방법 논문

항결핵제 리팜피신 함유 리포좀의 제조 및 품질 평가

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DOI:

10.3791/71858

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2026년 10월 1일

 ,  ,  , 
1School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources Biorefinery, Guangdong University of Technology

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 항결핵제 함유 리포좀의 제조 공정을 최적화하고, 리포좀 제형에 대한 표준화된 품질 평가 시스템을 구축하는 것을 목적으로 합니다.

초록

Mycobacterium tuberculosis (MTB)에 의해 발생하는 결핵(TB)은 전 세계적으로 주요한 감염성 사망 원인으로 남아 있으며, 특히 다제내성/리팜피신 내성 결핵의 확산과 약물 침투력 부족, 심각한 전신 독성, 낮은 치료 순응도와 같은 기존 화학요법의 중대한 한계로 인해 중국 내 질병 부담이 심화되고 있습니다. 리포좀 전달 시스템은 항결핵 치료에 독특한 장점을 제공하지만, 일관성 없는 제조 공정, 낮은 약물 봉입 효율 및 표준화된 품질 평가 체계의 부재로 인해 개발에 어려움이 있습니다. 본 연구에서는 박막 수화법(thin-film hydration method)을 초음파 처리 및 여과와 결합하여 서로 다른 인지질 대 콜레스테롤 비율을 가진 리팜피신 봉입 나노리포좀을 제조하였습니다. 봉입 효율과 약물 함량을 측정하기 위해 검증된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석법을 수립하였습니다. 동적 광산란법(DLS)과 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 입자 크기, 제타 전위 및 미세 형태를 분석하였으며, 용출 시험을 통해 체외 약물 방출 프로파일을 분석하였습니다. 최적화된 리포좀은 높은 봉입 효율, 이상적인 약물 함량, 균일한 나노 규모의 입자 크기, 우수한 저장 안정성 및 지속적인 체외 약물 방출 특성을 나타냈습니다. 본 연구는 항결핵 리포좀 개발을 위한 표준화된 실험 방법과 종합적인 품질 평가 체계를 제공함으로써, 결핵 치료를 위한 리포좀 전달 시스템의 임상 적용을 지원합니다.

서론

Mycobacterium tuberculosis (MTB)에 의해 발생하는 만성 감염성 질환인 결핵(TB)은 단일 병원체로 인한 감염성 질환 중 사망률이 가장 높은 질환으로 남아 있으며, 인류의 건강과 글로벌 공중보건 안보에 지속적이고 심각한 위협이 되고 있습니다. 세계보건기구(WHO)의 2025년 세계 결핵 보고서에 따르면, 2024년 한 해 동안 전 세계적으로 약 1,070만 명의 신규 결핵 환자가 발생했으며, 결핵 관련 사망자는 약 123만 명으로 추산됩니다1. 이 중 다제내성/리팜피신 내성 결핵(MDR/RR-TB) 신규 사례가 약 390,000건 보고되었으나, 해당 환자의 42%만이 치료를 시작했습니다. 약제 내성 결핵의 지속적인 전파는 WHO의 글로벌 결핵 퇴치 전략(End TB Strategy) 이행에 있어 핵심적인 장애물로 부상했습니다.

현재 화학요법은 결핵(TB)의 임상 치료에서 주된 방법으로 남아 있습니다. 표준 1차 치료법은 isoniazid, rifampicin, pyrazinamide 및 ethambutol의 조합으로 구성되며, 6개월에서 9개월의 장기적인 치료 기간이 소요됩니다2. MDR/RR-TB의 경우, 2차 항결핵제가 포함된 치료법이 필요하며, 이에 따라 치료 기간이 18~24개월로 연장되고3 비용이 크게 증가하며 약물 부작용이 현저히 증가합니다4. 최근 bedaquiline, delamanid, pretomanid와 같은 새로운 항결핵제들이 승인되어 약제 내성 결핵에 대한 새로운 치료 옵션을 제공하고 있지만5, 기존 항결핵 요법에 내재된 근본적인 병목 현상을 아직 극복하지 못한 상태입니다6,7.

첫째, M. tuberculosis는 주로 숙주의 폐포 대식세포 내에 서식하는 전형적인 세포 내 병원균입니다. 유리 약물은 대식세포 막을 통과하는 투과력이 낮아, 세포 내 약물 농도가 최소 억제 농도(MIC)보다 훨씬 낮게 나타납니다8. 결과적으로 세포 내 지속균(persisters)을 제거하지 못하는 것이 결핵 재발과 약제 내성 출현의 핵심 동인이 됩니다9. 둘째, 결핵 병변은 치즈양 괴사 조직과 섬유성 캡슐을 포함한 여러 생물학적 장벽을 형성하여 유리 약물이 병변 중심부로 침투하는 것을 방해하며, 이는 국소 약물 농도를 최적 수준 이하로 낮추어 살균 효능을 저하시킵니다10,11. 셋째, 고용량의 장기간 전신 투여는 리팜피신 유발 간독성, 아미노글리코사이드 관련 이독성 및 신독성, 플루오로퀴놀론 관련 건병증 및 심독성과 같은 심각한 부작용을 일으키기 쉬우며, 이는 치료 중단과 환자의 낮은 복약 순응도의 주요 원인이 됩니다12,13. 넷째, 단일 요법이나 순차 투여는 M. tuberculosis에서 약제 내성 돌연변이를 쉽게 선택하며, 반면 다제 병용 요법은 누적 독성의 위험을 더욱 증폭시켜 지속적인 임상적 딜레마를 야기합니다14.

나노의약품 전달 시스템의 개발은 앞서 언급한 항결핵 요법의 병목 현상을 해결하기 위한 유망한 전략을 제시합니다. 그중에서도 인지질 이중층으로 자가 조립된 나노 규모의 폐쇄형 소포 운반체인 리포좀은 우수한 생체 적합성, 생분해성, 표적 전달 능력 및 제어된 서방형 방출 특성 덕분에 항감염 치료를 위한 가장 임상 적용 가능성이 높은 나노운반체 플랫폼 중 하나로 부상했습니다15,16. 유리 항결핵제와 비교하여, 리포좀 전달 시스템은 결핵 치료에 있어 몇 가지 대체 불가능한 장점을 가지고 있습니다.

첫째, 리포좀은 대식세포 내의 표적 농축을 가능하게 합니다. 리포좀은 망상내피계(RES)의 phagocyte에 의해 우선적으로 섭취되어, 폐, 간, 비장과 같은 주요 MTB 서식 장기에 특이적으로 축적됩니다. 또한, 리포좀은 대식세포 막을 효율적으로 투과하여17 세포 내 약물 농도를 실질적으로 높임으로써, 지속성 세포 내 세균을 제거하고 결과적으로 결핵의 재발과 약제 내성을 근본적으로 감소시킵니다. 둘째, 결핵 병변으로의 투과성이 향상됩니다. 입자 크기, 표면 전하 및 표면 수식을 조절함으로써 리포좀은 결핵 병변의 섬유성 캡슐과 치즈양 괴사 장벽을 효과적으로 통과할 수 있으며, 이를 통해 국소 약물 농도를 유의하게 높이고 살균 효능을 개선합니다18. 셋째, 약물 독성을 현저히 감소시킵니다. 리포좀은 약물의 체내 생체 분포를 변화시켜 건강한 조직과 장기의 노출을 제한함으로써 항결핵제의 전신 독성을 크게 줄입니다. 예를 들어, 아미노글리코사이드가 적재된 리포좀은 달팽이관과 신장으로의 약물 축적을 크게 줄여 이독성 및 신독성 위험을 거의 제거합니다19. 넷째, 장기 지속 방출을 제공합니다. 인지질 이중층 구조는 약물의 제어된 서방형 방출을 가능하게 하여, 체내 순환 반감기와 작용 기간을 연장하고 투여 빈도를 줄여 환자의 복약 순응도를 실질적으로 개선합니다20. 다섯째, 여러 약물의 동시 전달이 가능합니다. 리포좀은 서로 다른 물리화학적 특성을 가진 여러 항결핵제를 동시에 캡슐화하여 동기화된 전달과 시너지 살균 효과를 달성함으로써, 약제 내성 MTB 변이주의 출현을 효과적으로 억제할 수 있습니다21.

항결핵 치료를 위한 리포좀 약물 전달 시스템의 임상 적용에 있어 상당한 진전이 이루어졌습니다. 아미카신 리포좀 흡입 현탁액(ALIS)은 마이코박테리움 아비움 복합체(MAC) 폐 질환 치료에 대해 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았으며22, 이후 여러 국가의 다제내성 결핵(MDR-TB) 치료 요법에 포함됨으로써 결핵 관리에서 리포좀 플랫폼의 임상적 가치와 폭넓은 응용 전망을 입증하였습니다23. 그럼에도 불구하고, 항결핵 리포좀의 개발 및 산업화는 제조 공정의 낮은 재현성, 낮은 약물 적재 용량 및 봉입 효율, 불균일한 입자 크기 분포, 저장 중 응집 및 약물 누출, 그리고 인비트로(in vitro) 용해/방출 거동과 인비보(in vivo) 효능 사이의 불분명한 상관관계 등 여러 핵심적인 기술적 병목 현상에 계속해서 직면해 있습니다. 이러한 과제들은 새로운 항결핵 리포좀 제형의 연구 개발 과정과 임상 적용을 심각하게 저해하고 있습니다24,25.

본 연구는 소수성 또는 약한 친지성 저분자 약물(예: rifampicin)을 인지질 이중층 내에 캡슐화하는 데 적합한 박막 수화-초음파 처리-여과법을 수립합니다. 매우 친수성인 약물의 경우, 추가적인 최적화(예: 황산암모늄 기울기 로딩)를 적용하지 않으면 기존의 박막법으로는 캡슐화 효율이 낮습니다. 본 절차는 표준 장비(회전 증발기, 초음파 세척기, HPLC, DLS, TEM)를 사용하여 특수 장치 없이도 쉽게 재현할 수 있도록 합니다. 현재의 10 mL 실험실 규모 설정은 안정적인 품질과 우수한 배치 일관성을 제공합니다. 산업적 규모 확장을 위해서는 증발 진공도, 회전 속도, 초음파 출력 및 멤브레인 사양의 최적화가 필요합니다. 특히, 리포좀은 4 °C에서 30 일 동안 안정적으로 유지되나, 60 일 후에는 산화, 응집 및 층분리가 나타나므로 장기 보존을 위해 동결 건조 또는 제형 수정이 필요합니다. 연구진은 인지질 대 콜레스테롤 비율을 체계적으로 최적화하고, 조제 워크플로우를 표준화했으며, 캡슐화 효율, 약물 로딩, 입자 크기, 제타 전위, 형태, in vitro 방출 및 저장 안정성을 포함하는 종합적인 품질 평가 시스템을 구축했습니다. 본 프로토콜은 연구자가 소수성 약물 전달에 대한 방법론적 적합성을 평가하는 데 명확한 지침을 제공하며, 제형 최적화, 실험 설계 및 예비 규모 확장 탐색을 위한 참고 자료로 활용될 수 있습니다.

프로토콜

본 연구는 인간 대상자나 동물을 포함하지 않았으며, 윤리 위원회의 승인이 필요하지 않았습니다.

1. 리팜피신 함유 나노리포좀의 제조

참고: 모든 제제는 3반복으로 준비하십시오.

  1. 10만 분의 1 정밀 분석 저울을 사용하여 리포좀 성분을 정량한다. 인지질 대 콜레스테롤의 질량비는 각각 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30으로 설정하였다(표 1).
  2. 회전 증발기에 적합한 100 mL 가지 달린 플라스크(eggplant-shaped flask)에 세 가지 성분을 넣는다. 모든 지질 성분을 6 mL의 클로로포름에 용해시킨다. 투명한 용액이 얻어질 때까지 수조에서 1 분 동안 초음파 처리(40 kHz, 100 W)를 수행한다.
    ​주의: 클로로포름은 휘발성 유기 용매로, 흡입하거나 피부에 흡수될 경우 유해하다. 클로로포름을 사용하는 모든 단계(1.3~1.5)는 인증된 화학 흄 후드 내에서 수행한다. 니트릴 장갑, 실험복 및 화학 안전 고글을 착용한다.
  3. 다음 파라미터를 설정한 회전 증발기를 사용하여 클로로포름을 제거한다.
    1. 응축기 온도를 -5 °C 이하로 설정한다.
    2. 수조 온도를 37 °C로 설정한다.
    3. 회전 속도를 60 rpm으로 설정한다.
    4. 클로로포름의 끓는점을 낮추기 위해 진공도를 330 mbar로 조절한다.
      주의: 회전 증발기는 반드시 흄 후드 내에서 작동시켜야 한다. 용매 증기가 진공 펌프로 유입되는 것을 방지하기 위해 콜드 트랩이 적절하게 연결되었는지 확인한다.
  4. 330 mbar에서 20 분 동안 가동한 후, 진공도를 80 mbar로 높여 10 분 더 유지함으로써 잔류 용매를 완전히 제거하고 얇은 지질 막을 형성한다26.
    참고: 응축기에서 응결된 증발 용매는 유기 할로겐 함유 폐기물로 수거한다. 모든 클로로포름 폐기물은 적절하게 라벨이 부착된 할로겐화 유기 용매 수거함에 버린다. 싱크대에 붓지 않는다.
  5. 25 °C의 진공( ≤ 80 mbar) 하에서 지질 막을 12 시간 동안 건조시킨다.
    참고: 잔류 용매가 방출되는 것을 방지하기 위해 건조 단계는 흄 후드 내의 진공 데시케이터에서 수행한다.
  6. 건조된 막을 10 mL의 인산염 완충 식염수(PBS) 버퍼로 수화시킨다. 플라스크를 회전 증발기에 장착하고(진공 없이) 100 rpm, 37 °C에서 지질 막이 완전히 떨어져 나올 때까지 1 시간 동안 처리한다. rifampicin의 최종 농도는 1 mg/mL이다.
  7. 37 °C의 수조에서 10 분 동안 초음파 처리(40 kHz, 100 W)를 수행한다. 수조 온도가 37 °C로 유지되는지 확인한다. 처리된 시료의 총 부피는 10 mL이다.
  8. 초음파 처리된 현탁액을 순차적으로 여과한다. 0.45 µm PES 시린지 필터(직경 13 mm)를 1 mL의 PBS로 미리 적신다. 10 mL 시린지를 사용하여 10 mL의 시료 전체를 0.45 µm 필터에 한 번 통과시킨다. 그런 다음 0.22 µm PES 시린지 필터(직경 13 mm)를 미리 적시고 여과액을 다시 한 번 통과시킨다. 리포좀 압출기(extruder)는 사용하지 않는다(그림 1).

2. 봉입 효율

참고: 봉입 효율(EE)은 물리적 저지(physical retention)를 기반으로 유리 약물과 리포좀에 봉입된 약물을 빠르게 분리하는 한외여과 원심분리법으로 결정하였습니다. 그런 다음, 두 분획의 약물 함량을 측정하여 봉입 효율을 계산합니다27.

  1. 0.5 mL 초여과 튜브(3 kDa MWCO)의 시료 저장소에 리포좀 현탁액 200 µL를 정확히 넣은 후, 원심분리하여 리포좀으로부터 유리 약물을 분리합니다.
  2. 25 °C에서 7,000 x g (고정각 로터)로 15 분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 여과액을 모으고, 이 과정을 4~5회 반복합니다.
  3. 모든 여과액을 합치고 부피 플라스크에서 Methanol을 사용하여 10 mL로 희석합니다. HPLC 주입 전, 0.22 µm Nylon66 시린지 필터로 여과합니다.
  4. HPLC 조건을 다음과 같이 설정합니다: 컬럼: C18 컬럼 (4.6 mm x 250 mm, 5 µm); 이동상: acetonitrile: aqueous phosphoric acid = 45: 55 (V/V); 검출 파장: 475 nm; 유속: 1.0 mL/min; 컬럼 온도: 40 °C; 주입 부피: 20 µL; 분석 시간: 20 min
    주의: Acetonitrile은 인화성 및 독성이 있습니다. 이동상은 흄 후드 내에서 준비하고 취급하십시오. 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하십시오.
  5. 다음 식을 사용하여 봉입 효율(EE)을 계산합니다: 봉입 효율 (EE, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wrfb] × 100%
  6. 다음 식을 사용하여 약물 함량(DL)을 계산합니다: 약물 함량 (DL, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wtotal] × 100%.
    참고: Wtotal—첨가된 인지질, 콜레스테롤 및 rifampicin의 총 함량; Wrfb—첨가된 rifampicin의 함량; Wfree—리포좀 내 유리 약물의 함량.

3. HPLC 분석법 검증

참고: 직선성, 정밀도, 반복성, 안정성, 회수율 및 특이성에 대해 다음과 같이 HPLC 방법 밸리데이션을 수행하십시오.

  1. 이동상 내에서 1.15, 2.3, 4.6, 9.2, 13.8, 18.4 및 23.0 µg/mL 농도의 rifampicin 표준 용액을 준비한다. 각 용액을 HPLC로 분석하여 피크 면적을 기록하고, 회귀 방정식과 R2 값을 계산한다.
  2. 9.2, 13.8 및 18.4 µg/mL rifampicin 용액의 피크 면적을 측정한다. 하루 동안 5회 병행 테스트를 수행하고 RSD를 계산한다.
  3. 9.2 µg/mL rifampicin 용액 4개를 병행하여 준비한다. HPLC로 피크 면적을 측정하고 분석법의 반복성 RSD를 계산한다.
  4. 9.2 µg/mL 표준 용액을 실온에서 보관한다. 0, 2, 4, 6, 12, 24시간에 용액을 분석하여 피크 면적을 기록하고, 안정성에 대한 RSD를 계산한다.
  5. 공백 리포좀 매트릭스에 일정량의 rifampicin 표준 물질을 첨가한다. 초여과법으로 시료를 처리한 후 HPLC로 분석하여 회수율과 RSD를 계산한다.
  6. 크로마토그램을 검토하여 rifampicin의 머무름 시간에서 간섭 피크가 발생하는지 확인한다.

4. 입자 크기 및 제타 전위

  1. 리포좀 현탁액 20 µL를 0.22 µm 필터로 사전 여과한 초순수 980 µL에 피펫팅한다. 10 s 동안 볼텍싱한 후, 수조에서 30 s 동안 초음파 처리한다.
  2. 희석된 시료를 크기 측정을 위해 유니버설 큐벳에, 제타 전위 측정을 위해 폴디드 모세관 셀(folded capillary cell)에 옮긴다.
  3. 매개변수를 다음과 같이 설정한다: 분산제 = 물, 온도 = 25 °C.
  4. 각 10–15회 측정으로 구성된 기술적 반복 실험을 최소 3회 수행한다. Z-평균값(강도 가중 평균 수력학적 직경)과 다분산 지수(PDI)를 기록한다.
  5. 동일한 매개변수 하에서 제타 전위를 측정하기 위해 큐벳에 팔라듐 전극을 삽입한다28.
  6. 큐벳을 제거하고 기기의 전원을 끈다.

5. 형태학적 특성 분석 (TEM)

  1. TEM 관찰에 적절한 농도가 되도록 리팜피신(rifampicin) 함유 리포좀 현탁액을 초순수로 50–100배 희석합니다.
  2. 희석된 시료를 수조식 소니케이터(40 kHz, 100 W)를 사용하여 30 s 동안 초음파 처리합니다.
    주의: 리포좀의 파열을 방지하기 위해 과도한 초음파 처리를 피하십시오.
  3. 300-메쉬 탄소 코팅 구리 그리드를 탄소 면이 위로 향하게 하여 여과지에 놓습니다.
  4. 희석된 리포좀 현탁액 10 µL를 그리드 중앙에 피펫팅합니다. 1 min 동안 흡착시킵니다.
  5. 깨끗한 여과지를 사용하여 그리드 가장자리의 과잉 현탁액을 닦아냅니다. 이때 중앙의 관찰 영역은 건드리지 마십시오.
  6. 음성 염색: 즉시 2% (w/v) 인텅스텐산(phosphotungstic acid, pH 7.0) 10 µL를 그리드 위에 첨가합니다. 1 min 후, 가장자리의 과잉 염색액을 닦아냅니다.
  7. 그리드를 실온에서 3 h 동안 공기 건조합니다. 건조된 그리드를 TEM 시료 홀더에 장착합니다.
  8. 80–120 kV의 가속 전압에서 관찰합니다. 저선량 이미징 모드29를 사용하고, CCD 카메라(예: Gatan OneView)를 이용하여 10,000x, 25,000x, 40,000x의 공칭 배율로 이미지를 획득합니다.
  9. 대표적인 영역을 선택하고, 응집이나 염색 아티팩트가 있는 영역은 피합니다.

6. 인 비트로(In vitro) 약물 방출

  1. 투석막(MWCO 7 kDa)을 적절한 길이로 자릅니다. pH 8.0으로 조절된 2% (w/v) 중탄산나트륨과 1 mmol/L EDTA의 대용량 용액을 준비합니다.
  2. 이 용액에서 투석막을 10분 동안 끓입니다. 증류수로 막을 충분히 세척합니다.
  3. 세척한 막을 방출 배지(0.01 M PBS)에서 30 분 동안 평형화합니다. 리포좀 현탁액 1 mL를 전처리된 투석 주머니에 옮기고, 양 끝을 투석 클립으로 밀봉합니다.
  4. 0.1% 아스코르브산(w/v)과 0.1 mL Tween 80이 첨가되어 37 °C로 예열된 방출 배지 80 mL가 담긴 100 mL 비커에 투석 주머니를 넣습니다. 빛을 차단하기 위해 비커를 알루미늄 호일로 덮습니다.
  5. 마그네틱 교반기를 사용하여 37 °C, 200 rpm에서 암실 상태로 교반합니다. 정해진 시간(0.5, 1.5, 3, 5, 7, 9, 12, 24, 48시간)에 방출 배지 1 mL를 채취합니다.
  6. 피펫을 사용하여 37 °C로 예열된 신선한 방출 배지 1 mL를 비커 벽면에 조심스럽게 흘려 넣어 추가합니다30 (시스템이 밀폐되어 있으므로 증발에 대한 보정은 필요하지 않습니다).
  7. 샘플을 0.22 µm 필터로 여과한 후 HPLC로 분석합니다. 섹션 2.4에 기술된 것과 동일한 HPLC 조건으로 샘플을 분석합니다.
  8. 누적 방출량(%) = (각 시간대에서 검출된 총 약물량 / 초기 약물 로딩량) × 100%로 계산합니다.

7. 저장 안정성 평가

  1. 준비된 rifampicin 함유 리포좀 현탁액을 밀폐된 유리 바이알에 넣어 4 °C에서 보관하고, 빛으로부터 보호하십시오.
  2. 보관 후 1일, 4일, 30일에 샘플을 수집하십시오. 채취한 샘플은 폐기하며(원래 바이알에 다시 넣지 마십시오),
  3. 각 시점에서 리포좀의 입자 크기, 다분산 지수 및 제타 전위를 측정하십시오31.
  4. 육안상 외관을 기록하고 리포좀 현탁액의 침전 또는 층 분리 여부를 관찰하십시오.
  5. 60일에 추가 샘플을 수집하여 현탁액의 산화, 침전 및 층 분리 여부를 육안으로 관찰하십시오.
    참고: 모든 측정은 세 번의 병렬 실험으로 수행되었습니다. 실험 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표기되었습니다.

결과

리팜피신(rifampicin) 정량을 위해 검증된 HPLC 분석법을 수립하였다. 리팜피신 표준 용액의 대표 크로마토그램이 그림 2A에 제시되어 있다. 리팜피신의 주 피크는 14.13분으로 유지 시간(retention time)에 나타났으며, 피크 형태가 양호하고 다른 피크로부터의 유의미한 간섭은 없었다. 검정 곡선은 1.15–23 µg/mL의 농도 범위에서 우수한 직선성을 보였으며, 회귀 방정식은 Y = 12729.5X-4778.6, 결정 계수는 R2=0.9995였다. 일반적으로 제약 실험실의 정량 분석에서는 R2 ≥ 0.999인 경우 수용 가능한 것으로 간주하며, 따라서 얻어진 0.9995라는 값은 해당 분석법이 테스트된 범위 전반에서 매우 높은 직선성을 가짐을 입증한다. 검은색 사각형은 측정 데이터 지점을, 실선은 적합된 선형 회귀선을 나타낸다(그림 2B).

세 가지 리팜피신 농도(9.2, 13.8, 및 18.4 µg/mL)에서 정밀도 테스트를 수행하였습니다. 피크 면적의 상대 표준 편차(RSD) 값은 모두 1% 미만으로 나타나 높은 기기 정밀도를 확인하였습니다(표 2). 반복성 테스트(n = 4) 결과 RSD는 0.32%로, 신뢰할 수 있는 반복성을 나타냈습니다(표 3). 실온에서 24시간 동안 실시한 안정성 테스트 결과 RSD는 0.59%로 나타나, 리팜피신 용액이 해당 조건에서 안정적으로 유지됨을 입증하였습니다(표 4). 평균 회수율은 98.12%로, 리포좀 샘플 내 리팜피신 분석에 대한 본 방법의 정확성을 확인하였습니다. 이러한 결과들을 종합하여 HPLC 방법이 본 연구의 리팜피신 정량 결정에 적합함을 검증하였습니다. 이와 같은 엄격한 밸리데이션을 통해 캡슐화 효율, 약물 로딩 및 방출 프로파일의 후속 측정값이 서로 다른 실험 배치 간에도 신뢰할 수 있고 재현 가능하다는 것을 보장합니다.

遊離 약물과 리포좀에 캡슐화된 약물은 초여과 원심분리를 통해 분리되었습니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정량 분석 결과, 콜레스테롤 함량이 20%일 때 리팜피신 함유 리포좀의 캡슐화 효율(encapsulation efficiency)은 최대 68.54 ± 2.19에 도달했으며, 약물 적재율(drug loading rate)은 11.42 ± 0.37이었습니다(그림 3). 콜레스테롤이 과잉될 때 리포좀의 캡슐화 효율과 약물 적재율은 유의미하게 감소합니다(표 5). 이러한 결과는 콜레스테롤 대 인지질 비율이 20%일 때 막의 강성과 유동성의 균형을 맞추고 이중층 내에 리팜피신을 유지하는 데 최적임을 입증합니다. 작은 표준 편차(3회 반복 조제 시 EE는 모두 <2.2%, DL은 <0.4%)는 본 조제 프로토콜이 우수한 배치 간 재현성과 함께 일관된 제형 품질을 생성함을 확인시켜 줍니다.

최적화된 방법을 통해 제조된 리포솜은 좁은 크기 분포를 나타냈습니다(그림 4), 평균 크기는 185 nm였다. PDI 값은 <0.3는 단분산 집단을 나타내는 지표로 널리 인정됩니다. 따라서 얻어진 0.153의 PDI는 리포좀의 크기가 매우 균일함을 확인시켜 줍니다. 절대 제타 전위 >30 mV는 일반적으로 응집을 방지하기에 충분한 정전기적 반발력을 제공합니다. 측정값인 −38 따라서 mV는 우수한 콜로이드 안정성을 예측합니다.323회 반복 시료 간의 낮은 표준 편차(예: 크기 185.41 ± 0.72 (콜레스테롤 20%에서 nm)는 제조 과정의 높은 재현성을 더욱 입증합니다. 이러한 결과는 박막 수화-초음파 처리-여과 프로토콜이 좁은 크기 분포와 적절한 표면 전하를 가진 나노 크기의 리포좀을 안정적으로 생성하여, 결과적으로 장기 안정성을 보장한다는 것을 보여줍니다.

제조된 리포좀은 뚜렷한 틴들 현상을 보였습니다. 그림 5A는 리포좀의 틴들 현상을 보여줍니다33. 리팜피신이 탑재된 나노리포좀의 형태학적 특성은 TEM과 동적 광산란법(DLS)으로 평가하였습니다. 그림 4에 나타난 바와 같이, 리포좀의 DLS 강도 가중 크기 분포 곡선은 단일하고 좁은 피크를 보였으며, 눈에 띄는 거대 입자나 응집체가 관찰되지 않아 제조된 제형의 균질성과 단분산성이 우수함을 나타냈습니다(그림 5B). 저배율에서는 구형의 리포좀 소포가 관찰되었으나, 일부 국소적인 응집이 확인되었습니다(그림 5C). 이는 시료 준비 과정 중 불완전한 분산이나 건조 과정 중 발생했을 가능성이 있는 소포 융합에 기인한 것으로 보입니다. 고배율(50,000×, 그림 5D)에서는 뚜렷한 대비 차이가 관찰되었습니다. 어두운 중심 영역은 약물이 포함된 수성 핵에 해당하며, 더 밝은 바깥쪽 고리는 지질 이중층을 나타내는데, 이는 음성 염색된 리포좀의 전형적인 특징입니다34.

TEM으로 관찰된 입자 크기는 DLS로 측정된 수동역학적 직경보다 작았습니다. 이러한 차이는 두 기술의 서로 다른 측정 원리에서 비롯됩니다. TEM은 진공 상태에서 탈수된 코어 직경을 측정하는 반면, DLS는 리포좀 나노입자의 잘 알려진 특성인 표면 수화층을 포함한 수화 직경을 검출합니다35.

처음 세 가지 리포좀 그룹에서는 뚜렷한 초기 과다 방출(burst release)이 나타나지 않았으며(0.5시간에서의 누적 방출률은 <(모든 군에서 40%). 초기 급격한 방출(burst release) <첫 1시간 이내에 40%가 방출되는 것은 일반적으로 지속성 항결핵 제제에서 안전한 것으로 간주되는데, 이는 급성 전신 독성의 위험을 최소화하기 때문입니다. 구체적인 방출 단계는 다음과 같이 나눌 수 있습니다.

급속 방출기(0.5–12 h): 약물이 리포좀의 표층 또는 막 인근 영역에서 서서히 확산되었으며, 방출 속도는 상대적으로 빨랐습니다. 처음 세 그룹의 누적 방출률은 12 h 시점에서 90%에 근접했습니다(그림 6).

24시간 후, 리팜피신(rifampicin)이 산화 분해 및 가수분해 분해를 겪어 누적 방출률이 비정상적으로 감소한 것으로 추정되었습니다.36콜레스테롤 함량이 30%일 때, 0.5시간에서의 누적 방출률은 >40%로, 서방성 기준을 충족하지 않았다.

따라서 5–15%의 콜레스테롤을 함유한 제형이 적절하며, 20% 또한 burst-release 기준을 충족합니다. 배치 간 변동성이 작다는 점(그림 6)은 방출 테스트 방법의 재현성을 확인시켜 줍니다.

처음 세 그룹의 방출 데이터를 일반적인 속도론적 모델(0차, 1차, Higuchi 및 Ritger-Peppas)에 적용하였습니다 (그림 7). 그 결과, 1차 속도론적 모델이 가장 높은 적합도(R2= 0.987)를 보였으며, 이는 0차(R2= 0.246), Higuchi(R2= 0.544) 및 Ritger-Peppas(R2 = 0.926) 모델보다 유의미하게 우수했습니다. 이는 리포좀의 약물 방출 거동이 1차 속도론을 따른다는 것을 나타냅니다. 방출 속도는 리포좀 내 잔류 약물 농도와 양의 상관관계를 가지며, 전형적인 "초기 급격한 방출 - 이후 지속적 방출" 특성을 보여주는데, 이는 콜레스테롤이 막 구조를 조절하여 확산 속도에 영향을 미치는 메커니즘을 더욱 입증합니다37.

리팜피신(rifampicin) 함유 리포좀은 4 °C에서 30일 동안 저장하는 동안 양호한 단기 안정성을 보였다. 1, 4, 30일의 평가 기간 동안 입자 크기는 완만하게 증가했으나, 우수한 크기 균일성(PDI < 0.15)과 양호한 콜로이드 안정성(절대 제타 전위 > 24 mV)이 유지되었다(표 6). 60일째에는 뚜렷한 산화와 응집물이 관찰되어, 해당 제형의 장기 안정성이 낮음을 나타냈다. 이 결과는 장기 보존을 위해 동결 건조나 제형 수정(예: 항산화제 또는 동결 보호제 첨가)이 필요함을 강조하며, 이는 이 프로토콜을 사용하는 연구자들에게 중요한 실질적 시사점이다.

figure-results-1
그림 1. 박막 수화법을 이용한 rifampicin 탑재 리포좀 제조. rifampicin 탑재 리포좀의 제조 과정을 나타낸 모식도. 지질 성분을 유기 용매에 용해시킨 후, 회전 증발, 진공 건조, 수화 및 초음파 처리를 통한 박막 형성을 거쳐 최종 리포좀 제형을 제조하였다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2리팜피신의 HPLC 식별 및 검정. (A) 정량 분석에 사용된 특징적인 머무름 피크를 보여주는 리팜피신(rifampicin)의 대표적인 HPLC 크로마토그램. (B) 리팜피신(rifampicin) 농도(1.15–)에 따른 피크 면적을 도식화하여 작성한 검량선23.0 µg/mL). 회귀 방정식 및 상관계수(R2 (= 0.9995)는 테스트된 농도 범위에서 우수한 선형성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3리팜피신 함유 리포좀의 봉입 효율 및 약물 적재량. 콜레스테롤 함량을 달리하여 제조한 리포좀의 봉입 효율(EE) 및 약물 적재량(DL). 콜레스테롤 함량이 20%일 때 가장 높은 EE(68.5%)와 DL(11.4%)이 관찰되었으며, 이는 콜레스테롤 함량이 약물 봉입 및 적재에 상당한 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 오차 막대는 평균을 나타낸다. × 표준편차 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4리팜피신 함유 리포좀의 입자 크기 분포. 다양한 인지질 대 콜레스테롤 비율로 제조된 리팜피신 함유 리포좀의 입자 크기 분포 프로파일. 최적화된 제형은 Z-평균 직경 185 nm, 다분산 지수(PDI) 0.153을 나타냈으며, 이는 좁은 크기 분포와 우수한 균질성을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5리팜피신 함유 리포좀의 물리화학적 특성 분석. (A리팜피신(rifampicin)이 함유된 리포좀 현탁액에서 관찰된 틴들 현상은 나노 크기 입자가 존재함을 나타냅니다.B) 최적화된 리포좀 제형의 세 번의 병행 반복 실험에서 얻은 입자 크기 분포 곡선. (C) 다수의 구형 리포좀 소포를 보여주는 투과전자현미경(TEM) 이미지. (D) 개별 리포좀 소포의 대표적인 고배율 TEM 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6. 리포좀으로부터 rifampicin의 인 비트로(in vitro) 방출 프로파일. 연구 기간 동안 서로 다른 인지질 대 콜레스테롤 비율로 제조된 리포좀으로부터 rifampicin의 누적 방출 프로파일. 방출 거동은 콜레스테롤 함량에 따라 다르게 나타났으며, 이는 약물 방출 특성에 미치는 콜레스테롤의 영향을 입증한다. 여기 를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

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그림 7리포좀으로부터의 리팜피신 방출에 대한 동역학적 모델링. 최적화된 제형(콜레스테롤 20%)의 방출 데이터를 (A) 0차, (B) 1차, (C) Higuchi 및 (D) Ritger-Peppas 속도론적 모델에 적용한 결과. 1차 모델이 가장 높은 적합도(R2 = 0.987)이며, 이는 실험적 방출 데이터와 가장 잘 일치함을 나타냅니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

리포좀 구성 성분레시틴콜레스테롤리팜피신
5%47.5 mg2.5 mg10 mg
10%45 mg5 mg10 mg
15%42.5 mg7.5 mg10 mg
20%40 mg10 mg10 mg
25%37.5 mg12.5 mg10 mg
30%35 mg15 mg10 mg
최종 부피10 mL

표 1: 리팜피신 함유 리포좀 제형의 조성. 최종 부피를 10 mL로 유지하면서, 레시틴, 콜레스테롤 및 리팜피신을 사용하여 인지질 대비 콜레스테롤 비율이 서로 다른 리포좀을 제조하였다.

농도 (µg/mL)X±SRSD(%)
9.2114012.75 ± 502.420.44
13.8171412.50 ± 493.900.29
18.4232334.00 ± 1358.420.59

표 2: 다양한 rifampicin 농도에서의 HPLC 정량 정밀도. 9.2, 13.8 및 18.4 µg/mL 농도의 rifampicin 표준 용액에 대해 피크 면적 측정값을 얻었습니다. 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, 상대 표준 편차(RSD) 값은 높은 분석 정밀도를 보여주었습니다.

아니오.1234상대 표준 편차 (%)
피크 면적1145031141251139691145390.32

표 3: HPLC 분석법의 기기 정밀도. 동일한 리팜피신 표준 용액을 4회 연속 주입하여 정밀도를 평가하였다. 기기 재현성을 평가하기 위해 피크 면적 값과 상대 표준 편차(RSD)를 보고하였다.

시간 (h)024681224상대표준편차 (%)
피크 면적1145031143251145161139781138941136381125760.59%

표 4: 리팜피신 표준 용액의 안정성. 실온에서 보관한 9.2 µg/mL 리팜피신 표준 용액을 0, 2, 4, 6, 8, 12, 24시간에 분석하여 안정성을 평가하였다. 테스트 기간 동안의 용액 안정성을 평가하기 위해 피크 면적 값과 상대 표준 편차(RSD)를 보고하였다.

콜레스테롤크기(nm)PDI제타 전위 (mV)봉입 효율 (EE, %)약물 부하량 (DL, %)
5%206.27±1.140.240±0.004-42.72±0.2664.09±1.3010.68±0.22
10%183.87±2.540.149±0.004-24.80±1.0464.70±0.3010.78±0.05
15%202.06±3.160.131±0.007-27.90±1.0465.11±1.6210.85±0.27
20%185.41±0.720.164±0.044-37.74±1.4468.54±2.1911.42±0.37
25%181.58±1.310.100±0.008-19.96±0.1649.38±2.528.23±0.42
30%178.78±0.820.074±0.014-40.25±0.3348.24±2.068.04±0.34 

표 5: 리팜피신-함유 리포좀의 물리화학적 특성. 서로 다른 콜레스테롤 함량으로 제조된 리포좀의 입자 크기, 다분산 지수(PDI), 제타 전위, 봉입 효율(EE) 및 약물 적재량(DL). 데이터는 평균 ± 표준편차(n = 3)로 표시됨.

1일4일30일 
크기(nm)183.87±2.54212.42±3.12273.57±4.38
다분산 지수 (PDI)0.149±0.0040.106±0.0020.126±0.009
제타 전위(mV)-24.80±1.04-57.12±1.49-55.38±2.50

표 6: 4 °C에서 리팜피신 함유 리포좀의 저장 안정성. 4 °C에서 1일, 4일 및 30일 동안 저장한 후 리팜피신 함유 리포좀의 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위의 변화. 결과는 저장 중 리포좀 제형의 물리적 안정성을 평가하는 데 사용되었다.

토론

리팜피신(Rifampicin)은 결핵 1차 화학요법의 핵심 약물로 남아있으나, 용량 의존적 간독성, Mycobacterium tuberculosis (MTB)를 포함하는 대식세포로의 낮은 세포 내 침투력, 그리고 치료 하한치 미만의 노출 시 빠르게 나타나는 약물 내성으로 인해 임상적 유용성이 심각하게 제한되고 있습니다. 이러한 미충족 임상 수요를 해결하기 위해, 본 연구에서는 리팜피신 함유 리포좀 제조를 위한 초음파 처리 및 여과 과정이 결합된 견고한 박막 수화 프로토콜을 수립하고 최적화하였습니다. 최적화된 제형은 균일한 나노 규모의 입자 크기, 온전한 소포 형태, 높은 약물 봉입 효율 및 지속적인 in vitro 약물 방출 프로필을 나타냈으며, 동적 광산란법(DLS), 투과 전자 현미경(TEM), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 in vitro 용출 시험을 통해 포괄적인 물리화학적 특성 분석을 수행하였습니다.

여러 프로토콜 단계가 리포좀의 품질과 재현성에 결정적인 영향을 미칩니다. 첫째, 인지질 대비 콜레스테롤 비율이 매우 중요합니다. 최적의 80:20 비율에서는 EE = 68.5%, DL = 11.4%의 결과가 나타나며, 이를 75:25 또는 70:30으로 변경하면 다음과 같은 결과가 발생합니다. >30% EE 손실. 10만 분의 1 정밀도를 가진 저울을 이용한 정밀한 무게 측정은 필수적입니다. 둘째, 수화(섹션 1.6) 100rpm으로 회전시켜야 함 rpm, 37 °C 1을 위해 진공 상태가 아닌 회전 증발기(rotary evaporator)에서 h 시간 동안 처리합니다. 정적 배양이나 수동 흔들기는 재현성이 떨어지는 결과로 이어집니다. 셋째, 초음파 처리(section 1.7): 40 kHz, 100 W, 10 37°C에서 최소 분 °C Z-평균값 185를 얻습니다. nm 및 PDI < 0.2. 짧은 초음파 처리 (5 분)의 수율은 >300 nm 및 PDI > 0.3; 더 긴 초음파 처리 (20 분)은 약물 분해의 위험이 있습니다. 37도를 유지하십시오. °C 리팜피신(rifampicin)은 열에 민감하기 때문입니다. 넷째, 순차 여과(0.45 µm 그다음 0.22 µm), PBS로 필터를 미리 적신 후 가볍게 한 번만 통과시키십시오. 건조한 필터에 강제로 밀어 넣거나 작은 주사기를 사용하면 소포가 파열될 수 있습니다. 다섯째, EE를 위한 초미세여과(섹션 2.1–2.3): 정확히 200 µL, 7,000rpm에서 4회 반복 × g, 25 °C각 주기 후에 모든 여과액을 수집하고 통합합니다. 불완전한 주기는 포집 효율(EE)을 과대평가하게 합니다. 여섯째, TEM 음성 염색(섹션 5.6): 2% 인텅스텐산, pH 7.0, 즉시 블로팅을 수행합니다. 지연되거나 pH가 맞지 않으면 소포가 붕괴됩니다. 이 여섯 단계를 일관되게 따르면 3회 반복 실험 간의 표준 편차가 낮음을 통해 확인할 수 있듯이, 수용 기준을 충족하는 리포좀을 얻을 수 있습니다.

콜레스테롤은 리포좀 이중층의 중요한 구조적 구성 요소이며, 막 유동성, 기계적 안정성 및 친유성 약물 보유력에 미치는 이중적 효과가 잘 입증되어 있습니다. 본 연구에서는 콜레스테롤 몰 비율이 제형 성능에 미치는 영향을 체계적으로 평가하였으며, 콜레스테롤 함량이 20%(질량비)일 때 최대 68.5%의 봉입 효율이 달성됨을 확인하였습니다. 이러한 최적 비율은 약물 누출을 최소화하기 위해 인지질 이중층의 정돈된 층상 구조를 유지하는 것과, 이중층의 소수성 코어 내에 친유성 rifampicin 분자를 수용하기 위해 충분한 막 유동성을 유지하는 것 사이의 균형을 맞춘 결과로 추정됩니다. 반대로, 콜레스테롤 함량이 20%를 초과하면 지질 이중층의 과도한 강직화와 규칙적인 층상 배열의 파괴가 일어나며, 결과적으로 봉입 효율과 약물 적재 용량이 모두 크게 감소하였습니다. 이러한 결과는 리포좀 막 공학에서 콜레스테롤의 역할에 대한 기존의 기전적 이해와 일치합니다. 따라서 높은 약물 적재량을 달성하기 위해서는 정밀한 지질 칭량(10만 분의 1 정밀 저울 사용)과 20% 콜레스테롤 질량비의 엄격한 준수가 필수적입니다.

최적화된 rifampicin 함유 리포좀은 평균 수력학적 직경 185 nm와 다분산 지수(PDI) 0.164 ± 0.044를 나타내어, 입자 크기 분포가 매우 균일함을 보여주었습니다. 이러한 나노 크기의 차원(< 200 nm)은 염증성 폐결핵 병변으로의 수동적 표적화를 위한 투과 및 유지 효과(EPR effect)와 호환될 뿐만 아니라, MTB의 주요 세포 내 서식지인 폐포 대식세포에 의한 효율적인 식세포 작용에 최적화되어 있습니다. 이러한 입자 크기 설계는 MTB 감염 대식세포 내에서 치료 농도에 도달하지 못하는 유리 rifampicin의 핵심적인 한계를 해결할 잠재력이 있습니다. 최적화된 제형의 -38 mV 제타 전위는 강한 입자 간 정전기적 반발력을 제공하여, 단기 보관 중 소포의 응집, 융합 및 침전물을 효과적으로 방지함으로써 우수한 콜로이드 안정성을 보장합니다. 특히, TEM으로 측정한 핵심 입자 크기가 DLS를 통해 얻은 수력학적 직경보다 작게 나타났는데, 이는 리포좀 특성 분석에서 잘 알려진 현상입니다. DLS는 주변의 수화층을 포함한 수화된 소포의 직경을 정량화하는 반면, TEM 이미징은 고진공 상태에서 탈수된 지질 코어를 포착하기 때문입니다. 따라서 이러한 차이는 특성 분석의 불일치가 아니라, 물리화학적으로 타당하고 예상된 결과입니다.

TEM 이미징을 통해 최적화된 리포좀의 형태학적 특성을 추가로 검증하였으며, 그 결과 대부분 균일하고 구형이며 온전한 단일층 소포(unilamellar vesicles) 형태를 띠고 있었고, 국소적인 응집은 소량 관찰되었으나 뚜렷한 융합이나 막 파열은 나타나지 않았습니다. 이러한 결과는 초음파 처리와 여과 공정의 결합이 리포좀 이중층의 구조적 무결성을 유지하면서 소포의 형태와 층상 구조를 정밀하게 제어할 수 있음을 확인시켜 줍니다. 구조적 무결성은 보관 중 약물 유지력, 체내 순환 안정성 및 표적 전달 효율과 직접적인 상관관계가 있으므로 리포좀 제형의 핵심 품질 특성입니다. 또한, 리포좀 현탁액에서 관찰된 뚜렷한 틴들 효과(Tyndall effect)는 나노 규모 소포 분산액의 콜로이드 특성을 더욱 뒷받침하였습니다.

인 비트로(in vitro) 약물 방출 연구 결과, 최적화된 rifampicin 함유 리포좀은 초기 0.5 h 이내에 유의미한 초기 급격한 방출(burst release)을 보이지 않았으며, 이는 유리 rifampicin의 급격한 최고 혈장 농도와 관련된 급성 전신 독성 위험을 완화하는 핵심적인 특성입니다. 약물 방출 속도론 모델링 결과, 방출 프로파일은 1차 속도론 모델에 가장 잘 부합하는 것으로 나타났으며, 이는 리포좀 이중층으로부터의 rifampicin 방출이 지질 매트릭스의 침식보다는 주로 수동 확산에 의해 지배됨을 시사합니다. 이러한 확산 제어형 서방형 방출 패턴은 유효 치료 약물 농도를 장기간 유지할 수 있게 하여, 약제 내성의 출현을 유도하는 치료 수준 미달의 노출 위험을 줄여주므로 항결핵 치료에 매우 바람직합니다. 24 h 이후 누적 약물 방출량이 약간 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 수성 방출 매질 내에서 캡슐화되지 않은 rifampicin의 산화 및 가수분해 분해에 기인한 것일 가능성이 높으며, 이러한 결과는 수성 환경에서의 rifampicin 안정성에 대해 이전에 발표된 데이터38와 일치합니다. 중요한 점은, 리포좀 이중층이 캡슐화된 약물에 보호 미세환경을 제공하여 유리 rifampicin에 비해 분해 조건에 대한 노출을 줄여준다는 것입니다.

본 연구에서 개발된 최적화된 리팜피신 함유 리포좀 제형은 기존 리팜피신 화학요법의 주요 한계점을 직접적으로 해결하여 결핵 치료에 있어 여러 가지 뚜렷한 장점을 제공합니다. 첫째, 리포좀 이중층은 수성 및 생물학적 환경에서 약물이 조기에 분해되는 것을 막아주는 보호 장벽 역할을 하여 리팜피신의 항균 활성을 유지합니다. 둘째, 지속적인 확산 제어 방출 프로파일은 약물의 전신 순환 반감기를 연장시켜 투여 빈도를 줄이고 환자의 치료 순응도를 향상시키는데, 이는 장기 결핵 화학요법의 주요 과제입니다. 셋째, 최적화된 나노 크기의 입자 사이즈는 EPR 효과를 통해 염증성 결핵 병변으로의 수동적 표적화를 용이하게 하며, MTB 감염 대식세포에 의한 효율적인 섭취를 가능케 하여 유리 리팜피신으로는 도달할 수 없는 높은 세포 내 약물 농도를 달성합니다39,40. 마지막으로, 이 제형은 생체 적합성이 있는 천연 유래 인지질과 콜레스테롤로 구성되어 운반체 자체로 인한 면역원성이나 전신 독성 위험을 최소화합니다.

특히, 본 연구에는 향후 연구에서 다루어야 할 몇 가지 한계점이 있습니다. in vitro 물리화학적 특성 분석 및 방출 프로파일링을 통해 유망한 제형 성능을 입증하였으나, 관련 동물 모델에서 rifampicin-loaded liposomes의 약동학적 거동, 조직 분포, 항결핵 효능 및 전신 독성을 평가하기 위한 추가적인 in vivo 연구가 필요합니다. 또한, 최적화된 제조 프로토콜의 산업 규모 생산을 위한 확장성(scalability)에 대해서는 추가적인 검증이 필요합니다.

결론적으로, 본 연구는 리팜피신(rifampicin) 함유 리포좀 제조를 위한 단순하고 재현성이 높으며 견고한 박막 수화-초음파 처리-여과 프로토콜을 수립하였습니다. 체계적인 제형 최적화를 통해 캡슐화 효율과 막 안정성을 결정하는 콜레스테롤 함량의 결정적인 역할을 확인하였으며, 최적화된 제형은 이상적인 물리화학적 특성, 높은 약물 캡슐화 효율, 우수한 콜로이드 안정성 및 조절된 지속적 인 비트로(in vitro) 약물 방출 특성을 나타냈습니다. 이 표준화된 프로토콜은 리포좀 기반 항결핵제 약물 전달 시스템의 개발 및 특성 분석을 위한 신뢰할 수 있는 방법론적 틀을 제공하며, 약물 감수성 및 약물 내성 결핵 치료를 위한 리포좀 리팜피신의 후속 전임상 평가를 위한 견고한 토대를 마련하였습니다.

공개 사항

저자들은 공개해야 할 이해상충 사항이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, No. 21977019)의 지원을 받았습니다.

재료

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L-α-포스파티딜콜린 (대두)RHAWNR024502≥순도 90%, 25g/병, CAS: 97281-47-5
1× PBS 완충액SolarbioP1038500 mL, 0.01 mol/L, pH 6.5
1× PBS 완충액, pH 7.4ThermoFisher Scientific (Gibco)C10010500BT-1500 mL, pH 7.4
클로로포름광저우 브랜드GD10-AR-2.5L분석 시약급(AR grade), 500 mL/병, CAS: 67-66-3
콜레스테롤알라딘C104028-5g AR 등급, ≥95% (HPLC), 병당 5 g, CAS 57-88-5
투석막 (MD25, 7000 Da)SolarbioYA1081-5m7000 Da MWCO, 길이 5 m, 비금속 재질
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템, LC-20AShimadzu Corporation, 일본LC-20A본 시스템은 SPD-20A UV 검출기, CBM-20A 4원 펌프, LC-20AT 온라인 탈기장치, SIL-20A 자동 시료 주입기, CTO-20A 컬럼 오븐 및 LC-solution 워크스테이션 소프트웨어로 구성되어 있으며, 리팜피신(rifampicin)의 정량 분석에 사용되었습니다.
고속 데스크탑 원심분리기상하이 안팅 과학기기 공장TGL-16B시료의 원심분리에 사용됨
L-아스코르브산MacklinA800296순도 99.99%, 100 g/병, CAS: 50-81-7
Omni 입자 크기 및 제타 전위 분석기Brookhaven Instruments Corporation, USA173PI리포좀의 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위 측정에 사용됨
리팜피신매클린R817237순도 97%, 병당 250 mg, CAS: 13292-46-1
투과전자현미경 (TEM)Hitachi, Ltd., 일본HT7700리포좀의 형태학적 관찰에 사용됨
Tween 80에너지 화학E0807391000-A01분석용 등급(AR grade), 100 mL/병, CAS: 9005-65-6
초여과 원심분리 필터 유닛 (0.5 mL, 3 kDa)Merck MilliporeUFC5003963 kDa MWCO, 0.5 mL 용량, 플라스틱 재질

참고문헌

  1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2025. Geneva: World Health Organization; 2025.
  2. Wei X, Yue L, Zhao B, Jiang N, Lei H, Zhai X. Recent advances and challenges of revolutionizing drug-resistant tuberculosis treatment. Eur J Med Chem. 2024;277:116785.
  3. World Health Organization. Consolidated guidelines on tuberculosis: module 4: treatment and care. Geneva: World Health Organization; 2022.
  4. Singh V. Tuberculosis treatment-shortening. Drug Discov Today. 2024;29(5):103955.
  5. Li SY, et al. Next-generation diarylquinolines improve sterilizing activity of regimens with pretomanid and the novel oxazolidinone TBI-223 in a mouse tuberculosis model. Antimicrob Agents Chemother. 2023;67(4).
  6. Timm J, et al. Baseline and acquired resistance to bedaquiline, linezolid and pretomanid, and impact on treatment outcomes in four tuberculosis clinical trials containing pretomanid. PLOS Glob Public Health. 2023;3(10).
  7. Chesov E, et al. Emergence of bedaquiline resistance in a high tuberculosis burden country. Eur Respir J. 2022;59(3):2100621.
  8. Dhillon J, Mitchison DA. Activity and penetration of antituberculosis drugs in mouse peritoneal macrophages infected with Mycobacterium microti OV254. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33(8):1255-9.
  9. Ge Z, Wang Z, Wei M. Measurement of the concentration of three antituberculosis drugs in the focus of spinal tuberculosis. Eur Spine J. 2008;17(11):1482-7.
  10. Parbhoo T, Schurz H, Mouton JM, Sampson SL. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in response to infection burden and host-induced stressors. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:981827.
  11. Sarathy JP, et al. Prediction of drug penetration in tuberculosis lesions. ACS Infect Dis. 2016;2(8):552-63.
  12. Fountain FF, Tolley EA, Jacobs AR, Self TH. Rifampin hepatotoxicity associated with treatment of latent tuberculosis infection. Am J Med Sci. 2009;337(5):317-20.
  13. Chen X, et al. Acquired resistance during short-course treatment for rifampicin-resistant tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2026;32(2):315-22.
  14. Singh V, Chibale K. Strategies to combat multi-drug resistance in tuberculosis. Acc Chem Res. 2021;54(10):2361-76.
  15. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. Int J Antimicrob Agents. 2000;13:155-68.
  16. Drulis-Kawa Z, Dorotkiewicz-Jach A. Liposomes as delivery systems for antibiotics. Int J Pharm. 2010;387(1-2):187-98.
  17. Singh SR, et al. Advancing tuberculosis chemotherapy: targeted nanomedicines for the mycobacterium TB granuloma. Small. 2025;21(49).
  18. Ferreira M, et al. Liposomes as antibiotic delivery systems: a promising nanotechnological strategy against antimicrobial resistance. Molecules. 2021;26(7):2047.
  19. Zweijpfenning SMH, et al. Safety and outcomes of amikacin liposome inhalation suspension for Mycobacterium abscessus pulmonary disease: a NTM-NET study. Chest. 2022;162(1):76-81.
  20. Allen TM, Cullis PR. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(1):36-48.
  21. Truzzi E, et al. Drugs/lamellae interface influences the inner structure of double-loaded liposomes for inhaled anti-TB therapy: an in-depth small-angle neutron scattering investigation. J Colloid Interface Sci. 2019;541:399-406.
  22. U.S. Food and Drug Administration. ARIKAYCE (amikacin liposome inhalation suspension) [prescribing information]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2018.
  23. Yıldırım M, Düzgüneş N. Liposome-encapsulated antibiotics for the therapy of mycobacterial infections. Antibiotics (Basel). 2025;14(7):728.
  24. Yun Y, et al. Recent advances in functional lipid-based nanomedicines as drug carriers for organ-specific delivery. Nanoscale. 2025;17(13):7617-38.
  25. Farooque F, Mughees MM, Wasi M. Liposomes as drug delivery system: an updated review. J Drug Deliv Ther. 2021;11(5 Suppl):149-58.
  26. Wang Z, Liu L, Yin W, Liu Z, Shi L, Tang M. A novel drug delivery system: the encapsulation of naringenin in metal-organic frameworks into liposomes. AAPS PharmSciTech. 2021;22(2):61.
  27. Niu NK, et al. Preparation and characterization of HRZ triple anti-tuberculosis drugs/TGF-β1 siRNA nanoliposomes. Orthop J China. 2018;26(23):2177-82.
  28. Wang Y, et al. Formulation and pharmacokinetic evaluation of a paclitaxel nanosuspension for intravenous delivery. Int J Nanomedicine. 2011;6:1497-507.
  29. Mishra M, et al. Mycobacterial lipid-derived immunomodulatory drug-liposome conjugate eradicates endosome-localized mycobacteria. J Control Release. 2023;360:578-90.
  30. Yoshizawa Y, Kono Y, Ogawara KI, Kimura T, Higaki K. PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. Int J Pharm. 2011;412(1-2):132-41.
  31. Guo LN, et al. Liposome and exosome pre-treatment for transmission electron microscopy and morphological observation. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni. 2025;64(4):62-68.
  32. Crommelin DJA, van Bommel EMG. Stability of liposomes on storage: freeze dried, frozen or as an aqueous dispersion. Pharm Res. 1984;1(4):159-63.
  33. Wang F, et al. Nanoliposome-encapsulated brinzolamide-hydropropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: a potential therapeutic ocular drug-delivery system. Front Pharmacol. 2018;9:91.
  34. Ubhe AS. Imaging of liposomes by negative-stain transmission electron microscopy and cryo-transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 2023;2633:245-51.
  35. Filippov SK, et al. Dynamic light scattering and transmission electron microscopy in drug delivery: a roadmap for correct characterization of nanoparticles and interpretation of results. Mater Horiz. 2023;10:2023-42.
  36. Wallenwein CM, et al. How wound environments trigger the release from rifampicin-loaded liposomes. Int J Pharm. 2023;633:122606.
  37. Forte J, et al. Mucoadhesive rifampicin-liposomes for the treatment of pulmonary infection by Mycobacterium abscessus: chitosan or ε-poly-L-lysine decoration. Biomolecules. 2023;13(6):924.
  38. Sorokoumova GM, et al. Bacteriostatic activity and decomposition products of rifampicin in aqueous solution and liposomal composition. Pharm Chem J. 2008;42:475-8.
  39. Fenaroli F, et al. Enhanced permeability and retention-like extravasation of nanoparticles from the vasculature into tuberculosis granulomas in zebrafish and mouse models. ACS Nano. 2018;12(8):8646-61.
  40. Hamed A, Osman R, Al-Jamal KT, Holayel SM, Geneidi AS. Enhanced antitubercular activity, alveolar deposition and macrophage uptake of mannosylated stable nanoliposomes. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:513-23.

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