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방법 논문

면역화된 레서스 원숭이의 혈액 및 골수 내 항원 특이적 및 총 항체 분비 세포 정량을 위한 ELISpot 분석법

59 조회수

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DOI:

10.3791/71836

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2026년 8월 21일

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1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

이 논문에서

요약

B세포 ELISpot은 혈액(면역화 후 단명하는 형질모세포를 반영)과 더 지속적인 골수 ASC 내에서 항원 특이적 IgG, IgM, IgA 장수 형질세포뿐만 아니라 총 항체 분비 세포(ASC)의 규모와 지속성을 정량화하기 위해 검증된 방법입니다.

초록

새로운 백신 항원과 면역증강제의 평가는 전통적으로 항체 역가 측정에 의존해 왔으며, 이는 면역 접종 후 개발될 때까지 시간이 걸립니다. 1차 및 추가 면역 접종 후 항체 분비 세포(ASC)를 정량화하면 백신으로 유도된 체액성 면역에 대해 더 빠르고 기전적으로 유용한 측정값을 얻을 수 있으며, 이는 백신 제형 및 면역 접종 전략의 최적화를 촉진할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 HIV 백신 연구의 중요한 전임상 모델인 레서스 원숭이의 말초혈액 단핵구(PBMC) 및 골수(BM) 세포에서 ASC를 수치화하는 방법을 설명합니다. 이 효소 결합 면역스팟(ELISpot) 분석법은 절대적 및 상대적 빈도를 측정함으로써 항원 특이적 및 전체 IgG, IgM, IgA ASC를 모두 정량화할 수 있게 합니다. 말초혈액의 경우, 이 분석법은 면역 접종 후의 정점 플라스마블라스트 반응을 포착하며, 골수에서는 서로 다른 이소형의 항원 특이적 형질 세포의 축적을 검출하여 장기 생존 ASC의 지속성을 평가합니다. 이 프로토콜은 전임상 백신 연구에서 면역원과 면역증강제 조합을 평가하기 위한 강력하고 재현 가능한 접근 방식을 제공하며, 유망한 백신 후보 물질의 임상 개발 전환을 뒷받침하는 가치 있는 데이터를 제공합니다.

서론

항체 분비 세포(ASC)는 적응 면역의 핵심 구성 요소이며, 면역 후 빠르게 생성되는 단명 형질모세포와 지속적인 항체 생성을 담당하는 장명 형질세포를 모두 포함합니다. 형질모세포는 말초 혈액과 이차 림프 기관에서 일시적으로 검출되며, 백신 제형과 숙주 종에 따라 면역 후 특정 시점에 최고 빈도에 도달합니다(일반적으로 레서스 원숭이는 4-5일, 인간은 약 7일). 이와 대조적으로, 성숙한 형질세포는 수명이 길며 주로 이차 림프 조직과 골수(BM) 내에 거주합니다. 효과적인 백신은 강력한 체액성 및 세포 매개 면역 반응을 모두 유도해야 합니다. 추가 접종 후 말초혈액 단핵구(PBMC) 내 형질모세포의 급격한 확장을 통해 반영되는 기억 반응의 측정은 백신으로 유도된 면역 반응의 규모에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 레서스 원숭이에서 Env 특이적 면역 후 초기 형질모세포 및 장명 형질세포 반응을 정량화하기 위한 견고한 방법을 제공하는 것입니다.

효소 결합 면역스팟(ELISpot) 분석법에서는 항원(Ag)이 코팅된 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 혼합 셀룰로오스 에스테르(MCE) 멤브레인 바닥 96-웰 플레이트에서 ASC를 배양하여, 생존 세포가 단백질을 분비하면 이를 멤브레인 표면에 직접 포획합니다. 포획된 단백질은 이후 일반적인 샌드위치 면역 분석 형식의 항체를 사용하여 검출합니다. 발색 ELISpot 분석에서는 서브스트레이트인 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC)이 horseradish peroxidase(HRP)에 의해 불용성 유색 침전물로 전환되면서 스팟이 생성되며, 이를 통해 개별 ASC를 시각화하고 수치화할 수 있습니다. ELISpot은 ex vivo에서 항원 특이적 반응을 검출할 수 있는 능력, 개별 면역 세포에 대한 고감도 기능 평가, 그리고 전임상 및 임상 연구 모두에서 T 세포 및 B 세포 면역 반응의 정량적 모니터링이 가능하다는 여러 중요한 장점을 제공합니다1,2,3.

본 프로토콜에서는 레서스 마카크의 PBMC와 BM 세포 내 총 및 항원 특이적 IgG, IgM, IgA ASC를 정량화하기 위한 B세포 ELISpot 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 총 및 Env 특이적 플라스마블라스트와 형질 세포 반응의 역학을 특성화하기 위해 플레이트 코팅, 블로킹, 세포 파종, 분석 개발, 스폿 수 측정 및 데이터 분석을 포함한 모든 핵심 단계를 상세히 다룹니다. 이 방법은 전임상 백신 연구에서 서로 다른 항원 및 면역증강제 제형의 면역원성을 평가하고 비교하기 위한 재현 가능한 접근 방식을 제공하며, 향후 임상 적용을 위한 백신 전략의 최적화를 지원합니다.

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프로토콜

본 프로토콜에 사용된 붉은털원숭이는 New Iberia Research Center의 특정 병원균 부재(SPF) 군집에서 제공되었으며, University of Texas MD Anderson Cancer Center의 Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research에서 사육되었습니다. 동물 관리 및 모든 실험 절차는 실험동물 관리 및 사용 가이드라인(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)을 준수하였으며, University of Texas MD Anderson Cancer Center 기관동물관리및사용위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(프로토콜 #2616RN00).

본 프로토콜은 ASC 반응을 검출하기 위해 개발되었으며, 이전의 면역화 전임상 연구4,5,6,7에서 설명된 기술을 최적화한 것입니다. 아래 프로토콜은 HIV 실험 백신 프로토콜에 참여한 레서스 마카크(rhesus macaques)로부터 분리한 신선한 PBMCs  및 BM  세포 준비물을 이용한 ELISpot 절차를 설명합니다.

참고: 섹션 1~4의 모든 절차는 무균 조작법을 사용하여 인증된 Class II 생물안전작업대 내에서 수행하십시오. 가능한 경우 멀티채널 피펫을 사용하십시오.

1. ELISpot 플레이트 준비

  1. ELISpot 플레이트 코팅
    1. 총 면역글로불린 (Ig) 플레이트 1번과 3번의 웰당 100 µL에 멸균 DPBS로 희석한 5 µg/mL 비결합 goat anti-monkey IgG + IgM + IgA를 넣어 코팅한다. 플레이트를 4 °C에서 최소 8시간, 가급적이면 하룻밤 동안 배양한다 (Figure 1A,C).
    2. 항원 특이적 플레이트 2번과 4번의 웰당 100 µL에 DPBS로 희석한 20 µg/mL Galanthus nivalis lectin (GNL)을 넣어 코팅한다. 플레이트를 4 °C에서 최소 8시간, 가급적이면 하룻밤 동안 배양한다 (Figure 1B,D).
    3. 코팅된 플레이트는 사용 전까지 4 °C에서 보관한다.
  2. 총 면역글로불린 플레이트 세척 및 블로킹
    1. 각 플레이트를 폐기물 용기 위로 빠르게 뒤집어 플레이트 1번과 3번에서 코팅 용액을 제거한다. 뒤집힌 플레이트를 흡수성 종이 위에 세게 쳐서 잔류 액체를 제거한다.
    2. 0.05% Tween 20이 포함된 200 µL/well PBS로 각 플레이트를 2회 세척한다. 그다음, 잔류 세제를 제거하기 위해 200 µL/well DPBS로 플레이트를 2회 세척한다.
      참고: Tween 20은 세포 독성이 있다. 세포 파종 전에 완전히 제거해야 한다.
    3. 각 웰에 200 µL/well RPMI-10을 첨가한다. 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 2시간 동안 배양한다.
  3. 항원 특이적 플레이트 세척 및 블로킹
    1. 각 플레이트를 폐기물 용기 위로 빠르게 뒤집어 플레이트 2번과 4번에서 GNL 코팅 용액을 제거한다. 뒤집힌 플레이트를 흡수성 종이 위에 세게 쳐서 잔류 액체를 제거한다.
    2. 200 µL/well DPBS로 각 플레이트를 4회 세척한다.
      참고: GNL 코팅 플레이트에는 Tween 20이 포함된 PBS를 사용하지 않는다.
    3. 각 웰에 200 µL/well RPMI-10을 첨가한다. 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 2시간 동안 배양한다.
    4. 블로킹 용액을 버린다. 200 µL/well DPBS로 각 플레이트를 4회 세척한다.
    5. 최종 농도가 5 µg/mL가 되도록 100 µL/well CH505 SOSIP 항원을 첨가한다. 37 °C에서 2시간 동안 배양한다.
    6. 항원 용액을 버리고 멸균 DPBS로 각 플레이트를 4회 세척한다.
      참고: 세포 파종 전 MCE 막이 마르는 것을 방지하기 위해 마지막 세척 후 웰에 DPBS를 남겨둔다.

2. 시료 준비: PBMC 및 골수 단핵세포의 분리

  1. 전혈에서 말초혈액단핵세포(PBMCs) 분리하기
    1. 10 mL EDTA 혈액 튜브를 450 x g에서 원심 분리합니다. g 브레이크를 설정하지 않은 상태로 실온에서 20분 동안 원심분리합니다.
    2. 혈장을 제거하고 Ca가 없는 DPBS 4 mL를 첨가하십시오.2+ 및 Mg2+10 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합한다.
    3. 15 mL 원심분리관에 4 mL의 Ficoll을 넣고, 그 위에 희석된 혈액을 조심스럽게 층이 지도록 쌓습니다. 800 x g에서 원심분리합니다. g 느린 가속 및 감속 설정을 사용하여 상온에서 30분 동안 처리합니다.
    4. 말초혈액단핵세포가 포함된 버피코트(buffy coat)를 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다. DPBS 8~10 mL를 넣고 450 x g에서 원심분리합니다. g 실온에서 10분 동안.
    5. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁하십시오.
    6. 세포 현탁액에 2 mL의 염화암모늄-염화칼륨(ACK) 용해 버퍼를 첨가한다. 실온에서 5분 동안 배양한다.
      주의: ACK 용해 버퍼에 장시간 노출되면 세포 생존율이 감소하므로 5분의 배양 시간을 초과하지 마십시오.
    7. 2% 태아 송아지 혈청(FBS)이 포함된 DPBS 10 mL를 첨가하여 적혈구 용혈을 중단시킨다. 세포를 300 x로 원심분리한다. g 실온에서 10분 동안 방치합니다.
    8. 상층액을 제거하고 세포를 RPMI-10에 재부유하십시오.
    9. 적절한 세포 계수법을 사용하여 PBMC 수를 측정하고, 생존율이 다음 기준을 충족하는지 확인하십시오. >90% (예: trypan blue 염색을 통해 확인).
    10. 한 개의 분주액을 5로 조정하십시오. × 106 항원 특이적 ELISpot 분석을 위한 mL당 세포 수. 두 번째 분주액을 1로 조정하십시오. × 106 총 면역글로불린 ELISpot 분석을 위한 mL당 세포 수.
  2. 골수 단핵세포 분리
    1. 70$\mu$m 필터를 배치합니다. µ세포 여과기(cell strainer)를 50 mL 원심 분리 튜브에 장착합니다. 1 mL의 DPBS로 여과기를 미리 적십니다.
    2. 1 mL의 골수 흡인물에 4 mL의 DPBS를 첨가하십시오. 세롤로지컬 피펫을 사용하여 충분히 혼합하십시오.
    3. 골수 현탁액을 70 $\mu$m 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시킵니다. µm 셀 스트레이너. 스트레이너를 폐기하기 전 2 mL의 DPBS로 헹굽니다.
    4. 필터링된 현탁액을 15 mL 원심분리 튜브에 담긴 4 mL Ficoll 위에 층이 생기도록 층층이 쌓습니다. 800 x에서 원심분리합니다. g 느린 가속 및 감속 설정을 사용하여 상온에서 30분 동안 원심분리합니다.
    5. 단핵세포층을 새로운 15 mL 튜브로 옮깁니다. 8~10 mL의 DPBS를 첨가하고 450 x g에서 원심분리합니다. g 실온에서 10분 동안.
    6. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁하십시오.
    7. 세포 현탁액에 2 mL의 ACK 용해 버퍼를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      주의: 세포 생존력을 유지하기 위해 권장 용해 시간을 초과하지 마십시오.
    8. 2% FBS가 포함된 DPBS 10 mL를 첨가하여 적혈구 용혈을 중단시킨다. 세포를 300 x g에서 원심분리한다. g 상온에서 10분 동안 방치합니다.
    9. 상층액을 제거하고 세포를 RPMI-10에 재현탁한다.
    10. 적절한 세포 계수 방법을 사용하여 골수 단핵구를 계수하고, 생존율이 다음 조건에 부합하는지 확인하십시오. >90%, 예를 들어 trypan blue 염색을 통해.
    11. 분주액 1개의 양을 5로 조정하십시오. × 106 항원 특이적 ELISpot 분석을 위해 mL당 cells로 조정하십시오. 두 번째 분주액은 1로 조정하십시오. × 106 총 면역글로불린 ELISpot 분석을 위한 mL당 세포 수.

3. 세포 파종 및 배양

  1. 총 면역글로불린 플레이트 분주
    1. 플레이트 1과 3을 폐기물 용기 위로 빠르게 뒤집어 블로킹 배지를 제거한다. 뒤집은 플레이트를 흡수지 위에 세게 쳐서 잔류 배지를 제거한다.
    2. 첫 번째 행의 각 웰에 100 µL RPMI-10을 넣고, 두 번째와 세 번째 행의 각 웰에 133 µL RPMI-10을 넣는다. 이는 기술적 반복(technical duplicates)으로 수행한다.
    3. 플레이트 1의 각 열 첫 번째 웰에 100 µL PBMC 현탁액(1 × 106 cells/mL)을 넣는다. 플레이트 레이아웃에 따라 샘플을 배치한다 [예: 웰 A1–A6는 레서스 원숭이 1(RM1), A7–A12는 레서스 원숭이 2(RM2)].
    4. 플레이트 3의 각 열 첫 번째 웰에 100 µL 골수 세포 현탁액(1 × 106 cells/mL)을 넣는다. 플레이트 레이아웃에 따라 샘플을 배치한다.
    5. 한 웰에서 다음 웰로 67 µL를 옮기고 매 전송 후 충분히 혼합하여 3배 연속 희석을 준비한다. 지정된 웰까지 연속 희석을 계속한 다음, 웰당 최종 부피를 133 µL로 유지하기 위해 마지막 67 µL를 버린다.
    6. 5% CO2가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양한다.
      ​참고: 더블 스팟(double spots) 발생을 방지하기 위해 배양 중에 플레이트를 움직이거나 건드리지 않도록 주의한다.
  2. 항원 특이적 플레이트 분주
    1. 플레이트 2와 4를 폐기물 용기 위로 빠르게 뒤집어 DPBS를 제거한다. 뒤집은 플레이트를 흡수지 위에 세게 쳐서 잔류 버퍼를 제거한다.
    2. 첫 번째 행의 각 웰에 100 µL RPMI-10을 넣고, 두 번째와 세 번째 행의 각 웰에 133 µL RPMI-10을 넣는다.
    3. 플레이트 2의 각 열 첫 번째 웰에 100 µL PBMC 현탁액(5 × 106 cells/mL)을 넣는다. 플레이트 레이아웃에 따라 샘플을 추가한다.
    4. 플레이트 4의 각 열 첫 번째 웰에 100 µL 골수 세포 현탁액(5 × 106 cells/mL)을 넣는다. 플레이트 레이아웃에 따라 샘플을 추가한다.
    5. 한 웰에서 다음 웰로 67 µL를 옮기고 매 전송 후 충분히 혼합하여 3배 연속 희석을 준비한다. 지정된 웰까지 연속 희석을 계속한 다음, 웰당 최종 부피를 133 µL로 유지하기 위해 마지막 67 µL를 버린다.
    6. 5% CO2가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양한다.
      참고: 진동으로 인해 더블 스팟이나 꼬리 끌림 현상(comet-tail artifacts)이 발생할 수 있으므로 배양 중에 배양기를 건드리지 않도록 주의한다.

4. ELISpot 플레이트 처리

  1. 총 면역글로불린 플레이트 처리
    1. 약 18시간 동안 배양한 후 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸다.
    2. 10% bleach가 담긴 폐기물 컨테이너 위로 각 플레이트를 빠르게 뒤집어 세포와 배양액을 버린다. 뒤집힌 플레이트를 흡수성 종이에 대고 세게 두드려 잔류 액체를 제거한다.
      참고: 나머지 처리 단계는 비멸균 상태에서 수행한다.
    3. 0.05% Tween 20이 포함된 DPBS 200 µL/well로 각 플레이트를 4회 세척한다.
      참고: 멤브레인이 마르는 것을 방지하기 위해 마지막 세척 버퍼를 웰에 남겨둔다.
    4. 플레이트 처리 수량이 많을 경우, 자동 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척한다.
    5. 0.05% Tween 20 및 1% FBS가 포함된 DPBS에 biotinylated anti-monkey IgG 및 IgM 항체를 1:1,000으로, biotinylated anti-monkey IgA 항체를 1:500으로 희석하여 검출 항체 용액을 준비한다.
    6. 플레이트를 흡수성 종이에 두드려 마지막 세척 버퍼를 제거한다. 1열과 2열, 7열과 8열에는 희석된 anti-IgG 항체 100 µL/well를, 3열과 4열, 9열과 10열에는 anti-IgM 항체 100 µL/well를, 5열과 6열, 11열과 12열에는 anti-IgA 항체 100 µL/well를 첨가한다.
      참고: 멤브레인이 마르는 것을 방지하기 위해 플레이트를 한 번에 하나씩 처리한다.
    7. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한다.
    8. 검출 항체 용액을 버리고 0.05% Tween 20이 포함된 DPBS로 플레이트를 4회 세척한다.
    9. 0.05% Tween 20 및 1% FBS가 포함된 DPBS에 HRP-avidin을 1:1,000으로 희석하여 효소 접합물을 준비한다.
    10. 각 웰에 희석된 HRP-avidin 100 µL/well를 첨가한다. 빛을 차단한 상태로 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한다.
    11. HRP-avidin 용액을 버리고 0.05% Tween-20이 포함된 DPBS로 플레이트를 4회 세척한다.
      ​참고: 기질 발색이 완료될 때까지 마지막 세척 버퍼를 웰에 남겨둔다.
  2. 항원 특이적 플레이트 처리
    참고: 절차는 총 면역글로불린 플레이트와 유사하다. 단, GNL 코팅을 보존하기 위해 모든 세척 단계에서는 Tween 20이 포함되지 않은 DPBS를 사용한다.
    1. 약 18시간 동안 배양한 후 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸다.
    2. 10% bleach가 담긴 폐기물 컨테이너 위로 각 플레이트를 빠르게 뒤집어 세포와 배양액을 버린다. 뒤집힌 플레이트를 흡수성 종이에 대고 세게 두드려 잔류 액체를 제거한다.
      참고: 나머지 처리 단계는 비멸균 상태에서 수행한다.
    3. DPBS 200 µL/well로 각 플레이트를 4회 세척한다.
      참고: 멤브레인이 마르는 것을 방지하기 위해 마지막 세척 버퍼를 웰에 남겨둔다.
    4. 1% FBS가 포함된 DPBS에 biotinylated anti-monkey IgG 및 IgM 항체를 1:1,000으로, biotinylated anti-monkey IgA 항체를 1:500으로 희석하여 검출 항체 용액을 준비한다.
    5. 플레이트를 흡수성 종이에 두드려 마지막 세척 버퍼를 제거한다. 1열과 2열, 7열과 8열에는 희석된 anti-IgG 항체 100 µL/well를, 3열과 4열, 9열과 10열에는 anti-IgM 항체 100 µL/well를, 5열과 6열, 11열과 12열에는 anti-IgA 항체 100 µL/well를 첨가한다.
      참고: 멤브레인이 마르는 것을 방지하기 위해 플레이트를 한 번에 하나씩 처리한다.
    6. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한다.
    7. 검출 항체 용액을 버리고 200 µL/well DPBS로 플레이트를 4회 세척한다.
    8. 1% FBS가 포함된 DPBS에 HRP-avidin을 1:1,000으로 희석하여 효소 접합물을 준비한다.
    9. 각 웰에 희석된 HRP-avidin 100 µL/well를 첨가한다. 빛을 차단한 상태로 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양한다.
    10. HRP-avidin 용액을 버리고 200 µL/well DPBS로 플레이트를 4회 세척한다.
      참고: 기질 발색이 완료될 때까지 마지막 세척 버퍼를 웰에 남겨둔다.
  3. 자동 세척 수행 (선택 사항)
    1. 제조업체의 지침에 따라 자동 마이크로플레이트 세척기를 DPBS로 프라이밍(prime)한다.
    2. 사전 정의된 ELISpot 세척 프로그램을 선택하고 DPBS를 사용하여 모든 세척 단계를 수행한다.
      참고: 서로 다른 세척 버퍼로 장비를 반복적으로 프라이밍하는 것을 방지하기 위해 모든 자동 세척에 DPBS를 사용한다.
    3. 마이크로플레이트 세척기의 경우  Table 1에 나열된 세척기 설정을 사용한다.

5. 검출

  1. 기질 용액 준비
    1. 기질 용액 1 mL당 발색제 용액 한 방울을 첨가하여 사용 직전에 AEC 작동 기질을 준비한다. 볼텍싱으로 충분히 혼합한다.
      참고: 96-웰 플레이트 4개를 위해 작동 기질 약 40 mL를 준비한다.
  2. 실온에서 ELISpot 플레이트 발색
    1. 플레이트를 한 번에 하나씩 처리한다. 최종 세척 버퍼를 제거하고 즉시 웰당 100 µL의 AEC 작동 기질을 첨가한다.
    2. 뚜렷한 붉은색 스폿이 보일 때까지 육안으로 발색 과정을 모니터링하며, 이는 보통 2–4분 이내에 이루어진다.
      주의: 과도한 발색은 배경 염색을 증가시키고 스폿 분해능을 저하시키므로, 플레이트를 과발색시키지 않도록 주의한다.
    3. 흐르는 수돗물로 플레이트를 충분히 헹구어 효소 반응을 중지시킨다.
    4. 수돗물로 플레이트를 4~5회 세척한다. 흡수성 종이 타월을 사용하여 과잉 수분을 제거한다.
    5. 플레이트의 하단 배수판을 제거하고 스폿을 계수하기 전 약 24시간 동안 공기 중에서 건조시킨다.
      참고: 과발색을 방지하기 위해 세포 농도가 가장 높은 웰에서 스폿이 보이기 시작하는 즉시 반응을 중지시킨다.
    6. 나머지 각 플레이트에 대해 단계 5.2.1–5.2.5를 반복한다.

6. 스팟 정량 분석

  1. ELISpot 이미지 획득
    1. 이미지 획득 소프트웨어가 탑재된 ELISpot 리더기를 사용하여 각 플레이트를 스캔합니다.
    2. 적절한 플레이트 템플릿을 선택하고, 분석할 웰을 정의한 후 소프트웨어 지침에 따라 이미지를 획득합니다.
    3. 원시 데이터를 저장하고, 보관 목적으로 플레이트 이미지를 TIFF 형식으로 내보냅니다.
  2. 항체 분비 세포 수 측정
    1. 각 웰의 자동 스팟 카운트 결과를 검토합니다.
    2. 각 웰을 수동으로 확인하여 잘못 병합되거나 분리된 스팟을 식별합니다. 정확한 카운트를 위해 필요한 경우 개별 스팟을 수동으로 표시합니다.
      참고: 자동 분석 소프트웨어에서는 큰 스팟이 여러 번 카운트될 수 있으므로 수동 확인을 권장합니다.
    3. 표 2에 기술된 대로 스팟 카운트와 해당 희석 배수를 스프레드시트에 기록합니다.
    4. 각 희석 단계의 평균 스팟 카운트를 계산하기 전, IgG, IgM 및 IgA에 대해 중복 웰을 각각 별도로 분석합니다.
    5. 평균 스팟 카운트에 해당 희석 배수를 곱하여 투입 세포 100만 개당 항체 분비 세포 수를 계산합니다.
      참고: 총 면역글로불린 분석에는 15×, 45×, 135×의 희석 배수를 사용하고, 항원 특이적 분석에는 3×, 9×, 27×의 희석 배수를 사용합니다.
    6. 모든 계산은 스프레드시트 소프트웨어에서 수행하고, 통계 그래프 소프트웨어를 사용하여 그래프를 생성합니다.

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결과

본 B세포 ELISpot 분석에서는 HIV-1에 대한 광범위 중화항체(bnAbs) 유도를 목표로 하는 백신 연구의 코팅 항원으로서 가용성 HIV-1 외피 당단백질(Env) 삼량체인 CH505 SOSIP를 사용하여 항체 분비 세포(ASCs)를 검출하였습니다. 그림 1은 서로 다른 플레이트에서 총 ASC 및 항원 특이적 ASC를 정량화하는 데 사용된 ELISpot 플레이트 레이아웃을 보여줍니다. 이 레이아웃에는 개별 동물과 IgG, IgM 및 IgA 분석을 위해 할당된 웰 위치가 표시되어 있습니다. 플레이트 라벨에는 연구 번호, 샘플링 시점 및 날짜도 포함됩니다. 또한, 레이아웃에는 분석에 사용된 코팅 농도, 세포 현탁액 부피 및 연속 희석 계획이 명시되어 있습니다.

그림 2는 골수 내의 대표적인 항원 특이적 ASC 반응을 보여주며, 서로 다른 양의 항체를 분비하는 개별 ASC...

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토론

B 세포 ELISpot은 혈액, 혈장 및 골수 세포 내의 전체 면역글로불린과 항원 특이적 항체 분비 세포(ASC) 반응을 검출하는 민감한 방법입니다8,9,10,11. 프로토콜의 재현성을 확보하기 위해서는 몇 가지 단계가 매우 중요합니다. 우선, 멤브레인을 최적 농도의 포획 항체로 정밀하게 코팅해야 합니다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 멤브레인 블로킹이 필수적이며, 본 프로토콜에 설명된 대로 4 °C에서 하룻밤 동안 수행하는 것이 바람직합니다. 시간이 제한적인 경우에는 37 °C에서 최소 2 h 동안 블로킹을 수행할 수 있습니다.

또 다른 중요한 요인은 갓 수확한 세포를 사용하여 높은 세포 생존율을 유지하는 것입니다. T 세포와 달리, B 세포 계열, ...

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공개 사항

저자들은 선언할 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

저자들은 Keeling Center for Comparative Medicine and Research의 동물들과 연구 관리 직원들의 보살핌에 감사를 표하며, 절차의 지속적인 개선을 도와준 많은 전 팀원들과 협력자들에게 감사를 전합니다. 이 NHP HIV 백신 프로젝트의 연구비는 NIH 지원금 5R01AI183472(MBZ) 및 R24OD010947(FJV)을 통해 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ACK LysisQuality Biological118-156-101500 ml
70µm 스트레이너Fisher22363548멸균 세포 스트레이너, 50 mL 원추형 튜브용
AEC 작동 기질BD Biosciences55195110개 플레이트 분량 시약
분석: ExcelMicrosoft officeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft 365용 Microsoft Excel
분석: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti Rhesus IgA biotinNHPRRAB-3086851동결건조
Anti-monkey IgG biotinRocklandP/N 617-106-012동결건조
Anti-monkey IgM biotinRocklandP/N 617-106-007동결건조
블로킹 배지실험실 조제 시약자체 조제RPMI-10
2차 항체 및 HRP 희석용 버퍼실험실 조제 시약자체 조제1% FBS 함유 1X DPBS
원심분리기 Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, 제조년도: 2013, TX-750 로터 및 75003608 (라운드 버킷)
코팅 버퍼실험실 조제 시약자체 조제1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
ELISpot 플레이트Millipore SigmaMSHAN4B5050개 플레이트 팩
소 태아 혈청 (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL UnconjugatedVector LaboratoriesL-1240-5동결건조
Horseradish Peroxidase (HRP) - AvidinVector LaboratoriesA-20045mg/ml 즉시 사용 가능
Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpot 리더기Mabtech ABP/N: 2000ELISpot 및 Flurospot 분석용 자동 이미지 캡처 및 분석 장치
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122100X
플레이트 워셔BioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRS405 TS 마이크로플레이트 워셔
RPMI-10실험실 조제 시약자체 조제RPMI-1640 + 10% 소 태아 혈청 및 1% Penicillin/Streptomycin 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life sciencesP7949500ml
Unconjugated Polyclonal Goat anti monkey IgG+IgA+IgM Antibody IgG/IgM/IgALS-BioC347340동결건조
세척 버퍼 (항원 특이적 플레이트)실험실 조제 시약자체 조제(1X DPBS 전용)
세척 버퍼 (전체 Ig 플레이트)실험실 조제 시약자체 조제(1X DPBS + 0.05% Tween 20)

참고문헌

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

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