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방법 논문

급성 백혈병에서 측정 가능한 잔여 질환 평가를 위한 표준화된 다색 유세포검사 프로토콜

143 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71756

⸱

2026년 8월 7일

1Department of Clinical Laboratory, The Second People's Hospital of Neijiang

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 급성 백혈병에서 측정 가능한 잔여 질환 평가를 위한 표준화된 다색 유세포 검사 워크플로우를 설명하며, 통제된 표본 처리, 조화로운 채취 매개변수, 순차적 게이팅 전략, 분모 조정 해석을 통합하여 일상 임상 실험실에서 분석 재현성을 향상시킵니다.

초록

측정 가능한 잔존질환(MRD)은 급성 백혈병 관리에서 중요한 예후 지표입니다. 그러나 일상적인 다색 유세포계(MFC) 평가는 혈액 방출, 불일치한 획득 깊이, 주관적 해석 등 사전 분석 및 분석 변동성에 취약합니다. 본 글은 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL)과 급성 골수성 백혈병(AML)에서 일상적인 MRD 평가를 위한 표준화된 운영 워크플로우를 제시합니다. 프로토콜은 엄격한 검체 수용 기준과 통합 적혈 융합 평가를 포함하고, 골수 및 말초혈 검체에 대해 대량 적혈구 용해 방법을 사용합니다. 분석 표준화는 질병 특이적 2튜브, 8색 항체 패널, 최소 50만 건의 CD45 양성 이벤트가 필요한 조화 획득 표적, 고정된 순차적 게이팅 전략을 통해 이루어집니다. 또한, 워크플로우는 분모 조정 탐지 한계(LOD)와 정량화(LOQ)를 적용하여 객관적인 3단계 보고 시스템을 지원합니다. 197개의 임상 표본에 대한 검증 결과, 강한 반복성, 견고한 희석 선형성, 쌍으로 된 직교 분자 분석과의 높은 일치성이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 표준화된 MRD 모니터링을 위한 실용적인 틀을 제공합니다. 일상적인 임상 실험실에서 제어된 사전 분석 처리와 조화로운 분석 매개변수를 통합하여 표준화된 MRD 모니터링을 위해.

서론

형태학적 관해를 달성한 후에도 급성 백혈병 환자는 재발 위험을 정확히 평가하기 위해 측정 가능한 잔존질환(MRD)에 대한 지속적인 모니터링이 필요합니다. 기존의 형태학적 및 세포병리학적 검사는 저수준 잔류 백혈병 집단을 감지하는 데 필요한 민감도가 부족합니다. 따라서 MRD 평가는 급성 골수성 백혈병(AML)과 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 모두에서 질병 모니터링의 필수 요소가 되었습니다. 유럽 백혈병넷(European LeukemiaNet)의 최근 권고는 AML에서 신뢰할 수 있는 MRD 평가가 단순한 분석법 가용성보다는 기술적 표준화와 관측자 간 재현성에 의존한다고 강조합니다 1,2. B-ALL에서는 다색 유세포검사(MFC)가 안정적인 분자 표적이 없는 환자들에게 특히 중요합니다. 이전 연구들은 구조화된 항체 패널 설계를 이용한 표준화된 다색 유세포계 접근법이 재현 가능하고 민감한 잔류 질환 검출을 제공할 수 있음을 입증했습니다. 유세포검사는 광범위한 적용 가능성, 빠른 처리 시간, 비용 효율성 덕분에 널리 사용됩니다. 분석의 성능은 표준화된 시료 준비, 채취 매개변수 및 데이터 해석에 크게 의존합니다.

유세포계 MRD 평가에서 주요 기술적 과제 중 하나는 획득 깊이와 총 사건 수에 크게 영향을 받는 희귀 사건 검출입니다. 동일한 항체 패널이 분모 크기가 일정하지 않은 경우 분석 감도가 달라질 수 있습니다. 따라서 표준화는 항체 선택을 넘어 조화로운 표본 처리, 적혈구 대량 용해, 기기 보상, 획득 표적, 게이팅 전략을 요구합니다. 골수 표본에서 혈액 희출은 말초혈 오염이 인위적으로 남은 백혈병 부담을 인위적으로 줄일 수 있어 중요한 사전 분석 변수이기도 합니다 6,7. 또한, 저주파 사건 해석에는 표본별 채취 깊이에 기반한 명확한 보고 임계값이 필요합니다. 최근 연구들은 분모 조정 검출한계(LOD) 및 정량화(LOQ)가 유세포 MRD 해석의 일관성 향상에 매우 중요하다는 점을 강조했습니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 B-ALL 및 AML에서 일상적인 MFC 기반 MRD 평가를 위한 표준화된 워크플로우를 제공하는 것입니다. 프로토콜은 표본 수용 기준, 적혈 희출 평가, 질병 특이적 항체 패널 설계, 대량 용해 샘플 준비, 조화로운 채취 표적, 고정된 순차 게이팅 전략, 분모 조정 보고 기준을 하나의 운영 프레임워크로 통합합니다 9,10. 표준화된 사전 분석 및 분석 절차를 결합함으로써, 이 방법은 MRD 모니터링의 일상적인 임상 실험실 구현에 실용적이고 재현 가능한 접근법을 제공합니다. 그림 1은 이 연구에서 구현된 전반적인 표준화된 사전 분석 및 분석 워크플로우를 보여줍니다. 표 1은 검증 기간 동안 등록된 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 코호트 및 표체 특성을 요약하였으며, 이는 사전 유도 종료, 통합 및 전-HSCT 기간 동안 검증 기간 동안 적용된 것입니다.

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그림 1: 일상적인 다색 유세포 MRD 평가를 위한 표준화된 워크플로우. (A) 사전 분석 워크플로우: 미리 정해진 모니터링 기간 동안 검체 선별 및 품질 평가를 보여주는 것. (B) 대량 적혈구 용해와 항체 염색부터 순차적 게이팅, 분모 조정 해석, 최종 MRD 보고를 거치는 분석 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 통합 환자 인구통계, 임상 표본 특성 및 일상적인 채취 지표. 이 단일 수정 표는 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 사례로 구성된 등록 코호트의 기초 임상 특징을 요약하며, 환자 수준 인구통계와 표본 수준 특성, 치료 모니터링 간격, 생존 가능성, 혈액 희출 점수, 획득 깊이, 분모 조정 가능한 잔여 질환 분류를 결합합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

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프로토콜

인간 표본을 포함한 모든 절차는 기관 지침에 따라 수행되었으며, 네이장 제2인민병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: PXTS887192). 이 연구는 정기 진단 검사 후 얻은 식별이 해제된 잔여 임상 표본을 활용했습니다. 연구가 환자 치료, 치료 배정 또는 샘플 수집 절차에 영향을 미치지 않았기 때문에 사전 동의는 포기되었습니다. 프로토콜에 사용되는 화학물질, 시약 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 표본 수집 및 사전 분석 평가

  1. 측정 가능한 잔존 질환(MRD) 평가를 위해 골수 흡인체를 선호하는 표본 유형으로 채취합니다. 골수 흡인이 임상적으로 금기이거나 선택된 감시 및 비교 분석 중에만 말초혈 검체를 사용하십시오.
  2. 가능한 한 첫 번째 흡인 채취 시 골수 샘플을 채취하세요. 말초혈 오염과 저수준 잔존 질환 과소평가를 최소화하기 위해 후속 흡인혈 채취를 피하세요.
  3. 채취 직후 이칼륨 에틸렌디아미네테트라아세트산(K2-EDTA) 또는 나트륨-헤파린 항응고제 튜브로 표본을 옮기십시오. 표본은 실온(18–25 °C)에서 보관 및 운송하며, 직사광선으로부터 보호하세요.
    주의: 표본은 냉장 보관하지 마세요.
  4. 모든 표본은 채집 후 24시간 이내에 처리하세요. 안정성 연구를 위해서는 상온 보관 조건을 유지하면서 24시간 및 48시간 반복 분석을 위해 알리코트를 보관합니다.
  5. 환자 식별자, 항응고제 종류, 검체 무결성 및 채취 시간을 확인하여 검체 수령 시점에 확인하세요. 광범위한 응고, 심한 용혈, 또는 뚜렷한 세포 퇴행을 보이는 시료를 거부합니다
  6. 최종 해석 전에 골수 표본에서 혈액 융합 여부를 평가하세요. 말초혈 오염 추정을 위해 0.00에서 1.00 사이의 반정량적 혈액 희출 점수를 계산합니다.
  7. 성숙한 림프구의 비율을 CD34 양성 전구, 미성숙 과립구, 성숙 림프구의 합으로 나누어 이 값을 결정하는데, 몫이 높을수록 희석 효과가 더 커집니다.
    참고: 다음 공식으로 점수를 계산합니다:
      figure-protocol-1
    점수가 높을수록 말초혈 오염이 더 심해졌음을 나타냅니다.
  8. 혈액 희출 점수는 다음과 같이 분류합니다: <0.20, 허용; 0.20–0.39, 약간 헤모랴트; 그리고 ≥0.40은 상당히 혈액 조절이 되었다.
    참고: 충분한 분모 크기와 보존된 골수 전구체 구조가 확인되지 않는 한, 현저히 혈액 분량이 많은 표본에 대해 명확한 MRD 음성 해석을 부여하지 마십시오.

2. 질병 특이적 항체 패널 준비

  1. B-ALL 및 AML 분석을 위한 표준화된 질환 특이적 2관, 8색 항체 패널을 준비합니다. 모든 튜브에서 고정된 백본 마커를 엄격히 준수하여 안정적인 인구 게이팅을 위해 패널 표준화를 달성합니다.
  2. 해당 계통 항원에 대해 일관된 형광색 접합체를 사용하고, 제조사가 권장하는 적정 부피를 엄격히 준수하여 로트 간 형광 변동성을 최소화하세요.
  3. 마커 조합, 플루오로크롬 할당, 항체 클론, 염색 부피, 획득 매개변수는 보충 표 1 을 참조하십시오.
  4. B-ALL 평가를 위해서는 두 튜브에서 CD19, CD45, CD34, CD10, CD20을 골격 마커로 사용하여 전구체 집단과 성숙 패턴을 정의합니다. CD38, CD58, CD81을 튜브 1에 추가하세요.
  5. 기저 평가에서 확립된 진단용 백혈병 관련 면역표현형에 따라 CD66c, CD123, CD73 또는 CD304를 튜브 2에 추가합니다.
  6. AML 평가를 위해서는 두 튜브에서 CD45, CD34, CD117, CD13, CD33, HLA-DR을 백본 마커로 사용하여 모반포 및 미성숙 골수계 집단을 정의합니다.
  7. CD7과 CD56을 튜브 1에 추가하여 교차 계통 항원 발현을 평가합니다. CD11b와 CD15를 2번 튜브에 추가하여 골수성 성숙 이상을 평가합니다.

3. 벌크 분해 준비 및 염색

  1. 잘 혼합된 골수 또는 말초혈 샘플 2.0 mL를 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다. 시료 부피가 제한되어 있다면 최소 입력 부피를 1.0 mL로 설정하세요.
  2. 예열된 염화암모늄 용해 완충제 10mL를 시료에 추가합니다. 현탁액을 상온에서 10분간 인큐베이팅하여 적혈구를 용해합니다.
  3. 시료를 500 × g 에서 5분간 원심분리합니다. 상정액은 핵화된 세포 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 버리세요.
  4. 펠릿을 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)과 2 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)이 포함된 인산 완충 생리식염수(PBS) 2mL에 재현탁합니다. 잔여 헤모글로빈 오염이 여전히 보이면 세척 단계를 한 번 반복하세요.
  5. 자동 혈액학 분석기나 수동 혈구계 계수(트리판 블루 배제)를 사용하여 핵 세포 농도를 측정합니다. 표준 획득을 위한 최소 핵 세포 농도를 5 ×10 6 cells/mL로 고려하라.
    참고: 세포 수율이 이 임계값 이하로 떨어지면 5분간 500 × g 에서 추가 원심분리를 하여 시료를 농축하고, 세포 밀도를 극대화하기 위해 부유 완충 부피를 조심스럽게 줄이세요.
  6. 일상적인 염색을 위해 튜브당 5개 × 10개 6개의 핵 세포를 할당합니다. 고감도 분석을 위해 샘플 회수가허용되는 경우 입력 투입량을 최대 1× 107 셀로 늘려야 합니다.
  7. 검증된 염색 패널 구성에 따라 개별 조절된 항체 혼합물과 재료표에 명시된 고정 가능한 생존성 염료를 각 튜브에 추가합니다. 검증된 일상 패널은 제조사가 권장하는 용량 조절이 다른 항체 특이적 부피를 나타내지 않는 한 플루오로크롬 결합 항체당 5 μL을 사용합니다.
  8. 최적의 항체-항원 화학양론을 유지하기 위해 최종 염색 반응량을 100 μL로 엄격히 유지해야 합니다. 표본을 어두운 실온에서 15분간 부화시킵니다.
  9. 염색된 세포를 워시 버퍼로 한 번 세척한 후 최종 펠릿을 500 μL 획득 버퍼에 재현탁합니다.
  10. 표본 채취 당일에 보상 비즈를 사용한 단일 염색 보상 방제제를 준비하세요.

4. 기기 설정 및 데이터 수집

  1. 환자 검체를 수집하기 전에 플로우 사이토미터의 매일 시작 품질 관리를 수행하세요. 제조사의 지침에 따라 보정 비드를 사용해 유체학, 레이저 정렬, 검출기 성능, 형광 타겟값을 검증하세요.
  2. 항체 패널에 포함된 동일한 형광색소를 사용하여 단일 염색 보상 대조군을 준비합니다. 환자 획득 전에 보상 매트릭스를 조정하고, 백본 마커가 미리 정해진 형광 표적 범위 내에 있는지 확인하세요.
  3. 검증 기간 동안 분석된 모든 표본에 대해 동일한 획득 템플릿, 검출기 설정, 보상 전략, 게이팅 계층 구조를 사용하세요.
    참고: 특수 보정 비즈를 사용하여 모든 검출기의 표준화된 표적 중앙 형광 강도 값을 설정하여 기기 간 적절한 조화를 보장하고, 임상 데이터 수집 전에 동일한 샘플이 플랫폼 간 유사 형광 프로파일을 산출하는지 확인합니다.
  4. 동시 현상을 줄이고 희귀 사건 탐지 정확도를 유지하기 위해 저에서 중간 정도의 유량으로 데이터를 수집합니다. 획득 중에도 사건 발생률을 지속적으로 모니터링하세요.
  5. 각 보고된 MRD 결과에 대해 최소 500,000건의 CD45 양성 핵 사건을 확보하세요. 표본의 품질과 사건 안정성이 허용되면, 특히 저수준 잔존 병이 의심될 경우 총 100만에서 150만 건의 사건까지 채취를 확대합니다.
  6. 유체 불안정, 시료 막힘, 급격한 사건 발생률 변화, 산란 품질의 눈에 띄는 악화가 발생하면 획득을 일시정지하거나 중단하세요. 적절할 경우 시료를 재여과하거나 재혼합하고, 안정적인 흐름이 회복된 후에만 샘플을 다시 채취합니다.

5. 순차적 게이팅 및 분모 조정 해석

  1. 검증된 유세포분석 소프트웨어를 사용하여 유세포측 데이터를 분석하세요. 모든 시료에 동일한 순차적 게이팅 전략을 사용하여 연산자 간 변동성을 줄이십시오.
  2. 정상 또는 재생 중인 골수 표본 최소 20개를 독립적으로 수집 및 분석하여 정상 및 재생 성숙 패턴을 설정하여 기준선 발현 템플릿으로 활용합니다.
  3. 전방 산란과 측면 산란 매개변수를 사용하여 잔해를 배제합니다. 전방 산란 면적 대 전방 산란 높이 게이팅을 적용하여 단일 셀을 분리합니다.
  4. 재료 표에 나열된 생존 염료 게이트를 사용하여 생존 불가능한 세포를 제외합니다. 비생존 세포는 비특이적 항체 결합을 보이고 배경 소음을 인위적으로 증가시키거나 희귀한 이상 개체군을 모방할 수 있으므로 일상적으로 제거해야 합니다.
    참고: 최적의 하위 분석을 위해 최소 생존 임계값을 75%로 요구하며, 이 값 이하로 떨어지는 표본은 희귀 사건 유물에 대해 신중한 해석이 필요함을 명시합니다. 적절한 측면 산란 특성을 가진 생존 가능한 CD45 양성 이벤트에 게이트하여 백혈구 분모를 정의합니다.
  5. B-ALL 표본의 경우, 분석은 CD19 양성 전구체 구획으로 제한합니다. 항CD19 표적 치료를 받는 환자를 위한 대체 게이팅 프레임워크를 도입하세요.
  6. CD19 발현과 독립적으로 백혈병 집단을 포착하기 위해 1차 평가를 CD22, CD24, CD34 양성 구획으로 전환합니다. CD34, CD10, CD20의 성숙 패턴을 평가하고 CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123, CD73 또는 CD304 발현 패턴을 사용하여 이상 개체군을 식별합니다.
  7. AML 시료의 경우, CD45, 측면 산란, CD34, CD117 발현을 사용하여 폭발 또는 전구체 영역을 정의합니다.
  8. CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b, CD15 등 골수계 및 교차 계통 마커의 비정상 또는 비동기 발현을 평가합니다.
  9. 획득 가능한 생존 가능한 CD45 양성 사건의 총 수를 분모로 사용하여 검체 특이적 검출 한계(LOD)와 정량 한계(LOQ)를 계산합니다:
     figure-protocol-2
      figure-protocol-3
  10. 최종 MRD 해석을 세 가지 범주 중 하나로 분류합니다: MRD 양성, LOD 이하, 또는 분석적으로 제한적.
    1. 명확하고 연속적인 이상 사건 군집이 표본 특이적 LOD를 초과하고, 정상 또는 재생 중인 조혈 집단과 구별되는 내부 일관된 면역표현형을 보일 때, 결과를 MRD 양성으로 분류합니다.
      참고: 산재적이고 군집이 아닌 사건을 MRD 양성으로 분류하지 마십시오. 기초 진단 샘플에서 추적한 백혈병 관련 면역표현형(LAIP)과 정상과 다른 패턴 인식(DfN) 패턴 인식 전략을 결합한 통합 분석 접근법을 활용합니다.
    2. 드물게 의심스러운 사건이 존재하지만 표본 특이적 보고 기준에 미치지 못할 경우, 결과를 LOD 이하로 할당합니다.
    3. 분모 크기가 부족하거나, 적혈 희석이 심하거나, 시료 품질이 낮거나, 사전 분석 또는 분석적 한계로 인해 확신 있는 부정적 해석이 어려울 경우 결과를 분석적으로 제한된 것으로 할당합니다.
  11. 두 번째 자격을 갖춘 분석가가 독립적으로 모든 MRD 양성 및 경계 저경 사례를 검토하세요.
  12. 정량적 중합효소 연쇄반응 또는 차세대 시퀀싱 결과를 포함한 쌍 분자 비교기 데이터를 검토하기 전에 유세포분석 해석을 최종 확정하세요.

6. 분석 검증 방법론

  1. 동일한 용해 후 세포 현탁액에서 복제된 알리코트를 준비하여 분석 반복성을 평가합니다. 최소 30개의 짝을 독립적으로 수집하여 분석하세요.
  2. 기대되는 저부하 범위 내에서 6개 수준에 걸쳐 연속 희석을 준비하여 희석 선형성을 평가합니다. 희석 시리즈 전반에 걸친 관측된 MRD 값과 예상 MRD 값을 비교합니다.
  3. 여러 자격을 갖춘 운영자와 조화로운 유세포계에 걸친 참조 시료를 분석하여 운영자 간 및 기기 간 재현성을 평가합니다.
  4. 통계적 비교 전에 log10 변환을 사용하여 형질전환 유세포계 및 쌍 분자 MRD 백분율을 변환합니다. 상관분석과 블랜드-알트만 분석을 사용하여 정량적 일치를 평가합니다.

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결과

일상 구현 데이터셋의 특성

연구 기간 동안 197개의 연속 표본이 자격 심사 및 사전 분석 품질 평가를 통과하여 보고 대상 작업 흐름에 진입했습니다. 연구 코호트에는 98명의 환자가 포함되었으며, 이 중 62명(63.3%)은 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 36명(36.7%)은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자였습니다. 코호트는 남성 64명(65.3%)과 여성 34명(34.7%)으로 구성되었으며, 중위 연령은 32세(4분위 범위[IQR], 13–49세; 범위 2–73세)였습니다. 중간 기준 폭발 비율은 67.2%(IQR, 56.9% – 80.2%)였습니다.

분석 대상 표본 대부분은 골수 흡인(174/197, 88.3%)이었고, 말초혈액 표본은 23/197(11.7%)을 차지했습니다. 미리 정해진 모니터링 간격에 따르면, 유도 치료...

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토론

본 연구의 주요 목적은 급성 백혈병에서 측정 가능한 잔존질환(MRD)의 다색 유세포측정 평가를 위한 표준화된 워크플로우를 확립하는 것이었습니다. 신뢰할 수 있는 MRD 평가는 항체 패널 선택뿐만 아니라 일관된 표본 취급, 획득 매개변수, 데이터 해석에도 의존합니다11. 본 연구 결과는 조화로운 표본 처리, 통제된 채취 깊이, 분모 조정 보고 기준이 일상적인 임상 실험실 환경에서 분석 재현성을 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 이 결과는 다양한 기관과 운영자 간에 플로우 사이토메트메트릭 MRD 평가를 표준화하려는 최근 노력과 일치합니다12.

이 작업 흐름의 중요한 구성 요소는 염화암모늄 기반의 벌크 적혈구 용해 절차입니다. 희귀 사건 MRD 검출은 충분한 분석 민감도를 달성하기 위해 큰 세포 분모를 확보해야 합니다. 표준화된 대량 분해 준...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 네이장 제2인민병원 임상실험실과에 이 연구를 위한 실험실 시설과 기술 지원을 제공해 준 데 감사를 표합니다. 저자는 또한 샘플 처리 및 데이터 수집에 도움을 준 실험실 직원과 임상 직원들께 감사의 뜻을 표합니다. 마지막으로, 저자는 이 연구에 기여한 잔여 임상 표본을 제공한 환자들에게 감사를 표합니다. 이 연구는 공공, 상업, 비영리 자금 지원 기관으로부터 별도의 자금 지원을 받지 않았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Acquisition bufferLaboratory-preparedPBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µLFinal resuspension before flow cytometric acquisition
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsEarly myeloid/blast identification
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsImmaturity marker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsLeukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsAberrant blast-associated phenotyping
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsCross-lineage aberrancy detection
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation and subtype discrimination
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsEarly myeloid/blast identification
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation-discordance assessment
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsDifferent-from-normal myeloid pattern assessment
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsImmaturity marker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsLeukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation and subtype discrimination
Ammonium chloride-based red blood cell lysis bufferLaboratory-prepared / commercial supplierAmmonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperatureBulk red blood cell lysis
Analysis softwareBeckman Coulter (Brea, CA, USA)Kaluza 2.1Data analysis and sequential gating
Automated hematology analyzerCommercial supplierAutomated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessmentNucleated cell concentration and viability assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsPrecursor B-cell definition
B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsB-lineage identification and entry into precursor compartment
B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation pattern assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs

참고문헌

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