안정적인 파리 Stomoxys calcitrans의 유전자 변형을 위한 효율적인 사육 및 미세주입 프로토콜

Summary

이 프로토콜은 안정적인 파리 유전체에 외래 유전 물질을 통합하는 신뢰할 수 있는 배아 미세 주입 방법, 주사 후 배아 발달을 모니터링하는 형광 스크리닝 시스템, 그리고 대 장균 을 접종한 활성탄 보조 노른자 한천으로 구성된 유충 사육 기질을 설명하여 알에서 성체로의 발달을 지원합니다.

Abstract

마구간파리는 가축, 반려동물, 인간의 피를 먹이는 해충으로, 남극을 제외한 모든 대륙에서 발견됩니다. 수컷과 암컷 성체 모두의 고통스러운 물림은 가축에서 스트레스 관련 행동을 유발하여 체중 감소와 생산자들에게 상당한 경제적 손실을 초래합니다. 수컷과 암컷 마구간파리 모두 의무적인 혈액 먹이자이며, 이는 불임 곤충 퇴치 기술과 수컷의 대량 방사가 필요한 기타 해충 관리 전략에 도전이 됩니다. 현재의 안정적인 파리 해충 관리 전략은 파리 개체 수를 적절히 통제하지 못하는 경우가 많습니다. 모기, 초파리 및 기타 모델 곤충군에 대해 외부 유전 물질 도입이나 유전자 노크아웃 유도를 위한 수많은 유전적 조작 방법이 개발되었지만, 안정적인 파리의 유전적 변형 방법은 여전히 제한적입니다. 이 프로토콜은 피기백 전이사제의 과활성 변이와 배아 미세주입 후 유충 회복, 부화, 먹이 섭취, 형광 선별을 지원하는 새로운 고체 유충 사육 배지를 사용하여 안정적인 파리에 이래 유전 물질을 도입하는 신뢰할 수 있고 향상된 접근법을 설명합니다.

Introduction

안정파리(Stomoxys calcitrans L., 1758)는 경제적으로 중요한 해충이자^가축의 질병 매개체^{이며, 전}세계적으로 분포하고 있습니다. 통합 해충 관리(IPM) 전략은 안정적인 파리 개체수를 적절히 통제하지 ^{못하는 경우가} 많아 미국 내에서만 연간 손실이 20억 달러를 넘는 것으로 추정됩니다³. 또한, 유럽의 안정적인 파리 개체군에서 살충제 내성이 문서화되었으며 미국에서도 보고되었습니다. 따라서 불임 곤충 기법(SIT)과 유전자 드라이브 시스템과 같은 유전자 방제 접근법은 전통적인 IPM 프로그램에 바람직한 추가물이 됩니다.

안정파리에서 유전적 방제 방법을 개발하려는 이전 노력들, 특히 SIT에 대한 유전적 성별 구분 균주 생성은 선택적 번식과 방사선 유도 전위에 의존했다 ^7,8. 이러한 접근법은 노동 집약적이며 비형질전환 변형에 한정됩니다. 그 후, O'Brochta 등은⁹는 Hermes 전이체효소 시스템의 사용이 S. calcitrans에 형질전환유전자를 통합할 수 있음을 입증했다; 그러나 이 프로토콜은 형질전환 효율이 낮아 주입된 배아의 약 0.11%가 형질전환 자손을 생산했고, 외부 프로모터⁹의 제어 하에서 강화 녹색 형광 단백질(eGFP) 마커의 발현이 약했습니다.

CRISPR-Cas 시스템을 포함한 다른 유전적 조작 접근법은 안정적인 파리 배아의 탄력성 경유관을 뚫는 데 어려움이 있어 아직 안정파리에 널리 적용되지 않았습니다. 단단한 외부 융모막은 다른 muscid 파리들과 비교할 수 있습니다^10,11. 석영 바늘을 이용해 코리온을 주입하거나 양면 접착 테이프로 코리온을 제거하려는 시도는 실패했고, 이를 위해 알의 부화율을 낮추는 산화용액(3% 차아염소산나트륨, NaOCl)으로 처리해야 했습니다.

안정적인 파리는 실험실 조건에서 장기간 유지할 수 있으며, 미성숙 단계는 일반적으로 나무 조각, 밀 겨, 또는 질소원(송아지 단백질 보조제나 생선 플레이크 포함)을 첨가한 발효된 셀룰로오스 기질에서 사육됩니다¹². 그러나 이러한 기질은 미세 주입 배아를 키울 때 몇 가지 단점이 있습니다. 불투명성과 높은 자가형광률로 인해 부화 후 기질에 파고든 GFP 양성 유충을 식별하기 어렵습니다. 또한, 유충 생존을 위해 일부 박테리아의 존재가^{필요하지만,} 발효된 배지는 예측 불가능한 박테리아 및 곰균 군집을 도입하여 부화 전에 배아를 손상시키거나 섭취할 수 있습니다. 이러한 한계로 인해 이전에 설명한 주입 및 사^{육 방법을 사용한} 변형된 유충의 회수가 불가능해졌으며, 발달 과정 전반에 걸쳐 형광 선별을 가능하게 하는 보다 신뢰할 수 있는 주입 프로토콜의 필요성을 강조했습니다.

여기에는 전이체 선택, 주사 방법론, 스크리닝 및 배양 배지의 개선을 포함한 재현 가능한 미세주입 프로토콜을 제시합니다. 이러한 변형은 SIT, 유전자 드라이브, CRISPR-Cas 매개 유전자 노크아웃 등 유전적 성별 분류 균주를 위한 유전자 변형 안정파리 개발을 용이하게 합니다. 주요 개선점으로는 안정파리열충격단백질(HSP)83 촉진제의 조절 하에 과활성 피기백 전이효소¹⁴ 를 사용한 점, 주사 후 난체 손실을 최소화하기 위한 배아 건조, 그리고 배아 주입 시 접착 테이프와 할로카본 오일의 제거가 있습니다.

주입된 배아의 회수는 대량 육배지를 평평하고 색소가 풍부한 한천 플레이트로 대체하여 대장균 잔디를 접종함으로써 더욱 향상되었습니다. 이 한천 제형은 두 가지 주요 장점을 제공합니다. 첫째, 유충 발달을 위한 예측 가능한 단일유전자 박테리아 먹이원을 제공합니다. 둘째, 1세대(G0) 유충의 형태, 발달 및 GFP 발현을 관찰할 수 있도록 고대비, 저자가형광 배경을 제공합니다. 집파리와 마구간파리는 대장균에 접종된 노른자 기반 한천 판에서 정상적으로 발달하고 번데기가 됩니다^13,15. 여기서 설명하는 제형은 활성화탄 분말을 비반응성 식품 안전 첨가제로 포함하여 배경 형광을 더욱 줄입니다.

Protocol

모든 실험과 운영은 텍사스 A&M 기관 생물안전 위원회(프로토콜 IBC2019-081)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 시약, 화학물질 및 도구는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 알을 낳기 위한 파리 사육

1. 성체 케이지 준비
   1. 인큐베이터 챔버의 온도조절기를 28°C로 설정하고, 염화나트륨 3kg과 ~5L 수돗물을 10L 팬에 섞어 소금의 ~50%를 녹입니다.
   2. 이 노출된 염수판을 인큐베이터 챔버 바닥에 놓아 약 80% 습도를 유지하세요. 챔버나 방 안에서 16:8 주야간 주기를 유지하세요.
   3. 곤충 우리 바닥(30 x 30 x 30 cm 스테인리스 및 알루미늄 망사)에 종이 타월 두 겹을 깔고, 종이 타월 위에 45mL 일회용 조미료 컵을 과립 식탁용 설탕을 채우세요(그림 1A).
      참고: 종이 타월은 파리점을 흡수하는 데 도움을 주고, 설탕은 혈액 공급에 앞서 먹이원을 제공합니다.
   4. 250mL 크기의 그리핀 비커에 약 100mL의 상온 수돗물을 채우고, 20cm x 20cm 크기의 검은색 면 천(평범한 검은색 베개 커버나 침대 시트에서 잘라낸 것)을 물에 담아 천이 촉촉해질 때까지 넣으세요. 검은색 원단의 가장자리가 비커 가장자리에서 1-2cm 더 뻗어 나오도록 조정하세요(그림 1B).
      참고: 이 촉촉한 천은 성충 파리에게 액체 상태의 물과 산란 표면을 제공합니다. 성체가 수분원에 접근할 수 없으면 빠르게 사망할 수 있습니다.
   5. 500-1,500마리의 안정적인 파리 번데기를 작은 접시나 비커에 옮겨 곤충 우리에 넣으세요. 성충 우리를 습한 사육실(단계 1.1.1)에 넣고 매일 폐화를 관찰하세요. 성체가 나오면 시트탄이 포함된 소 혈액으로 매일 먹이를 주기 시작하세요(1.2절).
2. 성충 파리를 먹이기
   1. 신선하게 채취한 소 혈액에 최종 농도인 10.9 mM 삼중나트륨 시트레이트 이하이드레이트를 첨가하여 시팅된 소 혈액을 준비합니다.
   2. 간단히 말해, 최소 양의 탈이온수에 시트레이트 소금 ~12.8그램을 부탁하고, 지역 도살장에서 채취한 혈액 4리터에 추가하세요.
      참고: 혈액 용기는 나사로 덮인 뚜껑(예: 사각형, 넓은 입, 4L 그립 병)이어야 하며, 사용 전에 따뜻한 비누와 물로 철저히 세척해야 합니다. 도축장에서는 도살된 동물의 첫 ~1리터 소 혈액을 채취하지 않아 털, 땀, 먼지 및 기타 응고물질 오염을 최소화하세요.
   3. 200mL 알리코트에 냉동 시토화된 소 혈액을 넣고 필요에 따라 해동하며, 해동한 알리코트는 최대 일주일간 4°C에서 냉장 보관합니다.
   4. 각 성충 우리에 600마리당 상온 혈액 ~40mL를 공급하세요.
   5. 혈액은 양념 용기나 비이커에 담을 수 있으며, 접힌 비멸균 면 거즈 스펀지를 혈관에 삽입해 혈액을 흡수해야 합니다. 심지를 휘저어 면이 완전히 젖을 때까지 한 뒤 케이지에 넣으세요.
      참고: 혈전은 폐열 후 24시간부터 매일 혈액을 교체해야 합니다.
3. 알 수집
   1. 검은 면 직물에 달걀이 발견되면, 비커에서 천을 떼어내고 세척병을 사용해 ~700mL 얕은 플라스틱 용기에 달걀을 씻어냅니다(그림 2A). 산란은 보통 파리가 7-10일 되었을 때 이루어집니다.
      참고: 혈액 컵에서도 알이 있는지 확인하고, 그곳에 놓인 난자를 수거하세요.
   2. 진공 여과 를 통해 필터 페이퍼에 알을 채취하세요. 이는 검은색 여과지를 부크너 깔때기에 넣고 진공청소기를 적용한 후 1.3.1단계 의 계란을 설치 위에 부어 진행합니다.
   3. 그 후 세척병을 사용해 눈금이 있는 실린더나 1.7mL 미세원심분리관으로 알을 옮기고, 채취된 알의 양을 기록합니다(그림 2B).
      참고: 알을 물에 장시간 담그는 것을 피하세요. 담그는 후 1~분 후부터 사망률이 증가하기 시작합니다.
4. 벌크 유충 배지 준비
   1. 표 1에 설명된 대로 벌크 유충 배지를 위한 재료를 수집합니다(그림 3A).
   2. 1000mL 비커에는 송아지 단백질 보충제와 모든 수돗물을 넣으세요. 실온에서 하룻밤 동안 수분을 보충시키세요.
   3. 밀겨와 버미큘라이트를 별도의 더 큰 혼합용기에 넣으세요.
   4. 하룻밤 동안 다시 수분 공급한 후, 다시 수화한 송아지 보충제를 충분히 저어 뭉치를 부순 후, 밀겨와 버미큘라이트가 섞인 용기에 혼합물을 부어줍니다. 모든 밀겨가 송아지 보충제 슬러리로 코팅될 때까지 충분히 섞으세요.
   5. 벌크 매체를 용기 바닥 전체를 덮는 ~8cm 깊이의 폴리프로필렌 식품 저장 용기로 옮깁니다(그림 3B).
   6. 배아를 채취하여 ~1,000개의 배아(2.2L 벌크 배지당 약 0.2mL의 난자)를 추가합니다 .직경 90mm 원형 필터 페이퍼에 진공 여과한 후, 필터 페이퍼를 미디어 빈 중앙에 뒤집어 놓습니다(그림 3B, C).
   7. 필터 페이퍼를 ~1cm 두께의 매체로 덮어 수분을 유지하고(그림 3C), 용기 전체에는 큰 검은색 면직물 직사각형을 덮고, 용기 가장자리를 넘어 5cm 정도 걸린 면직물을 덮습니다.
   8. 음식 용기 뚜껑에 큰 구멍(~12cm)을 뚫어 가스 교환을 가능하게 하고, 뚜껑을 미디어 통에 딱 맞게 고정한 채 검은 면 천을 용기와 뚜껑 사이에 가둡니다(그림 3D).
      참고: 이 장치는 개스킷 역할을 하여 뚜껑과 용기 사이의 틈이 1^령 유충이 응결 방울 속에 갇히는 것을 방지합니다.
   9. 완성된 매체 통을 번데기가 될 때까지 성충 사육실에 넣고 유충 발달을 모니터링하세요(그림 4)(번데기는 매질 온도와 유충 밀도에 따라 ~10일 정도 소요됩니다).
      참고: 천 덮개는 1령 유충이 통과하지 못하도록 충분히 미세해야 하지만, 매체 내부 벽에 결로가 생겨 유충이 가려져 익사하지 않도록 충분히 투과되어야 합니다.
5. 번데기 분리
   1. 번데기 통에서 천을 벗기고 숟가락이나 스쿱으로 번데기를 채취하세요.
      참고: 안정된 파리 번데기는 이동성이 없는 적갈색 원통형으로 나타나며, 길이는 4-7mm이며, 이는 이동성 있는 노란-흰색 유충과 대조적입니다. 번데기는 보통 용기 벽 외곽이나 매체 통 내 습하고 높은 위치에 모여 있는데, 파리가 유충에서 번데기, 성충으로 변태하기 시작할 때입니다.
   2. 번데기를 500-1,500 cm 깊이 층으로 접시 위에 쌓고, 1.1절에 설명된 대로 새 깨끗한 우리에 넣어 다음 세대를 번식시키세요.

그림 1: 성충 파리 사육 재료. (A) 자당 컵(S)과 산란 컵(O)을 보여주는 성충 파리 사육 케이지. (B) 비커 가장자리를 약간 넘는 수분에 젖은 검은 면 천으로 준비된 산란 컵. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 알 채취. (A) 세척병을 이용해 산란 천에서 알 채취. (B) 고대비 필터 페이퍼 위에 진공 여과를 통한 난자 회수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

벌크 유충 매체 재료
시약	질량 (g)
물	900
밀겨	230
종아리 보충제	100
버미큘라이트 (A4 굵기)	70
분리 핵화 용액 재료
해결책	구성
산화 욕조	탈이온수에서 3% 차아염소산나트륨
세안 목욕	Triton X-100 0.02% 용액을 탈이온수에 담아
가름	탈이온수
흑천 선별 및 양식판 재료
시약	질량 (g)
물	500
가루 달걀 노른자	18
활성탄	4
염화나트륨	1

표 1: 벌크 유충 배지용 시약, 탈코리오네이션 용액, 흑색한천 플레이트. 군체 유지를 위한 벌크 유충 배지 준비에 사용되는 시약, 안정적인 파리 배아에서 융합체를 약화시키고 제거하는 용액 조성, 그리고 500mL의 흑한천 선별 및 사육 배지를 준비하는 데 필요한 재료.

그림 3: 벌크 유충 배지 준비. (A) 벌크 유충 배지 준비에 사용되는 재료: 송아지 단백질 보충제(CM), 밀겨(WB), 버미큘라이트(VM), 저장 용기(SC), 뚜껑(L), 직물 개스킷(FG). (B) 매체 성분의 철저한 혼합. (C) 계란 덮인 여과지(EP)를 매체 표면에 뒤집어 놓고 추가 매체로 덮어 건조를 방지하는 것. (D) 용기와 뚜껑 사이에 면직물 개스킷 설치. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 벌크 배지에서의 유충 발달. 투명한 용기는 유충 발달과 매체 상태를 모니터링할 수 있게 해줍니다. 유충(L)은 용기 벽, 뚜껑, 그리고 매체 안에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 주사 준비: 탈코리온화 및 건조

1. 1.1.4단계에서 설명한 대로 젖은 검은 면 천을 비커에 넣고, 성충 우리에 옮겨 25분간 알을 채취하세요. 세척병을 사용해 106μm 스테인리스 체에 달걀을 씻어내세요.
   참고: 25분 채취 기간에는 보통 약 400개의 알이 나옵니다.
2. 배아를 체에 방해받지 않고 30분 더 쉬게 하세요.
3. 배아가 노화되는 동안, 표 1 (그림 5)의 "탈흑화 용액" 섹션에 설명된 산화, 세척, 세척 용액 각각 150mL씩 준비합니다. 배아를 약 1cm 두께의 용액으로 충분히 덮으세요.
4. 체를 들어 있는 배아를 산화 욕조에 2분간 담근 후 파스퇴르 피펫으로 배아를 부드럽게 저어줍니다(그림 6A).
   참고: 반복적인 흡입과 용액 분사를 통해 원형 소용돌이를 만들어 체의 중심에 배아를 집중시키고, 갓 체액 탈코리온된 배아가 체벽에 달라붙는 것을 방지합니다.
5. 산화 욕조에서 체를 빼고 남은 용액을 털어내세요. 체를 세척액에 옮기고 흡입 후 2분간 저어줍니다.
6. 배아가 포함된 체를 세척액에 옮기고 2.4단계에서 설명한 대로 2분간 저어줍니다. 세척액에서 체를 제거하고 남은 물을 수로 제거하세요.
7. 멸균 유리 커버슬립을 체에 올려놓고, 해부 현미경 아래에서 끝이 가는 나일론 페인트 붓으로 체에서 슬립 가장자리로 배아를 옮깁니다(그림 6B). 배아를 서로 닿지 않게 가까이 배치하고, 넓은 뒤쪽 극은 커버슬립의 가장자리를 향하게 하세요. 이식 중 배아를 구부리거나 왜곡하거나 찢는 것을 피하세요.
8. 1L 플라스크 바닥에 황산칼슘 건조제를 100mL 넣고 고무 마개로 밀봉하여 건조 챔버를 준비합니다.
   참고: 24시간 평형 상태가 지나면, 건조실은 일반적으로 23°C에서 상대습도가 <5%에 도달합니다.
9. 커버슬립에서 남은 물을 제거하고, 탈코리온 배아가 담긴 커버슬립을 건조제 위에 올려놓습니다. 플라스크를 고무 마개로 다시 밀봉하고 배아를 8분간 건조시킵니다.
10. 건조실에서 커버슬립을 분리하여 현미경 스테이지 위에 20× 대물렌즈 아래에 놓아 미세 주입을 합니다.

그림 5: 탈코리오네이션 해법. 왼쪽부터 오른쪽으로: 배아 탈코리오네이션에 사용되는 스테인리스 체, 산화 용액, 세척용액, 세척용액. 차아염소산나트륨은 빛으로부터 보호된 6% 스톡 용액으로 유지되며, 트리톤 X-100은 10× 스톡 용액으로 유지되어 사용 전 최종 농도가 0.02%로 희석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 배아 탈코리오네이션. (A) 부드러운 흡입과 용액 분사는 체의 중심에 배아를 집중시키고 체벽에 대한 부착력을 줄이는 소용돌이를 생성합니다. (B) 세척 후 반투명 융모막에서 탈코리온 배아가 나옴. 앞극(좁은 끝)은 보통 뒷극보다 먼저 나옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 미세주입

1. 표 2에 명시된 매개변수를 사용하여 100mm 필라멘트 유리 모세관(내각선 0.7mm, 외측 1.0mm)에서 석영 미세주입 바늘을 뽑아냅니다. 사용 전까지 바늘은 먼지 없는 곳에 보관하세요.
   참고: 유사한 기하학적 보로실리케이트 바늘도 사용될 수 있습니다.
2. 주입 완충제(0.1% w/v 페놀 레드, 인산염 완충식염수(PBS), pH 7.4)를 준비하고 0.22 μm 주사기 필터를 통해 필터 멸균합니다.
3. 20 μL 주입 혼합물을 준비하는데, 이는 왼쪽과 오른쪽 피기백 역말단 반복 사이에 유전 화물을 포함하는 피기백 헬퍼 플라스미드와 기증자 플라스미드 각각 10 μg을 결합하여 4 μL 주입 버퍼와 함께 준비합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 사용해 최종 농도인 500 ng/μL로 희석합니다.
   참고: 헬퍼 플라스미드는 HSP83 시작 코돈 상류에 위치한 3.1 kb hsp83 프로모터 서열과 과활성 피기박 전이부 코딩 서열로 구성되어 있습니다.
4. 주입 혼합물을 저용량 0.20 μm PTFE 주사기 필터로 옮기고, 필터를 0.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 입구에 넣습니다(그림 7A). ≥11,000 x g 에서 10분 또는 모든 주입 혼합물이 필터를 통과할 때까지 원심분리합니다. 사용하지 않은 주사 혼합액은 -20 °C에 보관하세요.
5. 마이크로 젤 로딩 피펫 팁을 사용해 약 2μL의 주입 혼합물을 석영 미세주입 바늘에 역채우기합니다(그림 7B). 로딩 중에 기포를 유입하지 마세요.
   참고: 미세 주입 바늘을 배아의 장축과 평행하게 배치하고, 찢어짐과 전단을 최소화하기 위해 수평 및 수직 각도 오프셋을 0으로 유지하세요.
6. 바늘 끝을 유리 슬라이드 가장자리에 부드럽게 두드려 주입 혼합물이 바늘 끝을 통과할 때까지 합니다(그림 7C).
   참고: 바늘 끝을 점차 부러뜨려 주입-혼합 흐름이 가능한 가장 작고 날카로운 구멍을 만드세요.
7. 건조 직후 배아를 후극을 통해 주입하는데, 주입 압력은 약 700 hPa, 역압은 약 300 hPa입니다.
8. 배아를 부드럽게 관통하여 배아 부피의 약 10분의 1에 주입 혼합물을 주입합니다(그림 7D–F).
   참고: 바늘 침투를 최소화하여 비텔린 막의 교란을 줄이고 바늘 빼는 과정에서 난체 손실을 방지합니다.
9. 주입 직후 커버슬립을 멸균되고 촉촉한 90mm 검은색 필터 페이퍼로 안감한 페트리 접시로 옮기고, 실온에서 48시간 배양합니다.
   참고: 산란 후 2시간 이내에 모든 주사를 완료하여 합시토리 단계 이전에 목표 배아를 대상으로 하세요.
10. 배아가 12시간에서 16시간마다 부화하는지 검사하세요. 갓 부화한 유충과 유리 커버슬립을 4절에 설명한 대로 접종 및 조절된 한천 플레이트로 옮깁니다.

매개변수	열기	필	벨	델	당겨
가치	825	5	60	150	175

표 2: 바늘 당기기 매개변수. 석영 미세주입 바늘을 생성하는 데 사용되는 매개변수들.

그림 7: 배아 미세주입. (A) 0.5 mL 미세원심분리기 튜브에 내장된 주사기 필터를 이용한 주입 혼합물 여과. (B) 젤 로딩 피펫 팁을 이용해 여과된 주입 혼합물을 마이크로 주입 바늘에 적재하는 것. (C) 석영 미세주입 바늘의 말단 형상. (D) 바늘이 배아의 후극과 정렬됨. (E) 비텔린 막의 교란을 최소화하면서 배아 표면을 침투하는 것. (F) 배아 부피의 약 10분의 1을 주입한 후 바늘 제거. 투명도가 높아지면 주입 혼합물에 의해 난소가 치워졌음을 나타냅니다. 스케일 바 = 400 μm (D–F) 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

4. 처리된 플레이트 준비

1. 한천 매체 제형
   1. 표 1의 "블랙 아가(Black Agar) 스크리닝 및 양식판 재료" 섹션에 설명된 배지를 준비하고 121 °C에서 15분간 오토클레이브합니다. 한천을 40°C에 부거나 실온에서 보관한 후 재가열한 후 90mm 페트리 접시에 분배하세요.
      참고: 고체 입자를 다시 부으기 전에 격렬하게 휘젓습니다.
2. 플레이트 접종
   1. K12 대장 균 24시간 배양물을 루리아-베르타니 육수에 OD600 = 0.200으로 희석한 후 냉각되고 굳어진 한천 플레이트에 200 μL을 투여합니다. 멸균 유리 구슬이나 유리 스프레더를 사용해 배양물을 고르게 펴고, 플레이트가 과도한 수분을 흡수하도록 하세요(그림 8A, B).
      참고: 한천 플레이트는 붓은 후 1개월 이내에 사용하거나 버려서 박테리아와 유충의 안정적인 성장을 보장하세요.
3. 판 조건화
   1. 검은색 여과지 6장× 6cm 접어 6-10개의 물결 모양 능선을 만들고 굽거나 오토클레이브로 멸균하세요. 멸균된 골판지 필터 페이퍼 한 장을 무균으로 접종된 페트리 접시 위에 올리고 멸균수 몇 방울로 적셔 주세요(그림 8C).
   2. 처리되지 않고 주입하지 않은 야생형(WT) 1령 유충을 표면 멸균하여 10마리의 유충을 적신 여과지에 옮깁니다.
      참고: WT 배아를 10% 표백제(0.6% NaOCl)에 1분간 담근 후 멸균 탈이온수에 2분간 헹구세요.
   3. 페트리 접시 뚜껑과 본체 사이에 90mm 필터 페이퍼를 넣어 개스킷 역할을 하세요.
   4. WT 유충이 24시간 동안 플레이트를 컨디셔닝한 후 주입된 배아를 유리 커버슬립에 넣으세요(그림 8C). 첫 주입된 배아가 부화한 후 WT 유충을 제거하세요.

그림 8: 한천 플레이트 준비 및 주입 후 회수. (A) 멸균 유리 구슬을 이용한 OD600 = 0.2 대 장 균 배양액으로 한천 플레이트 접종. (B) 배아 이식 전 과도한 표면 수분 흡수. (C) 페트리 접시 뚜껑과 본체 사이에 90mm 필터 페이퍼 가스켓을 삽입하는 것. (D) 유충의 형광 표지에 대한 선별. 주입된 배아는 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 넣은 탈이온화된 물 포화 90mm 필터 페이퍼에 부착되어 48시간 배양한 후 선별판으로 옮깁니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Results

이 프로토콜을 사용하여 431개의 안정된 파리 배아를 탈코리온화하여 피기백-Hsp83 기증 플라스미드와 Hsp83 보조 플라스미드를 최종 농도인 500 ng/μL로 주입했습니다.주입된 431개 배아 중 18마리의 ZsGreen 양성 유충(4.2%)과 8마리의 ZsGreen 음성 유충(1.9%)이 검은색 탄소 한천 플레이트에서 선별 후 48-76시간 이내에 부화했습니다(표 3). 전체적으로 431개의 주입된 배아 중 26개(6.0%)가 부화했고, 26개 중 16개가 성체까지 생존했습니다(61.5%).

종	주입 유형	구성	# 주입	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) 번데기	ZsGreen(-) 번데기	ZsGreen(+) 성체	ZsGreen(-) 성체	# 성체가 ZsGreen(+) 자손을 낳는 경우
스토목시스 칼시트란	전이체 삽입	Hsp83: hy-pBac (도우미, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (기증자, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
스토목시스 칼시트란	전이체 삽입	Hsp83: hy-pBac (도우미, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (기증자, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

표 3: 주입 통계. 배아 미세주입 후 생존, 변형 및 회복률.

18마리의 ZsGreen 양성 G0 유충 중 12마리(66.7%)가 번데기화까지 살아남았고, 10마리는 성충으로 개종되었습니다. 6명의 ZsGreen 양성 성체(주입된 배아의 1.4%, 가임 G0 생존자의 60%)가 ZsGreen 양성 자손을 낳았습니다. 이 자손들(그림 9A–E)은 작성 시점에서 6세대 동안 스스로 교배되어 형광을 유지했습니다.

8마리의 ZsGreen 음성 유충 중 6마리(75%)가 성충까지 생존했습니다. 비형광성 성체는 형광 자손을 낳지 못했습니다.

그림 9: 형질전환 파리의 형광 스크리닝. (A) ZsGreen을 발현하는 F1 유충과 WT 유충의 비교. (B) 번데기 큐티클을 통해 형광이 관찰되어 번데기 단계에서 유전자 형질전환 스크리닝이 가능하다. (C, D) 백색광(C) 및 형광(D) 조명 하에서 ZsGreen 발현 유충 3마리와 번데기(왼쪽)와 WT 유충 3종(오른쪽)을 비교. (E) ZsGreen을 발현하는 성체 형질전환 F1 파리(왼쪽)와 WT 성체 파리(오른쪽)의 차이. 스케일 바 = 1 mm (A), 2 mm (B,E), 3 mm (C, D). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

비모델 곤충 종의 유전적 변형은 절지동물 해충과 매개체에 대한 유전적 방제 전략 개발과 평가에서 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다.

안정적인 파리의 경우, 여기서 설명하는 프로토콜은 배아 미세주입 후 G0 파리의 주입 및 사육에 소요되는 시간, 자원, 노동, 변동성을 줄여줍니다. 또한, 흑한천 스크리닝 플레이트를 사용하면 생애 주기 전반에 걸친 발달 관찰이 가능하여, 주입, 회복, 유충 사육 과정에서 발생하는 문제의 식별과 교정을 용이하게 합니다. 본 연구에서 평가된 플라스미드 구조체를 사용하여 프로토콜은 이전에 보고^{된 방법보다} 주입된 배아가 적은 수로 형질전환 안정 파리계통을 생성했습니다. 이 방법 논문의 범위를 벗어나지만, 역PCR과 스플링커렛 PCR과 같은 확립된 접근법을 통해 형질전환유전자 삽입 부위의 확인 및 위치 지정이 가능합니다.

효율적인 주입 프로토콜은 형광 리포터를 이용한 프로모터 특성 분석을 포함한 기능 유전체학 분야의 향후 연구도 촉진합니다; 병원체 전파와 관련된 유전자의 역유전학 분석을 통한 벡터 역량; 안정적인 파리에서 CRISPR-Cas9 및 기타 프로그래밍 가능한 뉴클레아제 평가를 포함한 뉴클레아제 특성 분석; 후보 내성 대립유전자 변형을 통한 살충제 내성 연구; 혈액 공급, 교미, 발달에 관여하는 유전자를 포함한 기본 생물학 연구도 포함됩니다. 또한 저희 프로토콜은 이전 Musca 가정 및 Lucilia cuprina piggyBac 형질전환 문헌^16,17에 문서화된 바와 같이 주입 후 배아 주입 후 배아 오일 침입 주입과 산소 습도 챔버의 필요성을 없애줍니다.

성공적인 형질전환에는 여러 가지 매개변수가 매우 중요합니다. 배아 건조와 주입 시기는 특히 중요한데, 플라스미드 DNA가 세포화 전에 반드시 도입되어야 생식계 전구체 세포에 통합되도록 하기 때문입니다. 그러나 안정적인 파리 배아에서 세포 형성의 정확한 시기는 아직 알려져 있지 않습니다. 또한, 배아 발달 속도는 온도에 의해 영향을 받으며, 서로 다른 환경 조건에서 안정적인 파리 배아의 발달 연대기는 아직 완전히 규명되지 않았습니다. 안정적인 실험실 파리 균주의 발달률과 배아 발생에 대한 향후 연구는 미세 주입 및 형질전환 프로토콜 최적화에 대한 통찰을 제공하여 효율성과 프로토콜 재현성을 더욱 높일 수 있을 것입니다. 하지만 그때까지는 최적의 주입 창을 결정하는 것이 변환 효율성에 영향을 미칠 수 있는 방법론적 한계로 남아 있습니다. 생존율이 낮을 때는 처리되지 않은 배아, 탈코리온된 배아, 필터 멸균 PBS 주입된 배아, 한천 판에서 사육된 WT 배아의 부화 및 성체 생존율을 비교하여 문제 해결을 수행할 수 있습니다. Musca 국내 형질전환을 기술한 이전 문헌에서는 1,668회 주입 중 14건의 통합 사건(주입 중 0.84%)을 기록했으며¹⁶, 양 해충 Lucilia cuprina 형질전환은 약 900건의 배아 주입(주입의 0.33%)에서 3개의 형질전환 계통을 확립했음을 시사합니다¹⁷. 이는 이 프로토콜에서 설명된 안정적인 파리 형질전환 프로토콜(431회 주입 중 6건의 통합 사건)을 시사합니다. 주입된 1.4%는 문헌에 나오는 다른 해충 이룡 종에 비해 주입 효율을 개선합니다.

안정파리 hsp83 구성 프로모터는 발달 전 과정에서 ZsGreen의 강력한 발현을 제공했으며, 초기 배아 발생 중 과활성 피기백 트랜스포효아제의 발현을 지원하여, 이전에 보고된 안정파리 형질전환 프로토콜⁹에 비해 형광 표지 가시성과 형질 전환 효율을 향상시켰습니다. 본 연구에 사용된 보조 플라스미드는 hsp83 시작 코돈 바로 상류에 위치한 3.1 kb의 게놈 DNA 서브클로닝을 통해 과활성 piggyBac 트랜스포효아제 코딩 서열의 상류에 위치한 최소 플라스미드 벡터로 서브클로닝하여 생성되었습니다. 헬퍼-카고 플라스미드 비율은 질량 기준 1:1로 경험적으로 확립되었으며, 연구 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 추가 플라스미드 비율은 평가되지 않았으나, 대체 비율도 효과적일 수 있습니다.

여기서 설명한 개선은 다른 절지동물의 형질전환 프로토콜에도 적용될 수 있습니다. 또한, 이 천 기반 선별 및 사육 시스템은 현재 흑병파리(Hermetia illucens) 배아 주입 및 선별에 적용되고 있습니다. 이 프로토콜은 Musca domestica 와 Haematobia irritans 등 다른 머시드 파리의 유충 생태와 분해 섬유질 기질에서의 발달이 유사하기 때문에 특히 유용할 수 있습니다. 대장균 접종된 한천 플레이트의 사용은 주사 후 모니터링에 실용적인 접근법을 제공하며, 연구자들이 배아 발달, 유생 형태, 표지 발현, 부화율 및 전반적인 회복을 평가할 수 있게 합니다. 배지의 박테리아 성분을 목표 종의 생물학에 맞게 적응시키는 것은 이 접근법의 유용성을 더욱 높이고 형질전환 프로토콜 개발 및 최적화에 기여할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	건조 챔버
Bacto Agar	Difco	281230	검은색 아가 플레이트용 아가
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	알몸 컬렉션 컵과 애벌레 사육 빈용 검은 면직물
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	건조 챔버용 건조제
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	대량 유충 매체
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	주사 현미경
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	검은색 아가 플레이트용 영양원
E. coli	New England Biolabs	C2987H	검은색 아가 플레이트에 사용되는 박테리아
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	미세 주입 압력 공급
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	배아 이동
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	바늘 당기기용 모세관
Forceps	Fine Science tools	11251-20	샘플 처리
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	탈각시 중 배아 유지
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	콜리온 제거용 표백액
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	대량 유충 매체 용기
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	배아 수집
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	E.coli 배양용 LB 브로스
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	배아 이동 및 정렬용 현미경
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	바늘에 주입 혼합물 로드
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	주사용 마이크로매니퓰레이터
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	주입 혼합물 필터링
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	주입 완충액
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	검은색 아가 플레이트용 안료
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	모세관에서 바늘 당기기 장치
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	주입 완충액
Petri plates	VWR	391-0609	검은색 알 플레이트용 페트리 접시
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	주입용 염료
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	건조 챔버 플러그
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	대량 유충 매체
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	미세 주사용 유리 커버슬립
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	유충 스크리닝용 형광등 및 필터
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	플레이트에 박테리아 퍼뜨리기
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	탈각시 중 배아 세척
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	배아 탈각시
Wash bottle	Safetyware	Z423335	표면에서 배아 세척