C2C12 근아세포에서 철 과부하를 기반으로 한 철암모늄 시트레이트 기반 모델

요약

여기서는 C2C12 근모세포에서 철 부하, 철 부하, 철 반응 관련 분자 변화, 그리고 초기 페로스타틴 민감성 상실을 일으키는 빠른 철암모늄 시트레이트 기반 철 과부하 모델을 제시합니다.

초록

철분 의존성 조절 세포사멸 형태로, 노화와 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 우리는 이전에 노화된 근육 줄기세포가 세포 내 철분을 축적하고 활성화 시 철분 사멸을 겪는다는 사실을 발견했습니다. 여기서는 아철 암모늄 시트레이트를 이용해 쥐 C2C12 근아세포에서 철 과부하를 유발하는 간단한 시험관 내 모델을 설명합니다. 페릭 암모늄 시트레이트 처리는 세포 내 철분 부하를 증가시켰으며, 이는 페리틴 중염쇄 및 경쇄 전사체 증가, 페리틴 단백질 증가, 생세포 불안정 철염료의 신호 증강으로 나타났습니다. 페릭 암모늄 시트레이트(FAC) 노출은 또한 철학 검사와 관련된 분자 변화를 일으켰는데, 여기에는 Slc40a1 과 Hmox1 발현 증가, 그리고 글루타티온 퍼옥시다제 4 단백질 감소가 포함됩니다. FAC 관련 글루타티온 퍼옥시다제 4 감소는 데페록사민에 의해 부분적으로 되돌렸습니다. 12시간 후 세포독성 아철암모늄 시트레이트가 세포 생존력을 감소시켰고, 이 효과는 페로스타틴-1에 의해 구출되었는데, 이는 세포 사사의 철학 민감성 성분과 일치한다. 이후 시점에서는 변동성 증가와 분석의 동적 범위 감소로 생존 가능성 측정값의 해석 가능성이 제한됩니다. 따라서 이 프로토콜은 철암모늄 시트레이트 매개 철 부하의 빠르고 확장 가능한 모델을 제공하며, 이를 통해 철 암모늄 시트레이트 매개 반응을 연구하고 근육 세포에서 철 또는 철 조절 개입을 시험하는 데 활용할 수 있습니다.

서론

철압폐증은 다른 RCD와 분자적으로 구별되는 조절 세포사멸(RCD)의 한 형태입니다. 처음에는 RAS(쥐육종)를 선택적으로 유발하는 치명적인 소분자 에라스틴을 사용해 발견되었으며, 이 물질은 비세포자멸성 세포 사멸을 일으킨 것으로 밝혀졌습니다¹. Dixon 등은 그들의 기념비적 연구에서 처음으로 그 메커니즘을 철 의존적이라고 설명했고, 이에 따라 '철¹에 의한 낙하(사망)'라는 용어를 만들었다. 분자적으로 페로토시스는 과도한 철분 축적, 지질 과산화 증가, 그리고 활성 산소 종의 축적으로 나타나 세포 사멸로 이어집니다². 산화 스트레스 및 다른 RCD와 구별되는 점은, 카스파아제 활성화로부터 독립적이라는 점(아포토시스의 특징이며), 인산화된 수용체 상호작용 단백질 키나아제(RIPK3)와 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 키나제(MLKL)가 없기 때문이며, 이는 부사상사3에서만 관찰^됩니다. 더 나아가, 페로스타틴-1과 리프록스타틴-1 같은 지질 항산화제와 철 킬레이터인 데페록사민⁴로도 페로토토시스를 완화할 수 있습니다. 철강 세포 감소는 모든 유형의 RCD가 결국 세포 사멸로 이어진다는 점에서 유사하지만, 그 특징 때문에 기전적으로 다른 RCD와 구별됩니다.

철세포토시스 연구는 지난 10년간 새로운 특징을 식별하고 그 기전과^{인간 질병에} 대한 기여를 연구할 새로운 도구 개발을 위한 지속적인 노력 덕분에 주목받아 왔습니다. 최근 증거에 따르면 철분 과부하와 철 감소증이 연령 관련 허약과 근감소증에 충분히 연구되지 않은 원인임을 시사합니다 ^6,7,8. 최근 우리는 노화된 근육 줄기세포(MuSCs)가 만성 염증으로 인한 항산화 유전 프로그램을 후생유전학적 침^{묵을 통해} 억제되어 페롭토틱 사멸에 독특하게 취약하다는 것을 밝혔습니다. 우리는 노화된 MuSC가 성체 원소 철분의 약 30배 높은 비정상 수준의 세포 내 원소 철분을 축적한다는 사실을 발견했습니다. 철렙토시스는 여러 장기와 조직, 특히 노화와 관련된 질병과 연관되어 있지만, 그 생리적 역할은 아직 명확하지 않으며 추가 연구가 필요합니다.

이전 연구에서는 노화된 MuSC가 활성화 시 페롭토틱 사멸에 민감해진다는 것을 보여주었으나, 철 로딩이 이 표현형에 기여하는 구체적인 기여는 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다. 여기서는 아철암모늄 시트레이트(FAC)로 처리된 C2C12 근모세포에서 간단한 철 과부하 모델을 구축하고, 과도한 철이 철 세포 관련 분자 변화와 페로스타틴 민감성 생존력 상실을 유발하기에 충분한지 묻습니다. C2C12 세포는 저유지보수, 확장 가능하며 쉽게 이용 가능한 쥐 근육 전구계를 제공합니다¹⁰. 이 접근법은 근육 세포에서 철분 유발 스트레스 반응을 연구하고 페르토토시스 관련 표현형을 수정하는 중재를 시험하는 실용적인 플랫폼을 제공할 것으로 기대합니다.

프로토콜

1. C2C12 세포 준비

1. 해동 세포
   참고: 모든 세포 배양 단계는 멸균된 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다.
   1. 9mL의 따뜻한 완전 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, 고포도당 및 피루베이트 + 10% 태아 소 혈청 + 1% pen/strep)가 담긴 원뿔형 튜브를 준비합니다.
   2. 냉동 C2C12 세포 1바이알(~100만 개)은 주 배지 재고에서 800 μL의 사전 예열된 완전 배지를 바이알에 추가하여 해동합니다. 천천히 위아래로 피펫을 사용하세요.
   3. 해동 바이알에 넣은 배지가 차가워지면, 제거해 원뿔형 튜브에 넣으세요. 튜브에서 나온 같은 양의 따뜻한 미디어로 교체하세요. 피펫을 계속 위아래로 움직이며 매지를 교체하여 냉동 세포가 다시 현탁될 때까지 반복하세요.
   4. 바이알 내용물을 원뿔형 매체 튜브에 피펫으로 주입합니다. 뒤집어 혼합한 후, 10cm 크기의 세포 배양 처리된 접시에 내용물을 넣습니다. 37°C에서 4시간 배큐하세요.
   5. 세포가 현미경으로 붙어 있는지 확인해 보세요. 부착된 세포는 길쭉하게 보이고, 떠다니는 세포는 원형이며 판이 움직일 때 움직입니다.
      참고: 플레이트된 세포가 건강하다고 가정할 때, 대부분은 부착되어 있어야 합니다.
   6. 배지에서 흡입하여 죽은 세포와 이물질을 제거하세요. 10mL의 따뜻한 완전 배지로 교체한 후 인큐베이터로 돌아갑니다. 하룻밤 또는 플레이트가 80% 합류할 때까지 배양하세요.
2. 철 처리를 위한 C2C12 세포 시딩
   1. 원하는 합류점에 도달하면 세포 배지를 빼내세요. 플레이트에 2mL의 PBS를 드롭 방향으로 추가하여 전체 표면을 덮어줍니다; 흡입.
   2. 세포에 0.25% 트립신 2mL를 추가하세요. 37 °C에서 5–10분간 배양하거나 세포가 분리될 때까지 배양합니다. 세포가 분리되면 현미경으로 보면 원형으로 보이고, 트립신과 세포 현탁액은 흐릿하고 두꺼워집니다.
   3. 트립신을 중화시키기 위해 따뜻한 완전 DMEM 8mL를 추가하세요. 혈청학적 피펫을 사용해 용액을 완전히 섞고 플레이트를 세척하세요. 셀 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮기세요.
   4. 튜브를 부드럽게 3–5번 뒤집어 주세요. 적절한 부피를 제거하고 선호하는 방법(세포 계수기, 혈구계 등)으로 세포 수를 세세요.
   5. 각 조건에 대해 n = 3에 대해 원하는 수의 웰/플레이트를 시딩할 수 있는 충분한 세포 현탁액을 만든다: 10cm 플레이트(웨스턴 블롯 시): 100,000 셀/플레이트, 6-웰 플레이트(qPCR용): 50,000 셀/웰, 96-웰 플레이트(불안정 철 및 발광 염색용): 1,000 셀/웰. 세포를 37°C에서 하룻밤 배양시킵니다.
3. 씨앗 세포에 철분 처리 적용
   1. 치료 당일에는 시트레이트암모눔 페릭(FAC; 공식 = C₆H₁₁FeNO₇⁺³; MW = 265 g/mol)에서 무균 조건에서 다음 농도로 DMEM을 완료하는 데: 중증: 180 μM (0.0477 mg/mL), 세포독성: 1,800 μM (0.477 mg/mL).
      참고: 심한 + 150 μM 데페록사민(철 킬레이터), 차량 + 150 μM 데페록사민, 그리고/또는 차량 + RSL3(페롭토시스 유도제; 양성 대조군) 등 대조군 추가를 고려하되 이에 국한되지 않습니다. 또한, DMEM에는 기저 기준에서 소량의 질산철(III) 질산염 비수화물이 포함되어 있을 수 있다는 점도 주목할 만합니다. 독자는 위에 권장되는 FAC 농도를 차량 배양 배지 내에 이미 존재하는 철철 농도에 추가된 것으로 해석해야 합니다.
   2. FAC가 완전히 용해될 때까지 반전하여 혼합합니다.
      참고: FAC는 수용성 때문에 DMSO나 추가 용매가 필요하지 않습니다. FAC 첨가는 용액의 pH를 변화시킬 수 있으므로, 배지 색상 변화가 극적으로 관찰되면 처리된 배지를 배양 시 세포의 생존 가능성을 보장하기 위해 pH 측정을 권장합니다.
   3. 세포에서 배지를 흡인하세요. 처리 조건에는 같은 양의 철분 보충 전체 배지를 추가하고, 처리되지 않은 완전 배지를 차량 웰/플레이트에 추가합니다. 원하는 처리 기간 동안 37°C에서 인큐베이팅한 후 원하는 검사로 진행합니다: 변활 철 검사법: 2시간 FAC 처리, qPCR 및 서부 블롯 검사법: 12–24시간 FAC 처리, 발광 검사법: 12시간 FAC 처리.

2. qPCR

1. qPCR을 위한 mRNA 분리
   주의: RNA 추출 시약과 클로로포름은 호흡기 위험이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(실험복, 화학물질 저항성 일회용 장갑, 안구 보호구)를 착용한 채 연기구 후드에서만 다루세요.
   1. 벤치에서 세포에서 배지를 흡인하세요. 멸균된 PBS로 세포를 2번 세척하고, 남은 액체는 철저히 흡인하세요.
   2. 훈풍 후드에서 다음 부피로 세포에 RNA 추출 시약을 첨가합니다: 6웰 플레이트: 250 μL/웰, 10cm 접시: 1 mL/플레이트.
   3. 연기구 내 얼음 작업을 할 때, 셀 스크레이퍼로 용해진 세포를 부드럽게 긁어내세요. RNA 수율을 극대화하려면 플레이트의 모든 부분을 꼼꼼히 긁어내세요.
   4. 용해액을 멸균되고 미리 냉각된, RNAse 없는 마이크로퓨지 튜브로 피펫팅합니다. 실온에서 5분간 두세요.
   5. 추출 시약 1mL당 연 기 후드 안에 200 μL 클로로포름을 첨가합니다. 샘플을 최소 30초간 세게 흔들어 추출 시약과 클로로포름을 혼합합니다. 실온에서 5분간 두세요.
      참고: 시간이 지나면 상 분리가 일어나며, RNA를 포함한 투명한 수상이 그 위에 놓입니다.
   6. 원심분리기 샘플을 12,000 g , 4 °C에서 15분간 × 채취합니다. 한편, 새로운 오토클레이브 튜브에 라벨링하고, 얼음 위에 있는 튜브에 추출 시약당 500 μL의 이소프로판올을 추가하세요.
   7. 각 해당 튜브에 수상 전이만 전달하세요. 부드럽게 뒤집어 섞은 후 실온에서 10분간 두세요. 낮은 수율이 예상되면 2μL GlycoBlue를 추가하여 펠릿을 시각화합니다.
   8. 원심분리기에서 12,000 × g , 4 °C에서 15분간 원심분리기.
      참고: 침전된 RNA가 튜브 바닥에서 보일 수 있습니다.
   9. 과잉 이소프로판올을 지정된 폐기물 비커에 조심스럽게 부어주세요. 1mL의 분자등급 100% 에탄올을 튜브에 떨어뜨리지 않도록 조심하여 넣으세요. 원심분리기에서 7,500 × g , 4 °C에서 5분간 원심분리기.
   10. 에탄올을 부어. 튜브를 뒤집어 넣고 뚜껑을 종이 타월 위에 열어두세요. 펠릿을 물방울 없이 말릴 때까지 기다려 주세요(~15–30분).
       참고: 글리코블루를 첨가하지 않으면 펠릿이 반투명해질 수 있습니다.
   11. 펠릿을 멸균되고 RNAse 없는 25 μL 물에 재현탁합니다. 자외선 가시광선 분광광도계를 이용해 RNA 농도를 정량화합니다. 샘플 전반에 걸쳐 최대 1 μg의 RNA가 16 μL 단위로 허용되도록 정규화합니다.
2. qPCR을 위한 cDNA 합성
   참고: RNA/cDNA 수량을 극대화하려면 얼음 위에서 모든 단계를 완료하세요.
   1. 샘플을 해동하세요. 작업 공간을 RNAse 클리너로 세척하세요.
   2. 각 샘플에서 1μg RNA를 해당 PCR 스트립 튜브에 추가합니다.
   3. 각 튜브에 4μL cDNA 혼합물을 추가합니다. 필요 시 멸균수를 추가하여 총 부피를 20 μL로 만듭니다. 혼합물을 다음 열순환기 기준으로 돌리세요: 5분당 25°C, 30분당 42°C, 5분당 85°C, 무한정 4°C 조건.
3. qPCR 실행
   1. 추가 반응을 수행하기 전에 멸균된 물에 cDNA 1:10을 희석하세요.
      참고: cDNA는 -20°C에서 1개월간 또는 -80°C에서 6개월간 냉동할 수 있습니다.
   2. 프라이머를 멸균수와 함께 10 μM 농도로 희석합니다. 적절한 대조군 및/또는 관리 유전자(예: B2M, TBP1)를 포함하세요.
   3. 각 하우스키핑 유전자와 관심 있는 유전자별로 마스터 믹스를 만들어, 각 DNA 조건을 3배로 실행할 수 있는 충분한 반응 혼합물을 확보하세요. 마스터 믹스 레시피(반응별 기준)는 다음과 같습니다: 2x PCR 혼합물: 10 μL, 순방향 프라이머(10 μM): 1 μL, 역방향 프라이머(10 μM): 1 μL, 멸균수: 8 μL.
   4. qPCR 반응판을 96웰 냉각된 금속 블록에 넣습니다. 각 샘플 웰에는 희석된 cDNA 5 μL을, 반응 마스터 믹스 20 μL을 각 웰에 첨가합니다. 각 우물을 점검하여 모든 부피가 같은지 확인하고, 플레이트 실러로 덮은 뒤, 평평한 가장자리 도구로 기포를 매끄럽게 다듬으세요.
   5. 플레이트를 1,000 × g , 4 °C에서 1분간 원심분리합니다. 플레이트를 qPCR 기계에 넣어 올바른 방향으로 적재되도록 하세요.
   6. qPCR 소프트웨어에서 각 웰마다 샘플 및 관심 유전자 식별을 지정합니다. 같은 설정으로 여러 복제를 실행할 계획이라면 템플릿을 만드는 것을 고려해 보세요.
   7. 표 1에 표시된 qPCR 프로그램(지속 시간: ~1:36 h)을 실행하세요.
   8. 결과를 .로 내보내세요. CSV 또는 . XLSX 파일. qPCR 기계에서 사용자가 내보낼 값을 선택할 수 있다면, 내보내는 파일에 CT 값이 포함되어 있는지 확인하세요.
   9. 관심 있는 각 질환과 유전자의 평균 CT 값을 해당 조건의 하우스키핑 유전자의 CT 값과 비교하여 각 유전자의 접수 변화를 계산합니다. 차량 상태의 접힘 변화를 1.0으로 정규화하세요.

3. 서부 얼룩

1. 웨스턴 블롯을 위한 단백질 분리
   참고: 단백질 수량을 극대화하기 위해 모든 과정을 얼음 위에서 수행하세요.
   1. 생물안전 캐비닛에서 배양 배지를 흡인하세요. 배양판 바닥을 덮을 만큼 차가운 PBS로 세포를 헹구세요. 흡입하고, 반복하세요.
   2. 단백질 분해를 방지하기 위해 프로테아제 억제제와 인산효소 억제제 혼합물을 보충한 RIPA 버퍼를 추가합니다. 6웰 플레이트에서 배양할 때는 RIPA 용액 75 μL, 10cm 플레이트에는 200 μL RIPA 용액을 사용하세요.
   3. 얼음 위에서 작업할 때는 세포 스크레이퍼를 사용해 용해진 세포를 부드럽게 판에서 느슨하게 떼어내세요. 플레이트의 모든 부분, 가장자리를 포함해 세포를 제거하는 데 특별히 주의하세요. 용액은 투명하고 약간 점성이 있는 것처럼 보일 것입니다.
   4. RIPA-셀 현탁액을 냉각된 마이크로퓨지 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 원심분리기는 최대 속도로 4°C에서 10분간 샘플링합니다. 상정액(단백질 용해액)을 미리 냉각된 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 버려.
   5. 브래드포드 또는 BCA 분석법을 통해 단백질 농도를 정량하세요. 프로테아제와 인산화효소 억제제가 첨가된 순수한 물에서 얼음 위에 샘플을 1 μg/μL로 정규화합니다.
   6. 라엠리 완충액에 희석 용해액을 사용하여 최종 단백질 농도가 샘플 간에 균일하게 유지되도록 합니다. 단백질을 변성시키기 위해 95°C에서 10분간 끓이는 용해액을 사용합니다. 최상의 결과를 위해서는 준비 직후 바로 서부 블롯팅을 사용하세요. 그렇지 않다면, 단백질을 Laemmli에 단기적으로 -20°C(≤ 1개월) 또는 장기적으로 -80°C에 보관하세요.
2. SDS-PAGE용 아크릴아마이드 겔 준비
   주의: 아크릴아마이드는 신경독소이므로 적절한 개인 보호 장비(실험복, 화학물질 저항 장갑, 안구 보호구)를 착용한 상태에서만 다루어야 합니다.
   1. 관심 있는 단백질과 이 단백질들의 크기를 확인하려면 사용할 항체 회사 웹사이트를 참고하세요. 관심 단백질의 예측 크기를 바탕으로 젤에 필요한 아크릴아마이드 비율을 결정하세요.
      참고: 10%-15% 아크릴아마이드는 대부분의 분자량에 잘 작동합니다.
   2. 제조사의 지침에 따라 젤 캐스팅 스탠드와 프레임을 조립하세요.
   3. 해상도 젤의 경우, 표 2에 따라 필요한 2개의 젤에 필요한 성분을 표 2에 따라 적절한 부피로 원뿔형 튜브에 아크릴아마이드, 멸균수, 1.5 M Tris/HCl pH8.8 완충제, 10% 도데실 황산나트륨을 혼합합니다. 반전으로 믹싱하세요.
   4. 10% 과황산암모늄 용액을 추가하고 TEMED를 혼합물에 넣습니다. 믹스를 위해 인버트를 하세요.
   5. 즉시 용액을 젤 캐스팅 프레임에 넣고, 빗을 넣을 경우 젤 캐스팅 프레임 내 용액 부피가 빗 바닥에 도달하는 데 필요한 양보다 약간 낮아질 때까지 채웁니다.
   6. 즉시 경화 젤 위에 순수 에탄올 100–200 μL을 떨어뜨리며 추가합니다. 단백질 분해액을 해동 및/또는 변성해야 할 경우, 이 잠복 기간 내에 완료하세요. 단백질은 얼음 위에 해동하세요.
      참고: 이렇게 하면 용액이 분산되어 젤이 고르지 않게 굳지 않습니다.
   7. 굳으면 에탄올을 부어내세요. 스태킹 겔의 경우, 표 2 에 따라 두 젤에 필요한 성분이 나열되어 있는데, 두 젤에 필요한 성분이 명시되어 있는데, 두 젤에 필요한 성분이 명시되어 있는데, 원뿔형 튜브에 아크릴아마이드, 멸균수, 0.5 M Tris/HCl pH6.8 완충제, 10% 도데실 황산나트륨을 적절한 양으로 혼합합니다. 반전으로 믹싱하세요.
   8. 혼합물에 10% 과황산암모늄 용액과 TEMED를 추가하세요. 반전으로 믹싱하세요.
   9. 즉시 쌓기 용액을 젤 캐스팅 프레임에 넣어 부피가 위쪽에 도달할 때까지 넣으세요. 젤을 부은 직후 바로 젤 빗을 넣으세요. 겔 캐스팅 스탠드를 가볍게 흔들었을 때 웰의 모양이 변하지 않을 때까지 ~1시간 동안 휴지시킵니다.
3. 로딩 겔
   1. 전기영동실에 런 버퍼를 채워 적절한 충전 라인에 넣어 투입할 젤 수에 맞게 합니다.
   2. 빗이 아직 안에 있는 젤 프레임을 전기영동실로 옮기세요. 젤 사이 공간에 런 버퍼를 더 추가해 저장소가 가득 찰 때까지 계속하세요. 빗을 부드럽게 물에 담긴 젤에서 빼세요.
   3. 각 젤의 웰에 5–10 μL의 사다리를 피펫으로 주입합니다.
   4. 추출한 단백질 5–20 μL과 Laemmli 버퍼 샘플을 각 웰에 피펫 넣습니다. 빈 웰에 1x Laemmli 완충제 5–10 μL를 추가하세요.
      참고: 추가하는 부피는 관심 단백질의 유병률이나 항체의 효능에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
4. SDS-PAGE 실행 중
   1. 전기영동실을 파워팩에 연결하세요. 150V로 45분간 작동하도록 설정했습니다.
      참고: 설치 방식에 따라 완전한 이동이 이루어지려면 더 많은 시간이나 더 높은 전압이 필요할 수 있으니 필요에 따라 조정하세요.
   2. 단백질이 젤 끝(젤 캐스터와 젤 프레임이 기기 하단에서 만나는 지점)으로 이동하면 러닝을 멈추고 파워팩을 끕니다.
5. 단백질 전달 완료
   참고: 이 절편은 신속 단백질 전달 장치를 사용하여 개발되었습니다.
   1. 옮이 버퍼를 젤 트레이에 부어. 전이 스택을 추가하고, 이어서 니트로셀룰로오스 막과 또 다른 트랜스퍼 스택을 액체에 넣어 막이 중앙에 샌드위치를 형성합니다. 샌드위치 스택이 완전히 전송 버퍼에 잠겨 있는지 확인하세요.
   2. 신속 단백질 전달 장치를 켜고 관심 단백질의 젤 수와 크기에 맞는 적절한 프로토콜을 선택하세요.
      참고: 1.3 A와 25V 10분 동안 잘 작동하는 것으로 나타났으나, 최적화가 필요할 수 있습니다.
   3. 겸자로 상단 이식 스택을 제거하고 과잉 액체가 젤 트레이로 흐르도록 하세요. 스택을 단백질 전달 장치로 옮겨 최대한 평평하고 곧게 놓으세요; 롤러나 원뿔형 튜브를 사용해 주름을 펴세요. 멤브레인도 반복합니다.
   4. 무딘 끝 도구로 캐스팅 프레임의 상하부를 부드럽게 분리하세요. 젤을 단백질 전달 장치에서 막으로 옮깁니다.
   5. 남은 이식 스택을 젤 트레이에서 들어 올려 나가세요. 남은 액체를 빼낸 후 막 위에 올려놓고 다른 층을 올려놓으세요. 젤 상자를 닫고 프로그램을 실행하세요.
6. 항체로 인한 차단 및 염색
   1. 젤 상자를 열고 겸자로 윗부분 스택을 제거한 후 젤을 떼어내세요. 사다리에서 나온 밴드가 멤브레인에 있는지 확인해 주세요. 원하는 크기만 포함하도록 멤브레인을 잘라내세요.
   2. 멤브레인을 깨끗한 블롯 박스로 옮기세요. 블로킹 완충제를 5mL 또는 막을 덮을 만큼의 양을 추가하세요. 상온 교반 아래에서 1시간 동안 차단하세요.
   3. 한편, 각 막의 세척 완충액에 권장 농도의 1차 항체 2% 소 혈청 알부민 5mL를 첨가하여 항체 염색을 준비하세요. 가정용 단백질(예: GAPDH, β-액틴)에도 염색이 있습니다.
   4. 교반을 제거하고 차단 버퍼를 부어주세요. 1차 항체 용액 5mL를 추가하세요. 어둠 속에서 4°C에서 교반하여 하룻밤(~12–16시간) 배양합니다.
      참고: 앞으로는 모든 단계를 어둠 속에서 완료해야 합니다.
   5. 멤브레인을 실온 교반 후 3분 동안 세척 버퍼로 세척하세요.
   6. 권장 농도의 2차 항체를 5% BSA에 세척 버퍼에 첨가합니다. 각 막마다 5mL의 용액을 준비하세요.
   7. 과잉 세척 버퍼를 부어내세요. 각 블롯마다 2차 항체 용액 5mL를 추가하세요. 어둠 속에서 실온 교반 아래 1시간 동안 배양하세요.
   8. 멤브레인을 실온 교반 후 3분간 세척 버퍼를 사용해 세척하세요. 즉시 이미지를 찍어라.
7. 관심 있는 단백질의 검출 및 분석
   1. 선택한 플랫폼을 사용하는 단백질 영상.
   2. ImageJ나 다른 플랫폼을 사용해 관심 있는 각 밴드의 강도를 정량화하세요.

4. 불안정한 철 염료 분석

1. 불안정한 철 염료 염색
   1. 1섹션 전체를 완료하여 96웰 플레이트에 철분 처리를 받아 세포를 2시간 동안 시딩하세요. 각 철 처리 조건에 대해 최소 3개의 웰이 있어야 하며, 음성(유체; 배양 배지 + 150 μM 철 킬레이터 데페록사민) 및 양성(배양 배지 + 180 μM FAC + 불안정한 철염료 공처리) 대조군도 함께 확보해야 합니다.
   2. 혈청 없는 배지에서 1 mM 불안정 철 염료 스톡 용액을 1:200 희석하여 각 샘플 웰마다 200 μL을 확보합니다.
   3. 배양지에서 흡입하세요. PBS로 2번 세척하세요.
   4. 각 웰에 염색액을 추가하고 37°C에서 1시간 배양합니다.
   5. PBS로 한 번 씻으세요. PBS로 교체하세요.
   6. 형광 현미경의 원적색 채널(646/662 nm)을 사용해 세포를 영상화하세요. 이미지를 저장하고 .로 내보내세요. TIF 파일들.
2. 염색 분석
   1. 이미지를 ImageJ에서 열어보세요.
   2. m 버튼을 눌러 측정 창을 열어. 측정 창 안, 결과 | 측정값을 설정하고, 면적, 통합 밀도, 평균 회색 값을 선택하세요. 확인을 선택하세요.
   3. 폴리곤 도구를 사용해 이미지 내 각 셀 주위를 그리세요. 각 셀 뒤에 m을 눌러 측정 창에 측정값을 추가하세요.
   4. 이미지 내 모든 셀을 정량화한 후, 모든 값을 복사해서 스프레드시트에 붙여넣으세요. 원형 도구를 사용해 셀이 없는 영역에서 최소 세 가지 배경 측정을 취하세요.
   5. 다음 공식을 사용하여 각 세포별로 보정된 총 세포 형광(CTCF)을 계산합니다:
      CTCF = 통합 밀도 – (선택된 셀의 면적 x 배경 측정값의 평균 회색값)
   6. 철 처리된 셀과 차량 셀의 CTCF 값을 비교하세요. CTCF 증가는 불안정한 철분 수치가 증가함을 의미합니다.

5. 세포 발광 분석법

1. 발광 분석 세포 처리
   1. 섹션 1을 완료하여 각 조건에 대해 우물 수가 n = 3에 해당하는지 확인하세요. 최소 세 개의 셀 프리(완전한 배지만) 대조 우물을 추가하세요. 각 웰에는 100 μL의 세포와 배지를 추가해야 합니다.
   2. 처리되지 않은 세포를 하룻밤 배양한 후 원하는 대로 처리와 대조군을 적용하세요. 반드시 차량(미치료) 상태, FAC 단독 조건, 세포독성 + 10 μM 페로스타틴-1(항강제), 차량 + 1 μM RSL3, 그리고/또는 차량 + 10 μM 페로스타틴-1 + 1 μM RSL3를 반드시 포함해야 합니다. 치료 효과를 극대화하고 과도한 세포 사멸을 방지하기 위해 원하는 기간(12–24시간)까지 인큐베이팅합니다.
2. 발광 분석 완료
   1. 세포를 처리한 후에는 발광 완충 성분을 실온으로 해동합니다. 필요한 부품을 조합해 어둠 속에 보관해 두고, 사용 준비가 될 때까지 보관하세요. 온도 저장 요구사항은 키트 설명서를 참조하세요.
   2. 세포가 처리를 마치면, 키트의 지시사항을 따라 세포 처리를 진행하세요.
      참고: 여기에는 상온 평형이 포함될 가능성이 높으며, 그 후 발광 완충제를 추가하고 마지막으로 짧은 상온 잠복 기간이 있을 것입니다. 발광 완충기가 추가되면 모든 단계는 어둠 속에서 수행해야 합니다.
   3. 판 리더기나 유사한 기기를 사용해 발광을 완성하고 기록하세요.
      참고: 이 프로토콜에서는 0.3초의 적분 시간이 사용되었습니다.
   4. 실험 우물의 발광 값을 세포 없는 대조 우정의 평균 발광에 정규화합니다.
      참고: 발광 값이 높을수록 살아있는 세포 수가 더 많다는 의미입니다.

결과

우리와 다른 연구자들의 이전 연구를 바탕으로, 우리는 세포외철을 증가시키면 쥐 근육 세포에서 세포 내 철분 과부하가 발생하고, 하류 철분 반응을 모니터링할 수 있을 것이라고 가설을 세웠습니다. 따라서 우리는 그림 1에 설명된 C2C12 워크플로우를 개발했으며, 세포는 하위 분석에 따라 2시간에서 24시간 동안 정의된 농도의 페릭 암모늄 시트레이트에 노출되었습니다.

모델을 검증하는 첫 단계는 FAC가 셀에 침투할 수 있음을 확인하는 것이었습니다. 표 3에 기술된 검증된 프라이머를 사용하여 페리틴의 중사슬과 경사슬 모두에 대해 qPCR을 실시하였고, 철분 투입 증가가 페리틴 mRNA 수치 상승과 상관관계가 있음을 확인했습니다 (그림 2A,B). 단백질 수준에서도 FAC 농도가 증가함에 따라 페리틴 수치가 유사한 증가를 보였으나, 이는 용량 의존적이지 않은 것으로 보였 다(그림 2C). 마찬가지로, 살아있는 FAC 처리된 C2C12 세포를 염색한 결과, 세포독성 용량의 철분 투여와 양성 용량의 철분 염색을 동시에 투여한 세포가 시각적·정량적으로 철분 저장량이 증가하는 것으로 나타났습니다. 그림 2D). 전반적으로 이 결과들은 FAC를 통해 세포 배지에 도입된 철분이 실제로 세포 내에 유입되고 있음을 시사합니다.

FAC가 세포 내 철분 부하를 증가시킨다는 사실이 확인된 후, 우리는 철분 과부하가 철세포 지방 배출증과 관련된 분자 및 기능적 변화를 동반하는지 여부를 확인하고자 했습니다. FAC는 Slc40a1 (페로포틴) 발현을 증가시키고(그림 3A), Hmox1 을 증가시켰다(그림 3B). FAC는 또한 GPX4 단백질을 감소시켰으며, 이 감소는 데페록사민에 의해 부분적으로 되돌렸습니다(그림 3C). RSL3 치료도 GPX4 감소를 유사하게 나타나 FAC 반응을 철학 관련 분자 맥락 내에서 두었습니다. 기능적으로, 세포독성 FAC 용량은 12시간에서 발광 기반 생존력을 감소시켰으며, 이 초기 생존력 상실은 페로스타틴-1(그림 3D)으로 구제되었습니다. 반면 24시간에는 조건 간 차이가 덜 뚜렷해지고 더 가변적이 됩니다(그림 3E). 페로스타틴-1 처리 샘플은 세포독성 FAC 단독에 비해 여전히 높게 유지되지만, 이 시점에서 전체 분석의 동적 범위는 감소합니다. 이 데이터를 종합해 보면, FAC 처리는 철분 과부하, 철분 반응 관련 분자 변화, 그리고 시간에 따라 C2C12 세포에서 생존력 감소를 유발합니다.

그림 1: 철 과부하 모델의 그래픽 초록. 이 모델에서는 C2C12 세포를 시딩하여 철분 주입 배양지와 직접 분자 분석으로 처리하기 전에 하룻밤 배양합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 삼철암모늄 시트레이트 첨가 후 불안정한 철 저장 및 페리틴 합성 증가. (A) 페리틴 중쇄와 (B) 페리틴 경쇄의 mRNA 수준은 아철암모늄 시트레이트가 시스템에 첨가됨에 따라 증가합니다. (C) FTH1 단백질 농도는 시스템에 철철이 첨가되면 증가합니다. (D) 심적색 불안정 철 염료로 염색하기 전과 동시에 처리된 C2C12 세포에서 불안정성 철 농도가 증가하는데, 이는 차량 + 데페록사민 대조군과 비교함. 공동 처리 조건은 배양지 + 180 μM FAC + 불안정 철염료를 동시 처리하는 것을 의미합니다. 오류 바는 +/- SD입니다. 약어: FTH1 = 페리틴 중쇄; FTL1 = 페리틴 경쇄; DFO = 데페록사민. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: FAC 첨가 후 세포 생존력의 시간 의존적 감소 및 철철증 관련 분자 변화. FAC 처리 후 (A) 페로포틴(Slc40a1)과 (B) Hmox1의 mRNA 농도가 증가합니다. (C) FAC 처리 후 양성 대조군 RSL3가 있을 때 GPX4 단백질이 감소함; 데페록사민은 FAC 관련 GPX4 감소를 부분적으로 되돌립니다. (D) FAC, RSL3 및/또는 페로스타틴-1로 12시간 처리 후 C2C12 세포의 발광이 세포 무(배지 한정) 웰로 정규화됨. (E) FAC, RSL3 및/또는 페로스타틴-1로 24시간 처리 후 처리된 C2C12 세포의 발광이 정상화됨. 오류 바는 +/- SD입니다. 이 그림의 확대판을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

스테이지 대기
1	50 °C, 1.6 °C/s 속도로 올리고 2분간 유지하세요
2	1.6 °C/s 속도에서 95 °C까지 올리고 10분간 유지합니다
PCR 단계 (40회 달리기)
1	95°C에서 15초간 유지하세요
2	1.6 °C/s 속도에서 60 °C로 낮추고 1분간 유지하세요
용융 곡선 단계
1	1.6 °C/s 속도에서 95 °C까지 올리고 15초간 기다립니다
2	1.6 °C/s 속도에서 60 °C로 낮추고 1분간 유지하세요
3	0.15 °C/s 속도에서 95 °C까지 올리고 1초간 유지하세요

표 1: 프로토콜 섹션 2의 qPCR 프로그램 (지속 시간: ~1:36시간).

	해상도 젤			스태킹 젤
구성 요소	10%	12.50%	15%
아크릴아마이드 (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
멸균수 (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
트리스/HCl, 1.5 M pH 8.8 (mL)	4.2			-
트리스/HCl, 0.5 M pH 6.8 (mL)	-			1.25
10% 도데실 황산나트륨(μL)	166			50
0.1 g/mL 과황산암모늄(μL)	80			25
테메드	8.3			5

표 2: 웨스턴 블롯을 위한 젤 분리 및 스택 성공 세팅에 필요한 성분 및 부피 요약. 제공된 부피는 두 개의 젤에 충분하며, 이에 따라 축척할 수 있습니다. 백분율은 혼합물 내 아크릴아마이드의 양을 나타냅니다.  참고: APS와 TEMED는 주조 준비 시에만 마지막에 첨가해야 하며, 이는 젤 중합 과정을 촉발합니다.

유전자 타겟	유전자 심볼	기능	종	포워드 시퀀스	역시퀀스
베타-2-마이크로글로불린	B2m	가사 유전자	마우스	카카트가아 TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
타타 박스 결합 단백질	요약	가사 유전자	마우스	카갓 GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
페리틴 중사슬	첫 번째	철 저장 단백질인 페리틴의 소단위	마우스	TGGCTCTGAA 가크트트그카	TCATCACGGTC TGGTTTTTTTTA
페리틴 경쇄	Ftl1	철 저장 단백질인 페리틴의 소단위	마우스	아 아카캐그	아가아그차카 가가트개그트
헴 산소화효소 1	Hmox1	헴, 이산화탄소, 철분 존재 시 빌리버딘을 빌리루빈으로 전환합니다; 페로토시스에는 높은 수치가 존재합니다	마우스	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
페로포르틴 1	SLC40a1	과도한 철분을 세포 밖으로 운반합니다	마우스	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG 카카캇가

표 3: 관심 있는 철 수송 및 철 세포폐증 유전자에 대한 검증된 qPCR 프라이머 목록. 프라이머는 C2C12 세포에서 유래한 mRNA에 사용되기 때문에 쥐 특이적입니다.

토론

본 연구의 목표는 쥐 근육 전구세포에서 철분 과부하의 실용적인 시험관 내 모델을 확립하고, 철학 관련 반응이 신뢰성 있게 검출될 수 있는 조건을 정의하는 것이었습니다. 이 워크플로우를 통해 페릭 암모늄 시트레이트 처리는 강력한 세포 내 철분 축적을 유발하며, 페리틴 발현 증가와 불안정성 철 신호 상승을 동반함을 보여준다. 철 부하는 철분 단백질 발 현 증가와 GPX4 단백질 감소 등 철분 관련 스트레스와 일치하는 분자 변화와도 연관되어 있습니다. 기능적으로 세포독성 FAC 노출은 세포 생존력을 감소시키며, 이는 초기 시점에 페로스타틴-1에 의해 구출되어, 관찰된 세포 사멸에 기여하는 철학 민감성 성분의 존재를 뒷받침합니다.

철분 용량과 치료 기간은 이 시스템의 해석 가능성에 직접적인 영향을 미치는 중요한 변수입니다. 저희 입장에서는 초기 시점(약 12시간)이 조건 간 가장 명확한 구분을 제공하여, 페로스타틴-1이 FAC에 의해 유발된 세포독성을 재현 가능하게 구할 수 있게 합니다. 이후 시점(예: 24시간)에서는 전체 생존 가능성이 감소하고 조건별로 변동성이 증가하여 분석의 동적 범위가 감소합니다. 이는 생존 인구의 누적된 세포 손실과 적응, 예를 들어 항산화 능력 증가나 철분 처리 변화와 일치합니다.

철철(Fe²⁺) 대신 철철(Fe³⁺)을 투여하는 것, 투여된 철분 농도와 치료 기간도 프로토콜의 중요한 측면입니다. 철철 사용은 필수적인데, 이는 철^{철 수입}을 담당하는 주요 운송체인 트랜스페린에 쉽게 흡수되기 때문입니다. 철철은 다른 수송체(특히 이가 금속 수송기 DMT1)에 의해 흡수될 수 있지만, 이 맥락에서는 철철이 철철¹²보다 더 효과적으로 통합된 것으로 보인다. 이 프로토콜에 선택된 FAC 농도는 생리학적 관련성과 과거 유사 모델에서의 사용 성향을 고려하여 선택되었습니다^13,14. 철분 처리 기간은 24시간으로, 우리와 다른 이들의 유사한 모델을 기반으로 했습니다. 그러나 일부 맥락(예: 불안정한 철 염색 및 세포 발광 분석)에서는 24시간이 너무 긴 치료 기간으로 간주되었습니다. 이 경우, 24시간 치료가 너무 심한 세포 사멸을 초래하여 세포 물질이 파괴되어 결론을 내릴 수 없었습니다. 예를 들어, RSL3는 매우 강력한 지질 과산화제로, 12시간의 처리 기간만으로도 지질 과산화를 유도하는 동시에 철분 과부하의 효과가 동시에 나타나도록 할 수 있었습니다(그림 3C-E). 또한, 불안정성 철 염료의 경우, 세포는 철 과부하에 대한 초기 반응을 포착하기 위해 2시간(2, 4, 24시간 철 처리 후 염색 시도 후)만 FAC로 처리하여 세포 과부하가 발생하기 전에 초기 반응을 포착했습니다(그림 2D). 전반적으로, 유전자 및 단백질 수준의 변화는 철분 처리 후 12–24시간 후에 가장 잘 측정되었는데, 이는 세포가 변화를 일으키는 데 시간이 더 오래 걸리기 때문인 반면, 염색은 더 짧은 치료 후에 하는 것이 가장 좋기 때문인 것으로 보입니다.

다른 이들도 유사한 모델을 개발했습니다. 한 그룹은 철철 처리된 C2C12 모델을 생성하여 p53-Slc7a11 축이 철 지방 형성에서 역할을 연구했습니다. 그들은 철철 치료를 48시간 동안 진행하면 지질 과산화가 증가하고 Slc7a11 수치가 감소하여 철세포증(ferroptosis)을 시사^했다. 또 다른 유사한 모델—이번에는 황산철 처리된 C2C12 세포를 이용해 Akt-FoxO3-E3 유비퀴틴 리가아제 경로와 페로토시스의 관계를 연구하여—4시간¹⁴분 이상의 철분 치료를 포함했습니다. 이들 사이의 공통점은 줄기세포 유사 근모아 상태로 남아 있지 않고 미요관으로 분화된 C2C12 세포를 철분 처리한다는 점입니다. 이로 인해 우리 시스템은 이전에 관찰된 MuSCs에서 관측된 철분 축적과 특히 관련이 깊습니다.

이 방법은 시험관 내에서 근육에 대한 철분 과부하의 영향을 연구하는 간단한 방법이지만, C2C12 세포에서만 사용되었다는 한계가 있습니다. 과거 연구들은 근육 줄기세포가 노화 과정에서 철분 과부하에 취약하다는 것을 보여주었으며, 이와 유사한 방법이 해당 맥락에서 유효할 수 있음을 시사합니다⁹.

종합적으로 이 모델은 철 과부하가 C2C12 세포에서 재현 가능한 철학 관련 분자 변화와 페로스타틴 민감성 생존 감소를 유도하기에 충분함을 보여준다. 추가적인 직교 분석이 특정 맥락에서 세포 사사 분류를 더욱 정교하게 할 수 있지만, 여기서 관찰된 분자 및 약리학적 반응의 복합은 철철 세포 스트레스와 일치합니다. 이 접근법이 근육 노화와 질병에서 철분 조절 이상에 대한 기전적 연구를 촉진할 것으로 기대합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	-20 °C에서 보관. 얼음 위에서 해동.
15 mL 원심 분리기 튜브 CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% 아크릴아마이드/비스인산염 용액, 29:1, 500 mL 사이즈	Bio-Rad	1610156	신경 독소입니다. 적절한 PPE(연구실 코트, 장갑, 안구 보호기)를 착용한 후에만 취급하세요.
5425 / 5425 R 마이크로센트리퓨지	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri 원심 분리기	Eppendorf	05-414-459PM2
96웰 블랙/클리어 바닥 플레이트, TC 표면	Thermo Fisher Scientific	165305
암모늄 과황산염, 10 g	Bio-Rad	1610700	아크릴아마이드 겔 주조를 위한 중합제로, 무균 물에 10% 무게/부피 용액으로 용해합니다. 분말은 상온에서 안정하지만 용액은 장기간 -20 °C, 단기간 4 °C에서 보관해야 합니다.
Anti-GAPDH, 마우스 항체, 100 µg 사이즈	Thermo Fisher Scientific	AM4300	2% BSA + 세척 버퍼에 1:2000 농도로 사용. 37 kDa에서 실행.
BCA 단백질 분석 키트(희석 없는 BSA 단백질 표준 포함)	Thermo Fisher Scientific	A55865	제조사의 사용 지침을 따르세요. 표준은 처음 사용 후 4 °C에서 보관해야 합니다.
베타 액틴 로딩 컨트롤 단일클론 항체(BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	2% BSA + 세척 버퍼에 1:1000 농도로 사용. 42 kDa에서 실행.
BioLite 6 웰 멀티디시 세포 배양 처리 표면	Thermo Fisher Scientific	130184
블롯 박스, 블랙, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
브로모페놀 블루	Sigma-Aldrich	B0126	라엠리 버퍼 준비에 사용.
BSA, 고체, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	4 °C에서 보관.
C2C12 세포	ATCC	CRL-1772	액체 질소의 증기 상에서 보관.
cDNA Supermix QScript 500 반응	Avantor/VWR	101414-108	-20 °C에서 보관. 얼음 위에서 해동.
세포 리프터, 100pk	Fisher Scientific	8100240	크기가 크므로 10 cm 이상의 접시에서 세포 추출에 사용합니다.
세포 스크레이퍼, 10인치 손잡이, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	작은 머리가 있어 다중 웰 플레이트에서 세포를 제거하는 데 가장 적합합니다.
CellTiter-Glo 발광 세포 생존성 키트, 10 mL	Promega	G7570
클로로포름, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	흄 후드에서만 사용하고, 폐기물은 별도의 용기에 버리세요.
COMPLETE EDTA-free 단백질분해 저해제 탭	Sigma-Aldrich	4693132001	1정을 500 µL의 무균 물에 용해하여 100배 용액을 만듭니다.
CO2 100-120 V 인큐베이터	Binder	9640-0002	모델 버전 CBS 170-120 V. 세포 배양에 사용.
데페록사민 메실레이트, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO는 철 킬레이터이므로 세포에 첨가하면 철 함량이 감소합니다. 물에 용해하여 1 M의 농도로 스톡 용액을 만듭니다.
디메틸 설폭사이드, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	불안정한 철 염색 및 재구성에 사용.
DMEM, 고당, 피루브산, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 컨주게이트 염소 항-토끼 IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	세척 버퍼의 5% BSA에 1:5000 비율로 추가합니다.
DyLight 800 4× PEG 컨주게이트 염소 항-마우스 IgG (H&L) 2차 항체	Thermo Fisher Scientific	SA535521	세��