습니다. 데이터 정제 전 수집 워크플로우는 총 이벤트 중앙값 1,116,901건(IQR, 908,521–1,258,946)을 기록했습니다. 잔해, 동시 중복선, 비생존 세포의 순차적 분석 배제 후, 게이팅 전략은 중앙값 907,325건의 단일 CD45 양성 표적 이벤트(IQR, 690,112–1,095,836)를 달성했으며, 중앙값 획득 시간은 11.9분이었습니다. 중앙값 혈구 희출 점수는 0.20(IQR 0.14–0.28)이었습니다. 분모 조정 해석에 따르면, 41점(20.8%)이 MRD 양성으로 분류되었고, 156점(79.2%)은 표본별 검출 한계(LOD) 이하로 분류되었습니다(표 1).

분석적 검증: 반복성, 선형성, 안정성

표준화된 워크플로우의 분석 성능은 반복성, 희석 선형성, 단기 안정성 연구를 통해 평가되었습니다(그림 2). 동일한 대량 분해 표본에서 제조한 중복 알리코트는 중위 중복 변동 계수(CV)가 0.101%, 95백분위수 CV가 0.222%로 강한 반복성을 보였습니다.

그림 2: 표준화된 다색 유세포검사 MRD 워크플로우의 분석 검증. (A) 분석된 샘플 간 표본 생존 가능성 분포. (B) 로그 해석 시 연속 희석 실험에서 기대 MRD 값과 관찰된 MRD 값 간의 상관관계. (C) 반복성 평가 중 독립 복제 분석 간의 일치. (D) 0시간, 24시간, 48시간 동안 상온 저장 후 MRD 측정의 안정성. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

저수준 검출 행동을 평가하기 위해, 예상되는 낮은 MRD 범위 전역에서 총 72건의 관측값으로 구성된 12개의 연속 희석 실험을 분석하였다. 관측된 MRD 값은 로그 해석에서 기대값과 강한 일치를 보였으며(r = 0.999, 조정 R² = 0.998, 기울기 = 1.009, 인터셉트 = 0.018), 이는 저주파 사건 범위 전반에 걸쳐 선형성이 보존됨을 나타냅니다.

단기 안정성 시험에서는 시간이 지남에 따라 표본 생존력이 점진적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 중앙값 생존율은 0시간의 89.1%에서 24시간의 84.9%, 48시간의 80.6%로 감소했습니다. 반면, MRD 부담의 중간 절대 상대적 변화는 24시간(6.2%)과 48시간(12.0%)에서 제한적이어서 수집 후 24시간 이내에 일상적인 처리가 가능함을 보였습니다.

운영자 간 및 기기 간 재현성

여러 운영자와 조화로운 유세포계에 걸쳐 분석된 24개의 참조 시료를 사용하여 운영자 간 및 기기 간 재현성을 평가하여 총 96건의 평가를 생성하였습니다. 기준값과의 절대 중간 상대 편차는 13.7%였습니다. 이 결과들은 표본 준비, 채취 환경, 순차적 게이팅 전략의 표준화 이후 일관된 분석 성과를 보여줍니다(표 2).

표 2: 표준화된 측정 가능한 잔존 질환 워크플로우에 대한 분석 검증 및 방법-비교 성과 지표. 이 표는 분석 내 반복성, 희석 선형성, 단기 안정성, 운영자 간 및 기기 간 재현성, 직교 분자 방법 비교 지표 등 검증 결과에 한정되어 있습니다; 표 1에 보고된 환자 인구 통계나 표본 특성과 중복되지 않습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

임상 적용 및 직교 방법 비교

117개의 쌍 표본을 사용하여 직교 비교가 수행되었으며, 이 중 75개는 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)으로 분석되었고, 42개는 차세대 시퀀싱(NGS)으로 분석되었습니다. qPCR 평가는 주로 진단 시점에 설정된 질환 특이적 융합 전사체인 BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1, PML::RARA 등을 모니터링했습니다. NGS 접근법은 림프구성 백혈병의 클론 면역글로불린 또는 T세포 수용체 유전자 재배열을 평가하고, 급성 골수성 백혈병의 경우 표적 골수계 패널을 이용해 재발성 체세포 돌연변이를 추적하였습니다. 유동 세포 MRD 값은 측정 가능한 질병 수준 전반에 걸쳐 쌍 분자 결과와 강한 상관관계를 보였으며(로그 분석 시 r = 0.893).

Bland-Altman 분석은 평균 로그 차이가 −0.093이며, 일치 한계는 −0.848에서 0.663까지 범위를 보여주었습니다(그림 3). 불일치 사례 중 25개의 분자 양성 표본 중 1건의 위음성 결과가 확인되었습니다. 워크플로우는 78.1%의 긍정적 동의율, 97.6%의 부정적 동의율, 그리고 92.3%의 전체 일치율을 보여주었습니다.

그림 3: 표준화된 MRD 평가의 임상 적용 및 정교 검증. (A) MRD 양성 사례의 질병군 및 모니터링 간격 분포. (B) 로그 분석에서 유세포 MRD 값과 쌍 분자 비교기 결과 간의 상관관계. (C) 블랜드-알트만 분석을 통해 플로우 사이토메트와 쌍 분자 MRD 측정을 비교하며, 수평선은 평균 편향과 분석 범위 전반에 걸친 95% 일치 한계를 나타냅니다. (D) MRD 양성 결과의 치료 모니터링 간격 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

이 결과들은 표준화된 다색 유세포검사 워크플로우가 일상 임상 표본에서 직교 분자 MRD 분석과 강한 일치를 이루었음을 보여줍니다.

보충 표 1: 표준화된 다색 유세포 측정 잔여 질환 워크플로우의 포괄적인 운영 매개변수. 이 통합 표는 필수적인 방법론적 구성 요소를 구분하여 별도의 섹션으로 나눕니다. A 섹션에서는 CD73 또는 CD304 선택이 기저 진단 백혈병 관련 면역표현형을 기반으로 하는 질환 특이적 항체 패널 구성을 상세히 설명합니다. B 섹션은 표준화된 사전 분석 시체 처리 및 유세포 채취 목표를 개괄합니다. C조는 분모 조정 보고 기준과 최종 해석 기준을 정의합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구의 주요 목적은 급성 백혈병에서 측정 가능한 잔존질환(MRD)의 다색 유세포측정 평가를 위한 표준화된 워크플로우를 확립하는 것이었습니다. 신뢰할 수 있는 MRD 평가는 항체 패널 선택뿐만 아니라 일관된 표본 취급, 획득 매개변수, 데이터 해석에도 의존합니다¹¹. 본 연구 결과는 조화로운 표본 처리, 통제된 채취 깊이, 분모 조정 보고 기준이 일상적인 임상 실험실 환경에서 분석 재현성을 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 이 결과는 다양한 기관과 운영자 간에 플로우 사이토메트메트릭 MRD 평가를 표준화하려는 최근 노력과 일치합니다¹².

이 작업 흐름의 중요한 구성 요소는 염화암모늄 기반의 벌크 적혈구 용해 절차입니다. 희귀 사건 MRD 검출은 충분한 분석 민감도를 달성하기 위해 큰 세포 분모를 확보해야 합니다. 표준화된 대량 분해 준비는 충분한 핵화된 세포 수를 일관되게 회수할 수 있게 했으며, 획득 사건은 100만에서 150만 건을 자주 초과했으며, 동시에 적절한 표본 생존 가능성을 유지했습니다. EuroFlow 컨소시엄의 이전 연구들도 민감하고 재현 가능한 MRD 탐지를 지원하기 위해 고현수 획득이 필요하다고 강조했습니다¹³. 분석 민감도가 낮은 표본의 경우, 문제 해결에는 표본 부피, 세포 회복, 채취 깊이 평가가 포함되어야 합니다.

이 프로토콜에는 저수준 MRD 음성 결과를 해석하기 전에 정기적인 혈액 방출 평가도 포함됩니다. 혈액 융합은 골수 기반 MRD 검사에서 주요 사전 분석 한계로 남아 있는데, 말초 혈액 오염이 인위적으로 백혈병 부담을 감소시킬 수 있기 때문입니다. 반정량적 혈액 방출 점수를 보고 워크플로우에 직접 포함시키는 것은 오해를 방지하는 추가적인 안전장치를 제공합니다. 이전 연구들은 급성 골수성 백혈병에서 혈구 융합이 유동 구세포 MRD 분석의 신뢰성에 유의미한 영향을 미친다고 보고했습니다⁷. 따라서 상당한 혈액 희출(≥0.40)을 보이는 표본은 특히 획득 깊이나 골수 전구체 보존이 불충분한 경우 신중하게 해석해야 합니다.

본 연구에서 수행된 직교 비교는 유세포 측정법과 분자 MRD 평가법 간에 강한 전반적 일치를 보여주었습니다. 그러나 이러한 불일치 사례들은 유세포분석과 분자 분석이 잔류 질환의 뚜렷한 생물학적 측면을 평가한다는 점을 강조합니다. 이전 연구들은 표현형 변화, 클론 진화, 재생 조혈이 분석 플랫폼 간 불일치에 기여할 수 있음을 보여주었다¹⁴. B-ALL에서는 잔여 백혈병 전구체와 정상 혈종 질환을 구분하는 것이 질병 부담이 낮을 때 특히 어렵으며, 고립된 항원 이상보다는 다차원 면역표현형 패턴의 통합적 해석이 필요하다¹⁵. 이 때문에 이 워크플로우에서 모든 경계선 및 저수준 MRD 사례는 두 번째 분석가에 의해 독립적으로 검토되었습니다.

이 연구에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 검증은 제한된 수의 화성 악기를 사용하여 단일 기관에서 수행되었습니다. 둘째, 말초혈 표본은 대부분의 급성 백혈병 환경에서 골수를 대체할 수 없기 때문에 선택된 임상 상황에서만 포함되었습니다. 또한, 표준화된 워크플로우에도 불구하고 혈액 박출 점수 및 저수준 사건 해석 등 일부 분석 매개변수는 여전히 숙련된 운영자의 검토가 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 표준화된 다색 유세포계 MRD 평가의 일상적인 임상 구현을 위한 실질적인 틀을 제공합니다^16,17. 사전 분석 품질 평가, 조화로운 획득 전략, 분모 조정 해석 기준을 통합함으로써, 이 워크플로우는 일상 실험실 진료 전반에 걸쳐 보다 재현 가능하고 임상적으로 일관된 MRD 보고를 지원합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acquisition buffer	Laboratory-prepared	PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µL	Final resuspension before flow cytometric acquisition
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Aberrant blast-associated phenotyping
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Cross-lineage aberrancy detection
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation-discordance assessment
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Different-from-normal myeloid pattern assessment
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
Ammonium chloride-based red blood cell lysis buffer	Laboratory-prepared / commercial supplier	Ammonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperature	Bulk red blood cell lysis
Analysis software	Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Kaluza 2.1	Data analysis and sequential gating
Automated hematology analyzer	Commercial supplier	Automated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessment	Nucleated cell concentration and viability assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Precursor B-cell definition
B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	B-lineage identification and entry into precursor compartment
B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation pattern assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs