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연구 논문

HepG2 세포 및 NOD/SCID 마우스 이종이식 모델에서 소라페닙과 젬시타빈 병용 치료의 평가: 파일럿 연구

73 조회수

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DOI:

10.3791/71790

⸱

2026년 8월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, the Fourth Affiliated Hospital of School of Medicine, and International School of Medicine, International Institutes of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여는 HepG2 세포 증식의 가산적 억제에 대한 예비적 증거를 보여주며, p-ERK 및 VEGF 발현의 상관관계적 변화를 나타내고, NOD/SCID 마우스에서 간암 조직의 성장을 억제합니다.

초록

간암은 약물 내성과 제한적인 치료 옵션으로 인해 암 관련 사망의 주요 원인으로 남아 있습니다. 이에 따라 치료 결과를 개선하기 위한 치료 전략 탐구가 시급한 실정입니다. 본 파일럿 연구는 간암에서 sorafenib과 gemcitabine 병용 투여의 잠재적 효과와 그 기저 기전을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 간암 세포주인 HepG2를 사용하였으며, 비만성 당뇨/중증 복합 면역결핍(NOD/SCID) 마우스 이종이식 모델을 구축하였습니다. 주요 절차 단계로는 (1) HepG2 세포 배양 및 약물 처리, (2) MTT 분석 설정, 배양 및 흡광도 측정, (3) 단백질 추출, SDS-PAGE, 트랜스퍼 및 ERK와 p-ERK에 대한 면역블로팅, (4) NOD/SCID 마우스의 피하 이종이식 구축, (5) 종양 측정 및 부피 계산, (6) 종양 절편의 VEGF 면역조직화학 염색이 포함됩니다. 핵심 단계, 문제 해결 팁 및 장비 사양이 함께 제공됩니다. sorafenib(3 µmol/L)과 gemcitabine(10 µmol/L)의 병용 투여는 72 h에서 71.23% ± 6.76%의 억제율을 보였으며, q-값은 1.35로 나타나 테스트 조건의 특정 용량 조합에서  상승 효과 가 있음을 시사합니다. 대조군과 비교했을 때, 병용 치료는 p-ERK 발현 감소, 종양 부피 감소 및 정성적으로 더 낮은 VEGF 면역 염색과 관련이 있었습니다. 이러한 데이터는 p-ERK 발현 감소와 관찰된 항증식 효과 사이의 상관 관계를 보여주지만, 인과 관계를 입증하는 것은 아닙니다. HepG2 세포와 NOD/SCID 마우스 이종이식 모델에서 sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여는 항증식 잠재력의 예비 근거를 보여주며 VEGF 발현 감소와 관련이 있습니다. 다만, 미세혈관 밀도나 기능적 혈관 분석이 수행되지 않았으므로, 이 결과가 항혈관형성 활성의 직접적인 증거가 되지는 않습니다. 이 재현 가능한 프로토콜은 HCC 모델에서 약물 병용 투여를 평가하는 유용한 틀을 제공하며 다른 표적 치료-화학요법 요법으로 응용될 수 있으나, 임상적 함의를 도출하기 전 추가적인 기전 연구 및 용량 검증 연구가 필요합니다.

서론

간암은 가장 흔하고 치명적인 암 중 하나이며, 가장 빠르게 성장하는 악성 종양 중 하나이기도 합니다1,2. 간암의 발생률은 감소하고 있으나, 간암으로 인한 전반적인 부담은 계속해서 증가하고 있습니다. 2022년 글로벌 역학 데이터에 따르면, 글로벌 암 관측소(GLOBOCAN) 2022 온라인 데이터베이스의 간암 연령 표준화 발생률은 인구 100,000명당 15.0명이었으며, 연령 표준화 사망률은 인구 100,000명당 26.7명으로 나타나 암 사망 원인 중 두 번째로 높은 비중을 차지했습니다3. 현재 간암에 대한 효과적인 치료법의 부족과 잠행성 발병 특성으로 인해, 대부분의 환자가 진단 후 1년 이내에 사망합니다. 소라페닙(Sorafenib)은 임상적으로 승인된 최초의 다중 표적 키나제 억제제로, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 및 세린/트레오닌 키나제와 같은 수용체 티로신 키나제를 표적으로 합니다4,5. 경구용 다중 키나제 억제제인 소라페닙은 여러 성장 인자 경로를 표적으로 하여 간암에서 항증식 및 항혈관신생 효과를 나타냅니다. 과거에 소라페닙은 진행성 또는 절제 불가능한 간암 환자를 위해 FDA가 승인한 최초의 1차 전신 요법이었습니다6. 그러나 현재 진행성 간세포암(HCC)의 1차 치료 환경은 크게 확장되었습니다. 현재 권장되는 옵션에는 면역 관문 억제제 조합인 아테졸리주맙 플러스 베바시주맙, 렌바티닙, 그리고 이중 면역 요법 조합인 더발루맙 플러스 트레멜리무맙 등이 포함됩니다. 이러한 발전에도 불구하고, 면역 요법 조합을 쉽게 사용할 수 없거나 금기시되는 지역에서는 소라페닙이 여전히 중요한 1차 선택지로 남아 있습니다. 간암에서 널리 사용됨에 따라 약물 관련 이상 반응이 우려되어 왔습니다7. 2006년부터 2023년까지의 FDA 이상 사례 보고 시스템(FAERS) 데이터베이스 분석에서 소라페닙의 이상 반응은 주로 소화기계, 피부 및 피하 조직, 그리고 감염 및 손상과 같은 비특이적 신체적 불편함과 관련이 있는 것으로 나타났습니다7. 일부 진행성 간암 환자는 소라페닙 치료로 이득을 얻을 수 있지만, 대부분의 환자는 결국 내성이 생기거나 치료에 실패하여 좋지 않은 예후를 보입니다8,9,10. 사용 사례에도 불구하고 소라페닙은 HCC 환자의 약 30%에게만 효과가 있으며, 반응군조차 6개월 이내에 내성을 발달시키는 경우가 많습니다11. 소라페닙 내성에 관여하는 분자 경로는 세포 외 신호 조절 키나제(ERK)/인산화된 ERK(p-ERK), 단백질 키나제 B(Akt), 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K)/AKT/포유류 라파미신 표적 단백질(mTOR), 저산소 유도 인자 1α(HIF-1α)/HIF-2α 및 자가포식 관련 경로를 포함하며, 본 연구에서는 특히 ERK/p-ERK를 강조하여 선정하였습니다11. 젬시타빈(Gemcitabine)은 시티딘 유사체로, 체내에 들어가 디플루오로시티딘 이인산과 디플루오로시티딘 삼인산을 생성하여 DNA 합성에 서로 다른 억제 효과를 나타냅니다12. 간담도 악성 종양에서 젬시타빈은 병용 화학요법의 구성 요소로 평가되어 왔습니다. 그러나 젬시타빈은 임상적으로 더 큰 약물 내성을 보이는 것으로 보고되어 젬시타빈의 효과가 제한되었습니다12,13. 따라서 최적의 약물 요법을 효과적이고 효율적으로 결정하는 것은 매우 어려운 과제입니다. 최근 연구에 따르면 새로운 종양 줄기세포성 바이오마커 예측을 기반으로 젬시타빈과 소라페닙의 병용 요법이 치료 효능을 높일 수 있음이 밝혀졌습니다14. 하지만 저희가 알기로는 HepG2 세포와 비만형 당뇨병/중증 복합 면역 결핍(NOD/SCID) 마우스 간세포암 이종 이식 모델을 사용하여 간암에서 이 조합을 구체적으로 조사한 연구는 없었습니다. 따라서 간암에서 소라페닙과 젬시타빈의 가산 효과를 직접적으로 입증하는 실험적 근거가 여전히 부족한 실정입니다.

본 논문에서 설명하는 절차들은 널리 사용되고 있으나, 신진 연구자들이 재현할 수 있을 만큼 상세하고 시각적인 단계별 형식으로 제시되는 경우는 드뭅니다. 본 연구진은 sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여가 간암 세포의 증식과 종양 성장을 가산적으로 억제하며, 이러한 효과가 ERK/p-ERK 경로의 하향 조절 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 매개 혈관 신생의 감소와 관련이 있을 것이라고 가설을 세웠습니다. 본 연구의 목적은 in vitro 및 in vivo에서 HepG2 간암 세포주 증식에 대한 sorafenib과 gemcitabine 병용 투여의 억제 효과와 그 기전을 예비적으로 탐색하는 것입니다(Supplementary Figure 1). 본 연구의 독창성은 다음 세 가지 측면에 있습니다. (1) 널리 사용되는 HepG2 세포주와 그에 상응하는 NOD/SCID 마우스 모델을 사용하여 간암에서 sorafenib-gemcitabine 병용 요법을 구체적으로 테스트한 최초의 연구라는 점, (2) 잠재적 기전으로서 연구가 미진했던 ERK/p-ERK 경로를 조사했다는 점, (3) 계산적 예측이 아닌 직접적인 실험적 근거를 통해 간암에서 이 병용 요법의 가산적 효과를 입증했다는 점입니다. 이러한 특징들은 다른 종양 유형이나 다른 실험 모델을 사용하여 수행된 기존의 병용 요법 보고서, 특히 sorafenib 기반 요법과 본 연구를 차별화합니다.

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프로토콜

윤리적 승인은 Zhejiang University-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review(승인 번호 ZJU20250049)로부터 제공되었습니다.

동물 및 그룹화

면허를 보유한 상업적 공급업체(면허 번호 SCXK (Shanghai) 2013-0006)로부터 구입한 4~5주령, 체중 18~20 g의 암컷 NOD/SCID 마우스 총 40마리를 특정 병원균 제거(SPF) 등급의 동물실에 수용하였다. 모든 동물 실험 프로토콜은 표준 가이드라인을 준수하였다. 실험 기간 동안 동물들은 자유롭게 먹이와 물을 섭취할 수 있도록 하였으며, 온도 22 ± 2 °C, 습도 50%~60%, 12/12시간 명/암 주기가 유지되는 잘 제어된 SPF실 내에 그룹별(케이지당 5마리)로 수용하였다. 동물들에게 사료와 물을 자유롭게 제공하였으며, 2주마다 체중을 모니터링하였다. 마우스가 지속적인 통증, 악액질, 종양 궤양을 보이거나 종양 크기가 최대 2 cm에 도달한 경우, 또는 기타 가역적이지 않은 건강 문제가 발생한 경우, 동물윤리위원회가 승인한 인도적 종료 기준에 따라 체중 kg당 ≥150 mg의 0.45% 펜토바르비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 안락사를 시행하였으며, 이후 호흡 및 심박 정지, 각막 반사 소실을 확인하거나 필요한 경우 보조적인 물리적 방법을 적용하였다. 표본 크기(그룹당 n = 10)는 파일럿 실험에서 도출된 효과 크기 1.2, α = 0.05, β = 0.20(검정력 80%)을 가정한 검정력 분석과 20%의 소실 허용치를 기반으로 결정하였다. 종양 이식 절차는 치료군 할당 전에 수행되었다(제노그라프트 구축은 아래 참조).

종양 이식 및 종양 생착 확인 후, 난수표 방법을 이용하여 마우스를 대조군, sorafenib군, gemcitabine군, 그리고 sorafenib-gemcitabine 병용 투여군의 4개 그룹으로 무작위 배정하였으며, 각 그룹당 10마리(케이지당 5마리)를 배치하여 NOD/SCID 마우스 이식 종양 모델을 구축하였다. 모델링 과정 중 종양 조직으로 인해 NOD/SCID 마우스의 전신 상태가 악화되거나 심지어 사망할 수 있으며, 통계 분석에 일반적으로 유효한 표본 크기가 필요하다는 점을 고려하여 각 그룹에 최소 10마리를 포함시켰다. 무작위 그룹 배정은 독립적인 기술자에 의해 수행되었으며 케이지에 라벨을 부착하였다. 약물 투여 및 종양 측정 시 블라인딩을 실시하지 않았으며, 이는 중요한 한계점이다. 나머지 조직 샘플링, 생화학 및 병리학적 평가는 모두 블라인딩 처리된 실험실 인원에 의해 수행되었다. 데이터 또한 통계 분석이 완료되고 데이터 블라인딩이 해제될 때까지 인코딩된 파일에만 접근할 수 있었던 통계 전문가에 의해 블라인딩 분석되었다. 모든 동물은 최종 분석에 포함되었다. 전신 흡수와 일관된 생체 이용률을 보장하기 위해 두 약물 모두 복강 내 투여 경로를 선택하였으며, 1일 1회 투여는 이 요법에서 지속적인 혈장 농도가 나타난 이전의 약동학 연구를 기반으로 하였다. 차량 대조군에는 0.2 mL의 멸균 생리식염수를 복강 내 주사하였다. sorafenib군에는 40 mg/kg sorafenib 0.2 mL를 복강 내 주사하였다. gemcitabine군에는 100 mg/kg gemcitabine 0.2 mL를 복강 내 주사하였다. 병용 투여군에는 40 mg/kg sorafenib 0.2 mL와 100 mg/kg gemcitabine 0.2 mL를 각각 복강 내 투여하였다. 각 그룹에 20일 동안 매일 1회 투여하였다. 모든 동물은 최종 분석에 포함되었으며, 연구에서 제외된 마우스는 없었다. 20일의 치료 기간 동안 어떤 그룹에서도 사망 사례는 관찰되지 않았다. 투여 일정과 용량은 간담도암 모델에 관한 기발표 연구를 기반으로 선택하였다. gemcitabine의 매일 복강 내 투여는 독성을 유발할 수 있음에 유의해야 한다. 이식된 종양의 길이와 너비를 매일 측정하고 이식 종양의 부피를 계산하였다. 20일 후, 동물들을 깊은 마취 하에 경추 탈골법으로 안락사시키고 이식된 종양 조직을 포르말린에 고정하였다. 연구 전 기간 동안 2일마다 체중을 측정하였다. 마우스의 입모, 굽은 자세, 운동성 감소, 설사 및 기력 저하를 포함한 임상적 독성 징후를 매일 모니터링하였다. 그러나 혈청 생화학 검사(예: alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase 및 creatinine)와 주요 장기의 조직병리학적 검사는 수행하지 않았다. 따라서 잠복 독성을 배제할 수 없다.

약물 및 시약

Sorafenib은 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 -20 °C에서 보관하였다. 사용 전, 용액을 해동하고 최종 DMSO 농도가 세포 성장에 영향을 주지 않는 0.5% 미만이 되도록 희석하였다. Gemcitabine은 상용 제품을 구입하였다. Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer, thiazolyl blue, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK 및 VEGF에 대한 1차 항체, 2차 항체, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high-glucose 배지, fetal bovine serum 및 HepG2 세포주는 상용 제품을 구입하였다.

Sorafenib과 gemcitabine은 세포독성 제제입니다. 모든 약물 조제 및 취급 절차는 적절한 개인 보호 장구(실험복, 니트릴 장갑 및 안전 고글)를 착용한 상태에서 지정된 생물안전 작업대 내에서 수행해야 합니다. 본 프로토콜에 사용되는 DMSO, methanol, xylene 및 기타 유기 용매는 위험 물질이므로 흡입이나 피부 접촉을 피하기 위해 흄 후드 내에서 취급해야 합니다. 사용 전 모든 시약에 대한 물질안전보건자료(MSDS)를 검토해야 합니다.

세포 배양

HepG2 세포주를 회복시켜 10 mL의 DMEM high-glucose 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin-streptomycin 및 4 mmol/L glutamine 보충)가 담긴 세포 배양 병에 접종하였습니다. 세포는 5% CO₂가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 배양하였습니다. 배양액은 2일마다 교체하였으며, 로그 성장기를 유지하기 위해 4일마다 세포를 계대 배양하였습니다. HepG2 세포주는 상용 공급처로부터 구입하였으나, 본 연구에서는 독립적인 세포주 인증(예: short tandem repeat profiling) 및 마이코플라스마 검사를 수행하지 않았습니다.

증식 억제율 검출을 위한 MTT 방법

HepG2 세포주에 대한 sorafenib과 gemcitabine의 증식 억제율을 결정하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)법을 사용하였다. 대수 성장기에 있는 세포를 0.25% trypsin으로 2분간 처리하여 소화시켰으며, 동일한 부피의 완전 배지를 첨가하여 소화를 중단시켰다. 1000 × g에서 10분간 원심분리한 후, 세포를 완전 배지에 재현탁하였다. 세포 밀도를 1 × 105 cells/mL로 조정하고, 96-well 플레이트의 각 well에 세포 현탁액 200 µL를 분주하였다. 이 분주 밀도는 5 × 103에서 5 × 104 cells/well 범위의 세포 밀도를 테스트한 사전 최적화 실험을 바탕으로 선정하였다. 2 × 104 cells/well의 밀도에서는 96시간 동안 흡광도가 선형적으로 증가하였으며, 도립 현미경으로 관찰한 결과 종료 시점에서 confluence가 80% 미만으로 유지되었다. MTT 측정값이 선형 범위 내에 있도록 하기 위해, 각 시점마다 용매 처리된 대조군 well을 사용하여 예비 실험을 수행하였다. 영양분 고갈과 대사 부산물의 축적을 방지하기 위해 48시간마다 배지를 교체하였다. 도립 현미경을 사용하여 매일 confluence를 모니터링하였다. 96시간째에 대조군 well은 약 75%–80%의 confluence에 도달하였으며, 뚜렷한 영양분 고갈 징후는 관찰되지 않았다. 세포 부착 후 배지를 제거하고 약물이 포함된 배지를 첨가하였다. 처리하지 않은 대조군(in vivo 실험을 위한 용매 대조군)에는 약물이 없는 배지를 첨가하였다. 실험은 무처리 대조군, sorafenib군, gemcitabine군, 병용 투여군으로 나누어 진행하였다. sorafenib의 농도는 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/L, 6 µmol/L였으며, gemcitabine의 농도는 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L, 20 µmol/L였다. sorafenib과 gemcitabine을 병용한 농도는 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/L, 6 µmol/L + 20 µmol/L였다. 각 군의 세포를 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 well에 5 mg/mL MTT 20 µL를 첨가하고 세포 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 각 well에 DMSO 150 µL를 첨가하고 10분간 흔들어 formazan을 완전히 용해시켰으며, 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 각 well의 광학 밀도(OD) 값을 측정하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 각 군당 5개의 반복 well을 두었다. 데이터는 3회 생물학적 반복 실험의 평균 ± SD로 표시하였다. 세포 성장 억제율 (%) =(1 - OD 실험군 /OD 무처리군）× 100%로 계산하였다. 두 약물 간의 상호작용은 다음 공식으로 계산된 q-값으로 판단하였다: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). 여기서 EA와 EB는 약물 A와 B를 단독으로 사용했을 때의 억제율이며, EAB는 두 약물을 함께 사용했을 때의 억제율이다. q값이 1.15보다 크면 두 약물 간의 시너지 효과를 나타내며, 0.85–1.15는 가산 효과를, q값이 0.85보다 작으면 길항 효과를 나타낸다. q-값 방법은 간단한 스크리닝 도구이며 더 엄격한 시너지 분석을 대체하지 않는다. 몇 가지 고정 비율의 농도 쌍만 테스트되었으므로 시너지 주장의 강건함에 한계가 있다. 따라서 본 연구에서 “시너지”라는 용어는 전체 용량-반응 매트릭스에 걸쳐 검증된 가산 상호작용이 아니라, 특정 농도 쌍과 시점에서 q > 1.15임을 의미한다.

ERK 및 p-ERK 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석

세포 배양 및 실험군 설정은 위에서 설명한 대로 수행되었다. Western Blotting을 통한 ERK 및 p-ERK 검출을 위해 sorafenib의 농도는 3 µmol/L, gemcitabine의 농도는 10 µmol/L, 그리고 병용 투여 농도는 3 µmol/L + 10 µmol/L로 설정하였다. 72시간 처리 후, RIPA lysis buffer를 사용하여 세포를 용해시켰으며, 각 실험군에서 총 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 bicinchoninic acid (BCA)법으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질(레인당 30 µg)을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 통해 120 V에서 90분 동안 로딩 및 분리하였다. 단백질은 0.45 µm 공극 크기의 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 300 mA에서 90분 동안 4 °C에서 전이시켰다. 0.1% Tween-20이 포함된 Tris-buffered saline (TBST) 내의 5% non-fat milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹한 후, 막을 1차 항체와 함께 4 °C에서 완만하게 흔들어주며 하룻밤 동안 반응시켰다. TBST로 3회 세척(각 10분)한 후, 막을 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence (ECL) 기질을 사용하여 시각화하였으며, 디지털 젤 이미지 시스템을 사용하여 촬영하였다. 포화를 방지하기 위해 각 항체에 대해 노출 시간을 최적화하였다. 밀도 측정 정량 분석은 ImageJ 소프트웨어의 젤 분석 도구를 사용하여 수행하였다. 모든 표적 단백질 밴드 강도는 로딩 컨트롤인 GAPDH로 표준화하였으며, p-ERK 발현은 총 ERK 발현으로 추가 표준화하였다. 5% non-fat milk 외에 추가적인 블로킹 단계는 수행하지 않았다. 정량 결과는 1.0으로 설정된 대조군 대비 배수 변화(fold change)로 나타내었다. 각 실험은 독립적으로 3회 반복되었다. 대표적인 면역블롯 결과가 제시되어 있다.

NOD/SCID 마우스의 HepG2 이종 이식 종양 내 VEGF 발현의 면역조직화학적 검출

이종이식 모델 구축을 위해: 대수 성장기에 있는 HepG2 세포를 트립신 처리하여 수확하고, 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척한 후 혈청이 없는 DMEM에 재현탁하였다. 총 2 × 106 NOD/SCID 마우스에서 HepG2 피하 이종이식 모델을 구축하기 위해, 0.2 mL의 무혈청 DMEM(Matrigel 제외)에 현탁된 세포를 1 mL 주사기를 사용하여 각 NOD/SCID 마우스의 우측 겨드랑이 부위(혈류가 풍부한 영역)에 피하 주사하였다. 종양 형성 여부를 2일마다 모니터링하였다. 종양의 크기를 2일마다 측정하였으며, 종양 직경이 0.3~0.5 cm에 도달했을 때(주사 후 약 7~10일, 치료 시작점으로 정의함), 마우스를 실험을 위해 무작위로 4개 그룹으로 나누었다. 피하 이종이식종의 길이(L)와 너비(W)를 디지털 캘리퍼스로 매일 측정하였으며, 종양 부피(V)는 다음 공식에 따라 계산하였다: V = (L × W2) / 2. 모든 측정은 그룹 배정 내용을 모르는 연구자가 수행하였다. 20일 후, 동물들을 깊은 마취 하에 경추 탈골법으로 안락사시켰으며, 이종 이식 조직을 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 후 파라핀에 매립하였다. 조직 절편(5 µm (두껍게) 회전식 마이크로톰(rotary microtome)을 사용하여 절편을 제작하고 poly-L-lysine이 코팅된 유리 슬라이드에 부착하였다. 면역조직화학 염색을 위해, 절편을 자일렌(xylene)에서 탈파라핀화(3회 교체, 각 5분)하고 단계별 에탄올 시리즈(100%, 95%, 70%, 50%; 각 3분)를 통해 재수화하였다. 항원 회복은 절편을 10 mM 시트르산 나트륨 완충액(sodium citrate buffer)에 넣고 마이크로파 가열기로 15분간 가열한 후, 실온에서 20분간 냉각하여 수행하였다. 내인성 과산화효소(peroxidase) 활성은 메탄올 내 3% 과산화수소로 실온에서 10분간 차단하였다. 비특이적 결합은 PBS 내 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이후 절편을 1차 anti-VEGF 항체(희석 배수 1:200)와 함께 다음의 조건으로 하룻밤 동안 배양하였다. 4 °C 가습 챔버 내에서 처리하였다. PBS로 세척(3회, 각 5분)한 후, 절편을 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 결합된 염소 항-토끼 2차 항체(1:500)와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 신호는 3,3-′-디아미노벤지딘(DAB) 기질. 절편을 헤마톡실린으로 30초 동안 대조 염색한 후, 탈수, 투명화 과정을 거쳐 영구 봉입제를 사용하여 커버글라스로 봉입하였다. 이미징은 명시야 설정의 형광 도립 현미경을 사용하여 다음의 조건에서 수행하였다. ×100배 배율. 정성적 예시를 위해 대표 이미지를 나타내었다.

오염된 모든 팁, 튜브 및 세포 배양 폐기물은 생물학적 위험 폐기물로 수거하여 폐기 전 오토클레이브 멸균 처리하였습니다. 약물이 포함된 용액, DMSO, xylene, methanol을 포함한 화학 폐기물은 구분 및 라벨링된 폐기물 용기에 수거하였으며, 위험 화학 폐기물에 관한 해당 기관의 지역 규정에 따라 폐기하였습니다.

통계 분석

통계 분석에는 SPSS 19.0 소프트웨어가 사용되었습니다. 실험 데이터는 in vitro 실험의 경우 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험의 평균 ± SD로 표기하였으며, in vivo 실험의 경우 그룹당 n = 10마리 생쥐의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표기하였습니다. 두 그룹 간의 비교에는 양측 꼬리 비쌍 독립 t-검정(two-tailed unpaired t-test)을 사용하였습니다. 여러 그룹 간의 비교에는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정을 실시하였습니다. p < 0.05, p < 0.01 및 p < 0.001로 보고하였습니다.

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결과

HepG2 세포 증식에 대한 sorafenib 및 gemcitabine의 억제 효과

표 1에 나타난 바와 같이, Sorafenib과 gemcitabine은 HepG2 세포 증식을 농도 의존적으로 억제했습니다. 병용 요법은 모든 시점에서 단독 요법에 비해 유의하게 더 높은 억제율을 보였습니다. MTT는 대사 활성을 측정하며, 이는 세포 수와 상관관계가 있으나 증식이나 세포 독성을 직접적으로 측정하는 것은 아닙니다. 따라서 "증식 억제"라는 용어는 MTT 전환의 감소로 해석되어야 합니다. 특히, 3 µmol/L의 sorafenib과 10 µmol/L의 gemcitabine 조합이 가장 뚜렷한 억제 효과를 달성하여, 간암에 대한 효과적인 치료법으로서의 잠재력을 강조했습니다. 추가 연구를 통해 HepG2 세포에 대한 sorafenib과 gemcitabine의 가산 효과가 입증되었습니다. 표 2는 ...

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토론

간암은 잠행성 발병, 빠른 진행, 그리고 효과적인 치료법의 부족으로 인해 사망률이 높습니다3,15. 진행성 간암은 종종 화학요법 및 방사선 치료에 대한 내성을 보이며, 수술적 절제 및 간 이식을 포함한 현재의 선택지들은 여전히 불충분한 상태입니다15,16. 서로 다른 작용 기전을 가진 두 가지 이상의 화학요법 약물을 조합하는 방식이 잘 개발되어 왔으며, 이는 효율성을 크게 증대시켜 간암 치료의 대안적 전략이 될 수 있을 것으로 믿어져 왔습니다15,16. 간암 연구를 위한 표적 약물에는 단클론 항체(anti-VEGF 및 anti-EGFR), 티로신 키나아제 억제제, mTOR 억제제가 포함되며, 핵심 과제는 전체 생존율과...

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디지털 겔 이미징 시스템Bio-Rad Laboratories, Inc., USA1708280
고포도당 DMEM 배지HyClone, USASH30243.01
ERK 토끼 단클론 항체미국 산타크루즈sc-94
소 태아 혈청Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., 중국11011-8611/11011-8615
도립 형광 현미경Olympus, 일본IX73
GAPDH 토끼 다클론 항체미국 산타크루즈sc-25778
젬시타빈Eli Lilly and Company95058-81-4
염소 항-토끼 2차 항체Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., 중국D111018
ImageJ 소프트웨어 미국 메릴랜드주 베데스다, 국립보건원(National Institutes of Health) 버전 1.8.0_112
마이크로플레이트 리더Thermo Fisher Scientific Inc., USAMK3
p-ERK 토끼 단일클론 항체미국 산타크루즈9106
냉장 원심분리기Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd.DL-5M
RIPA 용해 완충액중국 Biyuntian 생물공학 연구소P0013B
회전식 마이크로톰Leica, 독일CM3050
소라페닙바이엘 사, 독일284461-73-0
티아졸릴 블루 (MTT)Sigma, USAM5655
3가스 배양기Thermo Fisher Scientific Inc., USA51026402
VEGF 토끼 단일클론 항체BioLegend, USAB199116

참고문헌

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