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방법 논문

분자 병리 전문의를 위한 Integrative Genomics Viewer (IGV) 활용 임상 변이 해석

134 조회수

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DOI:

10.3791/71808

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2026년 8월 14일

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1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

통합 유전체 뷰어(IGV) 소프트웨어는 임상 변이 호출(variant calling)의 기초 데이터에 대해 풍부하고 직관적인 창을 제공합니다. 본 영상에서는 실제 병원성 이벤트와 아티팩트를 신속하게 구분하는 방법을 보여주는 다섯 가지 사례를 제시하며, 궁극적으로 차세대 염기서열 분석(NGS) 분석의 분자 진단 결과 확정(molecular sign-out)을 수행하는 실무자의 진단 신뢰도를 높이고자 합니다.

초록

Integrative Genomics Viewer (IGV)는 복잡한 시퀀싱 데이터의 시각화 및 해석을 가능하게 하는 임상 유전체학의 핵심 도구입니다. 시퀀싱 결과의 시각적 평가에 임상적 지식을 결합하는 것은 분자 병리학자와 기타 전문가들이 사례를 평가하고 최종 확정하는 주요 수단입니다. 다양한 소프트웨어 도구가 보조할 수 있지만, 이러한 도구와 기본 데이터 간의 관계를 체계적으로 이해하고 적용해야 합니다. 본 연구에는 차세대 시퀀싱 (NGS) 데이터 파일 유형(예: FASTQ, BAM, VCF)에 대한 필수 배경 지식과 그 형식 및 목적에 대한 논의가 포함되어 있습니다. 그런 다음 이러한 파일로부터 세부적인 차이를 도출하는 IGV의 기능을 설명합니다. 우리는 임상 사례를 기반으로 큐레이션된 일련의 실무 사례를 활용하며, 이를 통해 독자는 IGV 소프트웨어를 사용하여 임상 NGS 시퀀싱 데이터와 상호작용하고 인간 참조 유전체와 관련하여 임상적으로 유의미한 다양한 유형의 변이를 검토하게 됩니다. 이러한 임상 사례들은 유전체 데이터 해석의 복잡성 중 일부 예시를 설명하고, 루틴 워크플로우의 일부로 IGV를 활용함으로써 일반적인 생물정보학 소프트웨어 알고리즘의 변이 호출을 넘어 변이에 대한 추가적인 해석 정보를 어떻게 제공할 수 있는지 설명하도록 큐레이션되었습니다. IGV 내의 도구를 활용한 유전체 변이의 시각적 검사는 유전체 변이 해석에 영향을 미칠 수 있는 미묘한 맥락적 단서(즉, 변이 대립유전자 빈도, 가닥 편향, 조직 특이적 맥락)를 드러낼 수 있습니다. 본 연구는 체세포 변이의 검출 및 해석을 위한 IGV 사용에 중점을 두고 있지만, 제공된 응용 방법은 복잡한 변이 분석 및 모자이시즘 검출을 포함하여 생식세포 설정에서의 사용으로 확장 적용될 수 있습니다.

서론

최근 몇 년 동안 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 활용하여 진단, 예후 및 치료법 선택에 필요한 정보를 제공함으로써 종양학적 케어가 변화되었습니다1. NGS 검사는 1) 분자적으로 정의된 종양의 진단 확립, 2) 치료 결정을 위한 종양 유형 불문 바이오마커 결과 활용, 3) 특정 종양 유형에 대한 위험 층화 결정이라는 측면에서 여러 종양 유형의 표준 치료법이 되었습니다2,3. NGS 및 기타 바이오마커 검사를 통한 정확하고 신속한 결과 도출은 종양학의 환자 케어 및 계획 수립에 있어 핵심적인 요소가 되었습니다.

NGS 검사는 일반적으로 대형 수탁 검사 기관이나, 해당 검사를 개발하고 유지할 수 있는 충분한 전문 지식과 자원을 보유한 병원 기반 또는 학술 연구소에서 수행됩니다. 학술 연구소를 위한 유전체학 조직(Genomics Organization for Academic Laboratories, GOAL)은 학술적 지식과 시약 비용의 공유에 중점을 둔 협력 네트워크로 구상되었습니다4. GOAL 컨소시엄의 중요한 노력 중 하나는 임상 연구의 검토 및 보고를 위한 핵심 요소들에 대한 교육 세션을 운영하는 것이었습니다. 이러한 세션들은 실무 교육 과정으로 개발되었으며, 유전체 의학에서 integrative genomics viewer (IGV)의 기본 및 고급 기능을 시연하는 인터랙티브 워크숍을 포함하고 있습니다.

대부분의 NGS 데이터는 그래픽 사용자 인터페이스 없이는 방대하고 다루기 어렵기 때문에, IGV는 사용자가 NGS 데이터 및 기타 대규모 데이터 세트를 쉽게 검토할 수 있도록 설계된 데이터 시각화 도구입니다5. IGV는 처음에 임상 변이 분석을 위해 설계된 것은 아니었습니다. 하지만 생물정보학 경험 수준과 관계없이 모든 분자 전문 가들이 쉽게 사용할 수 있다는 점 덕분에, 많은 실험실에서 복잡한 데이터 검토 워크플로우의 일부로 널리 채택해 왔습니다6. 본 연구는 이러한 정보를 더 넓은 유전체 실험실 전문가 커뮤니티에 전파하기 위한 메커니즘으로 구성되었습니다.

임상 워크플로의 일부로 IGV를 사용하는 임상적 필요성에는 시퀀싱 오류 검출, 게놈 변이 호출(variant calling)의 복잡성 처리, 그리고 추가적인 시각화가 적절한 데이터 해석에 도움이 될 수 있는 기타 반복적인 변이들이 포함됩니다7. IGV를 사용하려면 NGS 연구에서 생성된 표준 생물정보학 파일이 필요합니다8. IGV 소프트웨어의 핵심 기능은 시퀀싱 데이터의 시각화를 가능하게 하며, 임상 변이 해석을 위해 일련의 기본 설정 및 옵션 구성이 필요합니다 (Supplementary File 1).

숏리드 시퀀싱 워크플로우는 FASTQ, binary alignment map (BAM), 그리고 variant call format (VCF) 파일 표준으로 대표됩니다. NGS는 수백만 개의 숏리드(short reads)를 병렬로 생성함으로써 높은 처리량을 달성합니다. 이러한 전략은 데이터 생산 속도를 크게 높이지만, 각 리드는 원래 DNA 또는 RNA의 일부 단편에 불과합니다. 리드는 어댑터 서열에 의해 NGS 플로우 셀의 특정 위치에 고정됩니다. 광학 처리 과정에서 얻은 서열 및 염기 품질 정보는 FASTQ 파일에 기록됩니다. 이러한 raw 리드는 뉴클레오타이드 서열과 염기별 품질 점수로 구성됩니다. 따라서 raw 리드 처리의 초기 단계는 각 리드를 참조 게놈에 정렬(align)하는 것입니다8. 각 리드가 정렬 확률이 가장 높은 참조 게놈의 특정 위치에 할당됨에 따라, 동일한 위치에 해당하는 리드들이 각 유전좌위(locus)에 "쌓이게(pile up)" 되며, 이러한 데이터는 sequence alignment mapping (SAM) 규격(https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf에서 확인 가능; 최종 확인일: 2025년 9월 30일)에 따라 BAM 파일에 저장됩니다 (그림 1A). 이 정보는 IGV와 같은 게놈 브라우저를 통해 시각적으로 확인할 수 있습니다. 그림 1B에 나타낸 바와 같이, 리드 상호 간 또는 리드와 참조 서열 자체를 비교하면 뉴클레오타이드 서열 간의 차이점이나 불일치를 확인할 수 있습니다. 전체 게놈에서 이러한 "변이(variant)" 위치만을 요약하여 VCF 파일로 컴파일하며, 따라서 VCF 파일은 BAM 파일보다 크기가 훨씬 작으면서도 변이 검토에 필요한 유용한 정보의 상당 부분을 포함할 수 있습니다. 이러한 이유로 VCF 파일은 일반적으로 변이 호출(variant-calling) 파이프라인의 최종 출력물이 됩니다 (그림 1C). 결과적으로 FASTQ 파일에는 raw 리드 및 품질 데이터가 포함되고, BAM 파일은 해당 리드들이 게놈에 얼마나 정확하게 매핑되는지에 대한 통찰을 제공하며, VCF는 참조 서열과 샘플 서열 간의 차이를 나타내어 잠재적 보고를 위한 검토에 훨씬 다루기 쉬운 양의 데이터를 제공합니다.

본 연구의 6가지 임상 사례는 분자 진단 실험실의 체세포 변이 검출과 관련된 일반적인 분석 시나리오와 더불어, 기초 데이터의 정확한 이해 및 해석을 어렵게 만드는 문제점들을 보여줍니다. 전반적으로, 이러한 사례들은 점차 정교해지는 해석 시나리오를 예시하고, IGV의 고급 기능들을 활용하여 어떻게 종합적인 게놈 특성을 더 효과적으로 기술할 수 있는지 보여주기 위해 선정되었습니다. 본 연구는 체세포 변이 해석에 중점을 두고 있으나, 이러한 기능들은 생식세포 변이의 시각화 및 해석을 위한 IGV 활용에도 적용 가능합니다6. 특히, 본 논문에서 사용된 용어들은 합성 기반 시퀀싱(sequencing-by-synthesis) 화학법을 기준으로 하며, 적절한 경우 다른 플랫폼에 해당하는 유사한 용어 및 개념을 사용하였습니다.

각 임상 사례는 매우 간략한 임상적 배경으로 시작하며, 이어서 변이 또는 변이들을 조사하고 질문을 해결하는 방법, 즉 존재하는 변이 중 어느 것이 실제 변이이고 어느 것이 아티팩트인지 판별하는 방법에 대한 지침이 제공됩니다. 임상적 배경은 시퀀싱 데이터의 세부 사항과 함께 해당 질문에 답하는 데 중요한 역할을 합니다.

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프로토콜

여기에 제시된 데이터는 시뮬레이션된 데이터와 실제 환자의 NGS 데이터가 혼합된 것입니다. 하지만 모든 환자 데이터는 라벨 제거와 단일 로커스 리드 추출 방식을 통해 비식별화 처리되었습니다. 본 프로토콜은 모든 저자 소속 기관의 인간 연구 윤리 위원회에서 적용 가능한 가이드라인을 준수합니다.

1. 최신 버전의 Integrative Genomics Viewer (IGV) 다운로드하기

참고: IGV는 인간 게놈을 포함한 다양한 게놈을 시각화할 수 있는 무료 다운로드 프로그램입니다 (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV는 전사체, 특징 및 트랙의 최신 버전을 포함하기 위해 주기적으로 업데이트되며, 일반적으로 가장 최신 버전이 목록 상단에 위치합니다.

  1. 위에 제공된 URL에서 'IGV for Windows, Java Included'라는 이름의 파일을 바탕화면으로 다운로드하십시오. 기관에 따라 관리자 권한이 필요할 수 있습니다.
  2. IGV 내에서 제공되는 리포트에서 호출할로 계획된 인간 게놈 빌드(예: hg19 또는 hg38)를 선택하십시오.
    참고: 본 연구에서는 IGV 2.19.7 버전을 사용하였습니다. 본 프로토콜에서는 Java가 포함된 Windows용 버전을 다운로드하였습니다. IGV는 기본 메모리 할당량인 8Gb RAM으로 실행되었습니다. IGV 환경 설정 탭 및 기타 섹션에서 권장되는 설정은 Supplementary File 1.에 상세히 설명되어 있습니다.

2. 임상 사례 이해 및 필요한 파일 다운로드

  1. GitHub 저장소로 이동하십시오. 모든 파일은 GitHub 저장소 https://github.com/Eitan177/Demo_IGV 에서 다운로드할 수 있습니다.
    참고: GitHub 저장소에는 각 비네트(vignette)에 대한 세션 파일이 있으며, 이 세션 파일을 로드하면 세션 파일이 해당 단계를 처리하므로 파일을 개별적으로 로드하고 해당 유전자좌(locus)로 이동할 필요가 없습니다.
  2. 파일 메뉴를 통해 세션 파일을 로드하십시오. File > Open Session을 클릭하고 적절한 세션 파일을 선택하십시오.

3. 커버리지 트랙 설정하기

참고: IGV의 메인 창에는 "coverage track"(커버리지 트랙)이 포함되어 있습니다. 특정 상황에서는 특정 암 변이를 포함하는 리드의 비율이 매우 낮더라도 임상적으로 유의미할 수 있습니다. 이 때문에 분석 대상이 되는 게놈 부위 전체에서 매우 높은 리드 깊이(read depth)를 확보하는 것이 매우 중요합니다. 만약 특정 변이를 포함하는 리드가 2%에 불과하다면, 해당 변이를 확신 있게 판독하기 위해 수백 또는 수천 개의 리드 깊이가 필요할 수 있으며, 이것이 바로 "deep sequencing"(심층 시퀀싱)이라는 용어의 의미입니다.

  1. 커버리지 트랙 표시 확인: 상단 메뉴에서 View > Preferences를 클릭하고 Alignments 탭을 선택합니다. 해당 탭 상단에 'Show coverage track'이라는 레이블이 붙은 상자가 있습니다. 이 항목이 체크되어 있는지 확인하십시오.
  2. 임상적으로 유의미한 낮은 수준의 변이 임계값 설정: 단계 3.1에서 설명한 대로 Alignments 탭으로 이동하여 Coverage allele-fraction 레이블이 붙은 상자가 보일 때까지 아래로 스크롤합니다. 상자의 숫자를 0.01로 설정하고 Save를 누릅니다(Save를 누르면 설정 창이 닫혀야 합니다).

4. 소프트 클립 리드 설정하기

참고: 이 설정은 유전자 재배열, 복제수 변화 또는 삽입-결손 복합 사건과 같은 더 큰 규모의 구조적 변이를 검출하는 데 매우 유용합니다. EGFR 증폭 및 결손에 초점을 맞춘 고급 사례 연구들은 소프트 클리핑된 리드(soft-clipped reads)가 표준 변이 호출 방법으로는 놓칠 수 있는 구조적 변이의 존재를 어떻게 입증할 수 있는지 보여줍니다.

  1. 소프트 클립(soft-clips) 활성화: 상단 메뉴에서 View > Preferences를 클릭하고 Alignments 탭을 선택합니다. Show soft-clipped bases 상자로 스크롤하여 해당 항목이 체크되어 있는지 확인합니다(Supplementary File 1). 이를 통해 참조 서열에 완전히 매핑되지 않고 "클립(clipped)"되어 잘려 나간 가장자리를 가진 부분 정렬 리드(partially-aligned reads)를 확인할 수 있습니다.

5. 임상 사례

  1. 비네트 #1: 진정한 사례 구분하기 KRAS 시퀀싱 아티팩트로 인한 (Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog) 병원성 변이.
    참고: 사례 A는 새롭게 진단된 폐선암종으로 내원한 65세 남성 환자의 경우로, 조직학적 평가 결과 종양 함유량이 약 80%로 추정되었습니다. NGS 프로파일링을 통해 다음과 같은 결과를 확인했습니다. KRAS NM_004985.5 c.34G>T 비소세포폐암(NSCLC)의 알려진 드라이버 돌연변이인 (p.G12C) 변이. 그 결과로 발생하는 미스센스 변이 KRAS c.34G>T (p.G12C) 변이는 폐선암의 약 13%에서 발생하며, 표적 치료제 투여 대상 여부를 결정짓는 요인이 됩니다.9사례 B는 육종으로 알려진 54세 여성의 경우이며, 종양 조직과 정상 조직의 비율이 각각 약 50%로 추정됩니다. 동일한 KRAS c.34G>이 시료에서 T (p.G12C) 변이가 확인되었습니다. 하지만 KRAS c.34G>T (p.G12C)는 육종에서 드물게 보고되므로, 이것이 검출될 경우 시퀀싱 아티팩트(sequencing artifact)일 가능성을 의심해야 합니다. 
    1. IGV 워크플로우 (세션 파일 KRAS.xml)             
      1. 데이터 로드: 게놈 드롭다운 메뉴에서 Hg19를 선택하고 bam 파일인 kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam을 로드한 다음, chr12:25,398,281–25,403,833 영역으로 이동하여 다음 내용을 확인하십시오. KRAS 유전자 영역. 인덱스 파일(bam 파일과 이름은 동일하나 확장자가 .bai로 끝남)이 bam 파일과 동일한 디렉토리에 있어야 함에 유의하십시오.  
      2. 커버리지 및 VAF 조사: Exon 2의 코돈 12 검토 (NM_004985.5)) 그 다음 커버리지 트랙의 변이 위치를 클릭하여 해당 위치의 리드 깊이를 확인합니다. VAF가 35%~40%인 G→T 치환(트랜스버전 이벤트)이 관찰되며, 이는 이형 접합성 클론 드라이버 돌연변이와 매우 일치합니다.그림 2A), 특히 종양 세포 함량이 약 80%인 상황에서.   
      3. 가닥 편향(StrandBias) 확인: 가닥별로 색상 구분(참조 보충 파일 1, 4단계)를 통해 폐 샘플에서 정방향(빨간색)과 역방향(파란색)의 분포가 거의 50:50임을 확인합니다.  
      4. 사례 B인 육종 샘플에 대해 5.1.1.1~5.1.1.3단계를 반복하십시오. bam 파일인 kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam을 로드하고 다음을 기록하십시오. <1%의 VAF 및 거의 독점적인 정방향 가닥 지지로, 이는 PCR/정렬 아티팩트임을 나타냄 (그림 2B).
  2. 비네트 #2: 다중 뉴클레오타이드 변이(multi-nucleotide variant, MNV) 오분류 해결.
    참고: 전이성 흑색종을 앓고 있는 50세 여성 환자를 대상으로 NGS 기반의 종양 프로파일링을 실시합니다. 분석 결과, 잠재적인 BRAF (B-Raf 원암유전자, 세린/트레오닌 키나아제) c.1798_1799delinsAA 변이. 반면 BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E)는 다양한 고형암에서 더 흔하게 나타나며, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K)는 자외선이 C를 유도할 수 있다는 점에서 흑색종에 상대적으로 특이적입니다. > 디피리미딘 내의 T 전이10HGVS 규칙에 따르면, 두 개의 단일 염기 변이(SNVs)가 시스(cis) 하나의 MNV로 명명되어야 합니다. 많은 경우, 생물정보학 파이프라인은 이러한 복합 변이를 두 개의 인접한 SNV로 잘못 식별할 수 있습니다. 시스(cis) 형태로: BRAF c.1798G>A 및 BRAF c.1799T>A. 기술적(즉, 변이 호출기 관련) 및 생물학적 요인이 존재하기 때문에 (시스(cis) 대조 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. (구분) 고려 사항으로, 임상 검토 과정에서 데이터를 시각적으로 확인하지 않을 경우, 결과 보고 시점에 변이가 잘못 보고될 우려가 있습니다.      
    1. IGV 워크플로우 (세션 파일 BRAF.xml)           
      1. 데이터 로드: 게놈 드롭다운 메뉴에서 Hg38을 선택하고 bam 파일(kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam)을 로드한 후, chr7:140,453,136–140,753,336 영역으로 이동하십시오. 인덱스 파일(bam 파일과 이름이 동일하고 확장자가 .bai인 파일)은 반드시 bam 파일과 동일한 디렉토리에 있어야 함에 유의하십시오.
      2. 의 코돈 600을 확대하십시오. BRAF회색이 아닌 녹색과 청색으로 표시된 인접 커버리지 트랙 위치를 바탕으로 GT→AA 이핵산 변화를 확인하십시오. 이는 p.V600K와 일치합니다.. 
      3. 두 개의 개별 SNV를 스캔하여 이들이 다음 상태에 있는지 확인하십시오. 시스(cis) 또는 번역할 텍스트가 제공되지 않았습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.두 SNV가 모두 동일한 리드에 매핑되어 있으며, 다음 위치에 있음에 유의하십시오. 시스(cis).  
      4. 가닥 및 커버리지 조사: 전방/후방 지지도가 대략적으로 균등하게 나타나도록 리드에 색상을 지정하십시오(참조 보충 파일 1, 단계 4), 그리고 클론성 드라이버와 일치하는 50% 초과의 VAF. 커버리지 트랙 임계값 0.01(참조 보충 파일 1, 설정 단계 3)은 부분 서브클론(존재하는 경우)이 계속해서 보일 수 있도록 보장합니다(그림 2C).  
      5. 문맥 및 MNV 명명법 참고: 두 개의 뉴클레오타이드 변화가 서로 인접해 있습니다. 전문가 합의에 따라, 동일한 시퀀싱 리드(sequence read) 상에 매핑되며 거리가 50bp 이내인 SNV들은 단일 MNV로 지정하십시오. "복합체" 또는 "결실삽입" 변이체11. 
  3. 비네트 #3: a 조사하기 키트 위장관 기질 종양(GIST)에서의 (KIT 원암유전자, 수용체 티로신 키나아제) 엑손 9 삽입
    참고: 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor)이 있는 58세 남성 환자가 절제술을 받았으며, NGS 검사가 요청되었다. 결과에 따르면 다음과 같은 변이 가능성이 나타났다. 키트. 키트 변이는 GIST의 빈번한 발생 원인으로 약 75%의 사례에서 나타나며 표적 치료가 가능합니다. 엑손 11 활성 변이에 이어, 키트 엑손 9 활성화 돌연변이가 가장 흔한 드라이버로 확인되었으나, 엑손 9 돌연변이 GIST와 엑손 11 돌연변이 GIST는 티로신 키나아제 억제제 감수성 측면에서 서로 다르게 반응합니다.12. 
    1. IGV 워크플로 (세션 파일 KIT.xml)
      1. 데이터 로드: Hg19 게놈을 선택하고 BAM 파일인 KITdupmod2.bam을 로드하며, 인덱스 파일(.bam 파일과 이름이 동일하고 확장자가 .bai인 파일)이 동일한 디렉토리에 있는지 확인하십시오. 이후 [유전자의] 엑손 9 일부에 해당하는 chr4:55,592,144-55,592,257 영역으로 이동하십시오. 키트 유전자
      2. 뷰 축소: 정렬 트랙을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택하십시오 압착됨 보기를 압축하기 위해 (그림 3A).
      3. 삽입물 위치 확인: 55,592,178번과 55,592,179번 위치 사이에 있으며 커버리지 트랙 바로 위에 화살촉 모양으로 표시된 삽입 마커를 확인하여 짧은 삽입물(그림 3B,C).
      4. 인서트와 상호작용하십시오: 화살표 머리 부분을 클릭하여 뷰를 확장하고, 갭을 채우는 염기를 가진 리드 중 하나를 클릭하여 팝업창에서 세부 정보를 확인하십시오. 삽입된 서열을 참조 서열과 비교하여 이것이 중복(그림 3D,E).
      5. 커버리지 확인: 삽입 화살표 바로 옆의 커버리지 트랙을 클릭하여 지지 리드(supporting reads) 수를 표시합니다. 이를 전체 리드 수와 비교하여 대략적인 변이 대립유전자 빈도(VAF)를 결정할 수 있으며, 이 경우 약 28%입니다.
      6. 가닥 편향(strand bias) 확인: 리드를 리드 가닥별로 정렬하고 소프트 클리핑된 염기(soft-clipped bases)를 확인하십시오(참조 보충 파일 1, 섹션 3)를 통해 리버스 리드(reverse reads) 내 삽입 부위와 인접한 관심 영역을 보여줍니다(그림 3F).
  4. 비네트 #4: ~을 조사하기 표피성장인자 수용체 비소세포폐암(NSCLC)에서의 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor) 엑손 19 결손.
    참고: 새로 진단받은 비소세포폐암(NSCLC) 환자인 70세 여성이 종양 절제술을 받았습니다. 충분한 종양 순도가 포함된 조직 절편에 대해 차세대 염기서열 분석(NGS)을 실시하였으며, 결과에서 다음과 같은 변이 가능성이 나타났습니다. 표피성장인자 수용체 (EGFR)다수 표피성장인자 수용체 변이들은 티로신 키나아제 억제제에 감수성이 있으며, 이러한 변이는 환자의 치료 및 예후에 영향을 미칠 수 있습니다.13.
    1. IGV 워크플로우 (세션 파일 EGFR.xml)
      1. 로딩 Hg19 게놈을 선택하고 bam 파일인 EGFRE746_A750delmod.bam을 로드하십시오. 이때 인덱스 파일(bam 파일과 이름이 동일하며 확장자가 .bai인 파일)이 동일한 디렉토리에 있는지 확인한 후, 엑손 19의 일부에 해당하는 chr7:55,242,420-55,242,513 영역으로 이동하십시오. 표피성장인자수용체 유전자
      2. 커버리지 트랙을 이용한 결실 조사: 커버리지 트랙을 검토하여 리드(read)의 끝부분에 위치하지 않은 커버리지가 낮은 작은 영역을 확인하십시오.그림 4A,B). 커버리지 트랙을 확인한 결과, 엑손 19의 일부분에서 커버리지가 더 낮게 나타났습니다.
      3. 리드를 사용하여 결실 조사하기: 정렬 뷰를 확장하여 리드 내의 검은색 선으로 표시된 정렬 갭이 있는 리드들을 확인합니다.그림 4C,D).
      4. 유전체 컨텍스트 고려: 결손이 발생한 부위 및 그 직후 주변의 참조 서열 뉴클레오타이드 서열을 조사하십시오. 참조 서열 내 위치의 컨텍스트에서 결손 콜(deletion call)을 평가하십시오. 호모폴리머(homopolymer) 또는 반복 지역에서의 결손은 특히 변이 대립유전자 빈도가 낮을 때 시퀀싱 아티팩트(sequencing artifact)일 가능성이 있습니다. 다음을 참조하십시오. 소규모 결실 관찰 ~의 일부 보충 파일 2 워크플로에 대한 상세한 설명은 다음과 같습니다.
  5. 비네트 #5: 조사하기 상피세포 성장인자 수용체 교모세포종 환자의 변이.
    참고: 다음의 증상을 가진 77세 여성 환자 이소시트르산 탈수소효소(IDH) 야생형 교모세포종에 대해 차세대 염기서열 분석(NGS) 검사를 실시하였습니다. 분석 결과, 잠재적인 표피성장인자 수용체 복제수 증가 및 잠재적 EGFRvIII 재배열(엑손 2-7의 결실). 두 가지 모두 표피성장인자 수용체 (EGFR) 증폭 및 해당 EGFRvIII 이러한 변이들은 교모세포종에서 예후 및 치료적 중요성을 가집니다. 또한, 이 두 변이는 빈번하게 동시 발생하므로, 낮은 수준에서 검출되었을 때 어느 한 쪽의 존재가 다른 쪽의 유효성을 뒷받침할 수 있습니다.
    1. IGV 워크플로 (세션 파일 copynumber.xml):
      1. 데이터 로드: Hg38 게놈을 선택하고, 세그먼트 파일인 proband.seg와 비교군 샘플을 로드하십시오. c1.seg-c9.seg 파일을 IGV 창으로 드래그 앤 드롭하여 불러옵니다. Chr7로 이동합니다.
        참고: CNVKit에서 생성된 세그멘테이션 파일은 다운로드 가능하도록 제공됩니다. CNVKit를 사용하여 복제수 정량화를 생성하는 전체 워크플로는 본 연구의 범위를 벗어납니다. 다만, 간단히 설명하자면, 정상 및 이배체 표본으로 구성된 기제작 풀 참조(pooled reference)가 포함된 CNVKit 버전 0.9.9(https://github.com/etal/cnvkit에서 다운로드 가능)가 사용되었습니다. 입력값은 게놈 전반에 분포된 9,144개의 CNV 백본 프로브 위치가 포함된 bed 파일로 구성됩니다. 여기서 중요한 고려 사항은, 복제수 파이프라인 입력값 및 파라미터의 세부 사항보다 모든 샘플이 한 번의 런(run) 내에서 동일한 설정으로 처리되었다는 점이 더 중요하다는 것입니다. 이는 계통적 편향(systemic bias)의 인식을 용이하게 합니다.
      2. 히트맵 평가: 관심 샘플(해당 샘플에 해당하는 히트맵 행을 찾고, 다음으로 표시된)의 상대적 색상 강도를 비교하십시오. 발단자) 및 기타 샘플(c1-9)을 사용하여 실제 복제수 변화와 아티팩트를 구분합니다.
        참고: 모든 샘플에 걸쳐 특정 유전자 좌위를 수직으로 시각적 비교하는 것은, 배경 대비 각 샘플의 해당 유전자 좌위에서 나타나는 이상 징후(행 간의 색상 차이에 기반한 정성적 차이이며, 정량적 차이가 아님)를 식별하는 방법입니다. 다음을 참조하십시오. 그림 5 및 복제수 변이 확인 ~의 단면 보충 파일 2 상세 단계 참조.
  6. 비네트 #6: 조사하기 EGFRvIII 교모세포종 환자에서.
    참고: 동일한 환자에게서 ~의 증거 또한 관찰되었습니다. EGFRvIII 재배열(엑손 2-7의 결실). 두 가지 모두 표피성장인자 수용체 증폭 및 해당 EGFRvIII 이러한 변이는 교모세포종에서 예후적 및 치료적 중요성을 가집니다. 또한, 이 두 변이는 빈번하게 동시 발생하므로, 낮은 수준에서 검출되었을 때 어느 한 변이의 존재가 다른 변이의 타당성을 뒷받침할 수 있습니다.
    1. IGV 워크플로우 (세션 파일 egfr_vIII.xml):
      1. 데이터 로드: Hg19 게놈을 선택하고 환자의 bam 파일인 proband.bam을 로드하십시오. 이때 인덱스 파일(bam 파일과 이름이 같으며 확장자가 .bai인 파일)이 동일한 디렉토리에 있는지 확인한 후, 다음으로 이동하십시오. 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 유전자
      2. ~의 브레이크포인트 시각화 EGFRvIII후보 절단점(exon 2의 상류 및 exon 7의 하류)을 개별적으로 검토하기 위해 뷰를 조정합니다. EGFRvIII), 그리고 '염기별 정렬(sort-by-base)'을 수행합니다.  (또는 단축키 사용) Ctrl-s Windows/Linux 또는 Cmd-s (Mac의 경우) 중단점(breakpoint)에서 소프트 클리핑된 리드(soft-clipped reads)의 파일업(pileup)을 시각화합니다.
      3. BLAT 리드 정렬: 소프트 클리핑된 서열을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택하십시오. BLAT 서열 (IGV는 UCSC의 기본값을 사용하며, BLAT 기본 파라미터는 https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html를 참조하십시오). 첫 번째 행을 클릭하고 다음을 관찰하십시오. Blat 트랙 IGV 트랙 섹션 하단에 나타납니다.
        참고: 엑손 1/인트론 1 접합부와 인트론 6/엑손 7 접합부 모두에 정렬되는 단 하나의 리드만으로도 다음과 같은 증거가 될 수 있습니다. EGFRvIII, 다른 샘플로부터의 교차 오염이 이 리드의 원인이 아니라는 점이 확인된 경우에 한해. 다음을 참조하십시오. 그림 6 그리고 그 구조적 재배열 관찰 ~의 단면 보충 파일 2 상세 단계 안내를 참조하십시오.

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결과

참고로, 본 연구는 임상 보고를 위한 IGV 내 변이 검토의 세부 사항을 설명하는 데 중점을 둡니다. 최종 임상 보고는 각 개별 실험실의 검증된 파이프라인, 품질 기준 및 보고 정책에 따라 이루어져야 합니다. 이 중요한 주제에 대한 완전한 논의는 본 연구의 범위를 벗어나지만, 미국 의료유전학 및 게놈학회(American College of Medical Genetics and Genomics)와 분자병리협회(Association for Molecular Pathology)7에서 권장 표준 및 가이드라인을 마련하였으며, 이는 임상 실험실에서 정기적으로 적용되고 있습니다.

임상 사례 #1 해석:

높은 VAF, 균형 잡힌 가닥 분포, 그리고 폐암에서 KRAS c.34G>T (p.G12C)의 알려진 발생률을 고려할...

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토론

임상 보고를 위한 정확한 변이 검토는 복잡한 생정보학 알고리즘과 IGV를 이용한 복잡한 변이의 시각적 검토 결합에 따라 결정됩니다5,6. 본 연구는 IGV에서 단순 및 복잡한 유전체 변이를 시각화하기 위해 권장되는 설정값들을 간결한 리소스로 정리하기 위해 설계되었습니다 (부록 파일 1). 본 연구는 일반적인 체세포 변이와 이를 IGV에서 검토하는 방법에 초점을 맞춥니다.

본 프로토콜은 단순 치환 돌연변이(그림 2A)와 복합 치환 돌연변이(그림 2C)의 평가로 시작하며, 특히 확인된 소견이 실제인지 아니면 아티팩트인지 판별하는 데 중점을 둡니다. 이어서 단순 삽입(그림 3)과 단순 결실(<...

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공개 사항

모든 저자는 이해관계의 충돌이 없음을 밝힙니다.

감사의 글

IGV 소프트웨어의 모든 개발자들과 현재 IGV 개발 자금을 지원하고 있는 NIH 보조금 U24CA258406에 감사를 표합니다. 본 연구의 수행을 위해 수령한 연구비는 없습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BLATBLAT 게놈 검색https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat단독 BLAT 웹페이지. BLAT API는 IGV 내에서 사용할 수 있으며 별도의 설치가 필요하지 않습니다.
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitCNVKit를 무료로 다운로드할 수 있는 공개 GitHub 저장소입니다. CNVKit 다운로드 및 실행 지침 또한 여기에서 확인할 수 있습니다.
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #7GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일 #8GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg복제수 파일
비네트 #5용 비교 세그먼트 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg복제수 파일
인간 게놈 서열인간 게놈 서열https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzHg38 인간 게놈 빌드가 포함된 다운로드 가능한 fasta 파일입니다.  이는 IGV 내에서 사용할 수 있으며 별도의 다운로드가 필요하지 않습니다.
인간 게놈 서열인간 게놈 서열https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzHg19 인간 게놈 빌드가 포함된 다운로드 가능한 fasta 파일입니다. 이는 IGV 내에서 사용할 수 있으며 별도의 다운로드가 필요하지 않습니다.
IGV 소프트웨어 번들IGV 소프트웨어https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeJava(JDK 21)가 포함된 IGV 소프트웨어 버전 2.19.7이며 무료로 다운로드할 수 있습니다. 제공된 링크는 Windows용이며 Linux 및 Mac용 링크도 이용 가능합니다.
비네트 #5 케이스용 세그먼트 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg복제수 파일
튜토리얼 GitHub 저장소GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main6가지 비네트를 재현하는 데 필요한 모든 파일이 포함된 공개 GitHub 저장소입니다.
비네트 #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml세션 파일
비네트 #1 케이스 A bai 인덱스GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		정렬 파일
비네트 #1 케이스 A bam 정렬 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		정렬 파일
비네트 #1 케이스 B bai 인덱스GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		정렬 파일
비네트 #1 케이스 B bam 정렬 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		정렬 파일
비네트 #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml세션 파일
비네트 #2  bai 인덱스GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		정렬 파일
비네트 #2  bam 정렬 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		정렬 파일
비네트 #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml세션 파일
비네트 #3 bai 인덱스 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai정렬 파일
비네트 #3 bam 정렬 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam정렬 파일
비네트 #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml세션 파일
비네트 #4 정렬 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam정렬 파일
비네트 #4 bai 인덱스GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai정렬 파일
비네트 #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml세션 파일
비네트 #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml세션 파일
비네트 #6 bai 인덱스GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai정렬 파일
비네트 #6 bam 정렬 파일GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam정렬 파일

참고문헌

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