소약동물정자 쥐 모델에서의 이소플루란 보조 전기침술

요약

이 프로토콜은 쥐에서 아데닌 유도 올리고유정자증 모델을 구축하고, 이후 이소플루란 마취 하에 CV3, CV4, ST36, SP6에 전기침술을 투여하는 과정을 상세히 설명합니다. 결과는 컴퓨터 지원 정자 수와 운동성 분석, 그리고 고환 조직학과 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통해 검증되었습니다.

초록

올리고세력동물정자증은 남성 생식 기능 장애의 가장 흔한 형태 중 하나입니다. 설치류 연구에서 전기침술(EA)을 반복 세션에 걸쳐 일관되게 시행하는 것은 기술적 도전 과제를 제기하며, 특히 복부 정중선과 뒷지 경혈을 결합할 때 안정적인 전극 접촉이 매우 중요합니다. 중지(CV3), 관원(CV4), 조산리(ST36), 산인자오(SP6)는 불임 및 정액 이상 침술 시술에서 자주 사용되며, 복부 중간선과 뒷다리 배치가 표준화된 전극 쌍에 적합하기 때문에 선정되었습니다. 본 보고서는 아데닌 유도 쥐 모델인 올리고아스테노유소정자증 모델을 구축하고, CV3–CV4 및 ST36–SP6의 쌍 자극을 이용한 이소플루란 보조 EA를 투여하는 실용적인 프로토콜을 설명합니다. 수컷 스프래그-도울리 쥐는 생식 장애를 유도하기 위해 28일간 매일 가베지로 아데닌을 투여했습니다. 이후 EA는 흡입 마취 하에 매일 투여되었으며, 유도 시 3% 이소플루란, 마스크 유지에 1.5%를 사용하여 안정된 바늘 배치와 전극 쌍(CV3–CV4 및 ST36–SP6)을 정의된 자극 매개변수(2 Hz, 1.5 mA, 30분)로 유지하였습니다. 치료 효과는 정자 수 및 운동성을 위한 컴퓨터 지원 정액 분석을 통해 평가되었으며, 고환 헤마톡실린과 이오신(HE) 조직학을 보조하였습니다. 대표적인 결과는 아데닌 노출이 정자 수와 운동성을 감소시키고 분세성 세뇨관 구조를 교란시켰으며, EA는 정액 매개변수와 고환 형태의 부분 회복과 관련이 있음을 보여준다. 이 프로토콜은 일관된 EA 전달과 소유약동물정자 쥐 모델에서 정액/조직학적 검증이 필요한 연구에 적합한 참고 자료를 제공합니다.

서론

남성 요인이 불임에 크게 기여하며, 전체 불임 부부의 약 절반을 차지하며, 정자 수와 운동성의 이상이 가장 흔한 임상 소견 중 하나입니다 ^1,2. 정자 농도 감소와 운동성 저하가 특징인 올리고아스테노유머정자증은 남성 생식기능장애의 가장 흔한 형태 중 하나입니다 ^3,4. 보조 생식 기법과 경험적 의료 치료가 있음에도 불구하고, 정액 질을 개선하는 효과적인 전략은 제한적이며, 이는 추가 전임상 연구의 필요성을 강조합니다 ^5,6,7. 이러한 임상 및 중개 요구는 통제된 조건 하에서 남성 생식 장애를 연구하기 위한 재현 가능한 실험 워크플로우 개발을 촉진합니다.

침술 중재는 임상 및 실험적 맥락에서 정액 이상과 남성 불임에 대해 연구되었습니다⁸. 임상 연구에서 특정 정액 지표에 대한 잠재적 이점을 시사하지만, 설계, 중재 프로토콜 및 결과 측정^{은 매우 다양}합니다. 9. 전기침술(EA)은 수기 침술보다 통제된 자극 매개변수와 더 균일한 조절을 제공하여 치료 관련 생식 결과 변화를 평가하기 쉽게 하므로 실험실 연구에 특히 적합합니다^{10, 11, 12}. 이러한 절차적 이점 덕분에 EA는 남성 생식 연구에서 체계적인 전임상 워크플로우에 적합합니다.

동물 모델은 이러한 평가의 중심이지만, 모델 선정은 소유력동물정자 연구에서 여전히 핵심 방법론적 쟁점입니다. 최근 체계적 문헌고찰에서는 부술판 유도 모델링 방법이 논란이 많으며 평가 지수에서 상당한 이질성을 보인다는 점을 지적하여, 더 명확한 절차와 일관된 판독이 필요함을 강조했습니다¹³. 아데닌 기반 모델은 아데닌 가베지가 쥐의 생식 장애를 유발할 수 있어 실용적인 실험적 접근법을 제공하는데, 여기에는 정자 관련 종말점 감소와 고환 조직 조직 손상 등이 포함됩니다^14,15. 이전 연구에서는 아데닌 유도 올리고무기 정자 쥐 모델을 Shu-Mu 뇌신장 경혈 세트(Epangsanxian, BL23, GB25, KI3)와 비경혈점 및 양성 약물 대조 조건과 함께 EA로 치료했으며, ELISA¹⁶에 의해 정량화된 장기 계수 및 혈청 호르몬 수치를 포함한 확장 결과 측정을 수행하였습니다. 이 실험적 기반을 바탕으로 기존 경혈 연구 전반에 걸쳐 경혈 선택, 대조군 설계, 자극 매개변수 및 결과 측정의 이질성을 인식하여, 본 프로토콜은 안정적인 경혈 전달을 위한 방법론적 워크플로우를 정제하고 확장하기 위해 설계되었습니다.

따라서 본 프로토콜은 설치류에서 반복적인 EA 세션에 중요한 두 가지 실질적 변수를 해결하는 전달에 중점을 둡니다. 첫째, 동물의 움직임과 리드 와이어 견인으로 인한 바늘 이동과 간헐적 전극 접촉을 방지하기 위해, 자극 중 위치 안정화와 세션 전반에 걸쳐 신뢰할 수 있는 전극 접촉을 보장하는 이소플루란 유지 절차를 설명합니다; 이는 복부 중앙선 포인트와 뒷다리 포인트를 결합할 때 특히 중요합니다. 둘째, 이전 리뷰 및 경혈-처방 분석 ^9,17을 바탕으로 CV4, SP6, ST36, CV3가 불임 및 정액 이상 프로토콜에서 일반적인 생식 경혈점임을 확인하여, CV3, CV4, ST36, SP6를 선정하여 CV3-CV4와 ST36-SP6에 쌍으로 자극을 적용하였다. 복부 중앙선과 뒷다리 지점을 결합한 이 구성은 전극 연결을 표준화하고, 불안정한 리드 부착으로 인한 변동성을 최소화하며, 반복 치료 세션에서 재현 가능한 EA 전달을 지원합니다. 프로토콜 지향적 범위를 유지하고 이전에 보고된 내분비, 기전적 또는 양성 대조군 모듈의 중복을 피하기 위해, 결과 검증은 1차 정액 및 테스티스 판독 세트로 제한됩니다. 이 세트는 컴퓨터 지원 정자 분석과 고환 HE 염색을 포함하며, 이 워크플로우 내에서 성공적인 표현형 유도 및 치료 관련 변화를 확인하기에 충분합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 실험동물 관리 및 사용에 관한 기관 지침을 준수했으며, 닝샤 의과대학 윤리위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. IACUC-NYLAC-2021-130). 8주 된 수컷 스프래그-도울리 쥐(몸무게 180–220g)는 닝샤 의과대학 실험동물센터(라이선스 번호)에서 확보되었습니다. SYXK (닝) 2020-0001). 동물들은 22–24°C, 52%–56% 상대습도의 표준 실험실 조건 하에 12시간 빛/12시간 어둠 주기로 방치되었으며, 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다.

1. 동물 준비, 그룹 배정 및 아데닌 유도 모델 구축

1. 실험 7일 전부터 쥐를 적응시키고 매일 전반적인 상태를 모니터링하세요.
2. 적응 후에는 9마리의 쥐에게 고유 식별 번호를 할당하고, 컴퓨터 생성 무작위화 순서를 사용해 1:1:1 비율로 무작위로 세 그룹으로 배정합니다: 대조군(n = 3), 모델 그룹(n = 3), EA 그룹(n = 3). 각 쥐를 실험 대상으로 삼고, 사전 정해진 제외 기준이 충족되지 않는 한 모든 동물과 샘플을 최종 분석에 포함시키세요.
3. 컴퓨터 지원 정액 분석 및 조직학적 평가를 수행하는 연구자들은 그룹 배분에 대해 눈 감고 진행해야 합니다.
   참고: EA를 시행하는 연구자들은 개입이 눈에 띄는 집단 특화 절차를 포함하므로 블라인딩이 불가능합니다.
4. 0.5%(w/v) 아라비아 고무를 부유제로 함유한 20 mg/mL 아데닌을 생리식염수에 현탁액으로 준비하고, 가베지 전과 중에 모두 충분히 섞어 침전을 방지합니다.
5. 대조군에는 정상 식염수를, 모델 및 EA 그룹에는 10 mL/kg(체중 100 mL/100 g에 해당)의 가베지를 통해 아데닌 현탁을 하루 1회 28일 연속으로 투여합니다. 아데닌 용량은 200 mg/kg/일에 사용하세요.
6. 모델 기간 동안 체중과 전반적인 컨디션을 기록하세요.
   참고: 아데닌은 현탁액으로 투여되며 취급 중에 침전되는 경향이 있습니다. 가베지 중에는 지속적인 교반을 유지하여 강수량을 최소화하세요. 그렇지 않으면 투여 불일치와 가베지 바늘 막힘을 유발할 수 있습니다. 막힘이 발생하면 용액을 완전히 재현탁한 후 가비지 바늘을 교체한 후 계속 진행하세요.

2. 전기침술 투여를 위한 이소플루란 마취 (그림 1)

1. 유도실, 코 마스크, 온열 패드가 포함된 이소플루란 마취 시스템을 준비하세요.
2. 유도 챔버에서 3% 이소플루란으로 마취를 유도하여 자발적 활동이 현저히 감소할 때까지 마취를 유도합니다.
3. 쥐를 엎드린 상태로 온열 패드로 옮기고, EA 내내 코 마스크를 통해 1.5% 이소플루란으로 마취를 유지하세요.
4. 자발적인 움직임을 줄이고 눈 깜빡임 반사를 잃으면서 적절한 마취를 확인하되 규칙적인 호흡을 유지하세요.

3. 자극 전달 정확도 및 품질 관리

1. 온열 패드를 사용해 세션 내내 체온을 유지하고 저체온증으로 인한 생리적 변동을 줄이세요.
2. 모든 동물과 세션에 일관된 마취 설정을 적용하며, 유도 시에는 3% 이소플루란을, 유지 시에는 1.5% 이소플루란을 사용하세요. 마취 깊이는 최소한으로 유지하여 고통을 방지하고 규칙적인 호흡을 유지하세요.
3. 멸균 일회용 침술 바늘(0.25mm × 13mm)을 선택한 경혈에 수직으로 삽입합니다. 바늘을 CV3와 CV4에서 약 2mm, ST36에서 7mm, SP6에서 5mm까지 삽입합니다.
4. 바늘 삽입 및 전극 연결 후, 각 바늘이 안정적으로 위치해 있으며 호흡이나 팔다리 움직임으로 인한 느슨함이 관찰되지 않는지 시각적으로 확인합니다. 변위가 발생하면 바늘을 원래 깊이로 수직으로 다시 삽입하고 전극 접촉이 안정되는지 확인한 후 자극을 재개합니다.
5. 전극 리드를 바늘 손잡이 근처에서 클립으로 고정한 후, 납 무게와 당김이 흔한 박리 원인이므로 접힘 최소화를 위해 선을 라우팅하고 고정하세요.
6. 경보점에서 경미한 근육 떨림이 생기면서 신체 움직임이 심하지 않은지 확인해 효과적인 자극을 확인하세요. 떨림이 없다면 전극 접촉과 바늘 위치를 다시 확인하고 확인하세요.
7. 세션 중간에 15분에 단일 표준화 점검을 수행하세요. 필요하다면 바늘을 재조정하고 경미한 국소 떨림을 재확인한 후 동물 간 자극 전달의 변동성을 줄이세요.
   참고: EA 장치를 연결할 때는 케이블 무게로 인한 접힘을 줄이기 위해 니들 핸들의 근위 쪽 끝에 리드를 클립으로 고정하세요. 필요하다면 시술 중 손이 떨어지지 않도록 리드나 바늘을 테이프로 고정하세요.

4. 전기침 치료 (그림 2)

1. 28일간의 아데닌 가비지 다음 날부터 EA를 시작하고, 28일 연속으로 하루 한 번 투여하세요.
2. 이소플루란 마취 하에서 하복부와 뒷다리를 노출시키고, 표면 해부학적 랜드마크를 이용해 종지(CV3), 관원(CV4), 주산리(ST36), 산인자오(SP6)를 찾아라.
3. 멸균 일회용 침술 바늘(0.25 mm × 13 mm)을 수직으로 2 mm, ST36 깊이 7 mm, SP6 깊이 5 mm까지 삽입합니다.
4. 한 쌍의 전극은 CV3와 CV4에, 다른 한 쌍은 ST36과 SP6에 연결하세요.
5. 2Hz와 1.5mA로 30분간 전기 자극을 제공합니다. 이 매개변수들을 사용하여 이전에 아데닌 유도 올리고아스테노유저정자증에 적용된 것과 일치^합니다.
6. 3절에 명시된 품질 관리 검사를 적용하며, 15분에 세션 중 단일 점검을 포함합니다.
   참고: 용탕의 『실험적 침술 및 몹시 과학』¹⁸호 부록 II ("실험동물에서 흔히 사용되는 침점")과 비교 해부학적 특징을 참고하여 쥐 경혈을 위치시키세요. 쥐 경보점은 고정된 기하학적 점이 아닌 독립적인 해부학적 영역을 나타내므로, 일관된 신체 위치, 고정된 해부학적 기준점, 그리고 동물과 세션 전반에 걸쳐 밀리미터 단위의 표면 측정을 사용하세요. 종지(CV3)는 배측 중앙선, 배꼽 중심에서 꼬리쪽 약 33mm 지점에 위치한다. 관원(CV4)은 복부 중심선, 배비 중심에서 꼬리쪽 약 25mm 지점, 복벽의 피하 표면동맥 근처에 위치한다. 무릎 후외측, 즉 섬유골 머리에서 약 3mm 떨어진 곳에 주산리(ST36)를 위치시킵니다. 산인교(SP6)는 뒷다리의 내측, 내측 망골 끝에서 약 10mm 근처에서 위치한다. 모든 동물과 치료 세션에서 동일한 위치 기준, 신체 위치, 삽입 각도, 삽입 깊이를 일관되게 적용하세요.

5. 샘플 채취

1. 마지막 EA 세션 후 24시간 동안 쥐들을 단식하세요.
2. 조직 채취 전에 2% 펜토바르비탈 나트륨을 복막 내 주사로 2mL/kg에 투여하여 깊은 마취를 유도합니다. 발달 철회 반사와 자발적 움직임이 없으면 심마취를 확인하세요.
3. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 심마취 하에 참수하여 쥐를 안락사시킨다.
4. 즉시 생식기를 무균으로 노출하세요. 정자 분석을 위해 한 개의 꼬리 부고환을 분리하고, 조직학적 검사를 위해 한 개의 고환을 절제하세요.
5. 조직학적 처리 전에 고환을 4% 파라포름알데히드에 최소 24시간 고정하세요.

6. 정자 분석

1. 꼬리 부고환의 주변 지방을 제거한 후, 즉시 37°C로 예열한 2mL 생리식염수에 조직을 넣으세요.
2. 조직을 37°C 수조에 5분간 배양한 뒤, 안과 가위로 다진 후 200메시 스크린으로 현탁액을 걸러내고, 여과액을 부드럽게 섞습니다.
3. 정자 현탁액 10μL 알리코트를 예열된 계수실에 주입하고, 컴퓨터 지원 정액 분석(CASA) 시스템을 사용해 정자 수와 운동성을 분석합니다.
4. 동일한 챔버 유형, 가열 조건, 채취 설정을 모든 실험 내 샘플에 사용하세요.

7. 고환 조직의 조직학적 검사

1. 고환 조직을 최소 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하세요. 목표 부위를 다듬고 라벨이 붙은 카세트에 넣으세요.
2. 샘플을 등급 에탄올 계열로 탈수한 뒤, 자일렌으로 정화한 뒤 파라핀으로 침투한 뒤 삽입한 후 4 μm 절획합니다.
3. 40°C 물욕에 구간을 띄운 뒤 슬라이드에 장착한 뒤 60°C 오븐에서 건조하세요.
4. 헤마톡실린과 에오신 염색의 경우, 절편을 실렌으로 왁스를 제거한 후 등급 에탄올로 재수화한 뒤, 헤마톡실린으로 5–10분, 에오신으로 1–5분간 염색한 후 탈수, 투명화 후 마운트합니다.
5. 모든 그룹에서 일관된 배율 설정 하에서 분세관 조직과 정자 생성 세포 배열을 조사합니다.

8. 모델 구축 및 치료 관련 변화 평가

1. 대조군에 비해 정자 수 및 운동성 감소, 그리고 분쇄성 세뇌관 구조가 혼란적으로 나타나 모델 확립을 확인하라.
2. EA 그룹에서 모델 그룹에 비해 정자 수 및 운동성 증가, 그리고 분세관 형태의 부분 복원을 통한 치료 관련 변화를 확인한다.
3. 정자 처리 지연, 챔버 로딩 실패, 모델링과 관련 없는 저품질 절편과 같은 기술적으로 손상된 샘플을 사전 정의하여 제외 기준으로 삼으세요. 분석 중 제외 사항을 문서화하세요.

결과

정자 분석 (그림 3)
정자 수와 운동성을 정량화하기 위해 컴퓨터 지원 정액 분석 시스템을 사용하여 정자 수와 운동성을 정량화하기 위해 부고고체 정자 현탁액을 분석하였습니다. 이 대표적인 데이터셋에서 아데닌 투여는 대조군에 비해 두 매개변수 모두를 현저히 감소시켜 성공적인 모델 구축을 확인했습니다. EA 개입은 모델 그룹에 비해 정자 수와 운동성을 증가시켰습니다(그림 3). 일원 ANOVA 결과는 정자 수(F = 78.39, P < 0.001)와 정자 운동성(F = 374.81, P < 0.001)에서 유의미한 집단 효과를 보였음을 나타냈습니다. Bonferroni 조정 사후 비교 결과, 대조군과 모델 그룹 간, 그리고 모델군과 EA 그룹 간 유의미한 차이가 드러났습니다.

고환 조직학 (그림 4)

토론

탈약수정자증의 다요인 원인과 이용 가능한 약리학적 치료의 제한된 효능을 고려할 때, 침술과 EA는 반복 가능한 비약물학적 중재로 주목받고 있습니다¹⁹. 기존 임상 및 전임상 문헌은 침술 또는 EA가 남성 생식 기능에 영향을 미칠 수 있는 여러 그럴듯한 기전을 제시하는데, 여기에는 신경내분비 조절 조절, 생식 기관 미세순환 개선, 정자 생성을 저해하는 산화 스트레스 및 염증 반응 완화 등이 포함됩니다²⁰. 이러한 제안된 기전들은 정액과 고환 조직학을 주요 측정 지표로 사용하여 통제 동물 연구에서 EA를 평가하는 번역적 근거를 제공합니다.

EA는 프로토콜 중심의 전임상 연구에 특히 적합한데, 주파수, 강도, 세션 지속 시간, 전극 쌍 등 자극 매개변수가 수동 바늘 조작보다 더 일관되게 지정되고 재현될 수 있기

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd.	A8330
CASA 컴퓨터 보조 정액 분석 시스템	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co.,Ltd.	VICOS-SPERM
원심분리기	Sartorius	A-14C
분화 용액	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co.,Ltd	C0163M
일회용 멸균 침술 바늘	Hanyi 브랜드		0.25 mm ´ 13 mm
건조 기계	Leica	HI1220
전기 자극기	Changzhou Yingdi Electronic Medical Device Co., Ltd	KWD-808I
전자 저울	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co.,Ltd	HLD-6002
Eosin Y 염색 용액	Lanke Biotech	BS248
헤마톡실린 염색 용액	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
마이크로톰	Leica	RM2255
중성 발삼	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,Ltd	Zli-9555
파라핀 임베딩 기계	Leica	HistoCore Arcadia H
SD 쥐	Ningxia Medical University 동물 센터		8주령, 남성, 180-220 g
슬라이드 스캐너	Leica	Aperio LV1
소형 동물 마취 기기	RWD Life Science Co., Ltd.	R500
보르텍스 진동기	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co.,Ltd	QL-902
온난화 패드	Dongguan Hongda Electronics Co., Ltd.	45W-80X28CM