방법 논문

제어된 유전자 편집 및 약물 전달을 위한 빛 및 X선 활성 리포좀

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DOI:

10.3791/71788

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2026년 8월 14일

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1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 가시광선 또는 X선 방사선에 의해 활성화되어 CRISPR-Cas9 리보핵산단백질 및 화학요법제의 시공간적 제어 전달이 가능하며, 안과학 및 종양학 응용 분야로의 중개 가능성이 있는 verteporfin 통합 지질 나노입자의 제조 방법을 설명합니다.

초록

광역동 치료(PDT)는 광감작제의 활성화를 통해 주로 일중항 산소인 활성 산소종(ROS)을 생성하는 원리를 이용합니다. 이러한 광화학 반응은 직접적인 세포 독성을 넘어, 지질 나노운반체 시스템에서 필요에 따라 화물을 방출하는 방식으로 응용될 수 있으며, 이를 통해 기존의 지질 나노입자로는 달성할 수 없었던 치료제 전달의 시공간적 제어가 가능해집니다. 본 프로토콜에서는 두 가지 서로 다른 verteporfin (VP) 통합 지질 나노입자 제형의 제작 및 특성 분석 방법을 제시합니다: (1) CRISPR-Cas9 리보핵산단백질(RNP) 복합체 전달을 위해 DOTAP, DOPE, 콜레스테롤 및 VP로 구성된 빛 유도 리포좀, 그리고 (2) 화학요법 약물의 제어 방출을 위해 DOTAP, DOPC, VP 및 금 나노입자로 구성된 X선 유도 리포좀입니다. 690 nm(가시광선) 또는 임상 X선 방사선(6 MeV)으로 활성화되면, VP는 일중항 산소를 생성하여 불포화 지질 성분을 산화시키고, 이를 통해 나노입자 막을 불안정하게 만들어 캡슐화된 화물을 방출합니다. 본 프로토콜은 박막 수화법 및 막 압출법을 이용한 리포좀 제형 제작, 물리화학적 특성 분석, 빛 및 X선 유도 화물 방출 평가, 인간 세포 내 in vitro 유전자 녹아웃, 그리고 정량적 제브라피쉬 시각 리포터 시스템과 마우스 이종이식 종양 모델을 이용한 in vivo 검증 방법을 제공합니다. 대표적인 결과에 따르면, 빛 활성화를 통해 제브라피쉬 배아당 최대 약 326개의 서근섬유 녹아웃이 가능했으며, X선 유도 doxorubicin 방출을 통해 상당한 종양 성장 억제 효과가 나타났습니다. 안구 내 689–690 nm verteporfin 활성화의 임상적 전례는 이 플랫폼의 안과적 전달 가능성에 대한 평가 동기가 되지만, 망막 생체 분포, 약동학 및 대동물 안전성은 여전히 입증되어야 할 과제로 남아 있습니다. 이러한 방법들은 외부 제어형 치료 화물 방출을 위한 중개 연구 잠재력을 가진 실험적 접근 방식을 제공합니다. 

서론

지질 나노입자(LNPs)는 COVID-19 mRNA 백신에 적용되어 입증되었듯이, 핵산 치료제를 위한 가장 임상적으로 검증된 비바이러스성 전달 플랫폼으로 부상했습니다1. 그러나 기존의 LNPs는 세포 섭취 후 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 통해 화물을 방출하므로, 페이로드 전달의 시기, 위치 또는 범위에 대한 외부 제어가 불가능합니다2. 이러한 시공간적 제어의 부재는 부위 특이적 유전자 편집, 이질적 종양에서의 표적 화학요법, 그리고 눈과 같이 해부학적으로 접근 가능한 장기에서의 적정 유전자 억제 등 정밀한 온디맨드(on-demand) 방출이 치료적으로 유리한 응용 분야에서의 활용을 제한합니다3,4.

광동역학 치료(PDT)는 외부 자극에 의해 유도되는 생물학적 효과를 위한 잘 확립된 메커니즘을 제공합니다. 특정 파장에서 활성화되면, 광감작제는 주변의 생체 분자를 산화시킬 수 있는 일항 산소(1O2) 및 기타 ROS를 생성합니다5. 연령 관련 황반변성(AMD)의 중심와 하 맥락막 신생혈관에 대한 광동역학적 치료제로 Visudyne이라는 이름으로 임상 승인을 받은 벤조포르피린 유도체인 Verteporfin(VP)은 나노입자 광감작제 성분으로 특히 적합합니다6. VP는 안과적 광동역학 치료를 위해 임상적으로 689 nm에서 활성화되며, 이는 확립된 안구 광전달 선례를 제공합니다6,7,8. VP는 조직 침투 파장에서 1세대 헤마토포르피린 유도체보다 광동역학적 활성이 약 4배 더 높습니다6.

VP가 임상적으로 승인된 광감각제이자 나노입자 화물 방출을 위한 빛 응답성 트리거로서 동시에 작용하는 이러한 이중 기능성은 본 프로토콜에 설명된 메커니즘의 기초가 됩니다. VP가 낮은 몰 비율로 지질 이중층에 통합되면, 조명 시 1O2를 생성하며, 이는 기존 문헌과 일치하게 불포화 인지질 아실 사슬을 산화시켜 막을 불안정하게 만들고 캡슐화된 화물을 방출하는 것으로 제안됩니다9. 1O2의 짧은 확산 반경(생물학적 환경에서 ~20 nm)은 막 불안정화를 광감각제 주변의 즉각적인 영역으로 제한하여, 이중층을 효율적으로 붕괴시키면서도 화물에 대한 손상을 최소화합니다9,10. 또한, X선 활성화 방식은 가시광선의 조직 투과 깊이 제한을 극복합니다. 금 나노입자(3–5 nm)가 지질 이중층에 함께 매립되면, 임상 X선 조사(6 MeV)가 오제 전자 매개 에너지 전달을 통해 VP 활성화를 강화하여 심부 종양까지 적용 가능성을 확장합니다11,12. Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)을 이용한 직접적인 일중항 산소 측정 결과, 1O2 생성은 X선 선량에 따라 증가하며, VP 단독 사용 시와 비교하여 금 나노입자 공동 적재 시 약 1.4배 향상됨이 확인되었습니다11.

이 플랫폼은 안과 유전자 치료에 있어 특히 중요한 중개 연구적 관련성을 갖습니다. 현재 신생혈관성 AMD에 대한 anti-VEGF 치료는 빈번한 유리체 내 주사를 필요로 하며, 실제 임상 결과는 만성적인 치료 부족으로 인해 저하되는 경향이 있습니다13,14. 반면, 새롭게 등장한 AAV 유전자 치료는 이러한 부담을 줄여주지만 anti-VEGF를 지속적으로 발현시키므로15,16 용량 조절이나 투여 중단이 불가능합니다. 이는 지속적인 VEGF 억제와 지리적 위축, 망막 허혈 및 섬유화 사이의 연관성을 고려할 때 우려되는 부분입니다17,18. 대신 VP-리포좀을 이용한 빛 유도 CRISPR 기반 접근 방식은 임상의가 제어할 수 있고 공간적으로 제한된 VEGF-A 녹아웃을 가능하게 하여, 유전자 편집의 지속성은 유지하면서 초기 편집 이벤트에 대해 임상의가 제어하는 공간적 및 시간적 게이팅을 제공할 수 있습니다. 이러한 동일한 유도 방출 원리는 Stargardt 질환(ABCA4)19,20과 같은 거대 유전자 망막 이영양증과 포도막 흑색종으로 확장될 수 있으며, 특히 포도막 흑색종의 경우 VP의 수렴적 기전이 종양의 생물학적 특성과 잘 부합합니다21,22.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 가시광선(690 nm)에 의해 활성화되는 제형과 X선 방사선에 의해 활성화되는 제형이라는 두 가지 서로 다른 제형을 사용하여 VP-통합 지질 나노입자를 제조하고, 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 모델 시스템 모두에서 전달 효율을 평가하기 위한 포괄적이고 재현 가능한 방법을 제공하는 것입니다. 이 제형들은 지질 조성, 화물 적재 전략 및 활성화 방식이 서로 다르기 때문에 별도의 프로토콜로 제시됩니다. 본 프로토콜은 트리거 방출 나노입자 플랫폼, PDT 기반 전달 전략, 시공간적으로 제어되는 유전자 편집, 또는 광활성 안과 및 종양 약물 전달을 연구하는 연구자들을 위해 설계되었습니다.

프로토콜

제브라피시를 이용한 모든 동물 실험은 Macquarie University 동물 연구 윤리 위원회(ARA: 2015-034)에서 승인한 프로토콜에 따라 표준 조건 하에 수행되었습니다. 마우스 이종이식 실험은 Macquarie University 동물 윤리 위원회(승인 번호 2017/001)의 규정을 준수하여 수행되었습니다. 모든 절차는 1985년 동물 연구법(Animal Research Act 1985) 및 2010년 동물 연구 규정(Animal Research Regulation 2010)을 준수하여 진행되었습니다.

파트 A: CRISPR-Cas9 전달을 위한 빛 유발 VP-리포좀 (Aksoy 등9의 연구 기반)

1. CRISPR-Cas9 RNP를 봉입한 빛 응답형 VP-리포좀의 제조

  1. 유리 라운드 바텀 플라스크에 DOTAP, DOPE, cholesterol (Chol), 그리고 VP를 1:0.94:1:0.06의 몰비로 500 µL의 클로로포름에 녹인다9.
    주의: 클로로포름은 독성이 있고 휘발성이다. 클로로포름을 사용하는 모든 단계는 니트릴 장갑과 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태에서 화학 흄 후드 내에서 수행한다.
  2. 플라스크 벽면에 얇은 지질 막이 형성될 때까지 아르곤 가스 흐름 하에서 클로로포름을 증발시킨다.
  3. 잔류 용매를 완전히 제거하기 위해 플라스크를 진공 상태(예: 동결 건조기 또는 진공 펌프에 연결된 데시케이터)로 하룻밤(≥12 h) 동안 둔다.
  4. 500 µL의 nuclease-free water에 sgRNA (최종 농도 0.01 µM)와 Cas9 단백질 (최종 농도 0.1 mg/mL)을 혼합하여 하이드레이션 용액을 준비한다. 하이드레이션 전, 리보핵산단백질 (RNP) 복합체 형성을 위해 sgRNA와 Cas9을 상온에서 5 min 동안 사전 배양한다.
    참고: RNP 복합체는 형성 후 추가하는 것이 아니라 하이드레이션 단계 중에 로딩된다. 이는 리포좀의 수성 코어 내에 캡슐화되도록 하기 위함이다.
  5. 500 µL의 RNP 용액을 건조된 지질 막 위에 직접 가하여 하이드레이션시키고, 현탁액이 균질해질 때까지 섞는다. 지질이 완전히 하이드레이션될 수 있도록 하이드레이션된 지질 현탁액을 상온에서 2 h 동안 둔다.
  6. 균일한 크기의 단일층 리포좀을 생성하기 위해 미니 익스트루더를 사용하여 결과물인 다층 현탁액을 200 nm 폴리카보네이트 막으로 11회 압출한다9.
    참고: 이 제형의 크기 감소 방법은 초음파 처리가 아닌 압출법이다. 최종 생성물이 시작 물질과 막의 반대편에 위치하도록 하여 압출되지 않은 소포에 의한 오염을 줄이기 위해 현탁액을 홀수 횟수(11회)로 통과시킨다.
  7. VP-리포좀은 빛이 차단된 상태로 4°C에서 보관한다. 최적의 활성을 위해 제조 후 48 h 이내에 사용한다. 이 48 h의 사용 제한은 보수적인 수치이며, 10% FBS 내에서 96 h 동안 VP 방출량은 3% 미만으로 유지된다9.
    참고: in vitro 및 in vivo 적용을 위해, 표준 무균 기술을 사용하여 리포좀을 제조 및 취급하며, 사용 전 0.22 µm 필터를 통과시켜 최종 현탁액을 멸균한다.

2. VP-리포좀의 물리화학적 특성 분석

  1. 리포좀 현탁액을 nuclease-free water로 1:100 비율로 희석한다. 동적 광산란법(DLS)을 사용하여 수화역학적 직경, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위를 측정한다. 모든 DLS 측정은 샘플당 3회 반복 수행(n = 3 technical replicates)하며, 측정값은 평균 ± 표준편차로 표기한다.
    참고: Part A 포뮬레이션이 성공적으로 제조되었을 때 예상되는 특성은 수화역학적 직경 167.5 ± 1.9 nm, PDI < 0.3, 제타 전위 +28 ± 1.1 mV 및 Cas9 캡슐화 효율 약 75.09%이다. 성공적인 포뮬레이션의 대표적인 물리화학적 특성은 Table 1에 요약되어 있다.9
  2. 투과 전자 현미경(TEM) 분석을 위해, 희석된 리포좀 현탁액 10 µL를 탄소 코팅된 구리 그리드 위에 도포한다. 2% uranyl acetate로 20 s 동안 염색한다. 100 kV9에서 촬영하여 배치당 최소 10장의 대표 이미지를 확보한다.
매개변수파트 A: VP-리포좀
(광 유도)		파트 B: VP/AuNP-리포좀
(X선 유도)
수역학적 직경167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
다분산 지수 (PDI)<0.3< 0.3 (전형적)
제타 전위+28 ± 1.1 mV양전하 (DOTAP 기반)
봉입 효율Cas9 RNP: 75.09%Doxorubicin: 황산암모늄 원격 로딩; 0.1% Triton X-100 용해 후 정량
금 나노입자 로딩해당 없음리포좀당 156 ± 24 AuNPs (ICP-MS)
화물 방출 안정성10% FBS에서 96 h 동안 VP 방출률 <3%0%, 10%, 25%, 50% FBS 및 pH 7.4, 6.0, 5.0에서 48 h 동안 안정함
활성화 조건690 nm, 0.15 mW/cm² LED 조사6 MeV 임상 X선 조사
주요 화물CRISPR-Cas9 RNP 복합체Doxorubicin
활성화 방식가시광선X선 방사선
의도된 응용 분야유도형 유전자 편집유도형 화학요법 약물 방출

표 1: 두 가지 verteporfin (VP)-리포좀 제형의 물리화학적 특성 벤치마크 및 안정성 프로파일. 광유도 VP-리포좀 제형(파트 A)과 X선 유도 VP/AuNP-리포좀 제형(파트 B)의 대표적인 제형 특성, 로딩 파라미터, 안정성 프로파일 및 활성화 조건. 이 값들은 성공적인 제형 준비 및 특성 분석을 위한 예상 품질 관리 벤치마크를 제공하며, 본 문서에 기술된 프로토콜을 재현할 때 참조 기준으로 사용될 수 있습니다.

3. 빛으로 유도된 화물 방출 및 일항산소 측정

  1. 빛 유도 방출 분석을 위해, 동일한 지질 조성 및 수화/압출 프로토콜을 사용하여 VP-리포좀을 준비한다. PBS에 분산된 리포좀 현탁액 100 µL를 80 rpm으로 교반되는 12 mL의 PBS가 담긴 투석 장치에 분주한다.
  2. 정해진 시간 간격(2, 4, 6분) 동안 0.15 mW/cm2 세기의 690 nm LED 광원으로 샘플을 조사한다9.
  3. 0, 1, 3, 6, 24시간에 외부 투석액을 샘플링하고, 형광 측정을 통해 방출된 VP의 양을 정량한다. 동일한 양의 분액을 0.1% Triton X-100으로 용해시켜 전체 VP 양을 측정한다.
  4. VP 방출률을 Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100으로 계산한다. 여기서 Ft, F0, Fmax는 각각 시간 t, 기저선, 그리고 Triton 용해 후의 형광 값이다 (n = 3).
  5. 조사 전후의 동적 광산란법(DLS)을 통한 수력학적 직경의 변화를 측정하여 막의 불안정화를 확인한다.
    참고: 준비 및 보관 전 과정 동안 모든 VP 함유 샘플을 주변 빛으로부터 차단한다. 갈색 튜브를 사용하거나 알루미늄 호일로 감싸 보호한다.

4. 인 비트로(In vitro) 형질전환 및 유전자 녹아웃 분석

  1. 처리 시점에 약 70%의 합류도(confluency)에 도달하도록 적절한 밀도로 HEK293-GFP 세포(또는 이에 상응하는 리포터 세포주)를 96-웰 플레이트에 분주합니다. 세포를 완전 배지(DMEM + 10% FBS + 1% penicillin–streptomycin)에서 37°C, 5% CO2 조건으로 배양합니다.2.
  2. anti-GFP sgRNA/Cas9 RNP를 캡슐화한 VP-리포좀을 50 ug/mL 농도로 각 웰에 첨가한다. 형광 현미경 분석의 경우 2시간 동안, 유세포 분석의 경우 1시간 동안 배양한다.
  3. 배지를 신선한 완전 배지로 교체하십시오. 처리된 웰에 0.15 mW/cm2 강도의 690 nm LED 광을 조사하십시오. 형광 현미경 분석의 경우 2, 4 또는 6분 동안 조사하고, 유세포 분석의 경우 4분 동안 조사하십시오. 암조건 대조군(광조사를 하지 않은 리포좀)과 광조사 단독 대조군(리포좀 없이 광조사만 수행)을 포함하십시오.
  4. 형광 현미경 또는 유세포 분석기를 사용하여 처리 48시간 후의 GFP 녹아웃 정도를 평가하십시오.
    참고: 가이드 RNA는 사용 전 검증되어야 한다. 원천 연구에서는 제한 효소 절편 길이 다형성(RFLP) 분석을 통해 후보 eGFP 가이드의 절단 효율을 스크리닝하였으며, 선택된 가이드(sg_eGFP_06)는 88.24%의 절단 효율을 달성하였다. 오프타겟 위험은 가이드의 고유성을 확인하여 인실리코(in silico) 상에서 최소화하였다(Bowtie/Bowtie2를 사용하여 참조 게놈에 대해 BLASTN을 수행하였으며, 3' 말단 처음 10개 염기에서는 미스매치를 허용하지 않음). 게놈 전체 오프타겟 시퀀싱은 수행되지 않았으며, 이는 치료적 적용을 위해 권장되는 단계이다.9.
  5. 봉입 효율을 측정하려면, 원심분리하십시오. 리포좀 샘플을 4 °C에서 15,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 20 nm Whatman Anotop 10 시린지 필터로 여과합니다.
  6. BCA 단백질 정량법을 이용하여 여과액 내의 유리(비캡슐화) Cas9의 양을 정량한다.
  7. 봉입 효율은 EE (%) = [(C전체(Total) − Csup) / C합계] × 100 (여기서 C는총합 추가된 총 Cas9 및 C는 무엇입니까?sup 캡슐화되지 않은 Cas9은 상층액에서 회수됩니다. 다음을 참조하십시오. 표 1 대표적인 제형 성능 지표 및 예상 캡슐화 효율에 대해.

5. In vivo 검증: 제브라피쉬 시각적 리포터 분석

  1. 원본 프로토콜9에 명시된 비율에 따라 eGFP 타겟팅 sgRNA와 Cas9 단백질을 캡슐화한 VP-liposome을 혼합하여 주입용 MasterMix를 준비합니다. 최종 8 uL MasterMix는 sgRNA (75 ng/uL) 3.5 uL, Cas9 단백질 (500 ng/uL) 1.0 uL, VP-liposome 2.5 uL, 페놀 레드 1.0 uL를 포함합니다. 대조군 MasterMix의 경우, liposome 대신 nuclease-free water 2.5 uL를 대체하여 사용합니다.
  2. 보정된 미세주입 시스템9을 사용하여 1세포기 제브라피시 배아의 세포(난황이 아님)에 MasterMix 2 nL를 미세주입합니다.
    주의: 모든 제브라피시 실험은 승인된 동물 윤리 프로토콜에 따라 수행하십시오. 주입 중 기계적 손상을 최소화하기 위해 배아를 조심스럽게 다루십시오.
  3. 수정 후 2시간(hpf)에 주입된 배아에 690 nm LED 광선을 0.15 mW/cm2 세기로 정해진 시간(예: 0, 1, 2, 5분) 동안 조사하여 화물 방출을 활성화합니다9.
  4. 72 hpf에 배아를 Tricaine으로 마취한 후 1% 저융점 아가로스에 고정합니다. smyhc1:eGFP 형질전환 리포터 라인을 사용하여, 도립 형광 현미경과 공초점 현미경으로 eGFP 형광의 소실 여부를 확인하여 지근 섬유의 넉아웃 정도를 정량화합니다.
  5. 초점 적층 이미지를 획득하고 배아당 eGFP 음성(넉아웃된) 지근 섬유의 수를 계산하며, 일반적으로 그룹당 16개 배아를 분석합니다(예: Imaris 사용)9.
    참고: 이 분석법은 유전자 넉아웃 효율에 대한 정량적이고 시각적인 결과를 제공합니다. smyhc1:eGFP 리포터 라인에서 지근 섬유는 정상적으로 eGFP 양성을 띠며, 넉아웃 성공 여부는 이러한 섬유에서 eGFP 형광이 소실된 것으로 판정합니다9.

파트 B: 화학요법 약물 전달을 위한 X선 유도 VP-리포좀 (Deng 등11의 연구 기반)

6. 독소루비신이 탑재된 X선 트리거 VP/AuNP-리포좀의 제조

  1. 유리 둥근 바닥 플라스크에 DOTAP (클로로포름 내 100 mg/mL) 350 µL와 DOPC (클로로포름 내 100 mg/mL) 370 µL를 혼합하고, 클로로포름으로 총 부피를 1.0 mL로 맞춘다11.
    참고: 파트 B에서는 DOPE가 아닌 DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 사용한다. 두 제형은 헬퍼 지질(helper lipid)이 다르며, 이러한 구분은 재현성에 매우 중요하다.
  2. 지질 혼합물에 VP (DMSO 내 2.3 mg/mL) 50 µL와 금 나노입자 현탁액 (직경 3–5 nm) 40 µL를 첨가한다. 이는 ICP-MS로 정량화했을 때 리포좀당 약 156 ± 24개의 금 나노입자가 포함된 결과가 된다11.
    참고: 금 나노입자는 지질 이중층 내에 삽입되기 위해 직경이 3–5 nm여야 한다. 더 큰 입자(예: 50 nm)는 막에 통합되지 않으며, X선 활성화에 필요한 오제 전자 에너지 전달(Auger electron energy transfer)을 매개할 수 없다11.
    참고: 여기서 설명하는 기본 제형은 비표적형(non-targeted)이다. 원문 연구에서는 리포좀을 엽산 수용체 발현 종양 세포로 유도하기 위해 DSPE-PEG2000-Folate를 사후 삽입(post-insertion)하는 선택적 능동 표적화 수정을 도입하였으며, 이 단계는 핵심 VP/AuNP 방출 메커니즘을 변경하지 않고 추가할 수 있다11.
  3. 단계 1.2–1.3에 설명된 대로 아르곤 기류 하에서 클로로포름을 증발시키고 진공 상태에서 밤새 건조한다.
  4. 250 mM 황산암모늄 완충액 (pH 5.5) 1.0 mL로 지질 박막을 수화시킨다. 볼텍싱 후 수화된 현탁액을 밤새 방치한 다음, 200 nm 폴리카보네이트 막을 통해 11회 압출한다11.
  5. 막 관통 황산암모늄 구배를 형성하기 위해 4 C에서 PBS (pH 7.4)를 이용해 4회 완충액을 교체하며 투석하여 유리 황산암모늄을 제거한다.
  6. 투석된 리포좀을 약물 대 지질 중량비 1:10으로 60°C에서 1시간 동안 배양하여 독소루비신 (Dox)을 로딩한다11. 황산암모늄 구배에 의해 Dox가 리포좀 내부로 축적된다.
  7. 4 C에서 PBS를 이용해 4회 완충액을 교체하며 투석하여 캡슐화되지 않은 Dox를 제거한다.
  8. DLS로 로딩된 리포좀을 특성 분석하고(예상 크기: ~100–150 nm), 0.1% Triton X-100으로 리포좀을 용해하고 Dox 형광(들뜸 파장 485 nm, 방출 파장 590 nm)을 정량하여 캡슐화 효율을 측정한다  .
    참고: 성공적인 파트 B 제형은 일반적으로 약 100–150 nm의 수력학적 직경, PDI < 0.3 및 리포좀당 약 156 ± 24개의 금 나노입자 포함을 나타낸다. 대표적인 물리화학적 특성은 표 1에 요약되어 있다11.

7. X선 트리거 약물 방출 및 인 비트로(in vitro) 세포독성

  1. 임상 선형 가속기(6 MeV 광자 빔)를 사용하여 정해진 선량(1, 2, 4 Gy)으로 calcein이 적재된 VP/AuNP-리포좀을 조사합니다11. calcein 형광(들뜸 파장 485 nm, 방출 파장 510 nm)을 측정하여 화합물 방출량을 정량화하고, 0.1% Triton X-100으로 파괴시킨 후 총 방출량을 구합니다."
  2. 세포 독성 분석을 위해 HCT116 인간 대장암 세포를 96-웰 플레이트에 분주합니다(예: 10% FBS에서 2 × 104 cells/mL).
  3. LipoDox 단독 처리군, X선 단독 조사군 및 미처리 대조군을 포함하여, Dox가 적재된 VP/AuNP-리포좀으로 세포를 처리하고 위와 동일하게 X선을 조사합니다. 4 Gy 조사 후 0, 2, 4, 24시간에 MTS 분석을 통해 세포 생존율을 평가합니다11.

8. In vivo 검증: 마우스 제노그라프트 종양 모델

  1. 6-7주령의 암컷 BALB/c nude 마우스의 측면에 serum-free McCoy’s 5A medium11 100 µL에 희석한 5 × 106 HCT116 세포를 피하 접종합니다.
  2. 종양의 크기가 ~100 mm3에 도달하면, Dox가 적재된 VP/AuNP-liposome(Dox 당량 기준 10 mg/kg) 20 µL를 종양 내로 주입합니다11.
  3. 주입 24시간 후, 비표적 조직을 적절히 차폐한 상태에서 임상용 선형 가속기를 사용하여 종양에 4 Gy X-선 조사(6 MeV)를 수행합니다.
  4. 디지털 캘리퍼스를 사용하여 2일마다 종양 부피를 모니터링합니다. 종양 부피는 V = (π/6) × L × W2로 계산하며, 여기서 L은 최대 길이이고 W는 수직 너비입니다11.
  5. 실험 종료 시점에 종양을 적출하여 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 조직학적 분석(H&E 염색)을 위해 6 µm 두께의 동결 절편을 제작합니다11.

9. 통계 분석

  1. 별도로 명시되지 않는 한, 정량적 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시합니다.
  2. 제브라피쉬 유전자 녹아웃 연구의 통계 분석은 원문 연구에 보고된 바와 같이 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 수행하였으며, 두 그룹 간의 비교는 양측 Student's t-test를 사용하여 분석하였습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의하였습니다.
  3. X선 유도 리포좀 연구의 경우, 종양 성장, 체중, 화물 방출 및 조직학적 데이터 세트는 원문 출판물에 기술된 대로 Student's t-test를 사용하여 분석하였습니다.
  4. 각 실험의 n에 대한 정의는 해당 도표 설명에 제공되어 있습니다.
  5. 통계 분석은 GraphPad Prism 버전 7.0 (GraphPad Software)을 사용하여 수행하였습니다.
    참고: 본 프로토콜은 이전에 발표된 연구의 실험 워크플로우와 대표 데이터 세트를 재현합니다. 독자는 해당하는 경우 상세한 통계 분석 내용을 확인하기 위해 원문 출판물을 참조하시기 바랍니다9,11.

결과

빛 유도 유전자 편집 (파트 A):

Part A 프로토콜에 따라, CRISPR-Cas9 RNP를 캡슐화한 VP-리포좀은 빛 의존적인 화물 방출을 나타냈다. 암조건에서는 방출이 최소한으로 관찰된 반면, 690 nm (0.15 mW/cm2)에서의 조사는 조사 시간에 따라 증가하는 용량 의존적 방출을 유도했다 (Figure 1A)9. 제브라피쉬 eGFP 리포터 분석을 통해 유전자 넉아웃 효율에 대한 정량적 시각적 판독값을 얻었다. 광활성화된 배아는 배아당 308.37 ± 40.21개의 eGFP 양성 완만근 섬유(slow-muscle fibres)에서 넉아웃이 나타난 반면, 암조건 대조군에서는 53.15 ± 35.38개의 섬유에서 나타났으며(n = 80), 5분 조사 후에는 326.12 ± 36.55개의 섬유로 증가했다 (n = 60) (Figure 1B,C)9. In vitro에서 광활성화된 VP-리포좀은 Lipofectamine 2000과 유사한 수준의 GFP 넉다운(약 53% 대 50% 감소)을 달성했으며, 동시에 독특하게 빛으로 제어되는 시공간적 조절 능력을 제공했다 (Figure 1C)9. 이러한 결과는 동일한 나노입자 제형이 빛 노출 여부에 따라 현저히 다른 넉아웃 효율을 나타냄으로써 시공간적 조절이 가능함을 입증한다 (Figure 1A–C).

광화학적 유전자 편집 방법; CRISPR-Cas9, LED 유도, 형광 현미경 검사, 실험 결과, 강도 측정.
그림 1빛 유도 CRISPR-Cas9 전달 및 제브라피쉬 배아에서의 시공간적 유전자 녹아웃. (ACas9/sgRNA 리보핵산단백질(RNP) 복합체를 캡슐화한 버테포르핀(VP)-리포좀(DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06)의 모식도. 690 nm 빛을 조사하면 VP가 활성 산소종을 생성하여 리포좀 막을 불안정하게 만들고, CRISPR-Cas9 화물의 세포 내 방출을 유도한다.B) 의 대표 형광 이미지 smyhc1:eGFP VP-리포좀 처리 및 광노출 시간 증가(0, 1, 2, 5분; 690 nm, 0.15 mW/cm²)에 따른 수정 후 72시간(hpf)의 제브라피쉬 배아2). eGFP 형광의 소실은 완근 섬유의 녹아웃을 나타냅니다. 삽입도는 상자 영역의 확대 보기입니다. (C배아당 형광 강도 및 녹아웃된 서근 섬유(slow-muscle fibre) 수의 정량화로, 빛 의존적 CRISPR-Cas9 활성화 및 유전자 녹아웃을 입증함. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시됨. 제브라피쉬 실험은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석됨(n = 형광 강도 측정을 위한 배아 80개와 n = 섬유 수 분석을 위한 배아 60개; p < 0.0001). HEK293-GFP 검증 실험은 양측 검정(two-tailed)을 사용하여 분석되었습니다. t-검사 (n = 4). 스케일 바 = 500 µm (개요 이미지) 및 100 µm (확대 이미지). Aksoy 등의 허가를 받아 수정함.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

제브라피시 분석에서 최적이지 않은 결과에는 다음이 포함될 수 있습니다: (a) 배아당 파괴된 섬유가 50개 미만인 경우로, 이는 리포좀 품질 저하, Cas9 활성 부족 또는 부적절한 광량을 나타냅니다; (b) 배아 사망률이 20%를 초과하는 경우로, 이는 미세주입 중의 기계적 손상이나 과도한 VP 광독성을 시사합니다; 또는 (c) 조사하지 않은 대조군에서 섬유 파괴가 나타나는 경우로, 이는 리포좀 제형에서 화물이 조기에 누출되었음을 나타냅니다.

X선 유도 약물 전달 (파트 B):

Part B 프로토콜에 따라 준비된 VP/AuNP-liposome은 1–4 Gy 범위에서 용량 의존적인 calcein 방출을 보였습니다(그림 2A,B)11. HCT116 이종이식 모델에서, Dox가 적재된 VP/AuNP-liposome을 투여한 후 4 Gy X-선 조사를 수행한 마우스는 free Dox, X-선 단독 처리 및 조사되지 않은 liposome 대조군과 비교하여 유의미한 종양 성장 억제를 보였습니다(그림 2C)11. 종양 절편의 조직학적 분석 결과, H&E 염색으로 평가했을 때 병용 처리군에서 더 넓은 괴사 영역이 확인되었습니다(그림 2D).

X-선 표적 리포좀을 이용한 암 치료; calcein 방출, 종양 크기, 괴사 분석 그래프.
그림 2. X-선 유도 doxorubicin 방출 및 종양 성장 억제. (A) doxorubicin (Dox)을 함유한 verteporfin (VP)/금 나노입자 (AuNP) 통합 리포좀의 모식도. X-선 조사 시 AuNP 매개 에너지 전달을 통해 VP가 활성화되어 일항 산소를 생성하며, 이는 지질 이중층을 불안정하게 만들어 적재물의 방출을 유도한다. (B) X-선 조사량(0–4 Gy) 증가에 따른 리포좀의 calcein 방출 프로파일로, VP/AuNP-리포좀에서 용량 의존적인 적재물 방출이 나타남을 보여준다. 오차 막대는 4회 측정값의 표준편차를 나타낸다. (C) PBS, LipoDox, X-선 단독 또는 X-선 유도 LipoDox를 처리한 HCT116 이종이식 쥐의 종양 부피(왼쪽) 및 체중(오른쪽) 측정값. 데이터는 평균 ± SD (n = 그룹당 쥐 4마리)로 표시되었다. 통계적 유의성은 t-test (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001)를 사용하여 평가되었다. (D) 대표적인 haematoxylin 및 eosin (H&E) 염색 종양 절편과 평균 종양 괴사 영역의 형태학적 분석. 화살표는 대표적인 괴사 영역을 나타낸다. 박스 플롯은 중앙값과 사분위 범위를 나타내며, 수염은 1.5 × IQR까지 연장된다. 데이터는 t-test (n = 5)를 사용하여 분석되었다. 스케일 바 = 50 µm. Creative Commons Attribution 4.0 International License 조건에 따라 Deng et al.11에서 수정됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

제노그라프트 모델에서 나타날 수 있는 최적화되지 않은 결과는 다음과 같습니다: (a) 조사된 리포좀 그룹과 조사되지 않은 리포좀 그룹 간의 종양 성장 차이가 없는 경우로, 이는 VP 매개 방출이 불충분하거나 금 나노입자의 통합이 부적절했음을 나타냅니다. 또는 (b) 전신 독성(체중 감소 > 15%)이 나타나는 경우로, 이는 X-선 활성화 이전에 리포좀에서 Dox 누출이 발생했음을 시사합니다.

토론

본 프로토콜의 여러 단계가 성공을 위한 핵심 요소입니다. 파트 A에서는 지질 몰비(DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06)를 정밀하게 유지해야 합니다. VP 농도가 1O2 생성량과 그에 따른 화물 방출 효율9을 직접적으로 결정하기 때문입니다. 수성 코어 캡슐화를 위해서는 복합체 형성 후 결합시키는 방식이 아니라 수화 단계 중에 Cas9/sgRNA RNP를 로딩하는 것이 필수적입니다. 200 nm 폴리카보네이트 멤브레인을 통한 압출(11회 통과)은 균일한 단일층 소포를 생성하며, 초음파 처리는 Cas9 단백질을 변성시킬 수 있으므로 대체해서는 안 됩니다. 파트 B의 경우, 금 나노입자 크기(3–5 nm)가 매우 중요합니다. X선 조사 하에서 VP로의 효과적인 오제 전자 매개 에너지 전달을 위해서는 입자가 지질 이중층 내에 삽입될 수 있을 만큼 충분히 작아야 하기 때문입니다11. Dox 로딩에 사용되는 황산 암모늄 구배법은 약물을 첨가하기 전에 외부 황산 암모늄을 완전히 투석해야 하며, 투석이 불충분하면 로딩 효율이 감소합니다.

VP 매개 방출 메커니즘을 유지하면서 지질 조성은 다양한 응용 분야에 맞게 조정될 수 있습니다. 예를 들어, DOTAP의 일부를 PEG화된 지질(예: 5 mol%의 DSPE-PEG2000)로 대체하면 전신 투여 시 순환 시간이 개선될 수 있으나, 이는 표면의 양전하를 감소시켜 in vitro에서의 세포 섭취율을 낮출 수 있습니다2. DLS 측정 결과 PDI가 > 0.3으로 나타나면, 압출 횟수를 늘리거나 멤브레인의 무결성을 확인하십시오. VP가 정확하게 통합되었음에도 불구하고 일중항 산소 생성이 낮다면, VP 활성화는 파장에 특이적이므로(Soret 밴드의 경우 425 nm에서 최대 여기, Q-밴드의 경우 689–690 nm에서 치료 활성화) 교정된 파워미터로 LED 광원의 파장과 전력 밀도를 확인하십시오9. 제브라피시 분석에서 처리군의 배아 사망률이 20%를 초과하는 경우, VP 관련 광독성을 최소화하기 위해 주입 부피나 리포좀 농도를 줄이십시오. 표 1의 벤치마크를 기반으로 한 구조화된 문제 해결 프레임워크는 다음과 같습니다. PDI > 0.3: 압출 횟수를 늘리고 멤브레인 무결성을 확인하십시오. VP가 정확하게 통합되었음에도 유도 방출이 낮거나 없는 경우: 교정된 파워미터로 690 nm 출력을 확인하고 VP 몰비를 검증하십시오. 배아당 넉아웃된 완근섬유(slow-muscle fibre)가 ~50개 미만인 경우: 리포좀을 다시 제조하고, RNP 활성을 확인하거나, 조사 시간을 늘리십시오. 조사하지 않은 대조군에서 eGFP 신호가 소실된 경우: 리포좀 제조 후 48 h 이내에 사용하고 4°C 암소에 보관하여 저장 조건을 점검하며, 멤브레인 안정성을 확인하십시오. 제노그라프트 모델에서 조사군과 비조사 리포좀 군 사이에 차이가 없는 경우, 3–5 nm 금 나노입자의 내포 여부를 확인하고 전달된 X-선 선량을 검증해야 합니다.

빛 트리거 방식(Part A)의 주요 한계는 690 nm 빛의 투과 깊이이며, 이는 직접적인 활성화를 표면적으로 접근 가능한 조직이나 광섬유를 통한 빛 전달이 가능한 조직으로 제한합니다5. X선 트리거 방식(Part B)은 이러한 깊이 제한을 극복하지만, 임상용 선형 가속기 접근이 필요하며, 비록 치료 용량 내이긴 하지만 주변 조직을 전리 방사선에 노출시킵니다11,12. 현재 두 제형 모두 양이온성 지질인 DOTAP에 의존하고 있는데, 이는 용량 의존적 세포독성과 관련이 있어 전신 투여 시 치료 범위(therapeutic window)를 제한할 수 있습니다2. RNP 매개 유전자 편집의 일시적인 특성은 안전성 측면에서는 유리하지만, 표적 세포 집단에서 불완전한 녹아웃(knockout)이 일어난 경우 나노입자를 다시 투여하지 않고서는 동일 부위의 반복 투여로 이를 보완할 수 없음을 의미합니다. 또한, 본 프로토콜들은 세포주 및 소동물 모델에서 검증되었으며, 대동물 모델로의 확장 및 궁극적으로 인간 임상 적용을 위해서는 제형 최적화, 약동학 연구 및 GLP 조건 하에서의 공식적인 독성 평가가 필요할 것입니다. 특히, 본 프로토콜에는 약동학, 생체 분포 또는 망막 투과 데이터가 포함되어 있지 않습니다. 안구 및 기타 조직을 통한 빛 투과는 파장, 색소 침착 및 조직에 따라 달라진다는 점이 문헌에 잘 기술되어 있으며(광학 투명화 제제로 보완 가능), 정량적인 약동학, 생체 분포 및 망막 전달 연구는 중개 연구로서의 주장을 입증하기 위해 수행되어야 할 중요한 다음 단계입니다.

mRNA 백신에 사용되는 시스템을 포함한 기존의 LNP 시스템은 세포 섭취 후 엔도좀 탈출을 통해 화물을 수동적으로 방출하며, 전달에 대한 시간적 또는 공간적 제어가 불가능합니다1,2. AAV와 같은 바이러스 벡터는 효율적인 유전자 전달을 제공하지만, 포장 용량(~4.7 kb)의 제한, 재투여 시의 면역원성, 그리고 투여 후 조절이 불가능한 구성적 트랜스진 발현이라는 한계가 있습니다3. VP-리포좀 플랫폼은 화물 종류와 관계없이 외부에서 제어 가능한 방출 메커니즘을 제공함으로써 이러한 제한 사항을 해결하며, 대용량 페이로드(단백질, RNP 복합체 및 저분자 화합물)와 호환 가능하고, 비바이러스성으로서 반복 투여 면역원성 및 독성 연구 결과에 따라 잠재적으로 반복 투여가 가능합니다 . 광유전학 또는 열 응답성 시스템과 달리, VP 기반 접근 방식은 안전성 데이터가 확립되어 임상적으로 승인된 광감각제와 기존의 임상 레이저 인프라를 활용하며, 특히 689 nm Visudyne 레이저가 이미 표준 장비로 사용되는 안과 분야에서 유용합니다6. Sang 등은 VP 함유 지질-폴리머 하이브리드 나노입자가 대장암 모델에서 방사선 동역학 치료 효능을 향상시킨다는 것을 추가로 입증하여, 서로 다른 나노입자 구조 전반에서 VP 매개 ROS 생성의 적응성을 확인하였습니다12.

본문에 기술된 방법들은 세 가지 안과 질환과 특별한 관련이 있습니다. 신생혈관성 AMD의 경우, anti-VEGF 주사의 부담은 최적의 결과를 얻는 데 있어 여전히 결정적인 장벽입니다. 실제 임상 등록 데이터에 따르면 임상 시험 프로토콜에 비해 현저한 과소 치료가 나타났으며(1년 차 평균 주사 횟수가 12회 대비 7.3회였고, 환자의 38.8%가 치료를 중단했으며 시력 개선이 미미함)14, 빈번한 투여에도 불구하고 장기적인 시력 저하가 관찰되었습니다23. 이러한 부담을 줄이기 위해 개발 중인 AAV 유전자 치료제인 ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416, 그리고 RMAT로 지정된 4D-150(주사 횟수 83% 감소)24는 그럼에도 불구하고 anti-VEGF 트랜스진을 구성적으로 발현하며, 용량을 조절하거나 투여를 중단할 수 없습니다. 이는 지속적인 VEGF 억제가 지리적 위축과 연결된다는 증거(CATT17; 4,609안 대상 메타 분석18; 8년에 걸쳐 위축 유병률이 78.3%까지 상승25)를 고려할 때 잠재적인 우려 사항입니다. 대신 VEGF-A를 표적으로 하는 CRISPR-Cas9을 탑재한 빛 유도 VP-리포좀 시스템은 공간적으로 제한된 유전자 넉아웃을 가능하게 하여, 유전자 편집의 지속성을 유지하면서도 임상의가 초기 편집 이벤트의 공간적 및 시간적 게이팅을 제어할 수 있게 합니다. 전임상 연구는 이 접근법의 타당성을 뒷받침합니다. VEGFA를 표적으로 하는 Cas9 mRNA와 sgRNA의 LNP 공동 전달은 마우스의 레이저 유도 맥락막 신생혈관(CNV)을 감소시켰으며26, PEG 변이 LNP는 망막 색소 상피(RPE)에서 게놈 편집을 달성했고27, 펩타이드 유도 LNP는 비인간 영장류의 광수용체에 mRNA를 전달했습니다28. 그러나 2026년 초 기준으로 LNP 기반의 망막 유전자 치료제는 아직 임상 시험에 진입하지 않았으며29, 이는 중개 연구의 기회가 있음을 시사합니다. 스타가르트병의 경우, 약 6.8 kb의 ABCA4 코딩 서열이 AAV 포장 용량을 초과하여, 전달 효율이 낮은 이중 벡터 전략이 필요합니다19. 임상 후보 물질로는 이중 AAV 플랫폼인 SB-007 및 VG80130과 유전자 불가지론적 수정 치료제인 OCU410ST31가 있습니다. 비바이러스성 핵산 전달은 AAV 포장 제한을 우회할 수 있습니다. ABCA4 플라스미드를 탑재한 PEG-ECO 나노입자는 Abca4-/- 마우스에서 A2E 축적을 감소시켰으며20, 별도의 연구들을 통해 거대 망막 DNA 구조체의 전달32 및 안구 조직에서의 LNP 매개 mRNA 발현이 입증되었습니다33. 황반과 중심와에 대한 국소적 치료만으로 중심 시력을 보존하기에 충분하므로, VP-리포좀은 유전자 치료 화물을 이러한 영역에 정밀하게 고농도로 전달하는 데 매우 적합합니다. 포도막 흑색종의 경우, verteporfin은 세 가지 상호 보완적인 메커니즘을 통해 작용합니다: PDT 매개 세포 독성, YAP/TAZ 경로 억제(YAP1 발현이 가장 강력한 전이 마커인 3번 염색체 단일염색체성 및 BAP1 소실과 상관관계가 있음)21, 그리고 cGAS-STING 활성화를 통한 면역원성 세포 사멸입니다. VP 매개 YAP 억제 및 PDT를 anti-PD-L1 치료와 결합했을 때, 면역학적으로 cold tumor였던 종양이 immunologically active tumor로 전환되어, 정위 모델에서 종양 성장이 현저히 억제되고 생존 기간이 연장되었습니다22. 이러한 결과는 맥락막 흑색종의 1차 치료제로서 verteporfin 기반 PDT의 보고된 80% 반응률과 일치합니다34. 689 nm 활성화를 위한 안구의 광학적 접근성과 대부분의 포도막 흑색종의 명확한 위치는, VP-리포좀을 국소적 치료를 전달하는 유망한 플랫폼으로 자리매김하게 하며, 현재의 근접 치료 및 양성자 빔 접근 방식과 관련된 이환율을 잠재적으로 줄일 수 있게 합니다.

앞서 논의한 안과 및 종양학적 응용 분야 외에도, VP-리포좀 플랫폼은 외부에서 제어되는 온디맨드(on-demand) 페이로드 방출이 필요한 모든 치료 상황에 적용 가능합니다. 잠재적인 응용 분야로는 경피 조사가 가능한 피부과 질환에서의 빛 유도 유전자 편집, 임상 방사선 치료 분할 일정에 맞춘 X-선 유도 화학요법 약물 방출, 그리고 발생 생물학 연구를 위한 공간 패턴 유전자 넉아웃 등이 있습니다. 비망막 조직에서는 이미 여러 광활성화 유전자 편집 시스템이 입증되었으며, 여기에는 생체 내 시공간적 제어 게놈 편집을 위한 Mag-ABE 광활성화 염기 편집기35와 시공간적 제어 CRISPR-Cas9 편집 및 광역학 치료를 위한 NIR 활성화 업컨버전 나노입자 시스템36이 포함됩니다. 안과 분야에서는 지속적인 VEGF 억제 전략에 대한 관심이 높아짐에 따라, 장기적인 치료 효능과 생물학적 활성의 시점 및 위치에 대한 외부 제어를 결합한 전달 시스템의 필요성이 더욱 부각되고 있습니다37. 이러한 제조 방법과 최신 망막 LNP 전달 기술 및 광활성화 유전자 편집 시스템의 통합은 개별적으로 검증된 구성 요소들의 융합을 의미하며, 이를 눈에 결합하여 적용하는 것은 여전히 개방되어 있고 잠재적으로 영향력이 큰 연구 분야입니다. 저희 연구 그룹의 현재 연구는 망막하 및 유리체 내 전달 경로를 위한 제형 최적화, 대동물 안구 모델에서의 안전성 프로파일 평가, 그리고 임상 종양학의 표준 방사선 치료 프로토콜과 동시에 사용할 수 있도록 X-선 유도 모달리티를 적응시키는 방향으로 진행되고 있습니다.

공개 사항

Y.A.A.는 본 문서에 기술된 빛 활성 지질 나노입자 기술과 관련된 특허를 보유한 EosGene Therapeutics Pty Ltd의 이사이자 공동 설립자입니다. E.M.G.와 W.D.는 EosGene Therapeutics의 공동 설립자입니다.

감사의 글

저자들은 맥쿼리 대학교 제브라피쉬 시설(제브라피쉬 관련 연구)과 맥쿼리 대학교 동물 윤리 위원회에서 제공한 시설 및 기술 지원에 감사를 표합니다. 본 연구는 ARC 나노스케일 바이오포토닉스 우수 센터(CE140100003)의 부분적인 지원을 받았습니다. 또한 저자들은 EosGene Therapeutics Pty Ltd.의 지원에 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
20 nm 여과 막 (Anotop 10 또는 동등 제품)Whatman (Cytiva)N/A봉입 효율 측정 중 유리 Cas9의 분리에 사용
690 nm LED 광원ThorlabsM690L4VP 매개 리포좀 화물 방출을 유도하기 위한 광원; 출력 밀도 조절 가능
항생제–항진균제 (100X)Thermo Fisher Scientific15240062세포 배양 보충제; 최종 농도 1%
아르곤 가스 실린더 및 레귤레이터N/AN/A지질 막 준비 중 용매 증발에 사용
Avanti Mini ExtruderAvanti Polar Lipids610000리포좀 크기 표준화를 위해 200 nm 폴리카보네이트 막과 함께 사용하는 수동 압출 시스템
BALB/c nude 마우스 (암컷, 5–6주령)Animal Resources CentreN/AHCT116 제노그래프트 종양 모델에 사용되는 면역결핍 마우스
BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificN/A유리 Cas9의 정량 및 봉입 효율 측정에 사용
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad Laboratories12003154겔 및 웨스턴 블롯 이미징 시스템
CalceinSigma-AldrichC0875방출 분석용 형광 염료; 고농도에서 자가 소광됨
Cary 5000 UV-Vis-NIR SpectrophotometerAgilent TechnologiesN/A리포좀 및 버테포르핀의 UV-Vis 흡수 분광법 측정
CCD841 CoN 세포 (인간 정상 결장 상피)ATCCCRL-1790정상 결장 상피 세포주; 비암성 대조군으로 사용
클로로포름Sigma-Aldrich288306지질 막 준비를 위한 유기 용매
콜레스테롤Sigma-AldrichC8667광 유도 제형에 사용되는 리포좀 막 성분
임상용 선형 가속기 (6 MeV 광자 빔)Varian Medical SystemsN/A조사 연구를 위한 임상용 X-선 광원
디지털 캘리퍼스N/AN/A제노그래프트 종양 부피 측정에 사용
디메틸 설폭사이드 (DMSO)Sigma-Aldrich472301버테포르핀 스톡 준비를 위한 용매
DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850375PX-선 유도 제형에 사용되는 지질 성분
DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)Sigma-AldrichP1223광 유도 제형에 사용되는 헬퍼 지질
DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)Avanti Polar Lipids890890P두 제형 모두에 사용되는 양이온성 지질
독소루비신 염산염Sigma-AldrichD1515X-선 유도 리포좀에 적재되는 화학요법 약물
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PX-선 유도 제형에 사용되는 PEG화 지질
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092HEK293 및 PC12 세포용 세포 배양 배지
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144세척 완충액
소태아혈청 (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141세포 배양 보충제; 최종 농도 10%
Fluorolog-Tau3 SpectrofluorometerHORIBA ScientificN/A버테포르핀 특성 분석을 위한 형광 분광법 측정
포커스 스태킹 소프트웨어 (예: Zerene Stacker)N/AN/A제브라피쉬 이미징 시 포커스 스태킹 이미지 생성에 사용
동결 건조기 (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/A진공 건조 및 용매 제거에 사용
GFP sgRNAThermo Fisher ScientificA35943eGFP를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA; 녹아웃 검증에 사용
금 나노입자 (3–5 nm, 시트르산 안정화)NanoComposixN/AX-선 유도 제형에 사용되는 방사선 증강제
GraphPad PrismGraphPad Software7.0통계 분석 및 데이터 시각화
HCT116 세포 (인간 대장암)ATCCCCL-247in vitro 및 in vivo 연구에 사용되는 대장암 세포주
HEK293/GFP 세포GenTargetSC001CRISPR 녹아웃 검증에 사용되는 GFP 안정 발현 세포주
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570핵 염색제; 작동 농도 5 µg/mL
이미지 분석 소프트웨어 (예: Imaris)Bitplane (Oxford InstrumentsN/A녹아웃된 완만 근섬유의 정량 분석에 사용
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open source이미지 분석 소프트웨어
도립 형광 현미경Leica MicrosystemsDMi3000제브라피쉬 리포터 이미징 및 GFP 형광 평가에 사용
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging SystemPerkinElmer128201in vivo 형광 이미징 시스템
JEOL JEM-1400 투과 전자 현미경JEOLJEM-1400리포좀의 TEM 이미징
Leica SP2 공초점 현미경Leica MicrosystemsN/A세포 흡수의 공초점 이미징
저융점 아가로스N/AN/A이미징 중 제브라피쉬 배아 고정에 사용
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019양성 대조군으로 사용되는 형질전환 시약
Living Image 소프트웨어PerkinElmerN/A이미지 획득 및 분석 소프트웨어
McCoy's 5A 배지Thermo Fisher Scientific16600082HCT116 세포용 세포 배양 배지
미세주입 시스템N/AN/A제브라피쉬 배아 1세포기 미세주입에 사용
MTS 세포 증식 분석법PromegaG3582세포 생존능 분석
NanoDrop 분광광도계Thermo Fisher ScientificND-2000RNA 순도 및 농도 측정
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0582CRISPR-Cas9 RNP 준비에 사용
Opti-MEM 저혈청 배지Thermo Fisher Scientific31985070형질전환 배지
파라포름알데히드 (4%)Sigma-AldrichP6148조직학적 분석을 위한 고정제
PC12 세포 (쥐 갈색세포종)ATCCCRL-1721흡수 연구에 사용되는 신경세포 유사 세포주
폴리카보네이트 막 필터 (200 nm)Avanti Polar Lipids610006리포좀 크기 조절을 위한 압출 막
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134RNA 추출 키트
Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002일중항 산소 검출용 형광 프로브
Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치 (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570리포좀 준비 및 약물 적재를 위한 투석 장치
SYBR Gold 핵산 겔 염색제Thermo Fisher ScientificS11494핵산 겔 염색제
Tg(ubi:EGFP) 제브라피쉬Zebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2in vivo CRISPR 검증에 사용되는 형질전환 제브라피쉬
TNF-α (인간 재조합)Life TechnologiesRTNFAITNFAIP3 유도 연구에 사용되는 사이토카인
TNFAIP3 sgRNAThermo Fisher ScientificN/ATNFAIP3를 표적으로 하는 sgRNA
트리카인 메탄설포네이트 (MS-222)N/AN/A이미징 전 제브라피쉬 마취제로 사용
Triton X-100Sigma-AldrichT8787리포좀 용해 및 방출 분석에 사용되는 계면활성제
TrueCut Cas9 단백질 v2Thermo Fisher ScientificA36498CRISPR-Cas9 RNP 준비에 사용되는 Cas9 뉴클레아제
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific25200056세포 해리 시약
우라닐 아세테이트 (2%)Electron Microscopy Sciences22400TEM 이미징을 위한 음성 염색제
버테포르핀Sigma-AldrichSML0534-5MG리포좀 제형에 통합된 광감작제
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600동적 광산란 및 제타 전위 측정

참고문헌

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