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방법 논문

AAVS1에서 독시사이클린 유도성 ASCL1/DLX2 발현을 이용한 인간 유도 다능성 줄기세포로부터 GABA 신경세포 생성

86 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71804

⸱

2026년 7월 31일

 , 
1Centre de recherche Azrieli du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neurosciences, Universite de Montreal

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 AAVS1 에 독시사이클린 유도성 전형전동유전자를 통합하여 인간 유도 다능성 줄기세포로부터 GABA 신경세포를 생성하는 방법을 설명합니다. 안전 항구 유전자좌. 안정적이고 균질한 형질전환유전자 발현은 GABA 신경세포로의 직접 분화를 효율적으로 제공하며, 렌티바이러스 접근법에서 흔히 발생하는 전형전유전자 침묵화를 제한합니다.

초록

인간 유도 다능 줄기세포(hiPSCs)는 시험관 내에서 인간 신경학적 질환을 모델링할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 감마-아미노부티르산(GABAergic)과 같은 정의된 신경 집단의 신뢰성 있는 생성은 이 연구에서 필수적입니다. 이 프로토콜은 독시사이클린 유도 시스템을 사용하여 hiPSC를 GABA 신경세포로 분화하는 견고한 방법을 상세히 설명합니다. 이 접근법은 전사 인자 ASCL1 과 DLX2 를 암호화하는 형질전환유전자를 CRISPR/Cas9 매개 녹인을 통해 세이프하버 아데노 관련 바이러스 통합 부위 1(AAVS1.) 좌위에 안정적으로 통합하는 데 의존합니다. 이 표적 통합은 무작위 렌티바이러스 통합에서 자주 관찰되는 전형전환 침묵을 피합니다. 프로토콜은 hiPSCs 유지, 형질전환 유전자 통합을 위한 뉴클레오펙션 과정, 성공적으로 조작된 세포를 풍부하게 만들기 위한 푸로마이신 선택, 그리고 단계별 분화 절차를 포함합니다. 독시사이클린으로 유도하면, 조작된 hiPSCs는 세포 주기를 빠르게 벗어나 신경 형태를 획득하고 21일 이내에 GABA 계통 마커를 발현합니다. 주요 단계에는 특정 성장 인자를 이용한 신경유도와 이후 성숙, 그리고 성숙 중 세포 부착력을 개선할 수 있는 잠재적 접근법이 포함됩니다. 이 표준화된 방법은 GABA 계통 마커를 발현하는 유도 뉴런의 풍부한 집단을 얻어내어 신경과학 연구와 세포 모델링에 귀중한 도구를 제공합니다.

서론

인간 유도 다능성 줄기세포(hiPSCs)는 시험관 내에서 인간 신경학적 질환을 모델링하고, 발달과 퇴행을 촉진하는 복잡한 분자 메커니즘을 연구할 수 있는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 환자별 세포 모델을 생성하여 증후몽성 섬모병증의 초기 신경발달이상부터 산 발성 알츠하이머병에서 관찰되는 미묘한 후생유전체 변화에 이르기까지 다양한 질환을 조사할 수 있게 합니다. 따라서 hiPSCs의 방향성 분화는 현대 분자 신경과학의 초석이 되었습니다.

인간 신경학적 과정의 미묘한 차이를 효과적으로 포착하려면 매우 특이하고 순수한 신경 하위 유형을 생성하는 것이 필수적입니다. 예를 들어, 인간뉴런에서 MECP2와 같은 단백질의 특정 전사 역할을 밝히거나, SARS-CoV-2와 같은 바이러스 감염에 대한 말초 감각 신경세포의 표적 취약성을 평가하기 위해 정의된 신경 집단이필요합니다. 더불어, 기능성 미세교세포를 3차원 대뇌 오가노이드에 통합하는 것과 같이 복잡하고 생리학적으로 중요한 미세환경을 구축하는 것은 근본적으로 뚜렷한 신경 및 교세포 계통의 견고하고 예측 가능한 생성에 의존합니다. 이 하위 유형 중 GABA 신경세포는 중추신경계에서 중요한 억제 역할과 다양한 신경학적 및 정신질환에 대한 영향으로 특히 주목받고 있습니다7. 이 방법의 전반적인 목표는 hiPSC를 유도 뉴런으로 유도하여 GABA 계통 마커를 발현하는 방향성 분화를 신뢰할 수 있고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜로 제공하는 것입니다. 외적 신호 분자에 의존하는 전통적인 GABA 기반 분화 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 변동성이 크며, 세포 집단이 이질적으로 변할 수 있습니다8.

이러한 한계를 극복하기 위해 전사 인자 매개 순방향 프로그래밍이강력한 대안으로 등장했습니다. 이 프로토콜은 독시사이클린 유도 발현 시스템을 사용하여 ASCL1과 DLX210의 발현을 유도합니다. CRISPR/Cas9를 사용하여 이 형질전환유전자를 선도관 관련 바이러스 통합 부위 1(AAVS1.) 안전항구 유전자좌위에 표적으로 지정함으로써, 무작위 렌티바이러스 통합10과 관련된 전형전환 침묵 문제를 우회합니다. 기증자 구성체에는 mCherry와 같은 형광 리포터가 포함되어 있어 선별 후 형질전환 양성 세포를 모니터링합니다. 이 전략은 무작위 통합 접근법보다 더 균질한 형질전환유전자 발현을 지원하기 위한 것이지만, 각 유전자 계통별로 발현 안정성과 분화 재현성은 검증되어야 합니다. 이 표준화된 방법은 약 21일 만에 GABA 계통 마커를 발현하는 유도 신경세포의 농축된 집단을 생성하며, 이는 전통적인 소분자 접근법의 8.10일보다 짧은 시간입니다. 이 프로토콜은 고함량 현미경, 단세포 전사체학, 기능적 생리학적 검사와 같은 후속 응용을 위해 확장 가능하고 일관된 신경 집단이 필요한 연구자들에게 매우 적합합니다.

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프로토콜

주의: 인간 hiPSC 배양은 기관 생물안전 절차에 따라 잠재적 생물학적 위험 물질로 취급되어야 합니다. 모든 인간 hiPSC 배양 절차를 인증된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 수행하십시오. 인간 세포가 포함된 모든 폐기물, 인간 세포에 노출된 배지, CRISPR/Cas9 플라스미드 물질은 폐기 전에 지역 생물안전 지침에 따라 오염 제거되어야 합니다. 독시사이클린, 퓨로마이신, DMSO 및 기타 화학 시약은 장갑과 적절한 눈 및 피부 보호구를 착용하여 다루어야 하며, 폐기물은 기관의 화학 폐기물 처리 절차에 따라 폐기되어야 합니다. 기저막 추출물(BME)은 멸균 기법으로 취급하고 얼음 위에 보관하여 조기 중합을 방지해야 합니다. 액체 질소 저장과 냉동 취급은 적절한 극저온 장갑, 얼굴 보호구, 그리고 해동 중 냉 화상이나 바이알 폭발을 방지하기 위해 주의하여 수행해야 합니다.

참고: CRISPR/Cas9 매개 편집 및 신경 분화 이전에 hiPSC 배양은 사전에 정해진 품질 관리 기준을 충족해야 합니다. 세포는 마이코플라즈마 음성 판정을 받아야 하며, 정상 핵형 또는 허용 가능한 유전체 무결성 프로필을 보여야 하며, OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60, 및/또는 SSEA4 등 다능성 지표의 강력한 발현을 유지해야 합니다. 배양은 전형적인 조밀한 hiPSC 집락 형태를 보여야 하며, 높은 핵-세포질 비율, 뚜렷한 집단 경계, 최소한의 자발적 분화를 보여야 합니다. 권장 통과 범위 내의 활성 증식 배양만 사용해야 하며, 별도의 검증이 없는 한 실험실에서 정의한 최대 통과 번호(보통 40번째 통과 이하)를 넘지 않아야 합니다. 비정상적인 형태, 과도한 자발적 분화, 저조한 성장, 확실한 오염 또는 유전체 불안정성의 증거가 있는 배양은 편집 및 분화 실험에서 제외해야 합니다. 이 프로토콜에 필요한 모든 재료, 특히 미디어 레시피는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 시약 및 배양판 준비

  1. 50 mL 원뿔형 튜브에 녹아웃 혈청 치환(KOSR) 40mL와 디메틸설폭사이드(DMSO) 10 mL를 혼합하여 냉동 배지를 준비합니다.
  2. 피펫을 위아래로 10번 피펫팅하여 동결 매체를 균질화하세요. 용액은 최대 1개월간 4°C에서 보관합니다.
  3. 기저막 추출물(BME)을 Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12(DMEM/F12) 배지에 최종 농도인 80 μg/mL로 희석합니다.
    참고: 희석 전에 공급업체 웹사이트의 로트 번호를 이용해 받은 BME 용액의 농도를 확인하세요.
  4. 6웰 플레이트에 1mL의 희석된 BME 1mL를 웰당 첨가합니다. 즉시 기본 BME를 최대 1개월 동안 4°C로 되돌려 놓으세요.
  5. 플레이트를 기울여 용액이 웰 전체 표면에 고르게 분포되도록 하세요. 도포되지 않은 부분이 없는지 확인하세요.
  6. 사용 전 37°C에서 최소 30분간 배양하세요.
    참고: 최대 부화 기간은 없습니다. 1일 이상 배양할 경우, DMEM/F-12가 증발하지 않도록 주의하세요. 한 우물에 사용된 BME 용액은 두 번째 우물을 코팅하는 데 한 번만 재사용할 수 있습니다. 빠른 중합 때문에 상온에서 BME의 조작은 매우 짧아야 합니다.

2. hiPSC의 유지 및 전달

참고: 이 프로토콜에서 hiPSC 유지 매체는 mTeSR plus를 의미합니다. mTeSR plus는 일상적인 유지, 통과, 뉴클레오프 후 회복, 그리고 푸로마이신 선택에 권장되는 배지입니다.

  1. 세포가 60% 합류할 때 약 4–6일마다 hiPSC 전달을 수행합니다.
  2. 유물에서 배양 배지를 흡입하여 흡입 피펫을 사용하세요.
  3. 웰에 1mL의 ReLeSR을 추가하고 상온에서 30초간 배양합니다.
  4. 해리 시약을 흡입하고 37°C에서 8분간 배양합니다.
  5. 5mL 피펫을 사용해 hiPSC 유지 배지 1mL를 부드럽게 첨가합니다. 세포 현탁액을 50mL 튜브에 모으세요.
  6. 미세원심분리관에서 세포 현탁액 10 μL과 트리판 블루 10 μL를 혼합합니다. 혼합물 10 μL을 셀 카운터 슬라이드에 적재하여 생존 가능한 셀 농도를 측정합니다.
  7. 미리 준비된 우물에서 BME 코팅을 흡입하세요. 2mL의 hiPSC 유지 배지를 Rho-associated 코일 코일 키나아제(ROCK) 억제제(Y-27632; 10 μM 최종 용량)를 첨가합니다.
  8. 10만 개의 hiPSC를 우물에 뿌려 >90%의 생존율을 목표로 합니다. 세포의 균일한 분포를 위해 판을 8자 모양으로 움직입니다.
  9. 세포를 37 °C에서 5%CO2로 배양합니다.
  10. 24시간 후에는 배지를 2mL 신선 mTeSR과 ROCK 억제제가 없는 배지로 교체합니다.
    참고: ROCK 억제제 존재 시 세포 형태의 일시적 변화(세포 신장)가 예상됩니다. 세포가 제거된 후 고유한 형태를 되찾는지 확인하세요.

3. hiPSCs의 핵 확산

  1. 합류율이 약 60%에 도달하면 셀을 통과시킵니다.
    참고: 이 프로토콜에서 약 60%의 합류는 유정 표면의 절반 조금 넘는 부분을 차지하는 활발히 성장하는 hiPSC 집락에 해당하며, 군체 간 가시적 간격과 최소한의 자발적 분화가 존재합니다. 핵 방출 시에는 군락이 과도하게 잡식하거나 광범위하게 합쳐지거나 조밀하고 다층적인 중심을 보여서는 안 됩니다.
  2. 핵노출 장치가 켜져 있고, 핵노출 보충제를 핵복제 용액 P3에 첨가하세요. 얼음통 준비해.
  3. 얼음 위에 놓인 마이크로 원심분리관에 핵 형성 용액 P3 110 μL을 첨가합니다.
  4. CRISPR/Cas9 플라스미드 1 μg과 독시사이클린 유도성 ASCL1-P2A-DLX2가 포함된 기증 플라스미드 1 μg을 튜브에 추가합니다. 카세트, 형광 리포터, 그리고 푸로마이신 저항성 카세트를 튜브에 포함합니다. 거품을 넣지 않고 부드럽게 섞으세요.
  5. 두 개의 코팅된 웰에서 BME를 흡인하여 목적지 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 ROCK 억제제가 포함된 hiPSC 유지 배지 2mL를 추가하고, 37°C에서 배양합니다.
  6. 2.2단계부터 2.5단계까지 설명된 6웰 플레이트의 웰에서 60% 합류한 hiPSC를 해리합니다. 현탁액을 멸균 튜브로 옮기고 실온에서 500 x g 에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
  7. 상청액을 버리고 플라스미드가 포함된 110 μL 핵노출 용액 P3에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 기포가 생기지 않도록 피펫을 부드럽게 사용하세요.
  8. 세포 현탁액 100 μL를 얼음 위에 놓은 핵 적응 큐벳에 옮깁니다.
  9. 큐벳을 뉴클로펙터 장치에 삽입하고 hiPSCs에 대한 CB-150 프로그램을 실행하세요.
  10. 즉시 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용해 세포를 채취하세요. 셀 현탁액의 부피를 두 개의 미리 준비된 우물에 동일한 부피로 옮깁니다.
  11. 세포를 8자 모양으로 분포하고 37 °C에서 배양합니다.
  12. 24시간 후에는 ROCK 억제제가 없는 mTeSR과 매체로 매개체를 교체하세요. 해당되는 경우 형광을 관찰하여 핵 배출 효율을 검증합니다.

4. 항생제 선택

주의: 푸로마이신은 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 폐기물을 기관 지침에 따라 처리하십시오.

참고: 편집된 hiPSC를 선택하기 전에 각 hiPSC 라인의 최적 퓨로마이신 농도를 결정하십시오. BME 코팅된 6웰 플레이트에서 HIPSC 유지 배양지에 ROCK 억제제를 첨가한 상태에서 웰당 100,000 세포의 편집되지 않은 hiPSC를 시딩했습니다. 24시간 후에는 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5 μg/mL의 푸로마이신이 포함된 신선한 hiPSC 유지 배지로 배지를 교체합니다. 퓨로마이신 함유 배지를 매일 교체하고, 5일간 밝시야 현미경으로 세포 형태와 생존을 관찰하세요. 선택된 농도는 3–5일 이내에 모든 편집되지 않은 hiPSC를 제거하면서 과도한 독성을 최소화해야 합니다. 이 프로토콜에서 최적의 푸로마이신 농도는 일반적으로 0.4–0.6 μg/mL입니다.

  1. 핵 발화 후 3통 후, 보통 회복과 성장 속도에 따라 약 1–2주 정도 기다리며, 비통합 플라스미드가 손실될 때까지 기다린 후 선택을 시작합니다.
  2. 세포 전달을 수행하여 우물당 100,000개의 세포를 시딩합니다.
  3. 24시간 후에는 킬 곡선에 따라 정해진 농도, 일반적으로 0.4–0.6 μg/mL로 푸로마이신을 첨가합니다.
  4. 일반적으로 약 5일 정도 정해진 기간 동안 푸로마이신 선택을 유지하세요.
  5. 형광 현미경 또는 유세포 검사를 통해 리포터 양성 세포의 비율을 추정하기 위해 선정된 집단을 검증합니다.
    참고: 리포터 발현이 넓게 균질한 집단, 이상적으로는 >80–90% 리포터 양성 세포만 진행하세요. 리포터 발현이 모자이크 상태로 유지된다면, 선택 연장, 재농축 또는 분화 전에 클론 분리를 고려할 수 있습니다.
  6. 신경 분화를 시작하기 전에 접합 PCR을 통해 올바른 AAVS1 표적화를 확인한다.
  7. 엄격한 검증이 필요한 경우, 생거 시퀀싱으로 PCR 산물을 검증하고 qPCR, ddPCR 또는 다른 적절한 복사 번호 분석법으로 형질전환 유전자 복제 수를 평가합니다.
  8. 플라스미드 골격 서열 또는 더 넓은 유전체 통합 분석에 대해 PCR 기반 분석법을 사용하여 무작위 통합 효과를 평가하며, 이는 향후 적용 목적에 따라 다릅니다.
  9. 선택된 hiPSC 집단이 마이코플라즈마 음성을 유지하고, 전형적인 hiPSC 집락 형태를 유지하며, 푸로마이신 선택 후에도 견고한 성장을 유지하는지 확인해야 합니다.
  10. 특히 편집된 세포가 질병 모델링, 기능 검사, 장기 연구에 사용될 경우 핵형 분석, SNP 배열 또는 다른 검증된 검사법을 통해 유전체 무결성을 재평가합니다.
  11. 예측된 오프타겟 부위의 표적 시퀀싱 또는 필요시 더 넓은 유전체 접근법을 통해 CRISPR/Cas9의 잠재적 오프타겟 효과를 평가합니다.
    참고: 배양 배양이 이상 형태, 선택 후 회복 불량, 지속적인 모자이크 리포터 발현, 확정된 유전체 이상, 또는 AAVS1 통합 실패가 나타나면 분별을 위해 사용하지 마십시오. 이 프로토콜에서는 선택된 조작된 hiPSC를 집단으로 사용하며, 보고자 발현인 AAVS1 이 검증된 후 독시사이클린 유도 전에 냉동 보존할 수 있습니다. 표적, 형태 및 성장이 검증되었습니다. 독시사이클린 유도 후나 신경 성숙 중 냉동 보존은 표준 작업 흐름에 포함되지 않으며, 사용 전에 경험적으로 검증되어야 합니다.

5. GABA 작용성 뉴런으로의 분화

  1. 필요한 수의 BME 코팅 우물을 준비하세요. 0일째에 한 번 심어진 웰은 GABA 작용성 뉴런 웰 하나를 생산한다는 점에 유의하세요.
  2. 웰당 신경유도 배지 6.9mL를 준비하고, 독시사이클린(1 μg/mL)을 보충합니다. 증발이나 피펫팅 오류를 고려해 15% 초과 부피를 포함하세요.
    참고: 독시사이클린은 0일차부터 최종 농도인 1 μg/mL로 사용되며, 분화 및 성숙 내내 유지됩니다. 매질 교환마다 신선한 독시사이클린 함유 배지를 준비하여 일관된 형질전환 유도를 유지합니다. 이 용량은 강력한 리포터 발현과 효율적인 신경 전환을 가능하게 하여 선택되었습니다. 이 프로토콜에서는 공식적인 독시사이클린 용량 반응이 수행되지 않았으며; 따라서 이 방법을 적용하는 실험실에서는 형질전환 유도가 최적이 아니면 0.1–2 μg/mL 독시사이클린을 경험적으로 검사할 수 있습니다.
  3. 0일째에 유전자 조작된 hiPSC를 해리하고 준비된 BME 코팅 웰에 20만 개의 세포를 시딩합니다. 37°C에서 인큐베이팅하세요.
  4. 1, 2, 3일째에는 배지를 흡인하고 독시사이클린이 포함된 신선한 신경유도 배지 2mL를 추가하세요.
    참고: 3일째에는 세포 확장이 현저히 감소하고, 수상돌기 유사 구조가 나타나기 시작할 수 있습니다. 세포 주기 종료를 실험적으로 확인해야 할 경우, 3일째에서 4일째에 Ki-67 면역염색 또는 EdU/BrdU 통합을 시행할 수 있습니다.
  5. 4일째에는 뇌유래신경영양인자(BDNF), 교세포주 유래신경영양인자(GDNF), 신경영양인자-3(NT-3)를 각각 최종 농도인 10 ng/mL, 독시사이클린 1 μg/mL, 플루리슬른 20 μM으로 신경 성숙 배지를 준비합니다.
  6. 신경유도 매체를 흡인하세요. 새로 형성된 뉴런을 방해하지 않도록 웰 벽을 따라 2mL의 신경 성숙 배지를 조심스럽게 한 방울 정도 첨가하세요.
  7. 7일째에는 배지를 흡인하고 신경영양 세포 생존 억제제는 제외하되 신경 성숙 배지 2mL를 부드럽게 첨가합니다.
  8. 장기 유지 치료는 세포 밀도에 따라 신경 성숙 배지를 3일에서 4일마다 완전히 교체하는 것이 좋습니다.
    참고: 21일차가 GABA 신경 동일성 평가의 표준 평가 지점입니다. 21일째 되는 날에는 세포가 DLX1을 포함한 GABA 신경 특성을 보여야 합니다.발현을 계속하며 축삭 네트워크를 성숙시켜야 합니다. 우물당 200,000개의 씨앗 밀도를 경험적으로 선정하여 과밀과 성숙 관련 세포 사멸을 피하면서 적절한 간격을 둔 군집을 형성하였습니다. 150,000–300,000 세포/우물의 밀도는 적합하며, 형태학에는 낮은 밀도가 선호되고 물질 회수에는 높은 밀도가 선호됩니다. 이탈을 줄이기 위해 플레이트를 기울이지 않고 1,000 μL 피펫을 저유량으로 더 자주 하프 매체 교체를 수행하세요. 필요 시 3일간의 독시사이클린 유도 후 성숙 배지를 추가하기 전에 폴리-L-라이신/라미닌 또는 라미닌-521과 같은 강화 코팅을 사용하여 세포를 한 차례 재도할 수 있습니다. 성숙이 시작된 후 추가 배출은 피해야 합니다.
  9. 네트워크가 붙어 있고 생존 가능하며 증식하는 hiPSC 유사 군락이 없다면 배양은 21일 이후에도 장기간 성숙을 위해 유지될 수 있습니다. 21일 이후에는 독시사이클린과 신경영양 인자를 포함한 신선한 신경 성숙 배지를 사용하여 3-4일마다 반배지 교환을 수행하십시오.
    참고: 신경 형태와 신경돌기가 안정되고 박리가 최소화되며 미분화 집락이 보이지 않을 때 배양 분석을 수행하세요. 저희 손에서는 배양 검사가 보통 21일째에서 35일차 사이에 사용됩니다.

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결과

이 프로토콜의 성공적인 적용은 GABA 분자 특성을 가진 유도 뉴런 집단이 풍부해집니다. 이 전략은 AAVS1 유전자좌에 독시사이클린 유도성 ASCL1-P2A-DLX2 카세트를 표적 삽입하는 데 기반합니다(그림 1A). 조작된 hiPSCs가 선택된 후, 도키사이클린 유도가 GABA 작용성 신경 분화를 유도하는 데 사용되며, 이는 그림 1B에 표시된 타임라인에 나와 있습니다. 뉴클레오펙션 및 푸로마이신 선택 후, 연구자들은 hiPSC 콜로니 전반에 걸쳐 통합 형광 리포터(예: mCherry)가 거의 균질하게 발현되는 것을 관찰해야 하며, 이는 조작된 세포의 성공적인 농축과 일치합니다. 분화 단계에서 독시사이클린의 첨가는 hiPSCs의 빠른 형태학적 변형을 유도합니다(

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토론

GABA 생성 신경세포의 성공적인 생성은 이 프로토콜 내 여러 중요한 단계에 크게 의존합니다. 고품질의 미분화된 hiPSC를 유지하는 것이 가장 중요합니다; 핵 분리 이전의 자발적 분화는 통합 효율과 하위 신경 순도를 크게 저하시킵니다. 더불어, 정밀한 퓨로마이신 킬 곡선의 결정은 제대로 설계된 클론에 과도한 부담 없이 비통합 세포를 완전히 제거하기 위해 필수적입니다. 분화 단계에서는 배양물을 조심스럽고 부드럽게 다루는 것, 특히 유물 벽에 배지를 한 방울 단위로 첨가하는 것이 연약한 신경망 분리를 방지하는 데 매우 중요합니다.

연구자들은 목표 지향적인 문제 해결이 필요한 여러 도전 과제에 직면할 수 있습니다. 핵세포 생존 가능성이 비정상적으로 낮을 경우, 세포가 핵세포 용액에 노출되는 시간을 줄이고 얼음 위에서 엄격한 온도 조절을 유지하면 생존율을 크게 향상시킬 수 있습니다....

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

지원은 캐나다 줄기세포 네트워크 점프 스타트 ECR 프로그램과 UdeM pour le partenariat CHU 생트-쥐스틴 -Institut Imagine en épilepsie de l'enfant의 지원을 받았습니다. 테오 라빈은 오디세 네트워크의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4D-Nucleofector™ Core Unit로자AAF-1002BhiPSCs의 전기 투과/핵 주입을 위한 장치.
6웰 배양 플레이트Sarstedt83.3920300hiPSC 유지 및 분화를 위한 조직 배양 처리된 플레이트.
BDNF(뇌 유래 신경영양인자)STEMCELL Technologies78005신경 성숙을 위한 재조합 인간 단백질; 제조업체 지침에 따라 준비하고 최종 농도 10 ng/mL로 사용.
세포 카운터(Countess)Thermo Fisher ScientificC10283세포 계수에 사용.
원심분리기VWR76468-134세포 펠레팅용.
CO2 인큐베이터Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i 또는 동등37 °C, 가습된 대기, 5% CO2를 유지하는 세포 배양 인큐베이터.
크라이오튜브Thermo Fisher Scientific5000-0020hiPSC 동결을 위한 멸균 극저온 바이알; 외부 나사 1.8-2.0 mL 크라이오바이알을 외부적으로 사용할 수 있음.
Cultrex UltiMatrix 감소된 성장 인자 기저막 추출물Bio-TechneBME001-05프로토콜에서 사용되는 표준 BME 코팅 매트릭스. Bio-Techne 분석 인증서에서 로트별 재고 농도를 확인하고 DMEM/F-12에 80 µg/mL 작업 농도로 희석.
DMEM/F-12Wisent319-090-CLBME를 희석하는 데 사용되는 기본 매체.
DMSO(디메틸 설폭사이드)Sigma-AldrichD2650동결 매체 제조에 사용되는 동결 보호제.
기증자 플라스미드: 유도 가능한 ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 타겟팅 카세트맞춤형 플라스미드Addgene 등록 대기중도시사이클론 유도 ASCL1-P2A-DLX2 카세트 및 선택/보고 요소를 포함하는 맞춤형 AAVS1 기증자 플라스미드. 플라스미드 맵 및 전체 서열을 보조 파일 또는 요청 시 제공.
독시사이클린 하이클레이트Sigma-AldrichD9891ASCL1-P2A-DLX2 발현을 유도하는 데 사용. 멸균 스톡 용액을 준비하고, 분리하고, 빛으로부터 보호하고, 동결 상태로 저장하고, 최종 농도 1 µg/mL로 사용.
에탄올(70%)상업용 알코올 / 그린필드 글로벌P016EAAN생물학적 안전 캐비닛 내부 살균; 기관 승인된 70% 에탄올 또는 동등한 것을 사용.
형광 현미경ECHORevolve R4보고자 발현 및 신경 형태학의 위상차 및 형광 이미지를 촬영하는 데 사용되는 현미경.
GDNF(신경교 유래 신경영양인자)STEMCELL Technologies78058신경 성숙을 위한 재조합 인간 단백질; 제조업체 지침에 따라 준비하고 최종 농도 10 ng/mL로 사용.
hiPSC 라인 PGP1EditCo BioPGP1 인간 iPSC 라인이 프로토콜에 사용된 상업적으로 이용 가능한 공개 동의 인간 iPSC 라인; 수정 및 분화 전에 패시지 번호 및 QC 상태를 기록.
이미지 분석 소프트웨어ImageJ/Fiji오픈 소스; 사용된 버전 보고해야 함형광 정량화 및 대표 이미지 처리를 위한 소프트웨어.
KnockOut™ 혈청 대체물(KOSR)Thermo Fisher Scientific10828028동결 매체 준비에 사용.
라미닌-521STEMCELL Technologies200-0117표준 코팅 프로토콜의 일부는 아님. 신경 분리가 지속될 경우 대체 또는 이중 코팅 매트릭스로 사용할 수 있는 문제 해결용 선택적 시약.
액체 질소 듀워Thermo Fisher ScientificLocator 6 Plus 또는 동등기관 극저온 안전 절차에 따라 증기상 또는 액체 질소에서 동결된 hiPSCs의 장기 저장.
Mr. Frosty™ 동결 컨테이너Thermo Fisher Scientific5100-0001-80 °C에서 세포의 제어 속도 동결을 위한 컨테이너.
mTeSR™ PlusSTEMCELL Technologies100-0276hiPSCs의 피더 없는 유지 매

참고문헌

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신경과학제233호제233호빈 값호hESC/hiPSC분화CRISPR/Cas9.

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