인간 제대정맥 내피세포를 이용한 마이크로캐리어 비드 기반 3차원 혈관신생 모델

요약

이 프로토콜은 인간 제대정맥 내피세포를 이용한 마이크로캐리어 비드 기반 3차원 혈관형성 모델을 설명합니다. 이 분석법은 내피 발아와 내강 유사 구조 형성을 직접 시각화할 수 있게 하며, 혈관신생 기전 및 치료 개입 연구에 적용할 수 있습니다.

초록

혈관신생은 내피세포 활성화, 이동, 신장, 내강 형성, 가지, 문합 등 다단계의 생물학적 과정입니다. 기존의 2차원 배양 시스템은 약물, 유전자 또는 배양 조건의 예비 평가에 유용하지만, 3차원 세포외기질 내에서 내피 형태발생의 공간적 조직을 충분히 재현하지는 못합니다. 본 프로토콜은 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 이용한 마이크로캐리어 비드 기반 3차원 혈관신생 분석법을 설명합니다. HUVEC는 먼저 화학적으로 결합된 산성 변성 돼지 1형 콜라겐을 가진 마이크로캐리어 비즈에 시딩된 후 기저막 매트릭스에 삽입됩니다. 구강 점막 섬유아세포는 이후 젤 위에 시딩되어 내피 발아와 혈관 유사 구조 형성을 위한 파라크린 지원을 제공합니다. 배양 배지는 2일마다 교체되며, 발아 행동과 혈관신생 표현형은 역현미경으로 모니터링합니다. 적절한 배양 조건에서 내피 새싹이 며칠 내에 나타나고, 이어서 내강 유사 구조와 새싹 간 연결이 형성됩니다. 이 방법은 내피 형태형성의 시험관 내 연구를 위한 편리하고 재현 가능한 플랫폼을 제공하며, 유전자 조작, 약리학적 개입, 질병 모델링 연구에도 추가로 적용할 수 있습니다.

서론

내피 발아는 혈관신생에서 중요한 사건으로, 기존 혈관 구조에서 내피 세포가 출현, 이동, 증식 및 정렬을 포함하며, 이어서 내강 형성과 상호 연결된 혈관 유사 네트워크의 형성을 포함합니다 ^1,2. 기존의 2차원 배양 시스템과 겔 기반 튜브 형성 분석법은 기술적으로 간단하지만, 3차원 미세환경 내에서 내피세포의 공간적 재형성을 재현하는 데는 한계가 있습니다 ^3,4. 고전적인 마이크로캐리어 비드 기반 3차원 발아 분석법은 내피 발아, 신장, 내강 형성, 네트워크 조립 등 여러 단계의 혈관신생을 시험관 내에서 재현하며, 따라서 혈관신생 연구에 널리 사용되는 방법이 되었습니다.

본 프로토콜에서는 정상적인 인간 제대정맥 내피세포를 이용한 3차원 마이크로캐리어 비즈 기반 발아 모델이 구축되었습니다. 이전에 보고된 내피 미세운반체 비드 발아 분석 ^5,6,7을 기반으로 하여, 이 방법은 내피 세포 코팅을 미세캐리어 비드에 부착하고 3차원 매트릭스에 삽입한 후 섬유아동 오버레이 배양을 유지하면서도, 기존의 피브린 젤 대신 기저막 매트릭스를 사용하여 절차를 단순화하고 일상적인 영상 촬영을 용이하게 합니다. 이 수정된 프로토콜에서 기저막 매트릭스는 여러 실용적이고 생물학적 이유로 선택되었습니다. 실험적으로, 이 매트릭스는 빠른 겔 형성, 간단한 비드 삽입, 그리고 피브린 겔 준비에 필요한 추가 중합 단계 없이 편리한 일상적인 현미경 관찰을 가능하게 하는 3차원 매트릭스를 제공합니다. 생물학적으로, 기저막 기질에는 세포 내피 세포 부착, 이동, 새싹 확장, 내강 유사 구조 형성을 지원하는 세포외 기질 성분이 포함되어 있습니다. 따라서 이 변형은 내피 발아 행동의 직접 시각화, 혈관신생 표현형 비교, 3차원 배양 환경에서 약리학적 또는 유전적 개입 평가가 필요한 연구에 적합합니다. 그러나 기저막 매트릭스는 매트릭스 조성, 기계적 특성, 분해성, 생체 활성 단서 면에서 피브린 겔과 다르기 때문에, 본 분석법은 고전적인 피브린 기반 분석법을 직접 대체하기보다는 수정된 마이크로캐리어 비드 기반 발아 모델로 해석되어야 합니다. 이러한 매트릭스 관련 차이는 발아 속도론, 내강 안정성, 네트워크 형태에 영향을 미칠 수 있으므로, 다양한 3차원 혈관신생 시스템 간 결과를 비교할 때 고려해야 합니다. 이 모델은 내피 발아 행동을 3차원에서 관찰하는 데 적합하며, 약리학적 개입, 유전자 조작, 혈관신생 메커니즘 연구에 추가로 적용할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 인간 제대정맥 내피세포는 윈난성 제1인민병원 산부인과에서 채취한 인간 탯줄 조직에서 분리 및 배양하였습니다. 샘플 채취 전에 모든 기증자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 인간 유래 물질을 사용하는 모든 시술은 윈난성 제1인민병원 의료 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호는 KHLL2023-KY198). 인체 구강 점막 섬유아세포(HOMF)는 쿤밍 의과대학 부속 장강병원의 자이 제메이 박사 연구팀이 친절히 제공하였습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 준비

1. 인공 탯줄 정맥 내피세포(HUVECs)를 5% CO₂가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 태아 소 혈청(FBS)을 보충한 후 최종 농도가 10%로 배양합니다. 분석에 사용되는 세포는 오염이 없고, 안정적인 성장을 보이며, 로그 성장 단계에 있어야 합니다. 4번에서 6번 통로에 세포를 사용하세요.
2. 인간 구강 점막 섬유아세포(HOMFs)를 37°C의 고포도당 기저 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보충한 상태에서, 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 4번에서 6번 통로에 세포를 사용하세요.
3. 마이크로캐리어 비드 코팅 전에 두 세포 유형이 적절한 합류점에 있는지 확인하세요. 과도한 배양이나 과도한 효소 소화는 이후 발아에 부정적인 영향을 줄 수 있으므로 피해야 합니다.

2. 마이크로캐리어 비드의 준비

1. 마른 마이크로캐리어 비즈 0.5g을 50mL PBS에 최소 3시간 동안 수화시킵니다. 세척 후에는 50mL의 PBS에 비즈를 재현탁하여 약 3× 10⁴ 비즈/mL에 해당하는 10 mg/mL 마이크로캐리어 비드 현탁액을 얻습니다.
2. 현탁액을 실리콘 유리병에 옮기고, 115°C에서 15분간 오토클레이빙으로 멸균한 후 4°C에서 보관하다가 사용하세요.
3. 내피 세포 코팅 전에 저장 용액을 제거하고 멸균 PBS로 구슬을 세척하세요. 구슬을 내피 세포 성장 배지에서 37°C에서 최소 30분간 평형으로 보관합니다.
4. 침전과 구슬 뭉치를 방지하기 위해 사용 직전 즉시 부드럽게 재현탁하세요.
5. 셀 코팅 전에 구슬 현탁액의 작은 알리코트를 역현미경으로 검사합니다. 구슬이 완전히 수분이 충분하고 고르게 부유되어 있으며, 눈에 띄는 집합체나 파편 조각이 없을 때만 진행하세요.

3. 내피 세포를 마이크로캐리어 비드에 코팅하기

1. 트립신을 이용해 HUVEC를 분리하고 세포를 내피 세포 성장 배지에 재현탁합니다.
2. 마이크로캐리어 비즈를 비드당 1,500 셀의 밀도로 코팅합니다. 1.5mL의 내피 세포 성장 배지에 6^{개의 HUVEC} 3개× 10개, 6개의 마이크로캐리어 비즈를 혼합합니다.
3. 세포-비드 혼합물을 미세원심분리관에 옮기고 세포 배양 인큐베이터에서 12시간 배양합니다. 12시간 동안 부드럽게 튜브를 20분마다 한 번 부드럽게 뒤집어 세포와 구슬 간의 적절한 접촉을 유지하고 균일한 내피 세포 부착을 촉진합니다.
4. 12시간 후, 코팅된 구슬을 4mL 내피 세포 성장 배지를 포함한 25cm² 세포 배양 플라스크에 옮기고, 하룻밤 동안 배양하여 내피 세포가 미세 운반체 비드 표면에 단단히 부착되도록 합니다.
5. 삽입 전에 대표성 코팅된 비즈를 거꾸로 현미경으로 검사합니다. 검사된 구슬의 80% 이상에서 구슬 표면에 연속적이고 비교적 균일한 내피 세포층이 나타나고, 자유 부유 세포가 최소화되며, 명확한 세포 덩어리가 없고, 심한 구슬 집합이 없을 때만 매트릭스 임베딩을 진행하세요. 고르지 않은 코팅, 큰 셀 군집, 또는 광범위한 뭉치가 있는 구슬은 삽입에 사용해서는 안 됩니다.
6. 구슬이 플라스크 바닥에 달라붙으면 부드럽게 흔들어 구슬을 풀어주세요. 구슬 뭉치나 세포 분리를 유발할 수 있는 격렬한 피펫팅은 피하세요.

4. 코팅된 비즈를 3차원 매트릭스에 삽입

1. 내피 세포 코팅된 미세운반체 비즈를 15mL 원심분리관으로 옮기고 중력에 의해 비즈가 가라앉도록 합니다. 과잉 배지를 제거하고 적절한 양의 신선한 배지를 추가하세요.
2. 마이크로캐리어 비드 현탁액을 1:1(v/v) 비율로 미리 냉각된 기저막 매트릭스와 혼합하여 최종 비드 농도인 500 비즈/mL를 얻습니다.
3. 24웰 플레이트의 각 웰 중앙에 매트릭스 비드 현탁액 100 μL을 첨가하면, 혼합물이 웰 벽과 접촉하지 않고 단일 돔 모양의 젤 방울을 형성할 수 있습니다. 서스펜션을 조심스럽게 섞고 공기 방울을 넣지 않도록 하세요.
4. 24웰 플레이트를 실온에 5분간 두어 초기 겔화 및 젤 방울의 안정화를 기다립니다. 그 후 플레이트를 37°C에서 5% CO₂에 15분간 수직으로 배양한 후, 완전한 겔화 및 적절한 겔 형성을 위해 뒤집힌 상태로 추가로 15분간 배양합니다.
5. 젤이 완전히 굳어지면 즉시 섬유아세포 오버레이 배양을 진행하세요.

5. 섬유아세포 오버레이 배양

1. 1mL의 내피 세포 성장 배양액에 3개의 × 10⁴ 인간 구강 점막 섬유아세포(HOMFs)를 재현탁한 후, 각 웰 벽을 따라 세포 현탁액을 부드럽게 첨가하여 세포가 젤 돔을 직접 손상시키지 않고 젤 표면에 분포할 수 있도록 합니다.
2. 5% CO₂를 사용한 가습 인큐베이터에서 37°C의 내피 세포 성장 배양지에서 계속 배양합니다. 인간 구강 점막 섬유아세포는 삼차원 배양 시스템에서 내피 새싹 확장, 안정화 및 혈관 유사 재형성을 촉진하는 기초 유래 파라크린 신호를 제공하여 지지 세포로 사용됩니다.

6. 배양 유지 및 현미경 관찰

1. 배양지는 2일마다 교체하세요. 배지를 교환할 때는 사용한 배지를 천천히 흡입한 뒤, 겔을 손상시키지 않도록 웰 벽을 따라 신선한 배양지를 추가하세요.
2. 밝은 필드 또는 위상 대비 모드를 사용하여 매일 또는 격일로 역현미경으로 배양물을 관찰하세요. 종단 정량 분석을 위해 7일째에는 각 우물에서 여러 시야를 선택하고, 9일과 11일째에는 동일한 미리 정의된 시야를 촬영합니다.
3. 최적의 배양 조건에서는 보통 4일째에서 6일째에 명확한 내피 발아가 관찰되고, 5일부터 7일째에 내강 유사 구조가 나타나며, 7일째 이후에는 상호 연결된 미세혈관 유사 네트워크가 점차 형성됩니다.
4. 성공적인 발아란 구슬 표면에서 주변 3차원 매트릭스로 방사형으로 자라는 여러 내피 확장부의 존재로 정의합니다. 새싹은 구슬 표면을 명확히 넘어 구슬 관련 내피 세포층과 연결되어 있을 때만 세어야 합니다.
5. 내강 유사 구조 형성을 중앙에 투명한 공간이나 관 모양의 형태가 보이는 길쭉한 내피 구조의 모습으로 정의합니다. 새싹 간 연결은 인접한 새싹 사이에 형성되는 직접적인 접촉 또는 연속적인 구조로 정의됩니다.
6. 광범위한 세포 사멸, 심한 구슬 응집, 겔 구조 파괴, 풍부한 기포, 기질 붕괴, 또는 짧고 불규칙한 세포 돌출만 있는 배양은 최적이 아닌 것으로 간주되어 정량 분석에서 제외되어야 합니다.

7. 이미지 획득 및 정량적 분석

1. 7일째에는 각 웰에서 여러 시야각을 선택하고, 9일차와 11일차에는 동일한 미리 정의된 시야에서 이미지를 획득합니다. 모든 시점에서 동일한 배율, 노출 설정, 영상 조건을 사용하여 이미지를 수집해야 합니다.
2. 마이크로캐리어 구슬당 새싹 수와 혈관이 형성된 면적을 정량화하세요.
   1. 혈관 면적 측정을 위해서는 오픈소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용하세요. 획득한 이미지를 열고 다각형 또는 자유손 선택 도구를 사용해 혈관 화상 관심 영역(ROI)의 경계를 수동으로 표시하세요. 선택한 ROI를 ROI 관리자에 추가하세요.
   2. 시각화를 위해서는 관심 영역 시각화 플러그인을 사용해 ROI를 표시하세요. 측정 설정에서 면적 측정을 활성화하고, 선택한 ROI를 측정하여 혈관 부적을 얻습니다. 모든 이미지에 동일한 분석 설정을 적용하세요.
   3. 혈관신생률 분석의 경우, 7일차의 혈관 형성 부위를 기준선으로 사용하고, 9일차와 11일차의 혈관 형성 부위의 상대적 변화를 계산합니다.
3. 세 명의 관찰자가 독립적으로 개별 새싹 수를 세고, 평균값을 사용해 분석합니다.

결과

3차원 HUVEC 모델에서의 혈관신생

성공적으로 확립된 배양에서는 내피 세포가 미세운반체 비즈 표면에 균일하게 분포하며, 명확한 비즈 응집은 관찰되지 않습니다. 동적 관찰 결과 7일, 9일, 11일차에 점진적인 내피 발아와 미세혈관 유사 네트워크 형성이 관찰되었습니다(그림 1A). 정량적 분석을 통해 이 모델에서 진행성 혈관형성 반응이 확인되었습니다. 7일차를 기준으로 혈관 신생률을 0%로 설정했고, 9일차에는 66.94%± 18.49%, 11일차에는 169.51%± 100.83%로 증가하여 배양 과정에서 혈관 형성 부위의 점진적 확장을 나타냈다(그림 1B). 대표적인 명시야 영상 결과, 7일간의 배양 후 내피 새싹이 구슬 표면에서 방사형으로 주변 3차원 매트릭스로 나타났습니다(

토론

본 프로토콜은 마이크로캐리어 비즈를 기반으로 한 수정된 3차원 내피 발아 모델을 설명합니다. 그림 3은 실험 워크플로우의 개략적 개요를 제공합니다. 이 프로토콜은 Nakatsu와 Hughes가 보고한 고전적 혈관신생 검사법을 바탕으로 한 것으로,^{본 연구의} 목적에 맞게 최적화되었습니다^. 고전적 시스템에서는 내피 세포가 콜라겐 코팅된 미세운반체 구슬에 코팅되어 3차원 기질에 박혀 섬유아세포와 공동 배양하여 발아, 신장, 내강 형성, 혈관 유사 문합을 지원합니다 ^7,10. 본 프로토콜에서는 피브린 젤 대신 저저막 기반지를 사용하고, 인간 구강 점막 섬유아세포를 지지 세포로 사용하여 내피 혈관생성 행동...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브	Beyotime	FTUB306	투명, 핵산분해효소 없음
15 mL 원심분리기 튜브	Haier	311005	원추형 바닥, 무균, 백팩
24웰 세포배양 플레이트	Haier	612003	평평한 바닥, 조직배양 처리, 개별 포장, 부착 세포 배양용
자동 세포 계수 슬라이드	Countstar	12-0005-50	자동 세포 계수기용 일회용 슬라이드, 50매/박스
CO2 세포배양 육아기	Thermo Fisher Scientific	3110	37 °C에서 5% CO2로 세포 배양에 사용
Cytodex 3 마이크로캐리어	Cytiva	17048503	건조 분말; 콜라겐 코팅 덱스트란 마이크로캐리어 비드
점선 플러그인	N/A	N/A	혈관화 영역을 표시하는 관심 영역 시각화 플러그인
Dulbecco’s 수정 이글 배지 (DMEM), 고 포도당	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM 기본 (1×), 4.5 g/L D-포도당, L-글루타민, 110 mg/L 나트륨 피루브산 함유, 500 mL
내피 세포 배지 (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	내피 세포 배양 배지, 사용 전에 최종 농도 10%로 추가 FBS 보충
태아 소 혈청 (FBS)	Gibco	10099141C	합격, 일회용 포맷, 호주 원산지, 500 mL
인간 구강 점막 섬유아세포 (HOMFs)	Jiemei Zhai 연구팀, 쿤밍 의대 부설 치과병원	N/A	인간 구강 점막에서 분리한 1차 섬유아세포; 다른 연구실에서 친절하게 제공
인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs)	내부	N/A	인간 제대 정맥에서 분리한 1차 내피 세포; 카탈로그 번호 없음
ImageJ 소프트웨어	미국 국립 보건원 (NIH)	N/A	오픈 소스 소프트웨어; 버전 1.54p
반전 현미경	일본 올림푸스	N/A	밝은 필드, 위상차 및 형광 이미징용
레이저 스캐닝 공침 현미경	일본 니콘	N/A	공침 이미징용; 모델 지정 안 함
Matrigel 기저막 매트릭스	코닝	354262	고농도(HC), 페놀 레드 무첨가, LDEV 무첨가, 10 mL
페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)	Gibco	15140-122	세포 배양용 페니실린-스트렙토마이신 용액, 100×, 100 mL
인산염 완충 생리식염수(PBS)	리지 바이오	AC08L011	1×, 무균, 500 mL
T25 세포배양 플라스크	ABCBIO	ABC707008	T25, 환기 캡, 조직배양 처리, 부착 세포 배양용
트립신-EDTA(0.25%)	Gibco	25200-056	0.25% 트립신-EDTA 용액, 100 mL