미세아교세포에서 타우 클리어런스의 시간 측정을 위한 분할-루시페라제 보완 분석법

요약

마이크로플레이트 기반 발광 시스템을 사용하여 인간 유도 다능 줄기세포(iPSC) 유래 미세아세포에서 세포외 타우의 제거를 측정하는 민감하고 시간 분해 정량적 플랫폼을 기술합니다. 이 접근법은 마이크로웰 형식에서 타우 열화 동역학을 민감하게 검출할 수 있게 하여, 다양한 실험 조건에서 타우 처리에 대한 고처리량 조사를 가능하게 합니다.

초록

중추신경계의 상주 면역 세포인 미세아교세포는 뇌 항상성의 중심 조절자이자 신경퇴행성 질환의 주요 매개체입니다. 이 세포들은 신경 환경을 지속적으로 조사하며, 병리적 타우와 같은 잘못 접히고 응집된 단백질을 포함한 세포외 기질의 인식, 내화, 분해에 중요한 역할을 합니다. 미세아교세포가 타우 제거에 연관된다는 증거가 늘고 있음에도 불구하고, 타우 흡수 및 분해를 측정하는 기존 방법들은 이러한 동적 과정을 완전히 포착할 시간적 해상도와 민감도를 갖추지 못하고 있습니다. 여기서 우리는 인간 유도 다능줄기세포(iPSC) 유래 미세아교세포에서 타우 제거율을 정량적으로 모니터링하기 위한 발광 기반 분석법을 개발했습니다. 이 플랫폼은 분할 루시퍼레이스 기반 상보화 시스템을 활용하여 살아있는 세포 내 tau를 매우 민감하고 실시간으로 검출할 수 있게 하여 세포 내 처리를 정밀하게 추적할 수 있게 합니다. 이 검사법은 여러 세포 유형에 걸쳐 확장 가능하고 적응 가능하며, 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질환에서 내성소좀체 경로와 타우 처리를 조절하는 세포 메커니즘을 조사하는 다목적 도구를 제공합니다.

서론

알츠하이머병(AD)을 포함한 타우오병은 미세소관 관련 단백질 타우가 신경 회로를 통해 집집하고 확산되는 것이 특징입니다 ^1,2. 글리아는 타우 질환의 역학, 즉 흡수, 분해^{, 확산} 조절자로서 점점 더 주목받고 있습니다. 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. 교세포가 타우오파증에 어떻게 기여하는지 이해하는 것은 신경염증과 타우 전이 등 주요 질병 역학을 해결하는 데 있어 시급한 과제입니다. 교세포 집단 중에서 미세아교세포인 미세아세포는 타우 제거를 매개하는 독특한 위치에 있습니다.

미세아교세포에서 타우 처리 메커니즘을 밝힐 긴급한 필요가 있음에도 불구하고, 이 분야는 여전히 사용 가능한 분석법의 해상도와 처리량에 한계가 있습니다. 타우 내화, 세포 내 운송, 세포 정규화에 관한 주요 질문들은 아직 해결되지 않았습니다. 이 각 단계는 기전적으로 구분되는 과정을 나타냅니다: 흡수는 세포외 타우가 원형질막에서 내화되는 것을 의미하며; 운송은 내체, 리소솜 및 기타 세포 내 구획을 통해 내화된 타우를 분류하고 운반하는 것을 포함합니다; 그리고 분해는 주로 리소좀 및 프로테아좀 경로를 통해 타우의 단백질 분해를 의미합니다. 이러한 단계는 세포 외 타우 처리에 있어 연속적이지만, 내부화된 타우는 분해 메커니즘에 도달하기 전에 세포 내 구획을 통과해야 하므로 독립적으로 조절되며, 특정 실험적 교란이 한 단계에는 영향을 미치지 않고 다른 단계에는 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 세포 내 타우 신호의 감소는 흡수 저하, 분해 구획에서 오해, 또는 열화 증가를 반영할 수 있습니다. 이러한 과정을 해결하려면 단백질 존재를 감지하고 기존 측정과 결합하여 시간에 따른 단백질 운명을 결정할 수 있는 새로운 분석 플랫폼이 필요합니다.

현재 타우 내화와 분해를 해결하는 방법은 면역세포화학, 유세포분석, 서부 블롯팅, 형광 표지 접근법을 활용하여 타우 종 13,14,15,16,17,18의 흡수, 세포 내 위치 및 세포 내 처리를 정량화합니다. 그러나 이러한 접근법들은 단백질 클리어런스 역학 연구에 적용할 때 근본적인 한계를 가지고 있습니다. 면역세포화학과 서부 블롯팅은 저품도 타우 종을 감지할 민감도가 부족하며, 작업이 많이 소요됩니다. 유동세포분석과 형광 기반 분석법은 접합 단백질이 분해된 후에도 형광체가 남아 있을 수 있기 때문에, 단백질 클리어런스를 충실히 보고하지 못합니다. 이로 인해 형광 신호가 관심 단백질의 실제 운명과 분리됩니다. 이러한 제약들은 중요한 공백을 남기며, 타우 클리어런스 역학을 정량적으로 추적하는 데 필요한 민감도, 시간적 해상도, 확장성을 동시에 제공하는 기존의 방법은 없습니다. 따라서 미세아교세포에서 타우 처리 역학을 이해하는 데 있어 큰 장애물은 살아있는 세포에서 타우 클리어런스를 측정할 수 있는 정량적이고 시간 측정이 빠른 고처리량 분석법의 부재였습니다.

실시간 타우 역학을 모니터링할 정량적 플랫폼의 부족을 해결하기 위해, 우리는 세포 내 타우 단백질 역학을 감지할 수 있는 민감한 발광 기반 분석법을 개발했습니다. 이 접근법은 작은 펩타이드 태그(High Affinity Binary Technology, HiBiT)를 타우와 융합하여 살아있는 세포에서 동역학적 측정을 가능하게 하는 분할 루시퍼레이스 기반 상보화 시스템을 사용합니다. 상보적 결합 파트너(Large Binary Technology 또는 LgBiT)와 상호작용하면, 태그된 단백질은 활성 루시퍼라제 효소를 재구성하여 정량적인 생물발광 신호^20,21,22를 생성합니다. 이 발광 신호는 단백질 풍부도를 직접적이고 민감한 판독을 제공하여 시간에 따른 세포 내 농도 변화를 동적으로 추적할 수 있게 합니다. 따라서 발광은 세포 내 분해의 경우처럼 단백질의 존재 또는 손실을 강력하게 보고하는 도구로 활용될 수 있습니다. 이 플랫폼은 함께 tau(타우) 처리의 정밀하고 시간적으로 해소된 측정을 가능하게 하며, 단백질 교체 연구를 위한 폭넓은 적용 가능한 전략을 제공합니다.

프로토콜

모든 세포 실험은 매사추세츠 대학교 애머스트 캠퍼스 환경 및 보건 서비스에서 승인한 적절한 생물안전 레벨 2 실험실에서 수행되었습니다.

1. Tau-SLP 단백질의 발현, 정제 및 내독소 제거

1. Tau의 구성 요소에 분할 루시퍼라제 펩타이드 또는 SLP 태그(VSGWRLFKKIS)를 부착하여 Gibson assembly²³과 같은 표준 클로닝 방법을 사용하여 태그된 구조물(Tau-SLP)을 생성합니다.
   참고: 분할 루시퍼라제 펩타이드 태그의 상보화는 2N4R^{Tau 24}의 C-말단, N-말단, 또는 내부 도메인에 배치되었을 때 강력한 신호를 생성합니다.
2. 앞서 설명^{한 방법으로} Tau-SLP를 발현 및 정^제하고, SDS-PAGE와 면역블롯팅을 사용하여 순도를 보장합니다.
3. 미세아교세포에 사용할 경우, Tau-SLP 정제 후 박테리아 내독소를 제거하는 공개된 프로토콜을 따라, 교란 반응성을 제한해야²⁷.
4. 표준 비신코닉산 분석법(BCA) 또는 브래드포드 분석법^28,29를 사용하여 Tau-SLP 단백질 농도를 정량합니다.
5. 원한다면 앞서 설명한 프로토콜²⁴에 따라 Tau-SLP를 집계할 수 있습니다.
6. 제조사의 지침에 따라 시판 중인 루시퍼라제 기질과 상보 시약을 사용하여 표준 곡선을 생성하여 Tau-SLP의 기능적 발광을 검증합니다(재료 표 참조).

2. iPSC 유래 미세아리아(iTF-미세글리아) 배양

1. 적절한 배양지에서 5%_CO2 에서 미세아교세포를 37°C에서 배양합니다.
2. 검증된 프로토콜³⁰(재료표 참조)을 사용하여 6개의 독시사이클린 유도 전사인자를 보유한 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 계통을 분화하여 미소교세포(유도 전사인자 미세교세포 유사, iTF-미세아교세포)를 생성합니다(재료표 참조).
   참고: 이 검사법은 iTF-미세아리아에만 국한되지 않으며 모든 부착 세포주에 사용할 수 있습니다. 다른 세포주와 함께 작업할 때는 제거 시간 최적화가 필요할 수 있습니다.

3. 타우 정화 분석법

1. 24웰 플레이트에 1 x 10⁵ 셀 밀도로 각 조건별로 3배 배양액(250 μL)과 함께 배양지를 배양하고, 37 °C와 5%_CO2 에서 하룻밤 배양합니다(그림 1A).
2. 배양지를 제거하고, PBS(250 μL)로 세포를 한 번 세척한 후 250 μL 배양 배양액으로 교체합니다.
3. Tau-SLP 클리어런스를 시간적으로 측정하려면, 모든 웰이 동시에 채취되도록 셀을 단계적으로 노출시키고, 클리어런스 시간만 차이가 나도록 한다. 예를 들어, 0 h, 2 h, 4 h 클리어런스 그룹의 경우, 먼저 4 h 그룹에 100 nM Tau-SLP 함유 매지를 추가하고, 그 다음 1시간 후에 2h 그룹에, 마지막으로 1시간 후에 0 h 그룹에 추가합니다(타이밍 권장은 그림 1B 참조). 최종 내화기가 완료되면 모든 웰은 동일한 Tau-SLP 노출 기간을 거치지만, 다만 정규 기간만 다릅니다(그림 1B).
4. 배경 감산을 위해 Tau-SLP 처리를 받지 않은 우물도 포함합니다(그림 1C).
5. 내화기가 끝나면 Tau-SLP 함유 배지를 제거합니다. 세포를 PBS로 세 번 세척하여 세포외 Tau-SLP를 제거하고 Tau-SLP 없는 배양 배양액으로 교체합니다.
6. 지정된 클리어런스 기간 동안 세포를 배양하세요(그림 1A). 0시간 클리어런스 그룹은 내부 추출 단계 시작 시 내화된 Tau-SLP의 총 양을 나타냅니다.
7. 모든 정화 시점 후, 웰에서 매체를 제거하고 250μL PBS로 세척합니다.
8. 각 웰에 250 μL 트립신-EDTA 0.25%를 37 °C에서 5분간 처리합니다. 이 단계는 표면에 부착된 타우를 제거하여 발광이 내부화된 타우-SLP를 반사하도록 합니다. 각 웰을 250 μL 트립신 억제제(5 mg/mL)로 중화시킵니다.
9. 각 웰을 적절히 라벨링된 1.5 mL 마이크로 원심분리관과 펠릿에 원심분리(500 x g, 5분)로 수집합니다.
10. 루시페라제 기질과 상보화 성분을 포함한 적절한 양의 용해 버퍼를 준비하세요(재료 표 참조; 50 μL x # 웰 + 10%) 참조.
11. 흡인용 피펫으로 각 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 루시퍼라제 기질과 상보 성분이 포함된 50 μL 용해 완충제에 재현탁합니다. 이로 인해 분할 루시퍼라제 상보화 복합체가 생성되어 발광이 발생합니다(그림 1D).
12. 용해된 세포를 흰색 반 부피 96웰 플레이트에 옮깁니다.
13. 마이크로플레이트 리더기에서 실온(~23 °C)에서 10초간 궤도 흔들면서 발광을 측정하여 세포 펠릿의 완전한 용해를 보장합니다.
14. 먼저 Tau-SLP에 노출되지 않은 웰에서 얻은 평균 발광 값을 빼서 정규화된 Tau-SLP 풍부도를 결정합니다. 각 값을 0 시간 간격 그룹의 평균 배경 뺀 신호로 정규화합니다.
15. 플롯은 Tau-SLP 풍부도를 클리어런스 시간에 따라 정규화했습니다. 발광이 점진적으로 감소하면 세포 내 Tau-SLP 풍부도가 감소함을 나타내며 Tau-SLP 클리어런스로 해석되고, 안정적인 발광 값은 손상되거나 지연된 클리어런스를 나타냅니다. 퍼센트 클리어런스를 다음과 같이 계산합니다: % 클리어런스 = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

결과

이 민감한 발광 기반 분석법을 사용하여, 인간 iPSC 유래 미세아교세포에서 동기화된 흡수 기간 후 세포 내 Tau-SLP 풍부도를 시간에 따라 모니터링할 수 있습니다. Tau-SLP 세척 후에는 발광이 꾸준히 감소하여 세포 내 Tau-SLP 제거와 일치합니다. 이 플랫폼은 미세아교세포에 의한 단량체 및 섬유형 Tau-SLP 종의 취급 차이를 감지할 만큼 충분히 민감했습니다. iTF-미크글리아에서 단량체 Tau-SLP는 60분 이내에 완전히 제거되었고, 섬유형 Tau-SLP는 240분 이상 지속되었습니다(그림 2A). 또한, 돌연변이 타우(예: N279K)를 이용한 분석으로 통과 속도 반응학을 평가했으며, TauN279K-SLP는 단기간(15분) 동안에만 유의미하게 감소한 통과 속도를 보였습니다(그림 2B). 이러한 결과는 관찰된 열화가 이 분석의 높은 민감성 때문에만 뚜렷하게 드러날 수 있음을 시사합니다. 우리는 소분자 L-류실-L-류신 메틸 에스터(LLOMe)를 사용하여 타우-SLP 분해 실험을 수행하여 리소좀 관여를 확인했습니다. LLOMe는 리소좀 막을 투과시키고 리소^{좀 활성을} 방해하는 카텝신 C 기질입니다. LLOMe 처리 시, t=0에서 Tau-SLP 수치가 유의미하게 증가하고(그림 3A), 분해율이 유의미하게 감소했으며(그림 3B), 60분 후 Tau-SLP가 4배 증가하는 모습을 관찰했습니다. 마지막으로, 우리는 세포 유형 간 적합성을 확인하기 위해 iPSC 유래 뉴런에서 Tau-SLP 클리어런스 검사를 수행했습니다. 여기서 우리는 iPSC 유래 뉴런이 Tau-SLP의 단량체(그림 4A)와 섬유 형태(그림 4B) 모두에서 클리어런스 동역학이 감소함을 발견했습니다. 특히 Tau-SLP 섬유 수치는 240분 이상 유지되면서 ~100%로 안정적으로 유지되는 반면, 같은 기간 동안 iTF-마이크로글리아에서는 Tau-SLP 섬유 수치가 50% 이하로 떨어졌습니다. 이 결과는 우리의 분할 루시퍼레이스 기반 상보화 플랫폼이 Tau-SLP의 세포 내 내도소소좀 제거를 견고하고 신뢰할 수 있게 검출하며, 다양한 단백질이나 세포 유형에 적용할 수 있는 매우 유연한 분석 설계임을 보여줍니다.

그림 1: Tau-SLP 클리어런스 분석의 대표적 실험 설계. (A) 이 분석에 사용된 iTF-미세아리아의 대표적인 밝시야 이미지(스케일 바 = 100μm) (B) 인간 미세아교세포(iTF-미세아교세포)는 재조합 2N4R-SLP에 단계적으로 노출되어 견고한 발광 기반 검출을 가능하게 합니다. 1시간의 배양 후, 배지 교환을 통해 세포외 타우를 제거하고 PBS로 세포를 세척합니다. 세포는 수확 전 각각의 제거 기간(0시간, 2시간, 4시간) 동안 기저 배지에 유지됩니다. 종말점에서 세포를 용해시키고 발광을 측정합니다. (C) 단량체와 섬유 분해를 비교하는 Tau-SLP 클리어런스 측정을 위한 제안된 판 설계. (D) Tau-SLP 단백질이 세포 내화되어 리소좀 분해를 위해 경로화됩니다. LgBiT의 첨가는 상보화와 발광 생성을 통해 세포 내에 남아 있는 Tau-SLP의 양을 정량적으로 측정할 수 있게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: iTF-미크글리아가 제거한 세포외 Tau-SLP. (A) iTF-미크로아리아는 단량체 Tau-SLP(100nM) 또는 섬유형 Tau-SLP(50nM)에 노출되었고, 샘플은 각각 초기 흡수(t = 0; 100%)와 Tau-SLP에 노출되지 않은 세포(0%)에 대해 정규화되었습니다(평균 ± SD; 세 가지 독립 분화 중 n = 9). (B) iTF-미세아리아는 단량체 Tau-SLP 또는 TauN279K-SLP(100nM)와 함께 인큐베이션되었고, 샘플은 각각 초기 흡수율(t = 0; 100%)와 Tau-SLP에 노출되지 않은 세포(평균 ± SD; 세 가지 독립적인 미분에서 나온 n ≥ 7; ∗ p< 0.05를 무쌍 웰치 t-검정을 사용했다). 데이터는 Shultz 등, 2025²⁴쪽에서 재인용되었으며, 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY 4.0) 라이선스 하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 리소좀 억제가 Tau-SLP 클리어런스를 저해한다. (A) 1mM 리소좀 억제제 L-루실-L-류신 메틸 에스터(LLOMe)로 24시간 동안 치료를 받으면 H4 신경교세포에서 초기 Tau-SLP 흡수가 증가했습니다(t = 0) (평균 ± SD; n = 9개의 독립 배양; ∗ p < 0.05, 비상립 웰치 t-검정 사용 결과). (B) LLOMe(1mM) 치료를 24시간 동안 수행하면, 60분 이상 제거 시간(t = 60분) 후 정규화된 Tau-SLP RLU가 증가하였으며, 이는 차량(DMSO)과 비교했을 때입니다. 발광 신호는 각각 초기 흡수 수준(100%)과 Tau-SLP에 노출되지 않은 세포(0%)로 정규화됩니다(평균 ± SD; n = 9개의 독립 배양; ∗∗∗∗ p < 0.0001, ∗ p < 0.05, 비짝 Welch's t-검정 사용 시). 데이터는 Shultz 등, 2025²⁴쪽에서 재인용되었으며, 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY 4.0) 라이선스 하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: iTF-미세아세포와 iNeurons는 Tau-SLP 클리어런스에서 차이를 보인다. (A) iTF-미세아세포 또는 i뉴런은 단량체 Tau-SLP(100nM)와 함께 인큐베이팅되었고, 샘플은 각각 초기 흡수(t=0; 100%)와 Tau-SLP에 노출되지 않은 세포(0%)로 정규화되었습니다(평균±SD; n ≥ 6명, 2-3개의 독립 분화 중 n; ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001, 시간: F(1, 28) = 7.489, p = 0.0107; 세포 유형: F(1, 28) = 46.61, p < 0.0001; 상호작용: F(1, 28) = 3.229, p = 0.0831; 시닥의 다중 비교 검 정(p 값은 그림에 표시됨)과 t=0 값은 참고용으로 제시되었으나 통계 분석에서는 제외되었습니다. (B) iTF-미크로아세포 또는 i뉴런은 섬유형 Tau-SLP(50nM)와 함께 배양하였고, 샘플은 각각 초기 흡수율(t=0; 100%)와 Tau-SLP에 노출되지 않은 세포(0%) (평균±SD; n ≥ 6, 2방향 분화 ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001; 시간: F(1, 26) = 0.3888, p = 0.5384; 셀 유형: F(1, 26) = 43.09, p < 0.0001; 상호작용: F(1, 26) = 1.209, p = 0.2816; 시닥의 다중 비교 검 정(p 값은 그림에 표시됨)과 t=0 값은 참고용으로 제시되었으나 통계 분석에서는 제외되었습니다. 데이터는 Shultz 등, 2025²⁴쪽에서 재인용되었으며, 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY 4.0) 라이선스 하에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 분석법은 미세아교세포에 의한 세포 외 Tau-SLP 클리어런스를 높은 민감도와 시간 해상도로 측정할 수 있는 확장 가능하고 정량적인 플랫폼을 제공합니다. 전통적인 영상 기반 접근법은 종종 번거로운 샘플 처리가 필요하고 처리량과 시간 샘플링이 제한적이지만, 이 발광 기반 시스템은 마이크로플레이트 형식에서 타우 처리를 직접 집단 수준으로 정량화할 수 있게 합니다. 결과된 결과는 세포외 타우 노출 후 Tau-SLP 클리어런스를 정량적으로 측정할 수 있게 합니다. 측정이 여러 시점과 더 긴 잠복 기간을 통해 반복적으로 얻을 수 있기 때문에, 이 분석법은 tau의 흡수 및 제거 역학에 대한 고처리량, 동역학 분석을 가능하게 합니다. 또한, 시간에 따른 발광 변화는 세포 내 Tau-SLP 풍부도 변화와 일치하지만, 상완적 접근법 없이는 운송, 분해, 분비를 구분하지 못합니다. Tau-SLP 태깅이^{동반 연구에서} 타우의 흡수나 응집에 유의미한 변화를 보이지 않았으나, 외부 태그는 다른 단백질의 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 분석 결과는 직교 접근법을 사용해 보완하고, 가능한 경우 태그가 없는 타우 준비와 비교해야 합니다. 추가적인 제한은 이 검사가 내인성 타우나 환자 유래 병리학적 타우 집합체 대신 재조합 Tau-SLP 종을 사용한다는 점입니다. 재조합 2N4R tau는 재현 가능한 실험 기질을 제공하지만, 인간 환자 뇌에서 분리된 타우 종의 내인성 이질성(즉, 번역 후 변형)을 완전히 재현하지는 못합니다. 재조합 타우 단백질의 시험관 내 인산화를 위한 다양한 프로토콜이 존재하며, 이 작업 흐름에 쉽게 통합할 수 있습니다. 이 플랫폼은 내인성 타우 연구에도 적용될 수 있습니다; 이를 위해서는 유전공학을 통해 tau(MAPT) 유전자 좌위에 SLP 태그 서열을 통합해야 합니다.

중요한 점은, 신호 감소를 분해로 해석하는 것은 트립신화 또는 동등한 스트리핑 단계를 통해 세포외 및 표면 결합 타우의 효과적인 제거에 달려 있다는 것입니다. 효과적인 제거가 이루어지지 않으면 위음성이 발생할 수 있습니다. 타우 분해의 거짓 양성으로 해석될 수 있는 명백한 신호 손실도 가능합니다. 이는 세포 박리 또는 사멸, Tau-SLP 분비, 또는 단백질을 파괴하지 않고 SLP와 타우를 분리하는 단백질 분해 과정에서 발생할 수 있습니다. 따라서 발광 감소는 리소좀 분해의 직접적인 측정보다는 세포 내 Tau-SLP 풍부도 감소로 해석되어야 합니다. 신호 변화를 리소좀 분해에 더 명확히 귀속시키기 위해서는 직교 검증 전략이 권장됩니다. 여기에는 바필로마이신 A1 또는 LLOMe(그림 3)와 같은 리소좀 기능의 약리학적 교란, 그리고 흡수 및 분해 동역학을 구분하기 위한 펄스 체이스 실험 설계가 포함될 수 있습니다.

이 분석법의 유연성은 타우 흡수, 세포 내 수송, 분해를 조절하는 메커니즘을 조사하는 데 적합하며, 인간 세포 시스템에서 타우 제거를 조절하는 약리학적 또는 유전적 조절자를 선별하는 데에도 적합합니다. iPSC 유래 미세아교세포에서 입증되었지만, 이 플랫폼은 다른 세포 유형에도 쉽게 적응할 수 있어(그림 4), 알츠하이머병 및 기타 1차 및 2차 타오병을 포함한 타우 생물학 및 신경퇴행성 질환 모델 전반에 걸쳐 폭넓게 적용할 수 있습니다. 이 분석법은 Tau-SLP의 세포외 노출과 발광 기반 검출에 의존하기 때문에, 성상교세포, 희돌돌대교구 또는 일반적으로 사용되는 세포주에 쉽게 적응할 수 있으나, 흡수 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 접근법은 단백질 정상성에 관여하는 세포 경로를 해부하고 신경퇴행성 질환 과정에 대한 기전적 이해를 발전시키는 강력한 도구를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Doxycycline	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Graphing Software	GraphPad Prism (or similar)	n/a
Human GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Luminescent Plate Reader	SpectraMax i3x (or similar) - Molecular Devices	n/a
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, White	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
Recombinant Human IL-34	Thermo Scientific	200-34
Recombinant Human M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Recombinant Human TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012927
Tau-HiBiT protein	In house	n/a	Tau 단백질과 VSGWRLFKKIS 펩타이드 태그
Trypsin Inhibitor	Sigma Aldrich	T9128
Trypsin-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochloride	Bio-techne	1254