유방 형태 형성을 재현하는 3차원 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법

Summary

이 프로토콜은 통제된 3차원 배양 시스템에서 유선의 형태형성의 주요 특징을 재현하는 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법을 설명합니다.

Abstract

조직 구조와 세포 상태 역학을 재현하는 생리학적으로 중요한 인간 모델 시스템 개발은 유방 발달과 암 발생 초기 사건 연구에서 여전히 주요 과제로 남아 있습니다. 기존의 2차원 배양과 많은 3차원 시스템은 인간 유선을 정의하는 구조적 조직과 미세환경 단서를 포착하지 못합니다. 여기서는 I형 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 히알루론산으로 구성된 정의된 하이드로겔 기질 내에 내장된 1차 상피세포로부터 3차원 인간 유방 오가노이드를 생성하는 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 시스템은 21일 배양 기간 동안 단일 세포가 전구세포 확장, 상피 패턴, 말단 관소 소측 유체 구조 형성, 그리고 간엽 유사 구획의 출현 등 유선 형태형성의 주요 단계를 거치도록 지원합니다. 우리는 하이드로겔 준비, 세포 시딩 및 배양 조건에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 고함량 영상 및 오가노이드 수, 크기 분포, 구조적 복잡성에 대한 정량적 분석과 호환됩니다. 이 플랫폼은 상피 가소성과 환경 교란에 대한 기전적 연구를 가능하게 하여, 유방암 위험과 관련된 초기 조직 수준 변화를 조사할 수 있는 확장 가능하고 생물학적으로 적합한 시스템을 제공합니다.

Introduction

인간 유선의 발달과 악성 변형에 취약한 초기 사건들을 이해하려면 조직 구조, 세포 계층, 미세환경 신호를 충실히 재현하는 실험 시스템이 필요합니다. 2차원 상피 배양은 중요한 메커니즘적 통찰을 제공했지만, 상피 조직과 형태^{발생을 모델}링하는 데 필요한 구조적 맥락이 부족하다. 기저막 추출물을 기반으로 한 기존 3차원 배양 시스템은 이 분야를 발전시켰으나, 변동성 조성, 세포외 기질 구성 요소의 불완전한 제어, 고차 조직 구조의 일관성 없는 지원으로 인해 여전히 제한을 받고 있습니다^. 또한, 기저막 추출물을 기반으로 한 많은 오가노이드 시스템은 조직 유사 조직¹의 출현을 일관되게 지지하지 못하는 제약을 받고 있습니다. 특히 많은 시스템이 지지 미세 환경의 내인성 발달을 가능하게 하기보다는 외생성 기질 구성 요소에 의존하여, 조직 발달과 질병에 핵심적인 상피-중간엽 상호작용을 모델링하는 능력을 제한합니다. 이러한 한계는 발생 과정, 상피 가소성, 환경 또는 분자 교란이 조직 조직에 미치는 영향에 대한 재현 가능한 연구를 제한합니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 정의된 하이드로겔 기반 3차원 인간 유방 오가노이드 모델을 개발하여 1차 상피세포가 정의된 세포외기질 ^2,3,4,5,8 내에서 조직화된 구조를 생성할 수 있게 했습니다. 하이드로겔은 유선선 발달과 상피 형태 형성에서 확립된 역할을 바탕으로 선정된 성분들로 구성되어 있습니다. 이 세포외 기질 분자들은 인테그린, 디스코이딘 도메인 수용체, CD44, RHAMM 등 서로 다른 세포 수용체를 관여하며, 유선의 상피 극성, 분기 형태형성, 줄기세포 유지, 기계전달, 조직 조직을 조절하는 것으로 알려져 있습니다 ^6,7. 이 하이드로겔 시스템을 기술한 이전 연구들은 이러한 세포외기질 구성 요소의 도입이 콜라겐 단독 또는 마트리겔 기반 조건에 비해 관-엽 형태형성과 상피 성숙을 현저히 개선한다는 것을 보여주었다 ^3,8. 또한, 이 하이드로겔 제형의 물리적 특성은 이전에 원자력현미경으로 특성화되었으며, 복합 세포외 기질 하이드로겔이 콜라겐 단독 겔에 비해 강성이 낮고 팽창이 증가하는 것으로 나타났습니다(영의 탄성률: 각각 256.7 ± 20.0 Pa 대 559.2 ± 204.0 Pa). 이는 더 부드럽고 수분 많은 매트릭스 환경과 일치합니다⁸.

중요하게도, 이 모델은 상피 구조와 함께 발생하는 간엽 유사 구획의 출현을 지지하며, 이는 자연^{조직 조직을} 더 잘 반영하는 내인성 구조 및 신호 전달 지원을 제공한다. 이 하이드로겔 시스템의 생리학적 관련성은 형태학적 및 전사체 분석을 통해 기존 마트리겔 기반 오가노이드 배양물과의 직접 비교를 통해 평가되었습니다. 이전 연구들은 하이드로겔 배양이 마트리젤 기반 배양보다 조직화된 관-엽 조직 형성과 다계통 분화를 더 잘 지원하면서도 호르몬 반응성을 보존한다는 것을 보여주었다⁸. 최근에는 하이드로겔 유래 오가노이드, 마트리겔 성장 오가노이드, 그리고 1차 인간 유방 조직을 비교한 통합 단세포 RNA 시퀀싱 분석에서, 하이드로겔 성장 오가노이드가 천연 인간 유방 조직에 존재하는 상피 계층, 세포 다양성, 상피-중간엽 상호작용을 더 충실하게 재현한다는 것을 입증했습니다³. 반면, 마트리겔 성장 오가노이드는 증식성 잡종 기저 상태로 풍부하게 공급되었고, 연질 유사 집단이 없어 지향적 기관 발생보다는 상피 자기 조립과 일치한다.

여기서 설명하는 프로토콜은 섬유아세포 소모 및 단일 세포로의 해리 단계가 포함된 가끔 및 확장 가능한 원차 인간 조직에서 오가노이드를 생성하는 재현 가능하고 확장 가능한 방법을 제공합니다. 이 플랫폼은 라이브 이미징, 고함량 이미징, 정량적 형태측정 분석, 세포 추적, 유전적 교란 연구와 호환되기 때문에, 오가노이드 수, 크기, 구조 및 성장 역학을 평가하는 후속 접근법과 통합될 수 있습니다. 따라서 이 플랫폼은 인간 유방 발달, 상피 가소성, 상피-미세환경 상호작용, 발생, 분자 또는 환경적 교란에 대한 조직 수준 반응을 연구하는 생물학적으로 적합한 시스템을 제공합니다.

조직 처리, 하이드로겔 준비, 오르가노이드 배양, 발생 진행 및 후속 분석 등 워크플로우의 개요는 그림 1에 제공되며, 이 플랫폼을 통해 생성된 대표적인 오르가노이드 형태는 그림 2에 나와 있습니다.

그림 1. 하이드로겔 기반 오가노이드 생성 워크플로우 개요. (A) 조직 채취, 조직 처리, 냉동 보존, 회수 및 선택적 세포 준비, 하이드로겔 준비, 오르가노이드 배양, 오가노이드 개발, 그리고 후속 분석 응용 프로그램을 포함한 프로토콜 워크플로우를 요약한 플로우차트. (B) 하이드로겔 기반 오가노이드 생성 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 시각적 개요로, 조직 처리 및 준비, 회복 및 선택적 세포 준비, 하이드로겔 준비 및 오르가노이드 시딩 포함. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2. 정의된 하이드로겔 시스템에서 생성되는 대표적인 오르가노이드 형태. 정의된 하이드로겔 매트릭스에서 배양된 다양한 인간 조직에서 유래한 오가노이드의 대표적인 밝시야 이미지. 유방성형술 유래 단일 상피세포에서 생성된 유방 오가노이드는 배양 21일째에 영상화되었습니다. 종양 조각에서 생성된 환자 유래 이종이식 오가노이드는 배양 16일째에 이미징되었습니다. 상피 조각에서 생성된 타액샘 오가노이드는 배양 3일째에 촬영되었습니다. 상피 조각에서 생성된 신장 오기노이드는 배양 17일째에 영상으로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

Protocol

수술 후 의료 폐기물로 폐기될 예정이었던 1차 조직들은 메인 메디컬 센터와 터프츠 메디컬 센터의 기관 심사 위원회가 승인한 프로토콜을 사용하여 모든 관련 법률을 준수하여 확보되었습니다. 모든 조직은 이식 전에 익명화되었으며 특정 환자를 추적할 수 없었습니다. 이 때문에 이 연구는 매사추세츠 공과대학교(MIT) 및 터프츠 대학교 보건과학부의 실험 대상으로서의 인간 사용 위원회(IRB #13521)로부터 면제 지위를 부여받았습니다. 이 연구에 등록된 모든 환자는 연구 참여와 결과 출판에 동의하는 사전 동의서에 서명했습니다.

1. 조직 처리 및 준비

참고: 인간 조직을 사용하는 모든 시술은 기관의 생물안전 및 윤리 지침에 따라 수행해야 합니다. 절차 시작 전에 프로토콜 단계와 오가노이드 준비 워크플로우에 대한 시각적 개요를 보려면 그림 1A와 1B에 표시된 워크플로우 도식을 참고하세요.

1. 유선 상피 기저 배지를 52 μg/mL 소 뇌하수체 추출물, 10 ng/mL 인간 표피 성장 인자, 5 μg/mL 인슐린, 500 ng/mL 하이드로코르티손, 1% (v/v) GlutaMAX, 1% (v/v) 항생제-항균제(100X)를 보조하여 MEGM을 준비합니다.
2. 유선 상피 성장 배양액(MEGM)에 1.5 mg/mL 콜라겐제 A(−20°C에 보관)와 100 U/mL 히알루로니다제(4°C에 보관)를 첨가하여 해리 배지를 준비합니다.
3. 예방적 유방절제술과 축소 유방 성형술을 통해 얻은 인산 완충 식염수(PBS)에 고정되지 않은 상태로 4°C에서 유지된 인간 유방 조직을 받으세요. 조직을 정밀 저울로 무게를 재어 전체 조직 무게를 측정하세요.
4. 조직을 멸균된 생물안전 캐비닛에 넣으세요. 멸균 메스를 사용해 조직을 3–^{5mm 3} 조각으로 기계적으로 다집니다. 약 2–3g의 다진 조직을 15mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 각 튜브에 해리 배지 10mL를 추가하세요.
5. 튜브를 37°C에서 8rpm 속도로 궤도 회전기에서 12–18시간 동안 배양하여 조직을 효소적으로 소화합니다. 큰 조직 조각이 남아 있지 않고 매질 전체에 균일하게 조각된 물질이 보일 때 소화가 완료된 것으로 간주하자.
6. 상피 조각이 중력에 의해 5분간 가라앉도록 두세요. 매질에 눈에 띄는 조각이 남아 있지 않은지, 그리고 뚜렷한 펠릿이 존재하는지 확인하세요. 펠릿을 흔들지 않고 상상액을 조심스럽게 디캔트하고 버립니다.
   참고: 상청액에는 기질 세포와 기질 성분이 포함되어 있으며, 세척 후 사용 또는 보존이 가능합니다.
7. 펠릿을 5% 태아 소 혈청(FBS)이 PBS에 포함된 10mL 세척 매체에 재현탁합니다. 실온에서 스윙 버킷 원심분리기에서 250 × g에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
8. 세척 단계를 세 번 더 반복하거나 상상액이 깨끗하고 눈에 띄는 이물질이 없을 때까지 반복하세요.
9. 최종 펠릿을 MEGM에서 10% 디메틸 설폭화물(DMSO)으로 구성된 냉동 배지에 재현탁하며, 초기 조직 무게 1그램당 1mL의 부피로 재현탁합니다.
   주의: DMSO는 접촉이나 흡입 시 해롭습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 기관 지침에 따라 요구되는 경우 화학 안전 후드를 착용해 작업하세요.
10. 각 크라이오비아에 현탁액 1mL를 하나씩 넣어. 크라이오비알을 액체 질소에 장기간 보관하기 전에 −80°C 냉동 용기에 보관하세요.
    참고: 이 단계는 일시정지입니다. 장기 보관 조건으로 옮기기 전에 샘플을 −80°C에서 보관합니다.

2. 회수 및 선택적 세포 준비

1. 해동과 초기 회복
   1. 최소 24시간 이상 냉동한 후 −80°C 냉동 보존 조직을 제거하거나 액체 질소 장기 보관에서 꺼내십시오. 즉시 크라이오비얼을 캡까지 37°C 수욕에 담근 후 1분간 빠르게 해동하여 세포 사멸을 최소화하세요.
      참고: 해동 중에는 균일한 가열을 위해 크라이오비얼을 부드럽게 흔들어 주세요.
   2. 완전히 해동되면 즉시 크라이오비얼의 내용을 10mL MEGM이 들어 있는 15mL 원뿔 튜브로 옮깁니다. 250 g × 원심분리기를 5분간 사용하세요.
2. 선택적 섬유아세포 제거
   참고: 사전 도판에 의한 섬유아세포 소모는 상피 풍부 초기 개체군을 원할 때 빠르게 부착되는 기질 또는 섬유아세포 개체군을 줄이기 위한 선택적 농축 단계입니다. 이 단계는 오가노이드 형성에 필요하지 않으며 실험 목적에 따라 조정할 수 있습니다.
   1. 펠릿을 10mL의 MEGM에 재현탁합니다.
   2. 재현유된 조직을 10cm 세포 배양 접시에 옮깁니다. 섬유아세포 부착을 위해 5% CO₂가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 90분간 배양하세요.
      참고: 효율적인 섬유아세포 부착을 위해 배양 접시를 건드리지 마십시오.
   3. 10mL 혈청학적 피펫을 사용해 배양 접시를 약 45°로 부드럽게 기울인 채취 후 비부착 세포가 포함된 상청액을 채취합니다. 5mL PBS로 플레이트를 부드럽게 헹구고, 세척액과 함께 세척합니다.
   4. 결합 현탁액을 250 × g에서 5분간 원심분리하여 상피 농축 물질을 회수합니다.
      참고: 플레이트에 부착된 세포는 유선성 섬유아세포를 위해 농축되어 있으며, DMEM + 10% FBS와 항생제로 구성된 배지를 추가하여 별도로 증식할 수 있습니다.
3. 선택적 단일 세포로의 해리
   1. 펠릿을 0.25% 트립신으로 구성된 500 μL 예열(37°C) 해리 효소 용액에 재현탁합니다. 대체 해리 시약은 최적화가 필요할 수 있습니다. 현탁액을 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. P1000 피펫을 사용해 샘플을 20번 분쇄하여 해리를 촉진합니다.
      주의: 효소 해리 시약은 해로울 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 피부나 눈 맞춤을 피하세요.
   2. 튜브를 37°C에서 3-5분간 배양하세요. 배양 직후 P1000 피펫을 사용해 20회 분쇄하여 시료를 기계적으로 해리합니다.
   3. 효소 반응을 중화시키기 위해 혈청 함유 세척 배지 1mL를 추가하세요. 500 × g에서 원심분리기를 5분간 사용하세요.
   4. 펠릿을 300 μL 분산 용액(5 U/mL)과 30 μL DNase 용액(1 mg/mL)에 재현탁합니다. 37°C에서 3–5분간 배양하세요.
   5. 피펫팅 15–20회 피펫으로 시료를 기계적으로 해리합니다. 현탁액에 700 μL 세럼 함유 세척 매체를 첨가합니다.
   6. 셀 현탁액을 40 μm 셀 체를 통과시켜 깨끗한 튜브로 필터링합니다. 표준 40 μm 셀 체나 Flowmi 피펫 팁 체가 사용될 수 있습니다. 플로우미 스트레이너는 제한된 셀 수로 작업할 때 샘플 손실을 줄일 수 있습니다.
   7. 트리판 블루 배제를 이용해 생존 가능한 세포 수를 결정합니다. 셀 현탁액 10 μL를 트리판 블루와 1:1 비율로 혼합하고, 혼합물 10 μL을 셀 카운팅 챔버 또는 카운팅 슬라이드에 적재합니다. 자동 세포 계수기나 혈구계를 사용하여 세포 생존성을 측정합니다.
   8. 현탁액을 500 × g에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.
   9. 세포 펠릿을 원하는 농도로 MEGM에 재현탁하여 하이드로겔 시딩을 수행합니다.
      참고: 단일 세포 시딩 실험의 경우, 일반적인 투입량은 실험 목적과 기증자 샘플 특성에 따라 약 200 μL당 1,000–5,000 세포 사이입니다. 낮은 시딩 밀도는 일반적으로 개별 오가노이드 발달 추적을 용이하게 하기 위해 라이브 이미징 및 형태 발생 연구에 사용되며, 높은 밀도는 RNA 및 단백질 수집을 포함한 종말 분자 분석에 일반적으로 사용됩니다.

3. 하이드로겔 준비 및 오가노이드 시딩

1. 재고 준비 및 부피 계산
   1. 사용 전에 라미닌 용액(1.18 mg/mL), 히알루론산 용액(멸균수 1 mg/mL), 피브로넥틴 용액(멸균수 2 mg/mL), PBS 1×을 얼음에 넣으세요. 라미닌과 피브로넥틴 알리코트는 −80°C에 보관하고, 히알루론산 용액은 4°C에서 보관합니다. 사용 전에 0°C에서 4°C의 얼음 위에 천천히 해동합니다.
   2. 25× 세포외기질 보충제 용액을 준비하세요. 1 mL를 준비하려면 얼음 위에 보관된 튜브에 425 μL 라미닌, 250 μL 히알루론산, 250 μL 피브로넥틴, 75 μL PBS를 혼합합니다. 튜브를 3-4번 뒤집어 부드럽게 섞으세요. 용액은 최대 1개월간 4°C에서 보관합니다.
   3. 준비 전에 원하는 최종 하이드로겔 부피와 조성을 결정하세요. 피펫팅 및 이송 중 재료 손실을 고려할 수 있도록 최소 20% 이상의 초과 부피를 준비하세요.
      참고: 하이드로겔 제형은 콜라겐 I, 25× 스톡에서 최종 1× 농도의 세포외기질 보충제, 그리고 pH 중화 및 중합을 위해 콜라겐 I 부피에 비해 12.5%(v/v) 0.1 N 수산화나트륨으로 구성됩니다.
      참고: 최종 하이드로겔 농도는 1.7 mg/mL 콜라겐 I, 20 μg/mL 라미닌, 20 μg/mL 피브로넥틴, 10 μg/mL 히알루론산입니다.
   4. 다음 공식을 사용하여 필요한 콜라겐 I(V_콜라겐)의 부피를 계산합니다:
      
      여기서 C_최종  = 1.7 mg/mL, V_총합 은 원하는 최종 하이드로겔 부피, C_스톡 은 콜라겐 스톡 용액의 농도입니다. 콜라겐 스톡 농도는 2–12 mg/mL 사이입니다.
      참고: 콜라겐 스톡 농도는 배치마다 다를 수 있습니다. 농도가 높을수록 점도가 증가하므로 천천히 피펫 추출해야 합니다.
   5. 다음 공식으로 0.1 N 수산화나트륨(V_NaOH)의 부피를 계산합니다:
      V_NaOH = 0.125 x V_콜라겐
      멸균수에 1N 수산화나트륨을 희석하여 0.1N 수산화나트륨 작업 용액을 준비합니다.
   6. 다음 공식으로 세포외기질 보충제(V_ES)의 부피를 계산합니다:
      
   7. 다음 공식을 사용하여 성장 배지를 채울 남은 부피를 계산합니다:
      V_{성장 배지} = _총 V - (V_콜라겐 + V_NaOH + V_ES + V_{세포/조직})
      참고: 각 실험별로 세포 또는 조직 조각의 부피를 개별적으로 결정하세요. 허용 부피 내에서 일반적으로 10–100 μL 범위를 사용하세요. 조각 크기와 조성이 제조물마다 크게 다르기 때문에 정확한 조각 계수는 수행되지 않습니다. 조각의 풍부도와 분포를 시각적으로 평가하여 파종을 표준화합니다.
2. 하이드로겔 마스터 믹스 제조
   1. 콜라겐 I, 세포외기질 보충제, 수산화나트륨(0.1N), 성장 배지를 0°C–4°C의 얼음 위에 올려놓습니다. 모든 성분을 낮은 온도에서 유지하여 조기 중합을 방지하세요.
   2. 계산된 콜라겐 I의 부피를 냉각된 마이크로 원심분리기에 넣으세요.
   3. 계산된 미리 냉각된 성장 배지 부피를 콜라겐 용액에 추가하세요.
   4. 계산된 부피인 0.1 N 수산화나트륨을 첨가하여 용액을 중화시킵니다.
      참고: 이전 최적화 결과, 이러한 조건들이 적절한 겔 pH를 생성한다는 것이 확인되었습니다; 따라서 하이드로겔 혼합물에 대한 정기적인 pH 검사는 필요하지 않습니다.
      참고: 콜라겐 중합이 조기 발생하는 것을 방지하기 위해 이후 모든 단계를 신속히 수행하십시오.
   5. 튜브를 초당 약 한 번 정도 세게 흔들어 최소 6번 흔들어 혼합하세요.
   6. 계산된 세포외기질 보충제의 부피를 혼합물에 추가하세요.
   7. P1000 피펫 또는 넓은 피펫 팁을 사용해 계산된 단일 세포 또는 조직 조각의 부피를 추가합니다. 3.2.5 단계에 설명된 대로 즉시 흔들어 혼합하고 바로 다음 단계로 넘어가세요.
3. 하이드로겔 증착
   1. 수소겔 혼합물을 웰당 원하는 부피로 배양 용기에 피펫 흡입합니다. 4웰 챔버 슬라이드에는 웰당 200 μL 하이드로겔, 8웰 챔버 슬라이드에는 웰당 100 μL, 96웰 플레이트에는 웰당 20 μL 하이드로겔을 사용합니다.
   2. 챔버 슬라이드를 사용할 때는 하이드로겔을 얇은 패드로 표면에 펴 바르세요. 피펫 팁을 챔버 웰의 중앙 상단 가장자리에 위치시키고, 젤을 분사하면서 팁을 표면 위로 끌면서 고르게 패드를 만듭니다. 96웰 플레이트의 경우, 피펫 팁을 웰 중앙에 위치시키면서 표면과 접촉을 유지하고, 젤을 중앙에 분사하여 돔 구조를 유지합니다. 젤에 공기를 피펫팅해서 기포가 생길 수 있으니 피하세요.
   3. 배양 용기를 37°C에서 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 60분간 배양하여 완전한 중합을 가능하게 합니다.
      참고: 여기서 설명한 중합 조건은 본 연구에서 사용된 배양 형식에 최적화되었습니다. 배양 용기의 형상, 하이드로겔 부피, 배양 조건에 따라 중합 시간의 소폭 조정이 필요할 수 있습니다.
4. 문화 및 유지
   1. 각 웰에 미리 예열된 MEGM을 추가하세요. 배양 포맷에 따라 볼륨을 조절하세요.
   2. 피펫 팁을 사용해 하이드로겔을 배양 표면에서 부드럽게 분리하여 젤이 떠오르게 합니다. 피펫 팁을 젤 주변을 따라 미끄러뜨린 뒤, 중합된 하이드로겔 아래로 부드럽게 들어 올려 표면에서 분리합니다.
   3. MEGM은 주 2회 신선한 예열된 배지로 교체하세요. 5% CO₂가 포함된 가습 인큐베이터에서 약 3–4주간 유지하고, 하이드로겔이 완전히 붕괴되기 전에 배양을 종료합니다. 젤 내 광범위한 세포 돌출로 인해 발생한 조밀하고 불투명하며 플러그 같은 구조가 나타나는 것으로 붕괴된 수소겔을 식별할 수 있습니다( 보조 그림 1의 대표적인 예시 참조).

Results

이 프로토콜의 성공 시 조직화된 상피 형태와 조직 특이적 구조를 나타내는 3차원 오가노이드 구조가 형성됩니다. 오르가노이드는 씨앗 후 3일에서 7일 이내에 형성되기 시작하며, 배양 기간 내내 계속 발달합니다. 이 하이드로겔 오가노이드 시스템의 이전 특성 분석에서는 여러 독립적인 1차 인간 공여자에 걸쳐 반복 가능한 오가노이드 형성이 입증되었습니다^. 해당 연구에서는 질병이 없는 유방성형술 기증자 12명에서 분리된 1차 상피세포를 평가했으며, 12개 기증자 샘플 중 11개가 해당 배양 조건에서 성공적으로 오가노이드를 생성하였습니다. 기증자 전체에서 씨앗 세포 100개당 형성되는 오가노이드 구조의 중앙값은 1.775개(95% 신뢰구간: 0.45–4.10)였습니다. 오가노이드 형성 효율과 성장 역학에서 공여자 간 상당한 변동성이 관찰되었으나, 복잡한 관-엽 및 추막 형태는 공여자 간에 재현 가능하게 생성되었다.

단일 상피 세포에서 유래한 유방 오가노이드는 점진적인 형태 발생을 보이며, 배양 21일째에 가지형 구조를 형성합니다(그림 2). 이 구조들은 길쭉한 돌출과 다세포 조직이 특징입니다. 오르가노이드는 18일차까지 10,000에서 90,000 μm² 사이의 예상 면적을 보였으며, 원형도 값은 0.3 미만으로 4π ×(면적/둘레²)^3,9로 계산되었다. 조직 조각에서 유래한 오가노이드는 보통 18일째까지 90,000^{μm 2}를 초과하는 구조를 형성하는 반면, 종양 조각에서 유래한 오가노이드는 더 조밀하고 불규칙한 구조를 형성하며 조직이 감소하고 방사형 돌출이 증가하여 성장 행동 변화와 일치한다.

침샘과 신장 상피 조각에서 유래한 오르가노이드도 동일한 수소겔 조건 하에서 뚜렷한 형태를 보인다(그림 2). 타액샘 오가노이드는 초기 시점(3일째)에 조밀한 구조를 형성하는 반면, 신장 오가노이드는 17일째에 길고 비대칭적인 형태를 발달시킵니다. 이 관찰들은 유선 조직을 넘어 하이드로겔 기반 오가노이드 시스템의 광범위한 적응성을 보여주고, 여러 상피 조직원에서 오르가노이드 형성을 지원하는 능력을 보여주기 위해 포함되었습니다.

이전에 수행된 면역염색 및 분자 분석(^3,5,8)에서는 KRT8, KRT18, KRT19, E-cadherin, GATA3, JAG1, Notch1, MUC1 등 하루내 표지자 KRT5, KRT14, Slug, SOX9, TP63 등 상피 계통 표지자의 존재가 확인되었으며, 이는 오가노이드 내에서 상피 이질성이 보존됨을 나타냅니다. 말단 관엽 유닛과 유사한 조직과 일치하는 구조적 특징은 공초점 현미경과 3차원 재구성으로 관찰되었으며, 이는 인간의 말단 관소 단위 조직과 유사한 길게 뻗은 관상 영역과 연결된 구조로 정의되었다. 이 구조들은 또한 층층 상피 조직과 함께 하루내막 및 기저 세포 패턴을 보였으며, 이는 이전에 발표된 플랫폼³의 분석과 일치하였습니다.

간엽 유사 구획이 상피 구조와 연관되어 관찰되었으며, 이동 행동과 VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90, FAPα 등의 표지자의 발현이 특징지어졌습니다. 타임랩스 현미경 분석과 함께 이러한 관찰은 배^{양 시스템 내에} 지지적인 미세 환경이 형성되는 것을 뒷받침합니다.

중요한 점은, 이 프로토콜이 단일 고정된 생물학적 기준을 설정하기보다는 폭넓게 적응 가능한 방법론적 틀을 제공하는 것을 목표로 했다는 것입니다. 오가노이드 형성 효율, 크기, 가지의 복잡성, 세포 구성 등 정량적 결과는 기증 출처, 폐경기 상태, 시작 물질(예: 조직 조각과 단일 세포), 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

최적이 아닌 결과로는 오가노이드 형성 효율 저하(시드 세포 500개당 <1개의 오가노이드), 과도한 세포 잔해, 콜라겐 중합 실패 또는 조직 구조 형성 실패 등이 있습니다. 이러한 결과는 일반적으로 낮은 세포 생존율, 불완전한 조직 해리, 잘못된 수소 구성 또는 불적절한 pH 중화와 관련이 있습니다.

오르가노이드 발달에 대한 정량적 분석은 라이브 이미징 및 고함량 이미징 방식을 사용하여 오르가노이드 수, 크기 분포, 분기 행동, 구조 복잡성 및 세포 역학을 측정할 수 있습니다. 이 플랫폼을 이용한 이전 연구들은 종단 생체 영상, 세포 추적, 형태계측 분석, 유전적 교란 연구를 수행^{하여 오르}가노이드 성장 역학과 계통 행동을 시간에 따른 정량화했습니다^. 영상은 공초점 현미경을 사용해 수행되었고, 영상 분석은 NIS-Elements 소프트웨어를 사용했습니다.

보조 그림 1. 장기 오가노이드 배양 중 18일째에 붕괴된 하이드로겔의 대표적인 예시입니다. 붕괴 된 하이드로겔은 광범위한 세포 성장과 기질 수축으로 인해 조밀하고 불투명하며 플러그 같은 구조로 나타납니다. 이러한 형태학적 특징들은 완전한 하이드로겔 붕괴 전에 배양을 종료하는 기준으로 사용되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

Discussion

여기서 설명된 프로토콜은 유방 형태형성³의 주요 특징을 지원하는 정의된 하이드로겔 미세환경 내에서 3차원 인간 유방 오가노이드의 재현 가능성을 가능하게 합니다. 이 방법의 성공을 위해서는 여러 단계가 매우 중요합니다. 첫째, 조직 처리와 효소 해리를 신중히 조절하여 상피의 생존력을 유지하면서 과소화가 세포 수율을 감소시키고 이후 형태 발생을 저해할 수 있는 과소화를 최소화해야 합니다^. 특히, 기능적인 상피 집단을 유지하는 데 필수적이며, 단기간이고 순차적인 효소 치료와 부드러운 기계적 해리가 결합되어 필수적입니다. 둘째, 하이드로겔 제제는 콜라겐 농도, pH, 그리고^타이밍을 정밀하게 조절해야 합니다. 콜라겐의 중화는 중합을 시작하며; 따라서 수산화나트륨 첨가 이후의 모든 단계는 겔 형성이 일관되도록 신속하고 얼음 위에서 수행되어야 합니다. 불완전하거나 지연된 중합은 구조가 불완전하거나 붕괴된 하이드로겔을 초래하여 오가노이드 발달을 지원하지 못할 수 있습니다. 마지막으로, 각 기증자 샘플에 대해 시딩 밀도를 경험적으로 최적화해야 하며, 과도한 조직 또는 세포 부하가 빠르게 수축하고 구조적 완전성 손실을 초래할 수 있습니다¹².

여러 가지 문제 해결 요소가 재현성을 높일 수 있습니다. 오가노이드 형성 미량은 세포 생존율 저하, 수소겔 조성이 최적이 아니거나^{증착 중} 젤 취급 부적절한 경우 발생할 수 있습니다. 콜라겐 재고가 4°C로 유지되고 조기 중합이 발생하지 않도록 하는 것이 일관된 겔 품질을 위해 필수적입니다¹¹. 또한, 중합 후 배양 표면에서 하이드로겔이 성공적으로 분리되는 것은 적절한 겔 형성의 지표가 됩니다; 분리되지 않는 것은 일반적으로 불완전한 중합 상태나 부적절한 표면 조건을 반영합니다¹⁴. 기증자 샘플 간에 오가노이드 크기와 형태의 변동성이 예상되며, 이는 기술적 결함보다는 생물학적 이질성을 반영합니다. 이 플랫폼을 이용한 이전 연구들은 오가노이드 형성 효율성과 형태발생에서 상당한 공여자 간 변이에도 불구하고 독립적인 주요 인간 공여자 내에서 재현 가능한 오르가노이드 형성을 입증했습니다³.

이 방법은 몇 가지 한계가 있습니다. 이 모델은 상피 구조와 함께 간엽 유사 구획의 출현을 지지하지만, 생체 내 기질, 면역, 혈관 미세환경의 복잡성을 완전히 재현하지는 못합니다. 하이드로겔의 조성은 정의되어 있지만, 단순화된 세포외 기질을 나타내며, 천연 조직에 존재하는 모든 생체역학적 또는 생화학적 단서를 포착하지 못할 수 있습니다^15,16. 또한, 공여자 간 변동성은 오가노이드 성장 역학과 형태에 영향을 줄 수 있어 특정 응용에 대한 경험적 최적화가 필요합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 시스템이 자기조직화와 내생성 상피-중간엽 상호작용을 지원하는 능력은 기존 많은^{문화 모델에} 비해 상당한 진전을 의미합니다.

일반적으로 사용되는 기저막 추출물 기반 시스템과 비교할 때, 이 방법은 세포외 기질 조성을 더 잘 조절하고 불정의 물질과 관련된 변동성을 줄여줍니다¹⁷. 이 하이드로겔 플랫폼과 마트리겔 기반 오가노이드 시스템을 직접 비교한 이전 연구들은 조직 조직과 세포 구성에서 상당한 차이를 보여주었다 ^3,8. 하이드로겔 성장 오가노이드는 형태학적 및 전사체 수준 모두에서 토착 인간 유방 조직과 더 유사했으며, 하내막, 기저, 전구, 간엽 유사 구획을 포함한 다계통 상피 집단을 보존한 반면, 모트리겔 성장 오가노이드는 증식성 잡종 기저 유사 상태가 우세하며 기질 집단이 부족했다. 또한, 외부 기질 세포 추가에 의존하는 공동 배양 시스템과 달리, 이 모델은 지지하는 간엽 유사 구획의 내재적 출현을 가능하게 하여, 상피-미세 환경 상호작용을 생리학적으로 더 중요하고 덜 인위적으로 설계된 맥락에서 연구할 수 있게 합니다. 하이드로겔 내에서 새롭게 나타나는 간엽 유사 집단은 이전에 보완적 생체 영상, 면역염색, 단세포 전사체 분석을 통해 검증되었습니다^. 이 연구들은 Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1, Snail 등 간엽 및 상피-중간엽 전이 관련 표지자를 발현하는 매우 운동성이 높은 연질 유사 세포의 출현과 함께 리간드-수용체 분석을 통해 상호 상피-중간엽 신호 상호작용이 확인됨을 보여주었습니다. 이러한 특징들은 조직 구조와 세포 간 통신에 의존하는 과정, 예를 들어 형태 발생, 상피 가소성, 초기 조직 재형성 등 연구에 특히 적합합니다 ^4,5.

설명된 플랫폼은 기초 및 중개 연구 분야에서 폭넓은 응용을 가집니다. 이 기술은 인간의 유방 발달을 연구하고, 질병 초기 사건을 모델링하며, 분자 또는 환경적 교란이 조직 조직에 미치는 영향을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 플랫폼을 이용한 이전 연구들은 DDR1과 RUNX1과 같은 발달 조절 인자의 기능적 교란이 3차원 배양에서 계통 분화, 상피 조직, 그리고 관-소엽 형태형성을 변화시키는 것을 보여주었다 ^5,18. 정량적 영상 및 고함량 분석과의 호환성은 오가노이드 크기, 구조, 복잡성 변화를 포함한 표현형 결과에 대한 체계적인 검증을 더욱 가능하게 합니다. 따라서 이 방법은 질병 관련 맥락에서 인간 조직 조직과 그 교란을 연구할 수 있는 확장 가능하고 생물학적으로 적합한 플랫폼을 제공합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL 원뿔관	VWR	89039-664	조직 처리 및 원심분리를 위한 멸균관
40 & mu; M 세포 체감기	VWR	732-2757	단일 셀 현탁 준비를 위한 여과 장치
40 & mu; 저용량용 M 세포 체균기	벨-아르트	136800040	단일 셀 현탁 준비를 위한 여과 장치
자동 셀 카운터	바이오-래드	1450102	세포 수와 생존 여부를 판단하는 데 사용되는 장치
소 뇌하수체 추출물	써모 사이언티픽	13028014	상피세포 배지 보충제
세포 카운팅 슬라이드	바이오-래드	145-0011	세포 계수에 사용되는 이중 챔버 슬라이드
원심분리기	해당 없음	해당 없음	벤치탑 원심분리기는 최소 500 x g 속도 능력과 15 mL 및 1.5 mL 튜브 수용 능력을 가져야 합니다.
콜라겐 I	밀리포어 시그마	08-115	하이드로겔 형성에 사용되는 세포외 기질 단백질
콜라게나제 A	시그마-올드리치	11088793001	조직 해리에 사용되는 효소
크라이오바이알	코닝	976171	극저온 보관용 멸균 바이알
배양 용기(예: 챔버 슬라이드, 멀티웰 플레이트)	코닝	354104 354108 3603	하이드로겔 증착 및 오가노이드 배양을 위한 플랫폼.
디메틸 설폭사이드	밀리포어 시그마	317275	냉동 매체에 사용되는 냉동 보호제
디스파즈 II	로슈	4942078001	2차 조직 해리에 사용되는 효소
DNase I	로슈	10104159001	세포 해리 과정에서 사용된 효소.
태아 소 혈청	깁코	10437	세척 및 중화 매체에 사용되는 혈청 보충제
피브로넥틴	시그마-올드리치	F2006	세포외 기질 단백질 구성 요소
글루타맥스	써모 사이언티픽	35050061	상피세포 배지 보충제
인간 표피 성장 인자	시그마-올드리치	E9644	상피세포 배지 보충제
하이드로코르티손	시그마-올드리치	H0888	상피세포 배지 보충제
히알루론산	밀리포어 시그마	385908	하이드로겔 제형을 위한 세포외기질 구성
히알루로니다제	시그마-올드리치	H3506	조직 해리에 사용되는 효소
인큐베이터	써모 사이언티픽	3598	조직 배양용 장치
인슐린	시그마-올드리치	I9278	상피세포 배지 보충제
라미닌	깁코	23017-015	세포외 기질 단백질 구성 요소
유선 상피 기저 배지	써모 사이언티픽	M171500	상피세포 성장 배양지
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)	써모 사이언티픽	3451	소용량 반응에 사용되는 튜브
궤도 회전기	써모 사이언티픽	400110	효소 해리 중 조직 분산에 사용되는 회전자
P1000 피펫	길슨	P1000	최대 1,000 & mu의 볼륨을 혼합하고 전송하는 데 사용된 장치; L
페니실린-스트렙토마이신	써모 사이언티픽	15140122	상피세포 배지를 위한 항생제 보충제
인산 완충 식염수	깁코	20012-027	세척 및 헹구기에 사용되는 완충 용액
정밀 저울	메틀러 톨레도	ML303E	조직 무게 측정에 사용되는 저울
혈청학적 피펫	누크	170356N	비부착 상피 세포 채취에 사용되는 피펫
수산화나트륨 (1N)	피셔 케미컬	SS261	콜라겐 중화에 사용되는 시약
멸균 메스	바드-파커	372615	기계적 조직 다짐에 사용되는 도구
트리판 블루 용액	깁코	15250061	세포 생존 가능성 평가에 사용되는 염료
트립신 (0.25%)	깁코	25200056	세포 해리에 사용되는 효소 시약
수욕 (37 & deg; C)	VWR	10LA	샘플의 제어된 해동을 위한 장치 사용