연구 논문

HepG2 세포 및 NOD/SCID 마우스 이종이식 모델에서 소라페닙과 젬시타빈 병용 치료의 평가: 파일럿 연구

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DOI:

10.3791/71790

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2026년 8월 28일

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1Department of Pharmacy, the Fourth Affiliated Hospital of School of Medicine, and International School of Medicine, International Institutes of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여는 HepG2 세포 증식의 가산적 억제에 대한 예비적 증거를 보여주며, p-ERK 및 VEGF 발현의 상관관계적 변화를 나타내고, NOD/SCID 마우스에서 간암 조직의 성장을 억제합니다.

초록

간암은 약물 내성과 제한적인 치료 옵션으로 인해 암 관련 사망의 주요 원인으로 남아 있습니다. 이에 따라 치료 결과를 개선하기 위한 치료 전략 탐구가 시급한 실정입니다. 본 파일럿 연구는 간암에서 sorafenib과 gemcitabine 병용 투여의 잠재적 효과와 그 기저 기전을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 간암 세포주인 HepG2를 사용하였으며, 비만성 당뇨/중증 복합 면역결핍(NOD/SCID) 마우스 이종이식 모델을 구축하였습니다. 주요 절차 단계로는 (1) HepG2 세포 배양 및 약물 처리, (2) MTT 분석 설정, 배양 및 흡광도 측정, (3) 단백질 추출, SDS-PAGE, 트랜스퍼 및 ERK와 p-ERK에 대한 면역블로팅, (4) NOD/SCID 마우스의 피하 이종이식 구축, (5) 종양 측정 및 부피 계산, (6) 종양 절편의 VEGF 면역조직화학 염색이 포함됩니다. 핵심 단계, 문제 해결 팁 및 장비 사양이 함께 제공됩니다. sorafenib(3 µmol/L)과 gemcitabine(10 µmol/L)의 병용 투여는 72 h에서 71.23% ± 6.76%의 억제율을 보였으며, q-값은 1.35로 나타나 테스트 조건의 특정 용량 조합에서  상승 효과 가 있음을 시사합니다. 대조군과 비교했을 때, 병용 치료는 p-ERK 발현 감소, 종양 부피 감소 및 정성적으로 더 낮은 VEGF 면역 염색과 관련이 있었습니다. 이러한 데이터는 p-ERK 발현 감소와 관찰된 항증식 효과 사이의 상관 관계를 보여주지만, 인과 관계를 입증하는 것은 아닙니다. HepG2 세포와 NOD/SCID 마우스 이종이식 모델에서 sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여는 항증식 잠재력의 예비 근거를 보여주며 VEGF 발현 감소와 관련이 있습니다. 다만, 미세혈관 밀도나 기능적 혈관 분석이 수행되지 않았으므로, 이 결과가 항혈관형성 활성의 직접적인 증거가 되지는 않습니다. 이 재현 가능한 프로토콜은 HCC 모델에서 약물 병용 투여를 평가하는 유용한 틀을 제공하며 다른 표적 치료-화학요법 요법으로 응용될 수 있으나, 임상적 함의를 도출하기 전 추가적인 기전 연구 및 용량 검증 연구가 필요합니다.

서론

간암은 가장 흔하고 치명적인 암 중 하나이며, 가장 빠르게 성장하는 악성 종양 중 하나이기도 합니다1,2. 간암의 발생률은 감소하고 있으나, 간암으로 인한 전반적인 부담은 계속해서 증가하고 있습니다. 2022년 글로벌 역학 데이터에 따르면, 글로벌 암 관측소(GLOBOCAN) 2022 온라인 데이터베이스의 간암 연령 표준화 발생률은 인구 100,000명당 15.0명이었으며, 연령 표준화 사망률은 인구 100,000명당 26.7명으로 나타나 암 사망 원인 중 두 번째로 높은 비중을 차지했습니다3. 현재 간암에 대한 효과적인 치료법의 부족과 잠행성 발병 특성으로 인해, 대부분의 환자가 진단 후 1년 이내에 사망합니다. 소라페닙(Sorafenib)은 임상적으로 승인된 최초의 다중 표적 키나제 억제제로, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 및 세린/트레오닌 키나제와 같은 수용체 티로신 키나제를 표적으로 합니다4,5. 경구용 다중 키나제 억제제인 소라페닙은 여러 성장 인자 경로를 표적으로 하여 간암에서 항증식 및 항혈관신생 효과를 나타냅니다. 과거에 소라페닙은 진행성 또는 절제 불가능한 간암 환자를 위해 FDA가 승인한 최초의 1차 전신 요법이었습니다6. 그러나 현재 진행성 간세포암(HCC)의 1차 치료 환경은 크게 확장되었습니다. 현재 권장되는 옵션에는 면역 관문 억제제 조합인 아테졸리주맙 플러스 베바시주맙, 렌바티닙, 그리고 이중 면역 요법 조합인 더발루맙 플러스 트레멜리무맙 등이 포함됩니다. 이러한 발전에도 불구하고, 면역 요법 조합을 쉽게 사용할 수 없거나 금기시되는 지역에서는 소라페닙이 여전히 중요한 1차 선택지로 남아 있습니다. 간암에서 널리 사용됨에 따라 약물 관련 이상 반응이 우려되어 왔습니다7. 2006년부터 2023년까지의 FDA 이상 사례 보고 시스템(FAERS) 데이터베이스 분석에서 소라페닙의 이상 반응은 주로 소화기계, 피부 및 피하 조직, 그리고 감염 및 손상과 같은 비특이적 신체적 불편함과 관련이 있는 것으로 나타났습니다7. 일부 진행성 간암 환자는 소라페닙 치료로 이득을 얻을 수 있지만, 대부분의 환자는 결국 내성이 생기거나 치료에 실패하여 좋지 않은 예후를 보입니다8,9,10. 사용 사례에도 불구하고 소라페닙은 HCC 환자의 약 30%에게만 효과가 있으며, 반응군조차 6개월 이내에 내성을 발달시키는 경우가 많습니다11. 소라페닙 내성에 관여하는 분자 경로는 세포 외 신호 조절 키나제(ERK)/인산화된 ERK(p-ERK), 단백질 키나제 B(Akt), 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K)/AKT/포유류 라파미신 표적 단백질(mTOR), 저산소 유도 인자 1α(HIF-1α)/HIF-2α 및 자가포식 관련 경로를 포함하며, 본 연구에서는 특히 ERK/p-ERK를 강조하여 선정하였습니다11. 젬시타빈(Gemcitabine)은 시티딘 유사체로, 체내에 들어가 디플루오로시티딘 이인산과 디플루오로시티딘 삼인산을 생성하여 DNA 합성에 서로 다른 억제 효과를 나타냅니다12. 간담도 악성 종양에서 젬시타빈은 병용 화학요법의 구성 요소로 평가되어 왔습니다. 그러나 젬시타빈은 임상적으로 더 큰 약물 내성을 보이는 것으로 보고되어 젬시타빈의 효과가 제한되었습니다12,13. 따라서 최적의 약물 요법을 효과적이고 효율적으로 결정하는 것은 매우 어려운 과제입니다. 최근 연구에 따르면 새로운 종양 줄기세포성 바이오마커 예측을 기반으로 젬시타빈과 소라페닙의 병용 요법이 치료 효능을 높일 수 있음이 밝혀졌습니다14. 하지만 저희가 알기로는 HepG2 세포와 비만형 당뇨병/중증 복합 면역 결핍(NOD/SCID) 마우스 간세포암 이종 이식 모델을 사용하여 간암에서 이 조합을 구체적으로 조사한 연구는 없었습니다. 따라서 간암에서 소라페닙과 젬시타빈의 가산 효과를 직접적으로 입증하는 실험적 근거가 여전히 부족한 실정입니다.

본 논문에서 설명하는 절차들은 널리 사용되고 있으나, 신진 연구자들이 재현할 수 있을 만큼 상세하고 시각적인 단계별 형식으로 제시되는 경우는 드뭅니다. 본 연구진은 sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여가 간암 세포의 증식과 종양 성장을 가산적으로 억제하며, 이러한 효과가 ERK/p-ERK 경로의 하향 조절 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 매개 혈관 신생의 감소와 관련이 있을 것이라고 가설을 세웠습니다. 본 연구의 목적은 in vitro 및 in vivo에서 HepG2 간암 세포주 증식에 대한 sorafenib과 gemcitabine 병용 투여의 억제 효과와 그 기전을 예비적으로 탐색하는 것입니다(Supplementary Figure 1). 본 연구의 독창성은 다음 세 가지 측면에 있습니다. (1) 널리 사용되는 HepG2 세포주와 그에 상응하는 NOD/SCID 마우스 모델을 사용하여 간암에서 sorafenib-gemcitabine 병용 요법을 구체적으로 테스트한 최초의 연구라는 점, (2) 잠재적 기전으로서 연구가 미진했던 ERK/p-ERK 경로를 조사했다는 점, (3) 계산적 예측이 아닌 직접적인 실험적 근거를 통해 간암에서 이 병용 요법의 가산적 효과를 입증했다는 점입니다. 이러한 특징들은 다른 종양 유형이나 다른 실험 모델을 사용하여 수행된 기존의 병용 요법 보고서, 특히 sorafenib 기반 요법과 본 연구를 차별화합니다.

프로토콜

윤리적 승인은 Zhejiang University-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review(승인 번호 ZJU20250049)로부터 제공되었습니다.

동물 및 그룹화

면허를 보유한 상업적 공급업체(면허 번호 SCXK (Shanghai) 2013-0006)로부터 구입한 4~5주령, 체중 18~20 g의 암컷 NOD/SCID 마우스 총 40마리를 특정 병원균 제거(SPF) 등급의 동물실에 수용하였다. 모든 동물 실험 프로토콜은 표준 가이드라인을 준수하였다. 실험 기간 동안 동물들은 자유롭게 먹이와 물을 섭취할 수 있도록 하였으며, 온도 22 ± 2 °C, 습도 50%~60%, 12/12시간 명/암 주기가 유지되는 잘 제어된 SPF실 내에 그룹별(케이지당 5마리)로 수용하였다. 동물들에게 사료와 물을 자유롭게 제공하였으며, 2주마다 체중을 모니터링하였다. 마우스가 지속적인 통증, 악액질, 종양 궤양을 보이거나 종양 크기가 최대 2 cm에 도달한 경우, 또는 기타 가역적이지 않은 건강 문제가 발생한 경우, 동물윤리위원회가 승인한 인도적 종료 기준에 따라 체중 kg당 ≥150 mg의 0.45% 펜토바르비탈 나트륨을 복강 내 주사하여 안락사를 시행하였으며, 이후 호흡 및 심박 정지, 각막 반사 소실을 확인하거나 필요한 경우 보조적인 물리적 방법을 적용하였다. 표본 크기(그룹당 n = 10)는 파일럿 실험에서 도출된 효과 크기 1.2, α = 0.05, β = 0.20(검정력 80%)을 가정한 검정력 분석과 20%의 소실 허용치를 기반으로 결정하였다. 종양 이식 절차는 치료군 할당 전에 수행되었다(제노그라프트 구축은 아래 참조).

종양 이식 및 종양 생착 확인 후, 난수표 방법을 이용하여 마우스를 대조군, sorafenib군, gemcitabine군, 그리고 sorafenib-gemcitabine 병용 투여군의 4개 그룹으로 무작위 배정하였으며, 각 그룹당 10마리(케이지당 5마리)를 배치하여 NOD/SCID 마우스 이식 종양 모델을 구축하였다. 모델링 과정 중 종양 조직으로 인해 NOD/SCID 마우스의 전신 상태가 악화되거나 심지어 사망할 수 있으며, 통계 분석에 일반적으로 유효한 표본 크기가 필요하다는 점을 고려하여 각 그룹에 최소 10마리를 포함시켰다. 무작위 그룹 배정은 독립적인 기술자에 의해 수행되었으며 케이지에 라벨을 부착하였다. 약물 투여 및 종양 측정 시 블라인딩을 실시하지 않았으며, 이는 중요한 한계점이다. 나머지 조직 샘플링, 생화학 및 병리학적 평가는 모두 블라인딩 처리된 실험실 인원에 의해 수행되었다. 데이터 또한 통계 분석이 완료되고 데이터 블라인딩이 해제될 때까지 인코딩된 파일에만 접근할 수 있었던 통계 전문가에 의해 블라인딩 분석되었다. 모든 동물은 최종 분석에 포함되었다. 전신 흡수와 일관된 생체 이용률을 보장하기 위해 두 약물 모두 복강 내 투여 경로를 선택하였으며, 1일 1회 투여는 이 요법에서 지속적인 혈장 농도가 나타난 이전의 약동학 연구를 기반으로 하였다. 차량 대조군에는 0.2 mL의 멸균 생리식염수를 복강 내 주사하였다. sorafenib군에는 40 mg/kg sorafenib 0.2 mL를 복강 내 주사하였다. gemcitabine군에는 100 mg/kg gemcitabine 0.2 mL를 복강 내 주사하였다. 병용 투여군에는 40 mg/kg sorafenib 0.2 mL와 100 mg/kg gemcitabine 0.2 mL를 각각 복강 내 투여하였다. 각 그룹에 20일 동안 매일 1회 투여하였다. 모든 동물은 최종 분석에 포함되었으며, 연구에서 제외된 마우스는 없었다. 20일의 치료 기간 동안 어떤 그룹에서도 사망 사례는 관찰되지 않았다. 투여 일정과 용량은 간담도암 모델에 관한 기발표 연구를 기반으로 선택하였다. gemcitabine의 매일 복강 내 투여는 독성을 유발할 수 있음에 유의해야 한다. 이식된 종양의 길이와 너비를 매일 측정하고 이식 종양의 부피를 계산하였다. 20일 후, 동물들을 깊은 마취 하에 경추 탈골법으로 안락사시키고 이식된 종양 조직을 포르말린에 고정하였다. 연구 전 기간 동안 2일마다 체중을 측정하였다. 마우스의 입모, 굽은 자세, 운동성 감소, 설사 및 기력 저하를 포함한 임상적 독성 징후를 매일 모니터링하였다. 그러나 혈청 생화학 검사(예: alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase 및 creatinine)와 주요 장기의 조직병리학적 검사는 수행하지 않았다. 따라서 잠복 독성을 배제할 수 없다.

약물 및 시약

Sorafenib은 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 -20 °C에서 보관하였다. 사용 전, 용액을 해동하고 최종 DMSO 농도가 세포 성장에 영향을 주지 않는 0.5% 미만이 되도록 희석하였다. Gemcitabine은 상용 제품을 구입하였다. Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer, thiazolyl blue, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK 및 VEGF에 대한 1차 항체, 2차 항체, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high-glucose 배지, fetal bovine serum 및 HepG2 세포주는 상용 제품을 구입하였다.

Sorafenib과 gemcitabine은 세포독성 제제입니다. 모든 약물 조제 및 취급 절차는 적절한 개인 보호 장구(실험복, 니트릴 장갑 및 안전 고글)를 착용한 상태에서 지정된 생물안전 작업대 내에서 수행해야 합니다. 본 프로토콜에 사용되는 DMSO, methanol, xylene 및 기타 유기 용매는 위험 물질이므로 흡입이나 피부 접촉을 피하기 위해 흄 후드 내에서 취급해야 합니다. 사용 전 모든 시약에 대한 물질안전보건자료(MSDS)를 검토해야 합니다.

세포 배양

HepG2 세포주를 회복시켜 10 mL의 DMEM high-glucose 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin-streptomycin 및 4 mmol/L glutamine 보충)가 담긴 세포 배양 병에 접종하였습니다. 세포는 5% CO₂가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 배양하였습니다. 배양액은 2일마다 교체하였으며, 로그 성장기를 유지하기 위해 4일마다 세포를 계대 배양하였습니다. HepG2 세포주는 상용 공급처로부터 구입하였으나, 본 연구에서는 독립적인 세포주 인증(예: short tandem repeat profiling) 및 마이코플라스마 검사를 수행하지 않았습니다.

증식 억제율 검출을 위한 MTT 방법

HepG2 세포주에 대한 sorafenib과 gemcitabine의 증식 억제율을 결정하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)법을 사용하였다. 대수 성장기에 있는 세포를 0.25% trypsin으로 2분간 처리하여 소화시켰으며, 동일한 부피의 완전 배지를 첨가하여 소화를 중단시켰다. 1000 × g에서 10분간 원심분리한 후, 세포를 완전 배지에 재현탁하였다. 세포 밀도를 1 × 105 cells/mL로 조정하고, 96-well 플레이트의 각 well에 세포 현탁액 200 µL를 분주하였다. 이 분주 밀도는 5 × 103에서 5 × 104 cells/well 범위의 세포 밀도를 테스트한 사전 최적화 실험을 바탕으로 선정하였다. 2 × 104 cells/well의 밀도에서는 96시간 동안 흡광도가 선형적으로 증가하였으며, 도립 현미경으로 관찰한 결과 종료 시점에서 confluence가 80% 미만으로 유지되었다. MTT 측정값이 선형 범위 내에 있도록 하기 위해, 각 시점마다 용매 처리된 대조군 well을 사용하여 예비 실험을 수행하였다. 영양분 고갈과 대사 부산물의 축적을 방지하기 위해 48시간마다 배지를 교체하였다. 도립 현미경을 사용하여 매일 confluence를 모니터링하였다. 96시간째에 대조군 well은 약 75%–80%의 confluence에 도달하였으며, 뚜렷한 영양분 고갈 징후는 관찰되지 않았다. 세포 부착 후 배지를 제거하고 약물이 포함된 배지를 첨가하였다. 처리하지 않은 대조군(in vivo 실험을 위한 용매 대조군)에는 약물이 없는 배지를 첨가하였다. 실험은 무처리 대조군, sorafenib군, gemcitabine군, 병용 투여군으로 나누어 진행하였다. sorafenib의 농도는 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/L, 6 µmol/L였으며, gemcitabine의 농도는 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L, 20 µmol/L였다. sorafenib과 gemcitabine을 병용한 농도는 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/L, 6 µmol/L + 20 µmol/L였다. 각 군의 세포를 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 well에 5 mg/mL MTT 20 µL를 첨가하고 세포 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 각 well에 DMSO 150 µL를 첨가하고 10분간 흔들어 formazan을 완전히 용해시켰으며, 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 각 well의 광학 밀도(OD) 값을 측정하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 각 군당 5개의 반복 well을 두었다. 데이터는 3회 생물학적 반복 실험의 평균 ± SD로 표시하였다. 세포 성장 억제율 (%) =(1 - OD 실험군 /OD 무처리군）× 100%로 계산하였다. 두 약물 간의 상호작용은 다음 공식으로 계산된 q-값으로 판단하였다: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). 여기서 EA와 EB는 약물 A와 B를 단독으로 사용했을 때의 억제율이며, EAB는 두 약물을 함께 사용했을 때의 억제율이다. q값이 1.15보다 크면 두 약물 간의 시너지 효과를 나타내며, 0.85–1.15는 가산 효과를, q값이 0.85보다 작으면 길항 효과를 나타낸다. q-값 방법은 간단한 스크리닝 도구이며 더 엄격한 시너지 분석을 대체하지 않는다. 몇 가지 고정 비율의 농도 쌍만 테스트되었으므로 시너지 주장의 강건함에 한계가 있다. 따라서 본 연구에서 “시너지”라는 용어는 전체 용량-반응 매트릭스에 걸쳐 검증된 가산 상호작용이 아니라, 특정 농도 쌍과 시점에서 q > 1.15임을 의미한다.

ERK 및 p-ERK 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석

세포 배양 및 실험군 설정은 위에서 설명한 대로 수행되었다. Western Blotting을 통한 ERK 및 p-ERK 검출을 위해 sorafenib의 농도는 3 µmol/L, gemcitabine의 농도는 10 µmol/L, 그리고 병용 투여 농도는 3 µmol/L + 10 µmol/L로 설정하였다. 72시간 처리 후, RIPA lysis buffer를 사용하여 세포를 용해시켰으며, 각 실험군에서 총 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 bicinchoninic acid (BCA)법으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질(레인당 30 µg)을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 통해 120 V에서 90분 동안 로딩 및 분리하였다. 단백질은 0.45 µm 공극 크기의 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 300 mA에서 90분 동안 4 °C에서 전이시켰다. 0.1% Tween-20이 포함된 Tris-buffered saline (TBST) 내의 5% non-fat milk로 실온에서 1시간 동안 블로킹한 후, 막을 1차 항체와 함께 4 °C에서 완만하게 흔들어주며 하룻밤 동안 반응시켰다. TBST로 3회 세척(각 10분)한 후, 막을 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence (ECL) 기질을 사용하여 시각화하였으며, 디지털 젤 이미지 시스템을 사용하여 촬영하였다. 포화를 방지하기 위해 각 항체에 대해 노출 시간을 최적화하였다. 밀도 측정 정량 분석은 ImageJ 소프트웨어의 젤 분석 도구를 사용하여 수행하였다. 모든 표적 단백질 밴드 강도는 로딩 컨트롤인 GAPDH로 표준화하였으며, p-ERK 발현은 총 ERK 발현으로 추가 표준화하였다. 5% non-fat milk 외에 추가적인 블로킹 단계는 수행하지 않았다. 정량 결과는 1.0으로 설정된 대조군 대비 배수 변화(fold change)로 나타내었다. 각 실험은 독립적으로 3회 반복되었다. 대표적인 면역블롯 결과가 제시되어 있다.

NOD/SCID 마우스의 HepG2 이종 이식 종양 내 VEGF 발현의 면역조직화학적 검출

이종이식 모델 구축을 위해: 대수 성장기에 있는 HepG2 세포를 트립신 처리하여 수확하고, 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 세척한 후 혈청이 없는 DMEM에 재현탁하였다. 총 2 × 106 NOD/SCID 마우스에서 HepG2 피하 이종이식 모델을 구축하기 위해, 0.2 mL의 무혈청 DMEM(Matrigel 제외)에 현탁된 세포를 1 mL 주사기를 사용하여 각 NOD/SCID 마우스의 우측 겨드랑이 부위(혈류가 풍부한 영역)에 피하 주사하였다. 종양 형성 여부를 2일마다 모니터링하였다. 종양의 크기를 2일마다 측정하였으며, 종양 직경이 0.3~0.5 cm에 도달했을 때(주사 후 약 7~10일, 치료 시작점으로 정의함), 마우스를 실험을 위해 무작위로 4개 그룹으로 나누었다. 피하 이종이식종의 길이(L)와 너비(W)를 디지털 캘리퍼스로 매일 측정하였으며, 종양 부피(V)는 다음 공식에 따라 계산하였다: V = (L × W2) / 2. 모든 측정은 그룹 배정 내용을 모르는 연구자가 수행하였다. 20일 후, 동물들을 깊은 마취 하에 경추 탈골법으로 안락사시켰으며, 이종 이식 조직을 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 후 파라핀에 매립하였다. 조직 절편(5 µm (두껍게) 회전식 마이크로톰(rotary microtome)을 사용하여 절편을 제작하고 poly-L-lysine이 코팅된 유리 슬라이드에 부착하였다. 면역조직화학 염색을 위해, 절편을 자일렌(xylene)에서 탈파라핀화(3회 교체, 각 5분)하고 단계별 에탄올 시리즈(100%, 95%, 70%, 50%; 각 3분)를 통해 재수화하였다. 항원 회복은 절편을 10 mM 시트르산 나트륨 완충액(sodium citrate buffer)에 넣고 마이크로파 가열기로 15분간 가열한 후, 실온에서 20분간 냉각하여 수행하였다. 내인성 과산화효소(peroxidase) 활성은 메탄올 내 3% 과산화수소로 실온에서 10분간 차단하였다. 비특이적 결합은 PBS 내 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이후 절편을 1차 anti-VEGF 항체(희석 배수 1:200)와 함께 다음의 조건으로 하룻밤 동안 배양하였다. 4 °C 가습 챔버 내에서 처리하였다. PBS로 세척(3회, 각 5분)한 후, 절편을 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 결합된 염소 항-토끼 2차 항체(1:500)와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 신호는 3,3-′-디아미노벤지딘(DAB) 기질. 절편을 헤마톡실린으로 30초 동안 대조 염색한 후, 탈수, 투명화 과정을 거쳐 영구 봉입제를 사용하여 커버글라스로 봉입하였다. 이미징은 명시야 설정의 형광 도립 현미경을 사용하여 다음의 조건에서 수행하였다. ×100배 배율. 정성적 예시를 위해 대표 이미지를 나타내었다.

오염된 모든 팁, 튜브 및 세포 배양 폐기물은 생물학적 위험 폐기물로 수거하여 폐기 전 오토클레이브 멸균 처리하였습니다. 약물이 포함된 용액, DMSO, xylene, methanol을 포함한 화학 폐기물은 구분 및 라벨링된 폐기물 용기에 수거하였으며, 위험 화학 폐기물에 관한 해당 기관의 지역 규정에 따라 폐기하였습니다.

통계 분석

통계 분석에는 SPSS 19.0 소프트웨어가 사용되었습니다. 실험 데이터는 in vitro 실험의 경우 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험의 평균 ± SD로 표기하였으며, in vivo 실험의 경우 그룹당 n = 10마리 생쥐의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표기하였습니다. 두 그룹 간의 비교에는 양측 꼬리 비쌍 독립 t-검정(two-tailed unpaired t-test)을 사용하였습니다. 여러 그룹 간의 비교에는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정을 실시하였습니다. p < 0.05, p < 0.01 및 p < 0.001로 보고하였습니다.

결과

HepG2 세포 증식에 대한 sorafenib 및 gemcitabine의 억제 효과

표 1에 나타난 바와 같이, Sorafenib과 gemcitabine은 HepG2 세포 증식을 농도 의존적으로 억제했습니다. 병용 요법은 모든 시점에서 단독 요법에 비해 유의하게 더 높은 억제율을 보였습니다. MTT는 대사 활성을 측정하며, 이는 세포 수와 상관관계가 있으나 증식이나 세포 독성을 직접적으로 측정하는 것은 아닙니다. 따라서 "증식 억제"라는 용어는 MTT 전환의 감소로 해석되어야 합니다. 특히, 3 µmol/L의 sorafenib과 10 µmol/L의 gemcitabine 조합이 가장 뚜렷한 억제 효과를 달성하여, 간암에 대한 효과적인 치료법으로서의 잠재력을 강조했습니다. 추가 연구를 통해 HepG2 세포에 대한 sorafenib과 gemcitabine의 가산 효과가 입증되었습니다. 표 2는 두 약물 간의 잠재적인 시너지 상호작용을 나타내는 q-값을 제시합니다. 특히, 3 µmol/L sorafenib과 10 µmol/L gemcitabine의 조합은 여러 시점에서 1.15 이상의 q-값을 보였으며, 이는 p-ERK 발현 감소와 관찰된 항증식 효과 사이의 연관성을 시사하지만, 이 데이터로 인과관계가 증명된 것은 아닙니다. 이러한 결과는 치료 잠재력에 관한 결론을 내리기 전에 추가적인 간암 모델에서 더 많은 연구가 필요함을 나타냅니다. 시너지 효과는 모든 농도 쌍에서 관찰되지 않았으며, 특정 농도 조합 하나로 제한되었습니다.

그림 1은 sorafenib 투여군과 병용 투여군의 세포 증식 억제율이 72 h에서 정점에 도달했음을 보여줍니다. 병용 요법, 특히 sorafenib 3 µmol/L 및 gemcitabine 10 µmol/L 용량에서 단독 투여군에 비해 현저히 높은 억제율을 나타냈습니다.

sorafenib 및 gemcitabine이 ERK 및 p-ERK 발현에 미치는 영향

그림 2A는 모든 그룹에서 ERK 단백질 발현에 유의미한 변화가 없음을 보여줍니다. 그러나 p-ERK 발현은 sorafenib 투여군과 병용 투여군에서 유의하게 감소하였으며, 병용 투여군에서 가장 큰 감소가 관찰되었습니다. 이러한 데이터는 p-ERK 수치의 감소와 병용 투여 사이에 연관성이 있음을 입증하지만, p-ERK의 감소가 항증식 효과를 직접적으로 매개한다는 것을 입증하지는 않습니다. 밀도 측정 정량화, total ERK 및 GAPDH를 이용한 p-ERK의 정규화, 생물학적 반복 실험 정보 및 통계적 비교는 수행되지 않았습니다. 따라서 제시된 면역블롯은 대표적인 결과이며 정성적인 분석일 뿐입니다.

NOD/SCID 마우스에 이식된 간암 피하 이종이식편의 부피에 미치는 sorafenib 및 gemcitabine의 효과

치료 전 각 군 간의 피하 이종 이식편 부피에는 유의미한 차이가 없었습니다.p = 0.367). 처리 후, 종양 부피는 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며, 병용 투여군의 종양 부피는 소라페닙(sorafenib) 및 젬시타빈(gemcitabine) 투여군의 종양 부피보다 유의하게 더 작았다 (p < 0.001), 다음에서 보여지는 바와 같이 그림 2B. 관찰된 차이가 약물 관련 이환율이나 전신 노출도의 차이에 의해 혼동되지 않았음을 확인할 수 있는 독성 또는 약동학 데이터가 수집되지 않았으므로, 이러한 결과는 주의하여 해석해야 합니다.

NOD/SCID 마우스의 이식된 간암 모델에서 sorafenib 및 gemcitabine이 VEGF 발현에 미치는 영향

그림 2C는 종양 조직 내 VEGF 발현의 면역조직화학 분석 결과를 보여줍니다. 소라페닙(sorafenib) 투여군과 병용 투여군은 정성적 면역조직화학 분석에서 갈색-황색의 면역염색이 감소하고 VEGF 발현이 약해진 양상을 보였습니다. 이러한 결과는 혈관 형성 잠재력의 감소를 시사하지만, 내피세포 마커나 미세혈관 밀도 분석이 수행되지 않았으므로 혈관 형성을 직접적으로 증명하는 것은 아닙니다. 젬시타빈(gemcitabine) 투여군과 대조군은 정성적으로 더 강한 VEGF 발현을 보였습니다. 이러한 정성적 VEGF 분석 결과는 상관관계만을 나타내며 가설 생성 단계의 결과일 뿐입니다. 정량적 분석이나 직접적인 혈관 마커 없이는 혈관 형성 또는 혈관 형성의 시너지 효과에 대한 결론을 내릴 수 없습니다.

데이터 가용성

본 연구 과정에서 생성 및 분석된 원시 데이터는 보충 자료(보충 파일 1))에 포함되어 있습니다.

세포 처리 억제 효과; 그래프; 시간별 억제율; sorafenib, gemcitabine 분석.
그림 1: 다양한 중재가 HepG2 세포의 증식 억제율에 미치는 영향. (A) HepG2 세포에서 시간 경과에 따른 sorafenib의 억제율 (%). (B) HepG2 세포에서 시간 경과에 따른 gemcitabine의 억제율 (%). (C) HepG2 세포에서 sorafenib과 gemcitabine 병용 투여 시의 억제율 (%). (D) HepG2 세포에 72 h 동안 처리한 후 sorafenib (3 µmol/L) 단독, gemcitabine (10 µmol/L) 단독 및 병용 투여 시의 억제율 (%). *p < 0.05, **p < 0.01 vs. 대조군. 모든 억제율 데이터는 프로토콜에 기술된 MTT assay를 사용하여 얻었다. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

ERK/p-ERK 웨스턴 블롯, 종양 부피 막대 그래프, 조직병리 슬라이드; 암 치료 분석.
그림 2처리군에서의 ERK/p-ERK 발현, 종양 부피 및 VEGF 발현. (A) 다양한 처리 조건에 따른 HepG2 세포 내 ERK 및 p-ERK의 발현; (B) 부피 (mm3치료 전후 4개 그룹의 종양 (그룹당 n = 10). **p < 0.01 대(對) 처치 후 대조군. 최종 시점의 부피에 대해 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 통계적 비교를 수행하였다. (C) 대표 면역조직화학 염색 이미지 (스케일 바 = 100 µm각 군의 종양 조직에서 VEGF 발현을 나타낸 이미지(군당 n = 10). 이 이미지들은 정성적 예시를 위해 제시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그룹(μmol/L）처리 시간(h)
24487296
소라페닙1.512.41 ± 3.3722.74 ± 4.5729.76 ± 3.4815.77 ± 3.18
326.37 ± 6.1433.10 ± 4.3944.71 ± 5.4938.63 ± 5.68
4.534.42 ± 5.2658.91 ± 4.6767.85 ± 5.2054.26 ± 6.07
646.88 ± 6.6167.48 ± 5.7073.57 ± 7.0761.73 ± 6.10
젬시타빈53.56 ± 1.416.17 ± 1.739.31 ± 1.7611.35 ± 1.95
105.89 ± 2.479.62 ± 2.1514.57 ± 1.9416.58 ± 2.31
1514.57 ± 3.3819.53 ± 2.2722.43 ± 2.1324.75 ± 3.25
2022.36 ± 4.4628.76 ± 3.9233.18 ± 3.1938.49 ± 4.28
소라페닙 + 젬시타빈1.5 + 514.13 ± 2.1626.41 ± 3.4337.75 ± 4.7522.04 ± 2.84
3 + 1038.69 ± 3.9446.26 ± 4.0671.23 ± 6.7662.47 ± 7.20
4.5 + 1540.89 ± 4.2174.30 ± 6.9884.82 ± 9.1766.89 ± 7.16
6 + 2064.05 ± 6.5480.67 ± 9.7992.22 ± 10.2481.05 ± 9.87

표 1: HepG2 세포에 대한 sorafenib 및 gemcitabine의 억제율 (%). 데이터는 3회의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SD로 표시되었습니다.

그룹(μmol/L）처리 시간(h)
24487296
소라페닙+젬시타빈1.5 + 50.910.961.040.87
3 + 101.261.171.351.28
4.5 + 150.931.111.131.02
6 + 201.091.051.121.06

표 2: q-value를 통한 HepG2 세포에서 sorafenib과 gemcitabine의 시너지 효과 분석. q > 1.15는 시너지 효과를, 0.85–1.15는 가산 효과를, q < 0.85는 길항 작용을 나타냅니다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험으로부터 도출되었습니다.

부록 그림 1: 본 연구는 HepG2 세포주를 이용한 in vitro 실험과 NOD/SCID 마우스 이종이식 모델을 이용한 in vivo 실험의 두 가지 주요 단계로 수행되었습니다. In vitro 실험에서는 다양한 농도의 sorafenib, gemcitabine 또는 이들의 병용 투여를 HepG2 세포에 처리하였습니다. MTT assay를 통해 세포 증식을 평가하였으며, Western blotting으로 ERK 및 p-ERK의 발현을 분석하였습니다. In vivo 실험에서는 NOD/SCID 마우스의 피하에 HepG2 세포를 주입하여 이종이식 모델을 구축하였습니다. 마우스를 4개의 치료군으로 나누어 매일 복강 내 주사를 실시하였습니다. 치료 기간 동안 종양 부피를 측정하였습니다. 안락사 후 종양 조직을 채취하여 VEGF에 대한 면역조직화학 염색을 수행하였습니다. 모든 데이터는 SPSS 19.0 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석되었습니다.여기를 클릭하여 파일을 다운로드하십시오.

보충 파일 1: Raw data.rar.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

간암은 잠행성 발병, 빠른 진행, 그리고 효과적인 치료법의 부족으로 인해 사망률이 높습니다3,15. 진행성 간암은 종종 화학요법 및 방사선 치료에 대한 내성을 보이며, 수술적 절제 및 간 이식을 포함한 현재의 선택지들은 여전히 불충분한 상태입니다15,16. 서로 다른 작용 기전을 가진 두 가지 이상의 화학요법 약물을 조합하는 방식이 잘 개발되어 왔으며, 이는 효율성을 크게 증대시켜 간암 치료의 대안적 전략이 될 수 있을 것으로 믿어져 왔습니다15,16. 간암 연구를 위한 표적 약물에는 단클론 항체(anti-VEGF 및 anti-EGFR), 티로신 키나아제 억제제, mTOR 억제제가 포함되며, 핵심 과제는 전체 생존율과 삶의 질 개선을 달성하기 위해 기존 약물들을 최적으로 통합하는 것입니다17. 효율적이면서 독성이 낮은 약물의 조합을 탐색한다면 현재 간암 치료의 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 젬시타빈(gemcitabine)에 대해 화학요법 내성을 보이는 최근의 세포 모델은 젬시타빈/소라페닙(sorafenib)(EGFR 억제제)에 대해 다시 감수성을 가질 수 있음을 시사했습니다14. 이러한 발견은 아직 탐구되지 않은 과학적 주제이기에 저희에게 매우 흥미로운 부분입니다. 부분 요인 설계(fractional factorial design)를 통해 젬시타빈(1.4 mmol/L), 소라페닙(0.03 mmol/L), S-1(0.185 mmol/L)의 최적 3제 조합을 확인했으며, 이는 AKT/mTOR 경로를 억제하고 세포 사멸을 유도함으로써 담관암(CCA)의 증식과 종양 성장을 유의미하게 억제합니다18. Awasthi와 동료들은 소라페닙이 췌관 선암종(PDAC) 세포에서 유사 분열 촉진 단백질 키나아제(MEK), ERK1/2, 70 kDa 리보솜 단백질 S6 키나아제(p70S6K) 및 4E-결합 단백질 1(4EBP-1)의 인산화와 세포 증식을 억제함을 보여주었습니다. 또한 젬시타빈과 병용했을 때 다양한 세포에서 가산적인 증식 억제 및 세포 사멸 유도 효과를 보였으며, 이를 통해 종양 이식 동물의 생존 기간을 유의미하게 연장했습니다19. 젬시타빈과 소라페닙의 병용 치료는 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition) 과정을 억제하고, 추가적으로 비소세포폐암(NSCLC) 세포의 증식, 이동 및 침윤을 억제하며 세포 주기 정지와 세포 사멸을 유도합니다20. 그러나 저희가 알기로는, 본 연구가 HepG2 기반의 in vitro 모델 및 간세포암의 피하 이종이식 모델에서 이 조합을 구체적으로 테스트한 최초의 연구입니다.

본 연구는 다중 표적 키나제 억제제인 sorafenib과 시티딘 유사체인 gemcitabine의 병용 투여가 간암에 미치는 영향을 in vitro 및 in vivo에서 조사함으로써 이러한 공백을 메우고자 하였다. 본 연구에서 sorafenib과 gemcitabine 단독 투여는 모두 HepG2 세포의 증식에 억제 효과가 있었으며, 두 약물을 병용한 경우의 억제 효과는 단독 투여 시보다 유의하게 강력하여 가산 효과를 나타냈다. 하지만 MTT 분석만으로는 세포 정지(성장 억제) 효과와 세포 독성(세포 사멸) 효과를 구분할 수 없으며, 항증식 기전에 대한 직접적인 증거를 제공하지 못한다. 그중 sorafenib 3 µmol/L + gemcitabine 10 µmol/L 병용 투여군의 q-값은 각 시점에서 1.15보다 컸으며, 이는 시너지 효과를 보여준다. sorafenib과 gemcitabine 단독 또는 병용 투여는 HepG2 세포의 ERK 발현을 유의하게 변화시키지 않았으나, sorafenib 단독 및 병용 투여는 p-ERK의 발현을 유의하게 억제하였다. 두 약물의 병용 투여는 HepG2 세포에서 ERK의 인산화를 가산적으로 억제하였다. 이러한 데이터는 인과관계가 확립되지는 않았으나, p-ERK의 감소와 병용 투여의 항증식 효과 사이에 연관성이 있음을 나타낸다. 시너지 효과는 테스트한 모든 조건에서 나타나는 일반적인 특성이 아니었으며, 오직 하나의 특정 농도 비율에서만 관찰되었다. NOD/SCID 마우스 간암 이종 이식 모델의 면역조직화학적 결과는 sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여가 VEGF 발현을 유의하게 감소시키고 종양 부피를 줄일 수 있음을 보여주었다. 그러나 독성 또는 체중 데이터가 체계적으로 수집되지 않았기 때문에, 종양 부피의 감소가 특이적인 항종양 효과보다는 약물로 인한 이환율에 일부 기인했을 가능성을 배제할 수 없다. 면역조직화학 분석에서 나타난 바와 같이, sorafenib과 gemcitabine의 병용 투여는 종양 조직 내 VEGF 발현 감소와도 연관이 있었다. 이러한 관찰 결과는 잠재적인 항혈관 형성 효과를 시사하지만, 혈관 형성 감소에 대한 직접적인 증거(예: 미세혈관 밀도 분석)는 부족하다. 따라서 관찰된 항증식 효과에 대한 VEGF 하향 조절의 기여도는 상관관계 수준으로 남아 있다. 이러한 시너지 효과는 병용 요법이 약물 내성과 치료 실패를 자주 초래하는 단일 약제 치료의 한계를 극복할 수 있음을 시사한다. sorafenib과 gemcitabine의 최적 병용 용량을 규명하는 것은 이 치료법의 임상 적용을 위한 중요한 단계이다.

소라페닙(sorafenib)과 젬시타빈(gemcitabine)의 상가적 효과의 기저에 있는 분자적 기전은 병용 투여군에서 p-ERK 발현의 유의미한 감소가 나타난 것으로 보아 ERK 경로의 억제와 관련이 있을 수 있습니다. ERK 경로는 세포 증식, 생존 및 혈관 신생에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 암 치료의 핵심 표적이 됩니다. 본 결과는 병용 투여가 단일 약제 투여보다 ERK 경로를 더 효과적으로 차단할 수 있음을 시사하며, 이는 단독 요법에 비해 p-ERK 발현의 더 큰 감소와 상관관계가 있습니다. NOD/SCID 마우스 모델을 이용한 in vivo 연구는 병용 투여의 잠재적 치료 이점을 추가로 뒷받침합니다. 병용 투여군에서 종양 부피의 유의미한 감소와 VEGF 발현의 감소가 관찰되었습니다. VEGF는 간세포암(HCC)에서 혈관 신생의 핵심 동력이며, VEGF의 억제는 종양 성장 및 전이의 감소와 관련이 있습니다. 병용 투여에 반응한 VEGF의 하향 조절은 이 요법이 혈관 신생 과정을 조절할 수 있다는 가설과 일치하지만, 본 연구에서 항혈관 신생 활성에 대한 직접적인 증거는 평가되지 않았습니다. p-ERK 발현 감소와 병용 투여의 항증식 효과 사이에서 관찰된 연관성은 시사하는 바가 있으나 인과적 기전을 확립하는 것은 아닙니다. Western blot 분석이 약물에 장기간 노출된 후의 시점에서만 수행되었으므로, ERK 인산화의 초기 역동적 변화를 포착할 수 없었습니다. 또한, 밀도 분석 정량화, 반복 실험 수준의 통계 및 전체 ERK 및 로딩 컨트롤(loading control)에 대한 표준화가 이루어지지 않아 해석에 제한이 있습니다. 따라서 p-ERK의 감소가 병용 투여와 상관관계가 있음에도 불구하고, ERK 경로 억제가 상가적 효과를 직접적으로 매개하는지 여부는 현재 데이터로는 입증되지 않았습니다. 이러한 기전적 통찰은 간세포암의 내성을 극복하기 위해 평행 또는 보상 경로를 표적으로 하는 최신 전략들과 일치합니다.

본 연구는 간암에 대한 sorafenib과 gemcitabine의 잠재적인 상가적 효과에 대한 귀중한 통찰을 제공하지만, 몇 가지 제한점을 인정해야 한다. 첫째, 본 연구의 표본 크기가 상대적으로 작아 결과의 일반화에 한계가 있을 수 있다. 보다 다양한 환자군에서 병용 요법의 효능과 안전성을 확인하기 위해서는 더 큰 규모의 코호트 연구가 필요할 것이다. 둘째, 본 연구에서는 간암 연구를 위해 잘 확립된 모델인 HepG2 세포주를 사용하였으나, 이는 실제 환자에게서 나타나는 간암의 이질성을 완전히 반영하지 못할 수 있다. 간암의 다양한 아형과 유전적 배경에 따라 병용 요법에 대한 반응이 다를 가능성이 있다. 따라서 여기서 보고된 결과가 모든 간암 유형에 일반화되지 않을 수 있으며, 더 광범위한 결론을 도출하기 전에 추가적인 세포주(예: Huh7 [인간 간세포암 세포주] 및 PLC/PRF/5 [인간 간세포암 세포주, Alexander 세포로도 알려짐], 또는 환자 유래 이종 이식 모델)를 이용한 검증이 필요하다. 셋째, in vivo 실험은 면역 체계가 결핍된 NOD/SCID 마우스 모델을 사용하여 수행되었으므로, 인간 간암의 복잡한 종양-면역 미세환경을 완전히 나타내지 못한다. 향후 연구에서는 치료의 면역학적 측면을 더 잘 이해하기 위해 면역 기능이 유지되는 마우스 모델이나 인간화 시스템을 도입해야 한다. 넷째, 본 연구에서는 sorafenib–gemcitabine 병용 요법의 독성이나 안전성 프로파일을 평가하지 않았다. NOD/SCID 마우스의 체중 변화, 장기 독성(예: 간, 신장 기능 검사) 또는 이상 반응에 대한 데이터를 수집하지 않았다. 따라서 현재의 데이터로는 이 병용 요법의 안전성이나 내약성에 관한 결론을 내릴 수 없다. 다섯째, 항혈관형성 주장은 예비적인 것이며 과도하게 해석해서는 안 된다. VEGF 발현이 정성적으로 감소했으나, 정량적 면역조직화학(IHC) 분석(예: H-score, 양성 면적 비율, 염색 강도 또는 종양당 여러 시야에 대한 블라인드 디지털 이미지 분석)은 수행하지 않았다. 또한, Cluster of Differentiation 31 (CD31) 또는 endomucin과 같은 혈관내피세포 마커를 사용하여 미세혈관 밀도를 평가하지 않았으며, 기능적 혈관 분석도 수행하지 않았다. 따라서 현재의 VEGF 데이터는 혈관형성 감소를 직접적으로 입증하는 것이 아니라, VEGF 단백질 수준의 상관적 감소만을 보여준다. 여섯째, 통계 분석에 몇 가지 제한점이 있다. 종양 부피를 20일 동안 동일한 마우스에서 반복적으로 측정했음에도 불구하고, 시간적 상관관계를 고려하는 반복측정 분산분석(repeated-measures ANOVA)이나 혼합 효과 모델 대신 최종 시점의 부피에 대해서만 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 사용했다. 정규성과 분산의 동질성은 공식적으로 검정되지 않았다. 또한, 본 연구에서 p-ERK 발현 감소와 sorafenib 및 gemcitabine의 상가적 항증식 효과 사이의 연관성을 확인했으나, 이 데이터로부터 인과관계를 추론할 수는 없다. Western blot 분석에는 다음과 같은 추가적인 제한점이 있다: (i) ERK 인산화는 초기 및 일시적인 신호 전달 사건임에도 불구하고 단일한 후기 시점(72 h)만 조사되었다; (ii) 독립적인 생물학적 반복 실험에 대한 밀도 측정 정량화나 통계 분석 없이 대표 블롯만 제시되었다; (iii) p-ERK를 total ERK로 정규화하지 않았으며, total ERK 또한 로딩 컨트롤로 정량적으로 일정하게 정규화되지 않았다. 결과적으로, 이 데이터는 주로 정성적이며 가설 생성 단계의 데이터이다. 확정적인 기전 검증을 위해서는 p-ERK 수준을 회복시켰을 때 병용 요법의 항증식 효과가 감소하는지 테스트하는 구조 실험(예: 변이 MEK를 통한 ERK의 상시 활성화 또는 ERK 활성제 사용)이 필요할 것이다. 주요한 제한점은 심층적인 분자적 검증이 부족하다는 점이다. p-VEGFR, p-AKT 또는 세포사멸 마커를 조사하지 않았다. ERK 경로 데이터는 정성적이며 인과관계를 확립하지 않는다. 기전적 결론을 내리기 전에 근본적인 기전을 규명하기 위해 특별히 설계된 추가 연구가 필요하다. 마찬가지로, siRNA를 이용한 ERK 녹다운이나 상위 조절 인자(예: MEK 억제제)를 표적으로 하는 약리학적 억제제를 통해 관찰된 효과가 실제로 ERK 의존적인지 확인하는 것이 도움이 될 수 있다. 이러한 검증 실험은 본 초기 연구의 범위를 벗어났으나, 향후 연구의 중요한 방향이 될 것이다. PI3K/AKT 또는 관련 하위 인자와 같이 종양 증식 및 생존에 관여하는 다른 주요 경로들은 탐색되지 않았으며, 이들 또한 관찰된 효과에 기여했을 수 있다. 본 연구의 VEGF 발현에 관한 결과는 예비적이며 가설 생성 단계이다. 감소된 VEGF 면역염색은 혈관형성 경로의 잠재적 조절에 대한 중요한 단서를 제공하지만, 항혈관형성 기전의 결정적인 증거는 아니다. 정량화나 보완적인 혈관 마커 없이 VEGF IHC만으로는 항혈관형성 기전을 확립할 수 없음을 독자들에게 명시적으로 주의 바란다. 혈관내피세포 마커와 혈관 기능 분석의 부재는 본 연구의 주요 제한점 중 하나이다. 따라서 병용 요법의 작용 기전을 완전히 이해하기 위해서는 다른 키나아제 및 혈관형성 인자의 잠재적 역할을 포함하여 관련된 신호 전달 경로에 대한 보다 종합적인 분석이 필요하다.

여기에 기술된 절차는 HepG2 세포와 NOD/SCID 마우스에 최적화되었습니다. 재현성은 세포주나 마우스 계통에 따라 달라질 수 있습니다. 재현성에 영향을 미치는 주요 요인은 다음과 같습니다: (1) 세포 계대 횟수 (20대 이전의 계대 사용); (2) MTT 배양 시간 (정확히 4 h로 표준화); (3) 항체 로트 번호 (각 실험마다 기록); (4) 캘리퍼 측정자 교육 (실험 전반에 걸쳐 동일한 블라인드 측정자 사용). 조합 테스트 전, 사용자께서는 셋업 검증을 위해 양성 대조군 실험(예: sorafenib 단독 6 µmol/L 처리)을 수행하실 것을 권장합니다.

본 연구는 Western blotting을 통해 sorafenib과 gemcitabine의 병용 요법이 HepG2 세포 내 p-ERK의 발현을 유의하게 감소시켰음을 보여주었으며, 이는 ERK 신호 전달 경로의 조절 가능성을 시사합니다. 하지만 이러한 데이터는 정성적이며 인과 관계를 입증하는 것은 아닙니다. p-ERK는 ERK 경로 활성화를 나타내는 기능적 마커로 널리 사용되며, 이의 하향 조절은 일반적으로 경로 활성 감소의 지표로 해석됩니다(11). RT-PCR을 통해 하위 표적 유전자(c-Fos, c-Myc 등)의 전사 변화를 추가로 검출하지는 않았으나, 관찰된 p-ERK의 감소는 직접적인 기전적 증거라기보다 ERK 경로의 관여에 대한 상관적 근거를 제공합니다. 향후 연구에서 전사체 분석이나 표적 qPCR을 통해 ERK 하위 네트워크의 조절 세부 사항을 더 구체적으로 밝혀냄으로써 병용 치료 기전에 대한 이해를 높일 수 있을 것입니다. 또한, 본 연구는 병용 치료의 단기적 효과에 집중하였습니다. 반응의 지속성, 잠재적인 내성 발생 및 치료와 관련된 지연성 독성을 평가하기 위해서는 장기적인 연구가 필요합니다. 마지막으로, 본 연구에서는 치료 효과를 더욱 향상시킬 수 있는 면역 요법이나 다른 표적 치료법과 같은 최신 전략과 sorafenib 및 gemcitabine을 병용하는 가능성을 탐색하지 않았습니다. 향후 연구에서는 간암에 대해 더 효과적인 치료법을 개발하기 위해 다제 병용 요법을 조사해야 합니다. 요약하자면, 본 연구는 간암에서 sorafenib과 gemcitabine의 유망한 가산 효과를 시사하지만, 이러한 결과는 연구의 한계점 내에서 해석되어야 합니다. 이러한 결과를 검증하고, 이 통찰을 간암 환자의 임상 결과 개선 및 잠재적 부작용 분석으로 연결하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

결론적으로, 본 연구는 소라페닙(sorafenib)과 젬시타빈(gemcitabine)의 병용 투여가 HepG2 세포 및 NOD/SCID 마우스 이종 이식 모델에서 항증식 활성을 나타내며 VEGF 발현 감소와 연관되어 있다는 예비적 근거를 제공합니다. 그러나 VEGF 데이터는 정성적이며 항혈관형성 효과를 직접적으로 입증하지는 않았으므로, 현 단계에서 항혈관형성 활성에 대한 주장은 입증되지 않은 상태로 남아 있습니다. 데이터상으로 p-ERK 발현 감소와 병용 투여의 항증식 효과 사이에 연관성이 나타났으나, 인과 기전은 아직 확립되지 않았습니다. 본 연구에서 언급된 웨스턴 블롯(Western blot)의 한계를 고려할 때, 이 병용 요법에서 ERK 경로의 기전적 역할은 현재로서는 추측 단계에 있습니다. 소라페닙과 젬시타빈의 병용 요법은 ERK 경로 억제가 관찰된 시너지 효과의 핵심 매개체인지 확인하기 위해 경로 복구 실험 및 추가적인 간암 모델에서의 테스트를 포함한 추가 연구가 필요합니다. 소라페닙과 젬시타빈 병용 투여의 임상적 관련성은 향후 전임상 및 임상 연구, 특히 소라페닙 내성 종양이나 소라페닙이 여전히 임상적 선택지로 남아 있는 환경에서 현대적 표준 치료법과 비교하여 평가되어야 할 것입니다.

공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

저자들의 감사 인사는 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디지털 겔 이미징 시스템Bio-Rad Laboratories, Inc., USA1708280
고포도당 DMEM 배지HyClone, USASH30243.01
ERK 토끼 단클론 항체미국 산타크루즈sc-94
소 태아 혈청Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., 중국11011-8611/11011-8615
도립 형광 현미경Olympus, 일본IX73
GAPDH 토끼 다클론 항체미국 산타크루즈sc-25778
젬시타빈Eli Lilly and Company95058-81-4
염소 항-토끼 2차 항체Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., 중국D111018
ImageJ 소프트웨어 미국 메릴랜드주 베데스다, 국립보건원(National Institutes of Health) 버전 1.8.0_112
마이크로플레이트 리더Thermo Fisher Scientific Inc., USAMK3
p-ERK 토끼 단일클론 항체미국 산타크루즈9106
냉장 원심분리기Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd.DL-5M
RIPA 용해 완충액중국 Biyuntian 생물공학 연구소P0013B
회전식 마이크로톰Leica, 독일CM3050
소라페닙바이엘 사, 독일284461-73-0
티아졸릴 블루 (MTT)Sigma, USAM5655
3가스 배양기Thermo Fisher Scientific Inc., USA51026402
VEGF 토끼 단일클론 항체BioLegend, USAB199116

참고문헌

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