방법 논문

마우스 무릎 골관절염에 대한 전기침 치료의 다각적 평가

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DOI:

10.3791/71901

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2026년 10월 6일

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1Department of Acupuncture and Moxibustion, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Science and Technology for Brain-Inspired Intelligence, Fudan University, 4Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 연골 염색 및 국제 골관절염 연구학회(OARSI) 점수 산정을 포함하여, 전기침 치료 후 골관절염이 있는 마우스에 대한 다중 모드 종단적 평가를 위해 행동 및 영상 기술을 결합하였습니다.

초록

골관절염은 주로 무릎에 영향을 미쳐 통증, 부종, 강직 및 기능적 제한을 유발하는 만성 퇴행성 관절 질환입니다. 활막 염증과 관절 주변 근육의 변화는 질환의 발생과 진행에 기여합니다. 임상적 근거에 따르면 전침 치료는 국소 염증을 완화하고 연골 대사를 조절할 수 있습니다. 본 연구에서는 내측 반월상 연골의 외과적 불안정화를 통해 마우스에서 무릎 골관절염을 유도하였습니다. 결과는 로타로드 테스트, 초음파, 적외선 열화상 촬영, 자기공명영상 및 조직학적 염색으로 구성된 다중 모드 프로토콜을 사용하여 평가되었습니다. 관절강 부피와 피부 온도를 종단적으로 모니터링하였으며, 최종 시점의 자기공명영상과 Safranin O-Fast Green 염색을 통해 관절 주변 근육의 신호 변화와 연골 병리를 평가하였습니다. 전침 치료는 운동 능력 향상, 관절 부종 감소, 국소 피부 온도 상승, 자기공명영상에서의 관절 주변 근육 신호 변화 감소, 그리고 더 낮은 연골 퇴행 점수와 연관이 있었습니다. 이러한 결과는 전임상 마우스 모델에서 전침 관련 결과를 평가하기 위한 이 다중 모드 프로토콜의 유용성을 뒷받침합니다.

서론

무릎 골관절염(KOA)은 전 세계적으로 가장 흔한 골관절 질환으로, 약 2억 5천만 명의 사람들이 영향을 받는 것으로 추정됩니다1. 이 질환의 병리적 특징으로는 점진적인 연골 퇴행과 활막 증식이 있으며, 임상적으로는 통증, 부종 및 기능 장애로 나타납니다2,3.

골관절염(OA)은 오랫동안 비염증성 관절 질환으로 간주되었으나, 현재는 대부분의 환자에게서 활막염이 검출되는 등 염증성 성분이 포함되어 있는 것으로 인식되고 있습니다. interleukin (IL)-1β 및 IL-18과 같은 염증성 사이토카인은 활성 산소 및 생체역학적 스트레스와 함께 병리적 과정에 기여하는 것으로 생각됩니다4. 염증은 흔히 국소 혈류 증가를 동반하며, 이는 임상적으로 발적, 열감 및 부종으로 나타납니다5. 염증은 연골 분해와 기능 저하를 가속화할 뿐만 아니라, 특히 질환의 초기 단계에서 활발하게 나타날 수 있습니다. 따라서 시간에 따른 염증 상태를 모니터링하면 근본적인 메커니즘을 표적으로 하는 치료 전략을 수립하고 단계별 맞춤 관리를 가능하게 할 수 있습니다6,7. 마우스 무릎에 초음파(US) 스캐닝을 사용한 이전 연구들은 경골과 대퇴골 과(condyle) 사이의 삼각형 영역을 확인했습니다. 조직학적 분석 결과, 이 영역에는 활막, 반월상 연골, 지방 패드를 포함한 연조직과 활액으로 채워진 공간이 포함되어 있음이 확인되었습니다. 초음파로 검출되는 이 영역은 앞서 언급한 연조직 영역들을 포함하는 관절 간 부피(interarticular volume)로 정의됩니다8.

또한, 온도는 관절 염증의 진행 상황을 직접적으로 반영하는 핵심적인 물리적 파라미터입니다. 국소 온도 상승은 염증의 4대 주요 징후 중 하나이며, 열화상 촬영을 통해 이러한 열적 변화를 정밀하게 검출하고 정량화할 수 있습니다9. 최근의 체계적 문헌고찰에서는 피부 표면 온도와 염증성 및 퇴행성 관절 질환 모두 사이의 상관관계가 강조되었으며10, 이는 관절염 연구 및 임상 관리에서 적외선 열화상 촬영(IRT)의 유용성을 더욱 입증합니다11. 더욱이 IRT는 조직 관류 및 대사 활동과 관련된 간접적인 측정치를 제공하여 치료 반응을 모니터링하는 데 유용할 수 있습니다.

본 연구에서는 OA 마우스 모델에서 전기침(EA)의 효과를 평가하기 위해 로타로드 테스트, 초음파(US), 적외선 열화상 촬영(IRT) 및 자기공명영상(MRI)을 결합하였습니다. 이러한 다중 모드 접근 방식은 조직학적 분석만으로는 얻을 수 없는 운동 성능, 관절 형태, 열 변화 및 연부 조직 염증의 동시 평가를 가능하게 했습니다. 중요한 점은, 이 패널이 최소한의 추가 비용이나 노동력으로 여러 생물학적 수준에 걸쳐 상호 보완적인 정보를 제공한다는 것입니다. 따라서 이는 시간이 경과함에 따라 반복적인 비침습적 모니터링이 필요한 전임상 연구, 특히 조사 중인 중재법의 효과가 완만할 것으로 예상되거나 반응의 시간적 프로파일이 불확실한 경우에 특히 적합합니다. 저희가 알고 있는 한, 본 연구는 관절강 부피, 근육 염증 및 국소 온도를 포함하는 이러한 특정 기술 조합을 사용하여 OA에서 전기침에 대한 치료 반응을 추적한 첫 번째 연구입니다. 저희가 설명하는 프로토콜은 실용적이고 재현 가능하며, 유사한 실험 설정에서 향후 종단적 실시간 효능 평가를 위한 유용한 참고 자료가 될 수 있을 것으로 믿습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 Wuchuang Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. 실험동물 윤리위원회의 심의 및 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호: WTPZ20260209001). 본 연구에 사용된 모든 동물은 상업적 공급업체로부터 구입한 체중 약 20 g의 8주령 C57BL/6 마우스였습니다(재료 표 참조). 실험에는 총 24마리의 마우스가 포함되었습니다. 1주일간의 적응 기간을 거친 후, 동물들을 무작위로 배정하여 4가지 실험 조건에 각각 6마리씩 할당하였습니다. 실험 조건은 가짜 수술(sham surgery), 내측 반월상 연골 불안정화(DMM), 가짜 침 치료(SA) 및 전기침 치료(EA)로 구성되었습니다. 사용된 동물 수는 사전 표본 크기 계산 없이 결정되었으며, 대신 유사한 골관절염 모델과 평가 지표를 사용한 이전의 전기침 연구들을 참고하고 3R 원칙에 따라 그룹 크기를 선정하였습니다.

1. 수술 전 관리 및 모델링

참고: 모든 모델링 절차는 숙련된 수술 기술자에 의해 수행되었습니다. 동물들이 가열 패드 위에서 의식을 회복한 후에만 케이지로 돌려보내십시오.

  1. 실험 시작 전 최소 7일 동안 마우스를 실험 환경에 적응시킨다.
  2. 수술 전 모든 수술 기구를 멸균한다. 수술 부위를 철저히 소독한다.
  3. 가스 마취 장비를 켠다. 마우스를 유도 챔버에 넣고 2–3% isoflurane으로 5분간 전신 마취를 유도한다.
  4. 마취 유도가 완료되면 마우스를 수술대로 옮긴다. 수술 절차가 완료될 때까지 마취 마스크를 통해 1–1.5% isoflurane을 지속적으로 투여하여 마취 상태를 유지한다.
  5. 무릎 관절이 위를 향하도록 마우스를 앙와위로 배치한다. 자세가 안정적이고 수술 부위가 완전히 노출되었는지 확인한다. DMM을 사용하여 오른쪽 뒷다리에 모델을 제작한다12. Sham 군의 경우, 동일한 위치에 절개창을 낸 후 봉합하여 닫는다.
    1. DMM 수술 과정
      1. 무릎 관절을 노출시키기 위해 1 cm 길이의 종방향 내측 슬개골 주변 절개를 실시한다.
      2. 단계 1.5.1.1에서 만든 내측 슬개골 주변 절개창을 통해 관절낭에 종방향 개구부를 만든다. 포셉을 사용하여 관절낭을 주변 조직으로부터 충분히 분리한다. 그런 다음 과도한 압력을 가하지 않고 왼손으로 뒷발 원위부를 지지하며, 포셉을 사용하여 슬개골과 슬개인대를 외측으로 이동시켜 무릎 관절을 노출시킨다. 이 과정 전반에 걸쳐 부상을 방지하기 위해 발을 조심스럽게 다룬다.
        참고: 관절낭이 적절히 이완되어야 최소한의 힘으로 슬개골을 이동시킬 수 있다.
      3. 수술 중 관절 연골 표면의 건조를 방지하기 위해 멸균 식염수를 떨어뜨린다.
      4. 내측 대퇴 과와 내측 경골 고원 사이의 공간에서 내측 반월상 연골을 찾는다. 외측면에서부터 내측 반월상 경골 인대를 따라 경골 과간 융기 부착부까지 추적한다. 뒷발을 손으로 부드럽게 고정하고 10번 수술용 메스로 인대를 절단하되, 내측 반월상 연골 아래의 연골에 닿지 않도록 주의한다. 참고: 관절 연골 및 다른 인대가 손상되지 않도록 주의한다. 많은 경우, 인대를 확인하기 위해 상단의 지방 패드를 제거하지 않고 뒤로 젖혀야 한다.
      5. 무릎 관절낭의 가장자리를 근접시킨 후 6-0 흡수성 봉합사로 고정한다.
      6. 6-0 silk 봉합사로 피부를 봉합한다12.
  6. 수술 후 관리로, 국소 진통을 위해 수술 부위에 0.25% bupivacaine 한 방울을 투여하고, 마우스가 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 유지한다.
    참고: 마취 중 산소 유량을 0.5–1 NL/min 범위 내로 유지한다. 마취 성공 여부는 정위 반사 소실, 발가락 꼬집기에 대한 회피 반응 부재, 그리고 안정적이고 규칙적인 호흡을 통해 확인하였다. 수술 전반에 걸쳐 연골 수분 유지를 위해 멸균 인산완충식염수(PBS)를 세척액으로 사용한다. 관절낭 폐쇄를 위한 흡수성 봉합사와 피부 폐쇄를 위한 silk 봉합사의 구체적인 크기 및 사양은 재료 표(Table of Materials)에 상세히 기재되어 있다.

2. 전기침 치료

참고: SA 및 EA 그룹의 중재는 모델 구축 1주 후에 시작되었습니다 (그림 1A). 두 그룹 모두 4주 동안 매 세션당 15분씩, 주 3회, 격일로 치료를 받았습니다. Sham 및 DMM 그룹은 침 자극이나 전기 자극 없이 동일한 일정으로 동일한 마취 및 고정 절차를 거쳤습니다. 모든 작업자는 혈위 선택, 삽입 각도 및 깊이의 일관성을 보장하기 위해 실험 전 교육을 받았습니다.

  1. 마우스를 유도 챔버에 넣고 isoflurane으로 마취 유도를 한 후 꺼냅니다.
  2. 정지되고 안정된 상태를 유지하기 위해 전체 전침 시술 동안 isoflurane(100% O₂ 중 1.5–2.0%)을 이용한 지속적인 흡입 마취 하에 마우스를 앙와위로 유지합니다.
  3. 마우스의 혈위를 정확하게 찾습니다. 하지의 ST36(족삼리) 및 SP10(혈해) 혈위에 두 개의 일회용 멸균 침(0.16 mm × 25 mm)을 피부 깊이 5 mm까지 삽입합니다13 (그림 1B).
    ​참고: ST36은 경골 전결절의 외측 1 mm, 비골두 하단 3 mm, 그리고 무릎 관절 바로 아래에 위치합니다. SP10은 무릎을 굽혔을 때 대퇴 내측, 슬개골 상내측 가장자리에서 3 mm 위, 대퇴사두근의 내측 돌출부에 위치합니다.
    1. SA 그룹의 경우, ST36 또는 SP10이 아닌 인접한 비혈위 부위에 약 1 mm 깊이로 침을 천층으로 삽입하고, 전류를 흘리지 않은 상태로 전침 장치에 연결합니다14.
      참고: 따라서 SA 그룹은 침 삽입 위치, 삽입 깊이 및 전기 자극의 부재 측면에서 EA 그룹과 다르지만, 그 외 모든 절차적 파라미터는 동일하게 맞춥니다. DMM 그룹과 비교하면, SA 그룹은 전류 없이 비혈위 천층 자침 및 장치 연결을 수행하는 반면, DMM 그룹은 마취 및 고정만 수행합니다.
  4. 침을 전침 장치에 연결하고 2/100 Hz, 2 mA로 자극을 가하여 가벼운 근육 떨림이 일어나게 합니다. 모델링 7일 후부터 주 3회, 15분 동안 전침 자극을 시작하여 4주 동안 지속합니다.
  5. 처치 후 마우스를 가열 패드 위에 올려두고, 의식을 회복하면 케이지로 되돌립니다.

3. EA 효능의 역동적 평가

참고: 모든 평가(rotarod 테스트, US, IRT, MRI 및 OARSI 스코어링)는 그룹 할당 내용을 모르는 연구자에 의해 수행되었으며, 모든 데이터 분석이 완료될 때까지 그룹 식별 정보는 은폐되었습니다. 영상 획득과 데이터 분석은 서로 다른 담당자가 처리하였으며, 조직학적 평가는 치료 그룹을 모르는 두 명의 병리학자가 독립적으로 수행하였습니다. 평가자 중 누구도 동물 배정이나 전자침 치료 중재에 참여하지 않았습니다.

  1. 로타로드 피로도 검사
    1. 정식 테스트 전, 마우스가 실험 장치에 익숙해지도록 사전 훈련을 실시합니다.
    2. 정식 테스트 동안, 각 마우스를 로타로드(rotarod) 위에 개별적으로 올리고, 마우스가 떨어질 때까지 분당 4회전의 속도로 가속합니다.
    3. 각 마우스가 봉 위에 머무는 시간을 즉시 기록하십시오. 각 마우스의 시험 간에는 30분의 간격을 두며, 3회 반복 시험을 통해 평균값을 산출하십시오.
      참고: OA 모델 구축 전과 EA 치료 완료 후에 로타로드 테스트를 실시하여 운동 협응력을 평가하십시오. 수술 후 통증을 최소화하기 위해, 수술 후 첫 일주일 동안은 로타로드 데이터 수집 횟수를 줄이십시오.
  2. 소동물 초음파 검사
    ​참고: 초음파 영상 촬영 및 관절강 묘사를 위한 단계별 절차는 다음에서 확인할 수 있습니다. 그림 2.
    1. 공식적인 데이터 수집 전, 마우스가 운동 기능을 상실할 때까지 마취 챔버에 넣은 후 제모 크림을 사용하여 오른쪽 무릎 관절의 털을 제거합니다. 마우스의 털을 제거할 때는 최대한 부드럽게 수행해야 하며, 마우스의 자극을 최소화하기 위해 따뜻한 물로 부드럽게 닦아냅니다.
      참고: 모든 부피 측정 과정이 완료되고 통계 분석을 위해 그룹 정보가 공개될 때까지, 동물 코드와 시점만을 표시하여 분석 중 맹검 상태를 유지하십시오.
    2. 초음파 시스템의 전원을 켜고 소동물용 초음파 탐촉자를 장착한 후, 적절한 마우스 검사 프로토콜을 설정하십시오. 이와 동시에 마우스를 케이지에 넣어 지속적인 마취 상태를 유지하십시오.
    3. 마취가 완료되면 마우스를 제어 플랫폼으로 옮기고 비강 마스크를 통해 이소플루란 흡입 마취를 실시한다. 마우스의 머리는 작업자의 반대 방향을 향하게 하고, 꼬리는 작업자 쪽을 향하도록 배치한다.
    4. 무릎 관절을 굴곡시키고 마우스를 고정한 후, 슬개인대 위 피부에 초음파 접촉 매질(US coupling agent)을 도포합니다.
    5. 프로브를 조절하여 무릎 관절과 평행하게 위치시키십시오.
    6. 설정하십시오 스캔 거리 ~로 / ~에게 / ~까지 4 mm 그리고 그 단계 크기 ~로/에게/까지 0.04 mm해부학적 위치를 바탕으로 이미지에서 관절강을 찾으십시오. 프로브 스캔 중에 동물을 움직이지 마십시오.
    7. 이미지를 획득합니다. 대퇴골, 경골, 그리고 그 위의 피부 및 근육 사이의 경계가 뚜렷한 삼각형 영역인 관절강을 식별합니다.
    8. 스캔 결과의 이름을 지정하여 저장한 후, 기존 폴더 구조를 유지한 상태로 분석용 컴퓨터로 내보내십시오.
    9. 소프트웨어를 사용하여 무릎 관절강 부피를 분석하십시오. 다음을 입력하십시오. 연구 모듈을 선택하고, 다음을 클릭하십시오. 가져오기 기능
    10. 데이터 폴더를 찾아 선택하고, 가져올 데이터 파일을 확인한 후 더블 클릭하여 엽니다.
    11. 내부로 표시 모드, 선택 이미지 프로세싱 | 3D 로드 | 단면도 | 부피 측정 | 시작 순차적으로.
    12. 마우스 휠이나 슬라이스 슬라이더를 사용하여 근위부에서 원위부 방향으로 슬라이스를 스크롤하며, 관절강이 처음으로 나타나는 슬라이스를 찾으십시오(일반적으로 대퇴골, 경골, 그리고 그 위의 피부 및 근육 조직 사이에 경계가 뚜렷한 삼각형 영역으로 나타납니다).
    13. 관절강이 처음으로 나타나는 슬라이스에서 트레이싱을 시작하십시오. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 윤곽선 그리기를 시작합니다.
    14. 관절강이 완전히 사라질 때까지 관절강의 가장자리를 따라 점을 찍어 폐쇄된 윤곽선을 그리십시오.
    15. 클릭 완료시스템은 3D 분할 볼륨을 생성하고 볼륨 측정 결과를 출력합니다.
    16. 이미지를 TIFF 형식의 이미지 영역 파일(.tif)로 내보내려면 원하는 파일 유형을 선택하십시오.
  3. 소동물 적외선 열화상 촬영법
    ​참고: 측정은 OA 마우스 모델에서 수술 1일 전, 수술 7일 후 및 치료 종료 시점에 수행되었습니다. IRT는 치료 6시간 후 온도 조절실(22–24 °C), 그리고 촬영 전 30분 동안 마우스의 순응 시간을 가졌다.
    1. 동물을 배와 닿게 눕히고 뒷다리를 펴준 뒤, 무릎 부위가 일정하게 노출되도록 모든 사지를 테이프로 벤치에 고정합니다. 마우스를 유도 챔버에 넣고 완전히 마취될 때까지 이소플루레인을 지속적으로 투여합니다.
    2. 마취된 마우스를 수술대 위에 앙와위로 고정하고 주변 온도를 일정하게 유지하십시오.
    3. 마우스의 뒷다리를 부드럽게 잡아 오른쪽 무릎 관절을 펴준 다음, 적외선 열화상 카메라를 사용하여 해당 부위의 이미지를 캡처하고 온도를 측정하십시오.
    4. 기본 피부 방사율(0.98)을 사용하십시오. 깊은 마취 후 3분이 경과한 시점에서 이미지를 획득하십시오. 무릎 관심 영역(ROI)은 대퇴경골 관절의 내측 관절선으로 정의하고, 발목 ROI는 거퇴 관절의 배측 표면으로 정의하십시오. 이러한 지표를 바탕으로 숙련된 한 명의 작업자가 모든 ROI를 수동으로 설정하십시오.
    5. 장치에 포함된 소프트웨어를 사용하여 영상을 분석함으로써 무릎 관절과 주변 피부의 온도 데이터를 읽고, 온도 구배가 감소하는 발목 및 무릎 관절에 측정 제어점을 설정하십시오.
  4. 소동물 MRI
    ​참고: EA 처리 후, 소동물 MRI를 사용하여 각 군에 속한 마우스 무릎 관절의 국소 염증을 평가하였다.
    1. 마우스를 마취 상자에 넣어 마취시킵니다. 운동 능력이 소실되면 양측 슬관절에 제모 크림을 도포합니다.
    2. 1분 후, 따뜻한 물을 적신 거즈로 제모 크림을 닦아내어 양측 무릎 관절의 제모를 완료합니다.
      ​참고: 마우스의 털을 가능한 한 많이 제거하고, 마취 상태에서 수집을 수행하십시오.
    3. 마우스 크기의 갠트리(gantry)를 사용하여 적절한 프로토콜을 설정하십시오.
      1. 포지셔닝 장치가 3평면 고속 경사 에코 시퀀스(TR/TE = 50/3 ms, 시야(FOV) = 30)를 사용하는지 확인하십시오. × (30 mm, 슬라이스 두께 1 mm)로 설정하여 영상의 중앙에 무릎 관절이 오도록 하며, T2 가중 고속 스핀 에코(T2WI) 시퀀스를 사용하여 마우스 무릎 관절을 스캔합니다.
      2. 다음 스캔 파라미터를 사용하십시오: 반복 시간(TR) 2,500 ms, 에코 시간(TE) 8 ms, 시야(FOV) 20 × 20 mm, 256 매트릭스 × 256, 슬라이스 두께 0.5 mm, 슬라이스 간 간격 없음, 그리고 대퇴 과(femoral condyle)부터 경골 평면(tibial plateau)까지의 영역을 포함하는 10회의 연속 슬라이스로 설정하며, 단일 스캔 시간은 약 8분 20초가 소요될 것으로 예상됩니다.
      3. 검토하십시오 획득한 T2 강조 영상을 통해 무릎 연골, 활막, 관절강 및 주변 연부 조직의 형태학적 변화를 관찰하고, 평가하다 관절삼출, 활막 증식 및 국소 염증.
    4. 마우스를 갠트리(gantry) 위에 놓고, 마스크를 통해 이소플루란으로 흡입 마취를 유도하며, 무릎이 일관되게 위쪽을 향하도록 의료용 테이프로 사지를 고정합니다.
    5. 영상 촬영을 위해 갠트리를 MRI 스캐너 안으로 밀어 넣으십시오.
      1. 3평면 로컬라이저(localizer)에서 무릎 관절 공간이 관상면과 평행한지, 슬랩 중심이 관절 공간과 일치하는지 확인하고, 자화율 아티팩트(susceptibility artifacts)를 방지하기 위해 장관 루프나 공기강이 FOV에서 제외되었는지 확인하십시오. 위치가 맞지 않는 경우, 다시 로컬라이징하여 재스캔하십시오.
    6. 정성적 평가를 위해 획득한 다중 에코 T2 강조 영상을 DICOM 또는 NIfTI 형식으로 내보내십시오.
    7. 무릎 관절 및 관절 주변 연부 조직 내 고신호 강도 영역의 신호 강도와 분포를 시각적으로 검사하여 MR 영상을 평가하고, 내보낸 영상들을 바탕으로 그룹 간 염증 신호를 비교하십시오.

4. 병리학적 및 형태학적 관찰

  1. 마우스 무릎의 고정 및 절편 제작
    1. 마우스에서 채취한 두 개의 무릎 샘플을 10% paraformaldehyde에 48 h 동안 고정한다. 그 후, 샘플을 phosphate-buffered saline (PBS)에 30 min 동안 담근 후 세척한다.
    2. 과도한 수분을 닦아낸 후, 즉시 새로 준비한 탈회 용액(pH 7.2–7.4)으로 샘플을 옮기고 3일마다 용액을 교체한다.
    3. 2주 동안 탈회를 계속하고, 흐르는 물에 샘플을 헹군 다음 75% ethanol에 2 h 동안 담근다.
    4. 조직 처리기에서 18 h 동안 자동 구배 탈수를 수행한다.
    5. 탈수 후, 파라핀 매몰기로 예열된 파라핀 왁스에 샘플을 2 h 동안 담근 후 매몰을 진행한다.
    6. 무릎 관절을 시상면으로 매몰할 때, 내측 관절 표면이 먼저 절단될 수 있도록 아래쪽으로 향하게 배치한다.
    7. 조직 블록을 마이크로톰에 장착하고 4 µm 두께로 연속 절편을 제작한다. 반월판의 중앙 분리 지점에 도달하면 연속 절편 21장을 수집한다.
    8. 절편 확장기 위에 절편을 펼친다. 핀셋을 사용하여 수면 위의 표본을 분리하고 커버슬립으로 회수하며, 커버슬립당 두 개의 표본을 수집한다.
    9. 수분이 완전히 증발하도록 슬라이드 건조기에 슬라이드를 평평하게 놓고 1 h 이상 건조한다. 슬라이드를 표본 상자에 넣고 60 °C 오븐에서 8 h 동안 탈파라핀 처리를 한다. 이후 사용을 위해 따로 보관한다.
      ​주의: 모든 paraformaldehyde 고정액, 탈회 용액 및 ethanol 세척액은 유해 폐기물로 수거하여 기관 지침에 따라 폐기해야 한다.
  2. Safranin O-Fast Green 염색
    1. 염색되지 않은 절편을 염색 랙에 놓고 오븐에서 5 min 동안 가열한다. 이 시간 동안 흄 후드에서 염색액을 준비한다.
    2. 절편을 상온으로 식힌 후, 통상적인 절차에 따라 물까지 탈파라핀 처리를 한다.
    3. 절편을 습식 박스로 옮기고 신선한 Weigert's solution (Part A + Part B)으로 5 min 동안 염색한다.
    4. 물로 3 x 1 s 동안 헹군다.
    5. ethanol에 희석된 1% hydrochloric acid로 15 s 동안 분별 처리한 후, 증류수로 10 min 동안 헹군다.
    6. Fast Green solution으로 4 min 55 s 동안 염색한다.
    7. 잔류 Fast Green을 제거하기 위해 1% acetic acid 용액으로 10-15 s 동안 빠르게 세척한 후, 공기 중에서 건조시킨다.
    8. Safranin O 염색액에 4 min 35 s 동안 담근다.
    9. 95% ethanol로 3-5 s 동안 빠르게 탈수하고, 이어서 absolute ethanol로 2 x 1 min 동안 헹군다.
    10. xylene으로 투명화하고 중성 수지로 봉입한 후, xylene을 증발시키기 위해 흄 후드에 4 h 동안 둔다.
    11. 전슬라이드 스캐너로 절편을 미리 확인하고 스캔한다.
      주의: xylene, 산성 알코올, acetic acid, paraformaldehyde 및 Weigert's solution, Fast Green, Safranin O를 포함하여 본 연구에 사용된 염색액은 유해 물질이다. 모든 조작은 니트릴 장갑, 실험복, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태에서 흄 후드 내에서 수행해야 한다. 사용된 시약 및 세척액을 포함한 유해 폐기물은 분리 수거해야 하며, 특히 xylene 폐기물은 수성 폐기물과 별도로 지정된 용기에 수집하여 기관 규정에 따라 폐기해야 한다.

5. 통계 분석

  1. 연속형 데이터는 평균으로 보고하십시오. ± 별도로 명시되지 않는 한 표준편차(SD)이며, OARSI 점수는 중앙값(P25, P75)으로 보고되었습니다.
  2. 평균값으로 보고된 결과의 경우 ± 표준편차(SD)로 나타내었으며, 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 사후 검정을 사용하여 다집단 비교를 수행하였다. OARSI 점수는 Kruskal-Wallis 검정 후 다음의 방법으로 분석하였다. 사후 분석 두 집단 간의 쌍별 비교를 위해 단측 Mann-Whitney 검정을 이용한 분석15.
  3. 고려하십시오 P 값 < 0.05 통계적으로 유의미한 ("ns" (유의미한 차이가 없음을 나타냄).

결과

로타로드 테스트 결과, EA 그룹의 낙하 잠복기가 DMM 그룹보다 더 길게 나타났습니다 (P < 0.05), 반면 SA 군은 DMM 군과 유의미한 차이를 보이지 않았다 (그림 1C 및 표 1). 모델링 전, 무릎 관절의 종단 초음파 스캔(스캔 거리 4 mm, 스텝 크기 0.04 mm) 결과, 그룹 간 관절강 부피에 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다(그림 3A,B 그리고 표 2). 모델링 일주일 후, 3차원 재구성을 통해 확인한 결과 DMM, SA 및 EA 그룹의 관절강 부피가 Sham 그룹보다 유의하게 더 큰 것으로 나타났습니다 (P < 0.05)였으며, DMM, SA 및 EA 그룹 간에는 유의미한 차이가 없었습니다 (P > 0.05) (그림 3A,C). 4주간의 EA 처치 후, EA 그룹의 관절강 부피는 DMM 그룹보다 유의하게 낮았다 (P < 0.05) (그림 3A,D), 이는 관절강 부종의 감소와 일치하는 결과이다.

IRT는 시야 내의 초점면 온도 정보를 수집하고 표면 온도 분포를 의사색(pseudocolor) 형식으로 표시하는 데 사용되는 기술입니다16. 모델링 전 또는 모델링 1주일 후의 피부 표면 온도는 그룹 간에 유의미한 차이가 없었습니다(그림 4A-C 및 표 3). 그러나 EA 치료 후, DMM 그룹의 피부 표면 온도는 Sham 그룹보다 유의하게 낮았습니다. 반대로, EA 그룹의 피부 표면 온도는 DMM 그룹보다 유의하게 높았으며(그림 4A,D), 이는 EA가 DMM보다 국소 피부 표면 온도를 높이는 것과 관련이 있는 반면, SA는 그렇지 않음을 보여줍니다.

MRI 영상 결과, Sham 군에서는 관절 주변 근육의 신호 이상이 관찰되지 않았으며, DMM 군에서는 신호 변화가 더 뚜렷하게 나타났고, EA 군에서는 변화가 덜 뚜렷했으며, SA 군과 DMM 군에서는 유사한 변화가 관찰되었다(그림 5A). EA 처리 후 오른쪽 무릎 관절을 채취하여 파라핀에 매립하고 4 µm 두께로 시상면 절편을 제작하였다. 절편은 Safranin O-Fast Green으로 염색하였으며, OARSI 조직병리 시스템을 사용하여 등급을 매겼다. Sham 군과 비교하여 DMM 군은 관절 연골 마모가 더 심하고 OARSI 점수가 더 높았다. EA 군은 DMM 군보다 연골 퇴행이 적고 OARSI 점수가 낮았으나(P < 0.05), SA 군은 DMM 군과 유의미한 차이를 보이지 않았다(그림 5B,C 및 표 4).

figure-results-1
그림 1: OA 유도 마우스의 실험 일정, 혈자리 도식 및 로타로드 테스트.(A) 실험 일정. (B) 혈자리 도식. (C) 로타로드 테스트. 그룹당 n = 6. 각 마우스는 3회 시험을 완료함. 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. ### Sham vs DMM, P < 0.001; ns, SA vs DMM, P > 0.05; ** EA vs DMM, P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 초음파 검사 단계별 과정. (A) 마우스를 마취를 위한 유도 챔버에 넣습니다. (B) 뒷다리에 제모 크림을 바릅니다. (C) 크림을 고르게 바른 후 1분간 기다립니다. (D) 거즈로 남은 제모 크림과 털을 닦아냅니다. (E) 제모된 뒷다리 상태를 확인합니다. (F) 영상 획득 전, 마우스를 다시 유도 챔버에 넣어 마취시킵니다. (G) 뒷다리에 초음파 접촉매질을 바르고, 프로브가 뒷다리의 세로축과 평행이 될 때까지 회전시킵니다. (H) 초음파 영상을 획득합니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: OA 유도 마우스의 소동물 초음파 검사 대표 이미지 및 정량적 결과. (A) 수술 전, 수술 1주 후, 그리고 EA 치료 후 무릎 관절의 3차원 초음파 재구성 이미지(스캔 거리 4 mm, 스텝 크기 0.04 mm). 스케일 바 = 2 mm. (B) 수술 전 관절강 부피(그룹당 n = 6). (C) 수술 1주 후 관절강 부피(그룹당 n = 6). (D) EA 중재 후 관절강 부피(그룹당 n = 6). ### Sham vs DMM, P < 0.001; ns, SA vs DMM, P > 0.05; *** EA vs DMM, P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: OA 유도 마우스의 대표적 적외선 열화상 및 정량적 피부 온도 결과. (A) 수술 전, 수술 1주 후 및 EA 처치 후의 하지 열화상. 각 열화상은 적외선 카메라 소프트웨어의 자동 온도 범위를 사용하여 표시되었으므로, 패널 간의 색상을 직접적으로 비교할 수 없습니다. 정량적 비교는 패널 B-D의 산점도를 기반으로 해야 합니다.(B–D) 대퇴경골 관절의 내측 관절선으로 정의된 무릎 관절 관심 영역(ROI)의 정량적 피부 온도 분석.(B) 수술 전 하지 피부 온도(그룹당 n = 6). (C) 수술 1주 후 하지 피부 온도(그룹당 n = 6). (D) EA 중재 후 하지 피부 온도(그룹당 n = 6). 데이터는 평균 ± SD로 표시되었습니다. ### Sham vs DMM, P < 0.001; ns, SA vs DMM, P > 0.05; ** EA vs DMM, P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: OA 생쥐의 관절 주위 근육 신호 변화의 대표적 MRI 영상, 무릎 관절 조직 절편 및 정량적 결과. (A) 각 그룹의 대표적 MRI 영상. (B) 대표적인 Safranin O-Fast Green 염색 무릎 절편. 스케일 바 = 1 mm. (C) OARSI 연골 병리 점수 (그룹당 n = 6). OARSI 점수는 중앙값 (P25, P75)으로 표시됨. ### Sham vs DMM, P < 0.001; ns, SA vs DMM, P > 0.05; ** EA vs DMM, P < 0.01. 여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그룹N5주차
위약(Sham)6101.300 ± 5.416
디지털 멀티미터670.280 ± 3.363###
SA670.060 ± 7.796
전기천공법684.390 ± 9.504**
참고: ### Sham 대 DMM, P < 0.001; ** EA 대 DMM, P < 0.01.

표 1: 로타로드 테스트 (평균 ± 표준편차; 그룹당 n = 6). ### Sham vs DMM, P < 0.001; ** EA vs DMM, P < 0.01.

그룹N0주차1주 차5주차
위약(Sham)62.029 ± 0.0552.056 ± 0.0712.061 ± 0.079
디지털 멀티미터(DMM)62.058 ± 0.0682.591 ± 0.056###2.926 ± 0.088###
SA62.056 ± 0.0452.592 ± 0.0762.915 ± 0.112
전기천공법62.032 ± 0.0592.548 ± 0.0742.177 ± 0.110***
참고: ### Sham 대 DMM, P < 0.001; *** EA vs DMM, P < 0.001.

표 2: 관절강 부피 (평균 ± SD; 그룹당 n = 6). ### Sham vs DMM, P < 0.001; *** EA vs DMM, P < 0.001.

그룹N0주차1주 차5주차
위약(Sham)635.517 ± 1.36635.717 ± 0.54635.650 ± 0.701
디지털 멀티미터635.783 ± 1.29235.033 ± 0.78132.967 ± 1.223###
SA635.583 ± 1.78035.283 ± 0.86133.267 ± 0.501
EA635.500 ± 1.51035.417 ± 0.88234.533 ± 0.929**
참고: ### 가짜 수술(Sham) 대 DMM, P < 0.001; ** EA 대 DMM, P < 0.01.

표 3: 피부 온도 (평균 ± SD; 그룹당 n = 6). ### Sham vs DMM, P < 0.001; ** EA vs DMM, P < 0.01.

그룹N5주차중앙값
가짜 수술60.000 (0.000, 0.250)0
디지털 멀티미터(DMM)64.000 (3.000, 4.250)###4
SA64.000 (3.000, 4.250)4
EA62.500 (1.750, 3.000)**2.5
참고: ### Sham 대 DMM, P < 0.001; ** EA 대 DMM, P < 0.01.

표 4: OARSI 점수 [중앙값 (P25, P75); 그룹당 n = 6]. ### Sham vs DMM, P < 0.001; ** EA vs DMM, P < 0.01.

토론

Knee osteoarthritis (KOA) is a progressive degenerative disease, and current therapeutic interventions offer limited efficacy in halting its underlying progression17. Impaired muscle function and reduced physical performance are clinically significant predictors of symptom severity. Consequently, actively managing modifiable risk factors is essential for delaying KOA progression18. Using a multimodal evaluation system, this study demonstrated that EA was associated with improved motor performance, reduced joint cavity volume, higher local skin surface temperature, less pronounced periarticular muscle MRI signal changes, and lower OARSI scores in mice with OA.

The IRT findings further support this integrated view. At 1 week post-surgery, skin temperatures did not differ among groups, including the Sham group, which likely reflects a uniform response to surgical trauma, characterized by transient vasoconstriction and superficial edema that temporarily reduced heat emission from the skin surface. In contrast, the significant thermal divergence observed after treatment suggests that the anti-inflammatory and microcirculatory actions of EA are cumulative rather than immediate, becoming apparent only after repeated sessions. These outcome measures may be interrelated. Joint cavity swelling generally reflects the extent of synovial inflammation and effusion, whereas local microcirculatory status is closely tied to changes in vascular permeability during inflammation19. In our experiments, the reduction in joint volume following EA administration coincided with an elevation in local temperature. Although IRT does not directly measure blood flow, the coincident changes suggest that enhanced local blood flow might facilitate the clearance of inflammatory mediators, thereby reducing inflammatory infiltration within the synovium and surrounding muscles. The subsequent improvement in motor function may stem from the combined benefits of decreased swelling and mitigated inflammation. Overall, the observed changes across these parameters appear to be interconnected responses rather than isolated events. This pattern suggests that EA may modulate multiple pathological processes in an integrated manner rather than acting via a singular mechanism20.

Compared to conventional endpoint histological assessments, the multimodal dynamic monitoring system employed in this study offers distinct practical advantages. Small-animal ultrasound enables longitudinal, noninvasive tracking of joint effusion without radiation exposure, circumventing the inter-animal variability inherent in endpoint tissue sampling21. Small animal MRI complements US by providing detailed visualization of signal changes in periarticular muscles. This allows for a qualitative assessment of muscle inflammation that US alone might not fully capture. Paired with IRT for real-time measurement of local skin temperature, this approach provides an indirect indicator of the resolution of inflammation. The availability of these imaging modalities makes repeated measurements throughout the treatment course feasible. Beyond complying with the 3R principles, this longitudinal design allows repeated observations within each animal, which minimizes the influence of interindividual variability. To the best of our knowledge, no previous animal study evaluating acupuncture for OA has integrated US, MRI, thermography, behavioral testing, and histopathology within a single experimental framework. This multilevel approach yields complementary data across functional, morphological, and histological domains, providing a more comprehensive assessment than any single endpoint can offer.

Several limitations should be acknowledged. First, this work relies on observational data from animal experiments and lacks mechanistic evidence from in vitro studies. It remains unknown whether EA engages the NOD-like receptor family pyrin domain 3 (NLRP3)/caspase-1/IL-1β pathway. IL-1β and IL-18 are key mediators of synovial and muscle inflammation, and their maturation requires NLRP3 inflammasome activation22. We also cannot determine whether the observed circulatory improvements correlate with changes in the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) or endothelial nitric oxide synthase (eNOS)23. Second, we applied a single EA parameter (2/100 Hz) set to two acupoints (ST36 and SP10). Whether different settings or alternative acupoint combinations might yield superior results requires further investigation24. Third, a single operator acquired all imaging data. While this approach ensured technical consistency, interobserver reliability was not assessed, potentially limiting the generalizability of the imaging findings. Fourth, we omitted a control group subjected solely to restraint, making it challenging to entirely separate the effects of anesthesia, immobilization, and handling from the therapeutic effects of EA. Fifth, the SA procedure was designed as a minimal control to reduce effects specific to acupoints, deep tissues, and electrical stimulation. However, the difference in needling depth between the true and sham interventions prevents us from isolating the contribution of depth alone. Consequently, our findings should be interpreted as a comparison between the full EA protocol and a minimal sham procedure rather than a strict evaluation of electrical stimulation in isolation. Sixth, camera distance, imaging angle, and absolute ROI area were not formally documented, which constitutes a technical limitation. A final limitation is the use of separate ANOVAs per time point, which neglects repeated measures correlations and time by group interaction and thus reduces sensitivity to dynamic changes.

In summary, EA was associated with anti-inflammatory and functional outcomes in a mouse model of DMM-induced KOA. Despite limitations such as variable resolution across modalities, operator dependence of US and IRT, high MRI costs, and potential stress from repeated measurements, the protocol remains a feasible platform for longitudinal multimodal assessment. The integrated system provides a framework for preclinical evaluation. Future work should optimize electrical parameters and leverage organoid, organ‑on‑chip, and AI platforms to elucidate mechanisms and guide individualized therapy25,26. Improved sham controls, standardized protocols, and longer follow‑up are also required to enhance clinical translation.

공개 사항

저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.

감사의 글

본 연구는 상하이 과학기술 혁신 행동 계획(JMC에게 23YF1447900)과 중국 국가 자연과학 재단(LQY에게 U23A20508, HSC에게 82575196, HX에게 U24A6013)의 지원을 받아 수행되었습니다.

재료

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1% 아세트산 용액Solarbio카탈로그 번호 G1371염색용 분별/세척액
에탄올 내 1% 염산Solarbio카탈로그 번호 G1371산-알코올 분별 용액
7T 소동물 MRI상하이 첸광7T MRI NOVAL소동물 자기공명영상 시스템
침침 (0.16 mm × 25 mm)Wuxi Jiajian Medical Instrument, 중국 우시로트 번호 491226멸균 침
접착식 현미경 슬라이드Jiangsu ShitaiMH0662조직 절편용 현미경 슬라이드
무수 에탄올Shanghai Titan Technology Co., Ltd.64-17-5탈수를 위한 에탄올
C57BL/6 마우스Shanghai Silaike Laboratory Animal Co., Ltd.https://www.slaccas.com/실험 동물
커버스립강수 시타이제공되지 않음조직 절편 수집 및 마운팅
탈칼슘화 용액SerivebioG1105-500ml뼈 및 관절 탈회 시약, pH 7.2-7.4
전기 치료기Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd.SD-Z전침 자극기
에틸렌디아민테트라아세트산Shanghai Titan Technology Co., Ltd.60-00-4킬레이트제
Fiji (ImageJ)미국 국립보건원 (NIH)64비트 Java 8이 포함된 ImageJ.이미지 분석 소프트웨어
거즈Weizhe Medical유형 A1: 표준 거즈 패드 (멸균)제모 및 세정 재료
제모 크림VEET제공되지 않음제모 크림
적외선 이미지 분석 소프트웨어FLIR제공된 버전 없음적외선 열화상 카메라와 함께 제공되는 소프트웨어
적외선 열화상 카메라FLIR435-0007-03 (초기 배치)적외선 열화상 시스템
소동물용 흡입 마취 시스템매트릭스07149소동물 가스 마취 시스템
이소플루레인 (흡입 마취제)실제 임상 데이터217140901흡입마취제
Naisikang 의료용 방수 탄성 테이프 (3.81 cm × 4.57 m)나이시강™732MRI용 사지 고정 재료
변형된 Safranin O 및 Fast Green 염색 키트 (골 조직용)Solarbio카탈로그 번호 G1371연골 및 뼈 염색 키트
지침 홀더실제 임상 데이터F21001-12수술 중 클램핑 및 봉합
중성 수지 봉입제biosharp23338664조직학적 봉입제
산소제공되지 않음제공되지 않음흡입 마취용 운반 가스
파라핀 매몰기LEICAEG1150C파라핀 임베딩 시스템
파라핀 마이크로톰LEICARM2235회전식 마이크로톰
파라핀 왁스에프레디아151534매립제
파라포름알데히드Sinopharm Reagents Co., Ltd.80096618조직 고정제
인산완충식염수ServicebioG0002인산 완충 식염수
로타로드 장치PanlabLE8205로타로드 피로도 테스트 시스템
소동물 초음파 영상 플랫폼후지Vevo 3100소동물 초음파 시스템
수산화나트륨Shanghai Titan Technology Co., Ltd.G19852H실험실 시약
실체현미경OlympusSZ61해부 현미경
봉합사와 바늘 (6-0 흡수성 봉합사와 6-0 실크 봉합사)Ningbo Medical Suture Co., Ltd.미용 바늘 1/2 4X12 40수술 후 봉합
수술용 메스 날(10#)Hangzhou Nuoyang Biotechnology Co., Ltd.20090120내측 반월상 연골 인대 절개
조직 탈수기LEICATP1020자동 조직 처리기
조직 건조기LEICAHI1220슬라이드 건조기
조직 매립 블록강쑤 시타이REF31050102W포매용 소모품
조직 확장기LEICAHI1210절편 확장 시스템
초음파 분석 소프트웨어 (Vevo Lab 3.1.0)광학버전 3.1.03차원 초음파 분석 소프트웨어
초음파 접촉 매질호청유탕YY0299-2008초음파 커플링 젤
전슬라이드 스캐너OlympusVS200디지털 슬라이드 스캐닝 시스템
자일렌Sinopharm Reagents Co., Ltd.10023418투명화 시약

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