CD90 기반 형광 활성화 세포 분류를 이용한 갑상선 저하증 마우스 뇌하수체 갑상선 낭비 농축

요약

이 프로토콜은 효소 해리와 CD90 기반 형광 활성화 세포 분류를 이용해 성인 생상선 저하증 마우스 뇌하수체에서 갑상선세포를 풍부하게 하는 방법을 설명하여, 갑상선세포 집단의 분자 분석 및 단기 1차 배양을 가능하게 합니다.

초록

갑상선은 전엽 뇌하수체에 위치한 특수한 내분비 세포로, 갑상선 자극 호르몬(TSH)을 분비하고 갑상선 활동을 조절합니다. TSH 분비는 시상하부 갑상선 자극호르몬에 의해 긍정적으로 조절되고, 순환하는 갑상선 호르몬에 의해 음의 조절을 받습니다. 갑상선세포는 뇌하수체 세포의 일부(~5%)에 불과해 그 생리학을 분리하고 연구하는 데 어려움을 줍니다. 여기서는 갑상선 기능 저하증 성체 쥐에서 갑상선세포를 분리하는 강화된 접근법을 설명합니다. 갑상선기능저하증은 전부 뇌하수체의 효소적 해리와 CD90.2 표면 항원을 이용한 형광 활성화 세포 분류 전에 갑상선 세포 개체군을 확장하기 위해 유도되었다. 12마리의 쥐에서 전하수체를 처리한 결과, 약 1.5× 10개의⁶ 개의 CD90.2 양성 세포가 Tshb 메신저 RNA 발현에 풍부함을 얻었습니다. CD90.2 양성 세포는 전엽 뇌하수체 세포의 약 25%를 차지하며, CD90.2 음성 세포에 비해 약 5배 더 높은 Tshb 발현을 보여 상당한 갑상선 세포 풍부함을 나타냈다. 분리된 세포는 단기 배양에서 생존 가능했고 트리이오도티로닌 처리에 대한 반응성을 유지했습니다. 이 프로토콜은 마우스 갑상선기체의 풍부화 및 배양을 가능하게 하여 하위 분자, 전사체, 후생유전체, 생리학적 분석을 가능하게 합니다.

서론

뇌하수체는 뇌의 기저에 위치한 내분비 기관으로, 호르몬 항상성에 대한 계층적 통제를 담당합니다. 그 활동은 시상하부 신호에 의해 조절되며, 이는 뇌하수체 호르몬 생성을 자극하거나 억제하며, 이 호르몬은 말초 내분비 기관의 기능을 조절합니다. 이 샘에는 줄기세포/전구세포와 분화된 호르몬 생성 세포를 포함한 이질적이고 역동적인 세포 집단이 포함되어 있습니다^. 생리적 스트레스나 손상에 반응하여 뇌하수체 줄기세포/전구세포는 활성화, 자기 갱신, 그리고 여러 호르몬 분비 계통으로 분화할 수 있습니다 ^2,3. 구조적으로 뇌하수체는 두 개의 주요 엽으로 구성되어 있습니다: 후엽(PL)은 뇌세포와 신경분비 말단으로 구성되어 옥시토신과 바소프레신을 방출하며, 전엽(AL)은 성장호르몬, 프로락틴, 갑상선 자극호르몬(TSH), 부신피질자극호르몬, 그리고 생식선자극호르몬 난포자극호르몬(FSH)과 황체형성호르몬(LH)을 분비하는 특수한 내분비 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 전뇌하수체에는 S100B 양성 난포별체 세포, 내피세포, 주엽세포 등 비호르몬성 세포 유형도 존재하며, 이들은 내분비 기능을 지원합니다 ^4,5,6. 설치류는 뇌하수체 중간 엽 ^7,8에도 흑색영양균을 포함하고 있습니다.

뇌하수체 기능, 분화 및 발달에 대한 관심은 설치류 모델에서 성체 뇌하수체 줄기세포와 전구세포를 분리하기 위한 여러 프로토콜 개발을 촉진했습니다. 쥐는 뇌하수체 생리학 연구에 자주 사용되는데, 이는 더 큰 뇌하수체가 세포 수를 더 많이 생성하고 조직 처리 중 회복을 개선하기 때문입니다 ^4,9. 반면, 쥐에서 뇌하수체 세포를 분리하는 것은 기술적으로 여전히 어렵고, 표준화된 프로토콜도 제한적입니다. 최근 성인 뇌하수체 줄기세포/전구세포 집합체를 이용한 프로토콜은 뇌하수체 발달과 기능을 모델링하는 데 유용한 도구를 제공합니다¹⁰; 그러나 이러한 시스템들은 아직 특정 내분비 세포 집단을 직접 분리하는 것을 허용하지 않습니다. 전엽 뇌하수체의 호르몬 생성 세포 유형 중에서, 갑상선소는 시상하부-뇌하수체-갑상선(HPT) 축의 주요 조절자로, 포유류에서 갑상선 호르몬(TH) 합성과 분비를 조절합니다. 갑상선체가 생성하는 TSH는 Cga가 코딩하고 FSH 및 LH와 공유하는 공통 α소단위와 Tshb에 의해 암호화된 β소단위로 구성된 이형이중이물질 당단백질로, 수용체 특이성을 부여합니다. 이 세포들은 순환 중인 트리이오도티로닌(T3)과 갑상선(T4) 수치에 매우 민감합니다. 갑상선선 기능 저하증 중 T3와 T4 수치가 낮을 때 갑상선선 개체군은 증가하고, 갑상선기능항진증 때는 고전적인 음의 피드백 메커니즘(^11,12,13)을 통해 수축합니다.

필수적인 생리학적 역할에도 불구하고, 갑상선은 전부 뇌하수체 세포의 소수(약 5%)만을 차지하고 다른 내분비 집단과 표현형적 특성을 공유하기 때문에 연구가 여전히 어렵습니다. 이러한 희소성과 견고한 시험관 내 모델의 부재로 인해 갑상선 조절과 HPT 축 조절에 대한 기전적 연구가 제한적입니다. TαT1 종양 세포주는 흔히 사용되는 갑상선형 유사 모델¹⁴를 대표하지만, 생리적 반응을 완전히 반영하지는 않습니다; 특히, T3 의존적 Tshb 억제는 기저 전사 수준¹⁵가 매우 낮아 평가가 종종 어렵습니다. 따라서 많은 연구들이 HEK293, COS, CV1, GH3, JEG3 세포와 같은 비갑상선 세포주가 서로 다른 Tshb 구조를 발현하는 데 의존해 왔습니다¹⁵. 그러나 이들은 내인성 전사 기전보다는 플라스미드 골격에 의해 유발되는 비생리적 조절 인공물을 도입할 수 있는 이종 시스템입니다.

여기서는 9번 쥐에서 이미 확립된 방법을 적용하여 성체 쥐 뇌하수체에서 갑상선을 분리하는 단계별 프로토콜을 제시^{하며, 쥐} 뇌하수체의 크기가 작고 낮은 갑상선세포 함량에 최적화한 것입니다. Tshb 발현 세포의 수율을 높이고 신뢰할 수 있는 후속 분석을 보장하기 위해 여러 주요 수정이 도입되었습니다. 이 프로토콜은 갑상선세포가 풍부한 표면 마커인 표면 항원 CD90의 발현을 활용합니다. CD90(THY1로도 알려짐)은 글리코실포스티딜리노시톨 고정 막 단백질^16,17로, 인테그린 β2 리간드(ITGB2)와의 이형 상호작용을 통해 주스타크린 신호 전달을 매개합니다. CD90은 일반적으로 면역 및 신경 세포 집단과 연관되어 있지만, 이전 전사체 연구에서는 갑상선 단백질에서 Thy1 농축이 확인되었습니다. THY1 의존적 접촉 신호는 조혈세포, T 세포, 섬유아세포, 내피세포, 뉴런 등 다양한 세포 유형에서 발생하며, 부착, 이동, 세포자멸사, 종양 억제, 섬유증 등을 조절합니다 18,19,20.

중요하게도, 쥐 전방 뇌하수체의 단세포 전사체 프로파일링에서 Thy1이 갑상선 5에서 가장 많이 발현된 유전자 중 하나임을^확인하여, THY1이 갑상선소수에 풍부해진 표면 표지자임을 시사합니다. 더불어, 공개된 마우스 뇌하수체 단세포 리보핵산(RNA) 시퀀싱 데이터셋에 따르면 Thy1/CD90 발현이 갑상선소에서 풍부하게 증가함을 보여준다^22,23. 그러나 발현이 이 계통에만 완전히 국한되지 않으며, 소마토트로프와 락토트로프를 포함한 PIT1 계통 세포의 하위 집합과 전구체 유사 집단에서도 발현이 가능합니다. 단세포 전사체 연구는 PIT1 계통 뇌하수체 세포 간에 상당한 전사 중복이 있음을 보여주었으며, 여기에는 소매트로프, 락토트로프, 갑상선을 생성할 수 있는 공통 PIT1 전구체 집단이 확인되었다²⁴. 마찬가지로, Thy1/CD90은 갑상선염 개체군만을 식별하지는 않지만 쥐 갑상선염을 풍부하게 하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 발견을 바탕으로, 분리 전략에서 THY1 표적 항체를 사용하는 것은 갑상선기능저하증으로 인한 증식 후 갑상선세포를 풍부하게 하는 효과적인 방법을 제공하며, T3에 대한 호르몬 반응 평가를 포함한 기능적 연구를 가능하게 합니다.

프로토콜은 야생형 C57BL/6 마우스에게 저요오드 사료를 주고, 음용수에서 메티마졸(MMI)과 과염소산칼륨(KClO₄)으로 갑상선 기능을 억제하는 것으로 시작합니다²⁵. 이 치료는 1주 이내에 심각한 갑상선 기능 저하증을 유도하고, 전부 뇌하수체 내 Tshb 발현성 갑상선소 개체군을 증가시킵니다. 갑상선 기능 저하 상태에서 TSH 생성 세포는 과형성, 비대, 풍부한 공포성 세포질, 두드러진 세포질 돌기, 그리고 커진 리소좀 등 상당한 생리적·형태학적 적응을 겪으며, 이는 TH 피드백 부재에 대한 적응을 반영한다 26,27,28. 따라서 갑상선기능저하증 유도는 갑상선 개체군 확대 전략으로 활용될 수 있습니다.

갑상선기능저하증 유도 후, 쥐는 이소플루란으로 마취하고, 조직 해리 중 세포 생존력을 극대화하기 위해 Ca²⁺/Mg^{2+ 2+} 프리 HEPES 완충 식염수 용액으로 심장 관류를 받습니다. 채취 후, 전측 뇌하수체는 부드러운 효소 소화를 거쳐 단일 세포 현탁물을 생성하고, 이를 피코에리트린-시아닌 7-결합 항-CD90.2 항체와 함께 배양하여 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 갑상선을 풍부하게 만듭니다. 표지된 세포는 이후 단기 배양을 위한 배양지나 RNA 추출을 위한 TRIzol에 수집됩니다. 농축 전략을 검증하기 위해 분류된 집단에서 Tshb 메신저 RNA 발현을 측정했으며, CD90 양성 세포에서 매우 풍부한 것으로 나타났습니다. 이 방법은 유전자 발현 프로파일링, 전사체 및 후생유전체 분석, 고처리량 분석, 1차 세포 배양 등 쥐에서 광범위한 후속 응용을 지원하며, 갑상선염 기능과 HPT 축 조절의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 최소 1주간 갑상선기능저하증 유도 후 성체 쥐에서 새로 해리된 뇌하수체에서 갑상선을 AL에서 분리하는 방법을 설명합니다. 모든 동물 시술은 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 기관 및 국립보건원(NIH) 지침에 따라 수행되었습니다. 텍사스 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 동물 시술을 승인했습니다.

수컷과 암컷 쥐는 실험 중 함께 사용되었는데, 이는 갑상선 수율이나 하위 분석에서 성별 의존적 차이가 관찰되지 않았기 때문입니다. 한 실험당 약 12마리의 쥐가 사용되었으나, 최대 20마리의 더 큰 코호트는 모든 시약 부피를 비례적으로 조절하여 처리할 수 있습니다.

성공적인 분리는 빠르고 꾸준한 관류, 최소한의 해부 시간, PL의 완전한 제거, 그리고 1차 세포의 고밀도 플레이트에 달려 있습니다. 안락사, 관류, 뇌하수체 박리, 효소 소화 시작 사이의 권장 최대 처리 시간은 6시간이었습니다. 셀은 2.0–2.5 밀도× 0.7 cm² 우물당 10개의⁵ 셀(8웰 유리 챔버 슬라이드의 한 웰 표면적)로 도금되었습니다. 단기 티로트로프 배양을 지원하려면 최소 생존율 95%가 필요했습니다.

단일 세포 현탁 생성에 사용된 모든 시약은 멸균 조건에서 준비되었습니다. 작업 표면은 70% 에탄올로 멸균되었고, 해부 도구는 사용 전에 오토클레이션되었으며, 모든 세포 배양 준비 단계는 무균 기법을 이용한 생물안전 캐비닛에서 수행되었습니다. 이 프로토콜은 12마리의 동물에 대해 표준화되었습니다. 다른 수의 마우스를 사용할 때는 모든 시약 부피를 비례적으로 조절하세요. 모든 시약, 소모품, 장비에 대해서는 재료표 를 참조하라.

갑상선기능저하증 유도 시, 쥐들은 20°C–24°C의 특정 무병원체 조건과 40%–60% 상대습도, 12시간 빛/12시간 어둠 주기, 그리고 자유롭게 먹이와 물을 섭취하도록 했습니다. 동물들은 개별 환기가 되는 우리(한 우리당 최대 3마리)에 집단 방영되었으며, 표준 침구와 둥지 재료, 쉼터 등 환경 풍요가 갖춰져 있었습니다. 간에서 요오도티로닌 디오딘나제(Dio1) 발현을 측정하여 성공적인 갑상선기능저하증 유도가 확인되었습니다. 정상갑상선 대조군 마우스에 비해 Dio1 메신저 RNA(mRNA) 발현이 최소 50% 감소한 것은 성공적인 갑상선 기능 저하증 유도를 시사하는 것으로 간주되었습니다.

1. C57BL/6 마우스에서의 갑상선 기능 저하증 유도

참고: 요오드 결핍 식단과 갑상선 기능 화학적 억제를 통해 생체 내에서 갑상선기능저하증을 유도하기 위해 7–10일간 시행하세요. 실험 설계는 그림 1A 를, 갑상선기능저하증 유도 검증은 그림 1B 를 참조하세요.

그림 1. C57BL/6 마우스에서 갑상선기능저하증 유도. (A) 성체 C57BL/6 마우스에서 갑상선기능저하증을 유도하기 위해 사용한 실험 워크플로우의 도식적 표현. 쥐들은 전부 뇌하수체 격리 전 7일간 요오드 결핍 식단과 함께 0.05% 메티마졸(MMI)과 0.1% 과염소칼륨(KClO₄)을 음용수에 투여했습니다. (B) 간에서 쌍갑상선 및 갑상선 저하증 마우스에서 간 Dio1 메신저 리보핵산(mRNA) 발현의 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 분석. 기준 유전자로 사이클로필린 A(CyA)가 사용되었습니다. 데이터는 평균 ±표준편차(SD) (그룹당 n = 6)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 학생 t-검정을 사용하여 산출되었습니다. **P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. MMI/KClO₄ 식수를 준비하세요
   1. 1g MMI와 2g KClO₄를 2L 정수에 녹입니다.
   2. 용액을 실온(20°C–25°C)에서 1시간 동안 저어 완전히 용해될 때까지 사용하세요.
      주의: MMI와 KClO₄는 유해 화학물질입니다. 준비 및 취급 시 장갑, 실험복, 안구 보호구를 착용하세요.
      참고: MMI는 요오화물 조직화를 억제하는 반면, KClO₄는 나트륨-아이오다이드 심포터²⁵를 통한 요오화물 흡수를 차단합니다. 적절한 용량을 유지하고 침구, 음식물 찌꺼기, 미생물 증식으로 인한 오염을 최소화하기 위해 2일마다 교환하세요. 즉시 사용하지 않을 경우, 용액을 4°C에서 밀봉된 빛에 저항하는 용기에 최대 14일간 보관하세요.
2. 갑상선 기능 저하증 유발
   1. 8주 된 수컷 또는 암컷 C57BL/6 쥐를 한 우리당 최대 3마리씩 아이오드 없는 사육 환경에서 키웁니다.
      참고: 쥐는 20°C–24°C, 40%–60% 상대습도의 특정 병원체가 없는 환경에서 12시간 빛과 12시간 어두운 주기로 가며, 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있습니다. 동물은 개별 환기가 되는 우리에 표준 침구와 둥지 재료, 쉼터 등 환경 환경이 풍부하게 제공되는 곳에 보관하세요. 치료를 시작하기 전에 동물을 3일간 적응시키세요. 수컷과 암컷 집쥐를 따로 키우세요. 여기서 설명한 실험에서 정상갑상선 그룹은 각각 다른 우리에 갇힌 6명의 수컷과 6명의 암컷으로 구성되었고, 갑상선 기능 저하군은 각각 다른 우리에 수컷 6명과 암컷 6명으로 구성되었습니다. 성 의존적 갑상선 수율 차이나 후속 분석에서 관찰되지 않았기 때문에, 같은 처리군 내 수컷과 암컷 마우스의 AL을 함께 수집했습니다.
   2. 쥐에게 7일에서 10일 동안 요오드 결핍 식단을 자유롭게 먹이세요.
      참고: 요오드 결핍 식단과 MMI/KClO₄ 치료를 동시에 시작하세요.
   3. 치료 기간 내내 0.05% MMI와 0.1% KClO₄가 함유된 식수를 자유롭게 제공하세요.
      참고: 안락사 전까지 치료를 계속하세요. 갑상선기능저하증 유도 기간 동안 매일 체중, 음식, 수분 섭취, 임상 징후를 모니터링하세요. 성공적인 갑상선 기능 저하증 유도는 일반적으로 체중 증가 감소와 활동 감소, 무뎌진 털 같은 임상 징후와 관련이 있습니다. 7일과 10일 유도 기간은 비슷한 갑상선 농축 효율을 제공합니다.

2. 심장 관류 및 AL 박리

참고: 이 시술은 조직 생존력을 극대화하고 뇌하수체 격리 중 세포의 완전성을 유지하기 위해 쥐당 약 15분 이내에 시행하세요.

1. 관류 및 수집 용액을 준비하세요
   1. Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 HEPES 완충 식염수액(HBSS)을 준비합니다
      1. 0.9% NaCl 667mL, 1M HEPES 20mL, 213mL의 이중 증류수(ddH₂O)를 조합하여 Ca²⁺ 와 Mg²⁺ 없이 맞춤형 HBSS 1L을 제조합니다.
      2. 용액을 오토클레이브하여 4°C에서 보관하세요.
   2. Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 헤파린화된 HBSS를 준비합니다
      1. Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 맞춤형 HBSS 50 mL에 27 μL 에녹사파린 나트륨(100 mg/mL 정액)을 첨가합니다.
   3. 수집 배양지(CM) 준비
      1. 440 mL Dulbecco's 변형 Eagle 배지, 50 mL 열불활성화 태아 소 혈청(FBS), 4 mM L-글루타민, 10 mL 1 M HEPES를 혼합하여 최종 부피 500 mL를 만듭니다.
      2. 0.22 μm 필터를 사용해 용액을 필터 멸균하여 최대 1개월간 4°C에서 보관합니다.
         참고: 보관 전에 50mL 알리코트를 생물안전 캐비닛 아래에 준비하여 오염을 최소화하세요.
      3. 사용 전에 CM을 20°C에서 25°C까지 데워주세요.
   4. 해부 기구를 멸균하세요
      1. 사용 전에 가위, 겸자, 핀셋, 바늘 홀더, 홍채 겸자, 수술용 숟가락, 둔한 탐침을 75% 에탄올로 소독하세요.
         참고: 에탄올 멸균 후 조직 접촉 전에 기구를 완전히 자연 건조시키기 바랍니다.
2. 심장 관류 시술
   1. 100% 산소에 공급된 이소플루란을 이용해 쥐를 심하게 마취하세요. 5% 아이소플루란 챔버에서 마취를 유도하고, 3% 아이소플루란 코콘을 통해 지속적인 모니터링과 폐가스 제거를 통해 마취를 유지합니다.
      주의: 기관 안전 지침에 따라 아이소플루란 마취 절차를 수행하고, 흡입 노출을 최소화하기 위해 적절한 청소 시스템을 사용해야 합니다.
   2. 발가락 집기로 페달 철수 반사가 없는지 확인해 완전 마취를 확인하세요.
   3. 동물에게 75% 에탄올을 뿌리고 채취 팬 내 관류 단계에 올려놓으세요.
   4. 팔다리를 고정해 복막 부위를 노출시키세요.
   5. 주요 장기와 혈관 손상을 피하면서 흉강을 조심스럽게 열어야 합니다.
   6. 갈비뼈를 따라 가슴 판을 만들고, 그 판을 머리 위로 접은 뒤 지혈고정기로 고정하세요.
   7. 클램프로 심장을 안정시키고 23게이지 바늘을 좌심실 꼭대기에 삽입하세요.
   8. 실리콘 튜브를 이용해 바늘을 연동 펌프에 연결하세요.
   9. Ca²⁺ 없이 헤파린화된 HBSS로 관류를 시작하고, Mg²⁺ 유지를 실온에서 제공합니다.
   10. 관류가 시작되자마자 오른쪽 심방을 절개하여 배액을 허용합니다.
   11. 동물을 3 mL/분의 유량으로 5분간 관류하세요.
       참고: 간이 눈에 띄게 창백해지는 것을 관찰하여 성공적인 관류를 확인하세요.
3. AL을 분리하라
   1. 관류 후 즉시 쥐의 목을 베어라.
   2. 미세한 해리 가위와 겸자를 사용해 두피와 두개골을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
   3. 뇌와 두개골 사이에 수술용 숟가락을 삽입하세요.
   4. 뇌를 부드럽게 들어 올려 시교차를 잘라내세요.
   5. 입체체경으로 고운 핀셋을 사용해 뇌하수체를 덮고 있던 얇은 수막(경막)을 제거합니다.
   6. 그림 2A에 보이는 대로 PL을 조심스럽게 분해하고 버리세요.
      참고: AL은 앞쪽에 위치한 더 큰 분홍색 조직으로 식별하세요. PL은 등쪽에 위치한 작고 하얗고 반투명한 조직으로 식별합니다.
   7. 둔한 프로프로브로 주변 결합 조직과 잔여 수막을 다듬어 AL 접근을 개선합니다.
   8. 무딘 핀셋으로 AL을 잡고 1.8 mL CM이 들어 있는 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다.
      참고: 12마리 동물의 AL을 같은 채집관에 모으세요.
   9. 모든 해부가 끝날 때까지 샘플을 실온에 보관하세요.
      참고: 세포 생존력 손실을 최소화하기 위해 조직 채취와 효소 소화 시작 사이에 3시간을 초과하지 마십시오.
4. 갑상선기능저하증 유도 확인
   1. 각 마우스로부터 약 50mg 정도의 소량의 간 샘플을 채취하세요.
   2. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 간에서 Dio1 mRNA 발현을 정량화하고, 처리되지 않은 진갑상선 대조군과 비교합니다(그림 1B).
      참고: 성공적인 갑상선기능저하증 유도란 정상갑상선 대조군에 비해 간 Dio1 발현이 최소 50% 감소한 것으로 정의합니다. Dio1 발현은 순환 TH 수치와 양의 상관관계를 보이며,²⁹; 따라서 Dio1 발현 감소는 성공적인 갑상선 기능 저하증 유도를 확인시킨다.
5. 반복 조직 채취
   1. 2.2–2.4단계를 반복합니다. 12마리의 쥐에서 AL을 수집할 때까지.
   2. 즉시 3단계로 진행하세요.

그림 2. 마우스 전방 뇌하수체에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다. (A) 전엽(AL) 해리, 효소 해리, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 단일 세포 현탁액 준비를 보여주는 워크플로우. 작업 흐름에는 후엽 제거, 콜라겐제 소화, 트립신-에틸렌디아미네테트아세트산(EDTA) 소화, 그리고 FACS 분석 전 여과가 포함됩니다. (B) 정상갑상선 및 갑상선기능저하증 마우스의 해리 전뇌하수체 세포의 생존 염색 및 자동 세포 계수 대표 이미지. 총 세포 수율과 생존 가능한 세포 농도가 표시되어 있습니다. 스케일 바 = 200 μm. (C) 조직 해리 및 하류 FACS 분석 준비 후 전방 뇌하수체 세포 직경 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요. 

3. 마우스 AL에서 단일 세포 현탁액 준비

참고: 이 시술은 전부 뇌하수체 조직에서 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 약 60분 이내에 수행하세요.

1. 효소 소화액을 준비하세요
   1. 2% 콜라겐제 용액을 준비하세요
      1. 클로스트리디움 히스톨리티쿰에서 추출한 콜라겐제 100 mg(고형당 >125 콜라겐 소화 단위)을 4.9 mL ddH₂O에 녹입니다.
      2. 100 μL 1M HEPES를 추가하여 최종 부피 5mL를 얻습니다.
      3. 0.22 μm 필터를 사용해 용액을 멸균하세요.
      4. 용액을 200μL 용량으로 분할하여 −30°C에서 최대 2개월간 보관합니다.
         참고: 반복되는 냉동-해동 사이클은 피하세요. 해동된 콜라게나제 알리코트는 재사용하지 마세요.
   2. 0.25% 트립신-에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 제제합니다
      1. 0.5% 트립신-EDTA 1mL와 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없는 HBSS 1mL를 혼합합니다.
      2. 용액은 사용 전까지 4°C에서 보관하세요.
         참고: 조제 당일에는 희석된 트립신-EDTA 용액을 사용하세요. 희석된 트립신–EDTA를 저장하거나 재사용하지 마십시오.
2. 콜라겐제 소화 수행
   1. 수집된 AL 조직에 200 μL 2% 콜라게나제 용액을 첨가합니다.
   2. 저보존 팁이 장착된 P1000 마이크로피펫으로 조직을 부드럽게 섞으세요.
   3. 현탁을 37°C 물욕에서 15분간 부화시키세요.
      참고: 배양 중에는 튜브 캡을 닫아 오염을 최소화하세요.
   4. 부화 기간 동안 5분마다 튜브를 부드럽게 두드리세요.
3. 디옥시리보뉴클레아제 I(DNase I) 소화를 수행합니다
   1. 상정액을 제거하지 않고 5 μL DNase I(1 U/μL)를 현탁액에 직접 첨가합니다.
   2. 튜브를 10번 부드럽게 두드려 용액을 섞으세요.
   3. 현탁액을 37°C에서 5분간 인큐베이팅하세요.
4. 조직에 펠릿 넣기
   1. 현탁액을 100 × g에서 실온에서 5분간 원심분리하세요.
   2. 1 mL 피펫을 사용해 상원액을 조심스럽게 제거하세요.
      참고: 상정액 제거 시 세포 손실을 최소화하기 위해 펠릿 위에 약 50 μL의 잔류 액체를 남겨두세요.
5. 트립신 소화 수행
   1. 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 펠릿에 첨가합니다.
   2. 37°C에서 10–15분간 현탁물을 배양하여 보이는 온전한 조직 조각이 사라질 때까지 보관합니다.
      참고: 과도한 조직 소화와 세포 생존 감소를 피하기 위해 15분을 초과하지 마십시오.
6. 효소 소화를 멈추고 조직을 해리시키세요
   1. 트립신화 억제를 위해 2 mL CM을 추가하세요.
   2. 1mL로 설정된 마이크로피펫을 사용해 부드럽게 10–20회 위아래로 피펫팅하여 보이는 조직 조각이 남지 않을 때까지 조절합니다.
      참고: 기계적 해리 시에는 저유지 피펫 팁을 사용하세요. 허용되는 단일 세포 현탁액은 주로 단일 세포로 구성되며 눈에 띄는 집합체나 이물질이 최소화된 균일하고 저점도의 현탁액입니다(≤Trypan Blue 배제 현미경 검사로 5%–10% 덩어리 포함).
7. 단셀 현탁을 수집하세요
   1. 현탁액을 100 × g에서 실온에서 5분간 원심분리하세요.
   2. 상정액을 조심스럽게 제거하세요.
   3. 즉시 4단계로 진행하세요.
      참고: 단일 세포 현탁 준비 후 15분 이내에 염색을 시작하고, 가능한 한 1시간 이내에 세포 분류를 완료하세요. 이 기간 동안 세포를 얼음 위에 보관하여 생존 능력을 최소화하세요.

4. 형광 활성화 세포 분류를 위한 염색

참고: CD90 양성 세포의 FACS에 대해 해리된 전방 뇌하수체 세포를 염색하기 위해 약 60분 후에 이 절차를 시행하세요.

1. 세포 현탁 준비
   1. 세포 펠릿에 인산염 완충식염수(PBS, 1×)로 구성된 350 μL 염색 완충제를 2% FBS와 0.09% 아지드 나트륨을 첨가합니다.
   2. 저보존 팁이 장착된 P1000 마이크로피펫을 사용해 10회 피펫팅하여 펠릿을 부드럽게 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
   3. 현탁액을 1.5mL 저결합 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
2. 세포 농도와 생존 가능성을 결정하세요
   1. 세포 세기를 위해 현탁액에서 5 μL 알리코트를 제거하세요.
   2. 알리코트에 5 μL 생존 염료를 섞으세요.
   3. 혼합물 10 μL를 자동 셀 카운터에 주입합니다.
      참고: 생존 염료 배제로 결정된 세포 생존율이 ≥85%이고 잔해와 세포 집합체가 최소화된 경우 FACS로 진행하십시오.
   4. 정상갑상선 샘플의 경우 총 세포 농도가 약 1 × 10⁷ cells/mL, 갑상선 기능 저하 샘플의 경우 약 2 × 10⁷ cells/mL임을 확인하라(그림 2B). 해리 후 세포 크기 분포는 그림 2C에 나타난다.
3. 보상 통제 준비
   1. 세포 현탁액 50 μL를 300 μL 염색 버퍼에 옮깁니다.
   2. 현탁액을 각각 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 각각 100 μL 알리코트 세 개로 나누어 사용합니다.
   3. 다음 대조군을 준비합니다: (i) 염색되지 않은 대조군, (ii) 프로피듐 요오다이드(PI) 단독 대조군, (iii) 피코에리트린-시아니 7(PE-Cy7) CD90.2 단독 대조군.
4. 세포에 염색
   1. 300 μL 세포 현탁액에 3 μL PE-Cy7 결합 항-CD90.2 항체를 첨가합니다.
      참고: 항체 농도는 이전 적정 실험을 통해 결정되었습니다. 최종 희석 1:100은 양성과 음수 모집단 간 최적의 분리를 제공하면서 배경 염색을 최소화했습니다.
   2. CD90.2 보상 대조에 1 μL 항체를 추가하여 최종 희석 비율을 1:100으로 얻습니다.
   3. 모든 샘플은 어두운 얼음 위에 30분간 배화하세요.
      참고: 인베이팅 기간 동안 샘플을 10분마다 부드럽게 섞어 균질한 염색을 유지하세요.
5. 얼룩진 세포를 씻어내세요
   1. 각 튜브에 1mL의 냉염색 완충제를 추가하세요.
   2. 샘플을 210 × g에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.
      참고: 가능하다면 감속 시 셀 펠릿의 교란을 최소화하기 위해 원심분리기 브레이크를 비활성화하세요.
   3. 상정액을 조심스럽게 제거하고 버리세요.
6. 착색된 셀을 다시 현지하세요
   1. 주 세포 현탁액을 300 μL 염색 버퍼에 재현탁합니다.
      참고: 분리 직전에 PI를 최종 농도인 1 μg/mL로 추가하세요.
   2. 각 보상 조절 제어를 100 μL 염색 버퍼에 재현지합니다.
7. 셀 현탁액을 필터링하세요
   1. 분류 직전에 35 μm 세포 체가 장착된 유동 세포 측정관을 통해 세포 현탁액을 여과합니다.
8. 형광 활성화 세포 분류로 진행하세요
   1. 즉시 5단계로 넘어가 형광 활성화 세포 분류기를 사용해 염색된 세포를 분류하세요.

5. FACS 게이팅 및 분류 전략

참고: FACS를 이용해 생존 가능한 CD90.2 양성 갑상선세포를 분리하기 위해 약 60분 이내에 시행하세요.

1. 셀 소터를 설정하세요
   1. 셀 분류기에 100 μm 노즐을 설치하세요.
   2. 칼집 압력을 20 psi로 설정하세요.
      참고: 멸균된 PBS 기반 피유를 실온에서 유지하세요.
2. 기기 품질 관리 수행
   1. 샘플 채취 전에 제조사의 지침에 따라 기기 품질 관리 절차를 수행하세요.
      참고: 대체 셀 분류기에는 제조사가 권장하는 동일한 품질 관리 워크플로우가 적용될 수 있습니다.
   2. 보정 비드를 사용해 드롭 지연과 스트림 안정성을 검증하세요.
3. 형광 보상 수행
   1. 단일 색상 보정 제어를 획득하세요.
   2. 게이팅과 분류 전에 형광 보상을 수행하세요.
      참고: 보상은 염색되지 않은 대조군과 단일 염색된 대조군을 사용하여 계산하세요. 필요 시 정렬하기 전에 보상 행렬을 수동으로 확인하고 조정하세요.
4. 게이팅 전략을 정의하세요
   1. 전방향 산란 및 측면 산란 매개변수를 사용하여 잔해를 배제합니다(그림 3A,B).
   2. 전방향 산란 높이 대 전방 산란 면적, 측면 산란 높이 대 측면 산란 면적을 이용한 게이트 단일 셀(그림 3A,B).
   3. PI 음성 세포를 게이팅하여 죽은 세포를 배제합니다.
   4. 갑상선 세포 강화를 위한 게이트 CD90.2 양성 세포.
      참고: CD90.2 양성 세포를 CD90 검출 채널에서 형광 강도가 10³ 을 초과하는 사건으로 정의합니다(그림 3C–F).
5. 수집관 준비
   1. 다음 용도에 맞게 수집관을 준비하세요.
      참고: RNA 분리를 위해 1mL QIAzol 용해 시약을 미리 채우거나, 세포 배양을 위해 10% 숯으로 제거된 태아 소 혈청을 보완한 Medium 199를 미리 채워 넣으세요.
6. CD90.2 양성 갑상선선 선정
   1. CD90.2 양성 단일 세포를 채집관에 분류하세요.
   2. RNA 분석을 위한 세포 수집
      1. 세포를 1mL 용해 시약에 직접 수집합니다.
      2. 1분간 튜브를 소용돌이로 돌려 세포를 용해합니다.
      3. 샘플을 즉시 드라이아이스 위에 냉동하세요.
      4. RNA 추출 전까지 샘플을 −80°C에서 보관합니다.
   3. 1차 배양을 위한 세포 채취
      1. 세포를 배양지에 모아 10% 목탄 제거 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충합니다.
      2. 세포를 최소 200 μL 밀도로 8웰 유리 챔버 슬라이드에 씨앗 뿌리며, 최소 200 μL 밀도로 최소 2×⁵ 셀/웰 슬라이드를 사용합니다.
      3. 세포를 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 최대 72시간 배양합니다.
         참고: 허용 가능한 배양 성능은 24시간 이내에 세포 부착이 눈에 띄고, 부착 효율이 약 60%–80%, 72시간 후 ≥70%–80% 생존율로 나타난다.
      4. 필요 시 배양액에 100 nM T3를 추가하세요.
         참고: 세포 부착 후, 보통 도금 후 24시간 후에 T3 처리를 시작하고, 72시간 동안 샘플 수집이 완료될 때까지 처리를 유지하세요. 40 mM NaOH에 T3 스톡 용액을 준비하고, 동일한 최종 용매 농도에서 차량 처리 대조군을 포함합니다.
         참고: 숯 제거 혈청은 TH 고갈된 배양 환경을 유지하며, 실험적으로 유도된 T3 의존적 Tshb 발현 억제 현상의 검출을 향상시킵니다.

그림 3. FACS 게이팅 전략과 갑상선 단백질 풍부의 검증. (A,B) 생존 가능한 단일 전방 뇌하수체 세포를 분리하기 위해 사용한 순차적 게이팅 전략. 게이트에는 전방산란면적(FSC-A)과 측면산란면적(SSC-A)을 이용한 잔해 배제, 전방산란 높이(FSC-H)와 FSC-A, 측면 산란 높이(SSC-H)와 SSC-A를 이용한 단일 산란 분별, 그리고 프로피듐 요오화물(PI) 양성 죽은 세포의 배제가 포함됩니다. (C–F) 피코에리트린-시아닌 7(PE-Cy7) 접합된 항CD90.2 항체를 사용하여 CD90.2 양성 및 CD90.2 음성 세포군을 식별하고 풍부하게 한 대표적인 FACS 플롯. (G–I) 분류된 세포 집단에서 갑상선 세포 농축의 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 검증. 약어: FSC-A, 전방 산란 영역; SSC-A, 측면 산란 영역; FSC-H, 전방 산란 높이; SSC-H, 측면 산란 높이; PI, 프로피듐 요오다이드; PE-Cy7, 피코에리트린-시아닌 7; 신경전형, 치료받지 않은 상태. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. CD90 양성 세포와 CD90 음성 세포에서 실시간 중합효소 연쇄 반응을 통한 Tshb mRNA 유전자 발현 분석

참고: 이 절차를 약 5시간 후에 수행하여 분류된 세포 집단에서 Tshb mRNA 발현을 정량화하세요.

1. RNA 추출을 위해 분류된 세포를 수집합니다
   1. CD90 양성 및 CD90 음성 세포(2.5 ×^{10 5} 세포)를 1 mL 용해 시약이 들어 있는 별도의 1.5 mL 튜브에 수집합니다.
2. 세포를 용해시켜
   1. 샘플을 1분 동안 격렬하게 소용돌이로 만들어 세포를 완전히 용해시키고 얼음 위에 올려놓으세요.
      참고: 필요시 RNA 추출 전에 용해된 샘플을 −80°C에서 보관하십시오.
3. 총 RNA 추출
   1. 제조사의 RNA 추출 키트 지침에 따라 총 RNA를 추출하세요.
      참고: 정제 과정에서 제조사의 지침에 따라 RNase 없는 DNase I을 사용하여 잔류 게놈 디옥시리보핵산(DNA)을 제거하여 용출 전에 DNase 소화를 수행하십시오.
   2. 분광광도계를 사용해 RNA 농도를 측정하세요.
      참고: 상보적 DNA(cDNA) 합성을 위해 A260/A280 비율이 약 1.8–2.1이고 A260/A230 비율이 1.8 이상인 샘플을 사용하세요.
4. cDNA 합성
   1. 제조사의 첫 가닥 cDNA 합성 키트에 포함된 지침에 따라 총 100 ng RNA로 cDNA를 합성합니다.
      참고: cDNA 합성 중에는 올리고(dT) 프라이머를 사용하세요.
   2. 표 1에 따라 템플릿-프라이머 혼합물을 준비합니다.
   3. 시약을 부드럽게 섞고 잠시 원심분리하여 튜브 바닥에서 샘플을 수집하세요.
   4. 템플릿-프라이머 혼합물을 65°C에서 10분간 변성시킵니다.
   5. 샘플은 즉시 얼음 위에 식히세요.
   6. 표 2에 따라 역전사 반응 혼합물을 준비하여 최종 부피 20 μL를 얻습니다.
      참고: 표 2 에 나열된 시약 부피에 샘플 총 수를 곱하고, 피펫팅 변동성을 고려해 추가로 10%의 초과 부피를 추가하여 마스터 믹스를 준비할 수 있습니다.
   7. 소용돌이 없이 반응을 부드럽게 섞고 잠시 원심분리하세요.
   8. 반응을 50°C에서 60분간 배양합니다.
   9. 반응을 85°C에서 5분간 비활성화합니다.
   10. 샘플을 얼음 위에 올려 차갑게 보관하세요.
   11. 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)으로 바로 진행하거나 cDNA를 −30°C에서 보관하여 사용 후에야 합니다.
       참고: cDNA는 뉴클레아제가 없는 조건에서 −30°C에서 최대 6개월간 저장할 수 있습니다. 반복되는 냉동-해동 사이클을 피하세요.
       참고: 증발을 최소화하기 위해 가열된 뚜껑이 장착된 열순환기에서 cDNA 합성 단계를 수행하세요.
5. RT-qPCR 반응 혼합물을 준비합니다
   1. 표 3에 따라 RT-qPCR 반응 혼합물을 준비합니다.
6. RT-qPCR 플레이트를 장전하세요
   1. 96웰 플레이트의 각 웰에 9 μL RT-qPCR 반응 혼합물을 추가합니다.
   2. 총 RNA 5ng의 역전사 생성물에 해당하는 1μL cDNA 주형을 추가합니다.
   3. 샘플을 부드럽게 섞고 잠시 원심분리하세요.
7. RT-qPCR 수행
   1. SYBR 그린 마스터 믹스에 포함된 제조사 지침에 따라 RT-qPCR을 수행하세요.
      참고: 초기 변성 단계인 95°C를 2분간 사용한 후, 95°C에서 5초, 60°C에서 30초간 40회 사이클을 사용하세요. 각 확장 단계 끝에 형광을 획득하세요. 65°C에서 95°C까지 0.5°C 단위로 용융곡선 분석을 수행하여 단일 제품 증폭을 검증합니다.
8. Tshb 표현 정규화
   1. ΔCt 방법을 사용하여 Tshb 발현을 사이클로필린 A(CyA) 발현으로 정규화합니다.
      참고: 분석 전에 실험군 간 CyA 변동이 최소화되어 CyA 안정성을 검증하십시오.
9. 상대 유전자 발현 계산
   1. CD90 양성 세포에서 CD90 음성 세포와 비교하여 2^−ΔΔCt 방법을 사용하여 Tshb 발현을 상대적으로 계산합니다.
      참고: 8개의 생물학적 샘플을 사용하여 RT-qPCR 분석을 수행하며, 각 샘플은 기술적 중복 반응으로 분석됩니다(그림 3G–I).

시약	볼륨	최종 양/농도
총 RNA	가변	100 ng
앵커 올리고(dT)18 프라이머 (50 pmol/μL)	1 μL	2.5 μM
PCR 등급 물	가변	총 부피 13 μL로 조정하세요
총	13 μL	—

표 1: 상보적 디옥시리보핵산 합성을 위한 템플릿-프라이머 혼합물 준비. 상보적 디옥시리보핵산(cDNA) 합성을 위한 템플릿-프라이머 혼합물을 준비하는 데 사용된 시약, 부피, 최종 양. 각 반응에는 총 리보핵산(RNA) 100 ng, 고정된 올리고(dT)18 프라이머, 그리고 최종 부피 13 μL로 조정된 중합효소 연쇄반응(PCR) 등급의 물이 포함되어 있었습니다. 보고된 2.5 μM 농도는 역전사 반응 성분을 첨가하기 전의 13 μL 템플릿-프라이머 혼합물 내 프라이머 농도를 의미합니다.

시약	볼륨	최종 양/농도
전사체 역전사효소 반응 버퍼 (5×)	4 μL	1×
프로텍터 RNase 억제제 (40 U/μL)	0.5 μL	20 U
디옥시뉴클레오타이드 혼합물 (각각 10 mM)	2 μL	각각 1 mM
전사체 역전사효소 (20 U/μL)	0.5 μL	10 U
템플릿-프라이머 혼합물 (표 1)	13 μL	—
총	20 μL	—

표 2: 상보적 디옥시리보핵산 합성을 위한 역전사 반응 혼합물. 1가닥 상보성 디옥시리보핵산(cDNA) 합성에 사용되는 시약, 부피 및 최종 농도. 최종 반응 부피는 20 μL였습니다. 보고된 디옥시뉴클레오타이드 삼인산 농도(각각 1 mM)는 전체 반응 혼합물의 최종 농도를 의미합니다.

시약	볼륨	최종 양/농도
파워트랙 SYBR 그린 마스터 믹스 (2×)	5 μL	1×
Tshb 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (재료표 참조)	0.5 μL	400 nM
PCR 등급 물	3.5 μL	9 μL 반응부피로 조정하세요
소총 반응 부피	9 μL	—
cDNA 템플릿	1 μL	5 ng
최종 반응 부피	10 μL	—

표 3: 역전사 정량 중합효소 연쇄반응 혼합물 준비. Tshb 메신저 리보핵산(mRNA)의 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 증폭에 사용되는 시약, 부피 및 최종 농도. 주형 첨가 전 반응 혼합물 부피는 9 μL이었다. 증폭 직전에 상보성 디옥시리보핵산(cDNA) 주형을 1 μL로 첨가하여 최종 반응 부피 10 μL를 얻었다.

결과

8주 된 C57BL/6 마우스 12마리(수컷 6마리, 암컷 6마리)는 MMI와 KClO₄를 식수에서 1주일간 요오드 결핍 식이요법과 함께 치료하여 갑상선기능저하증을 유도하였습니다(그림 1A). 간형 1형 Dio1 mRNA 발현을 정상갑상선 및 갑상선 저하증 마우스에서 정량하여 갑상선기능저하증 유도 성공을 확인하였다²⁹. 갑상선 기능 저하증 마우스는 정상갑상선 대조군에 비해 간 Dio1 mRNA 발현이 약 60% 감소하여 성공적인 갑상선기능저하증 유도를 확인했습니다(그림 1B).

마우스 AL에서 단일 셀 서스펜션을 준비하는 데 사용된 워크플로우의 도식은 그림 2A에 나와 있습니다. 12마리...

토론

여기서 설명한 CD90 기반 FACS 프로토콜은 성체 마우스 뇌하수체 조직에서 원차 갑상선 세포를 풍부하게 하는 재현 가능한 방법을 제공하며, 호르몬 반응성을 유지합니다. 이 방법은 갑상선 생물학 및 HPT 축 조절 연구에서 오랫동안 존재해온 기술적 한계를 해결합니다. 역사적으로 갑상선세포 조절 연구는 TαT1 세포주에 크게 의존해 왔으며; 그러나 TαT1 세포는 기저 Tshb 발현이 매우 낮으며, 정상적인 T3 매개 억제를 일관되게 보여주지 않아 생리학적 중요성이 제한됩니다 14,15,20. HEK293, COS, GH3, JEG3 세포와 같은 비갑상선 세포주에서 Tshb 리포터 구조를 사용하는 이종 시스템은 비생리적 조절 맥락을 도입하며, 비내인성 인핸서-프로모터 상호...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 µm 필터	Corning	430769	수집 매체 살균용
0.22 µm 시린지 필터	Pall Life Sciences	PN4602	콜라겐분해효소 살균용
0.5% 트립신-EDTA	Gibco	15400-054	세포 분리용
1.5 mL 저결합 마이크로 원심분리 튜브	Invitrogen	AM12450	FACS 염색용
15 mL 폴리프로필렌 튜브	Falcon	352097	전엽 수집 및 세포 분리용
23게이지 바늘	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	심장 관류용
8웰 유리 챔버 슬라이드	Millipore	PEZGS0816	FACS 후 배양용
Accudrop 비드	BD Biosciences	345249	FACS 중 드롭 지연 보정용
Anti-mouse PE-Cy7 anti-CD90.2 항체	Invitrogen	25-0902-82	FACS 염색용
자동 세포 계수기	DeNovix	s-10700	세포 계수용
샤콜 흡착 산소 제거 태아 우 혈청	Gibco	12676029	FACS 후 갑상샘 자극 호르몬 배양용
Clostridium histolyticum 출처의 콜라겐분해효소	Sigma-Aldrich	C9263	세포 분리용
수집 팬	표준 실험실 해부 트레이	N/A	심장 관류용
칼슘 이온 및 마그네슘 이온 제거된 사전 준비된 HEPES 완충 식염수 용액 (HBSS)	N/A	N/A	관류 및 세포 분리용
Cyclophilin A (CyA) 올리고뉴클레오티드 프라이머 정방향	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	RT-qPCR용
Cyclophilin A (CyA) 올리고뉴클레오티드 프라이머 역방향	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	RT-qPCR용
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	수집 매체용
DNase I 용액	Promega	M6101	세포 분리용
에녹사파린 나트륨 주사제	Sandoz	0781-3119-64	관류용
태아 우 혈청 (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	수집 매체용
유동 세포 분석 염색 버퍼	Invitrogen	00-4222-26	FACS 염색용
출혈 정지기	Fine Science Tools	13008-12	흉강 안정화용
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	수집 매체용
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	HBSS 제조용
요오드 결핍 식단	Envigo	TD.95007	생체 내 갑상선기능저하증 유도용
아이리스 포스셉	Fine Science Tools	11065-07	뇌하수체 해부용
아이소플루란	Piramal Critical Care	66794-017-25	마취용
L-글루타민	Gibco	35050-061	수집 매체용
Medium 199	Gibco	11150-059	FACS 후 배양용
메티마졸 (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	생체 내 갑상선기능저하증 유도용
MicroAmp Fast 96웰 반응 플레이트	Applied Biosystems	4346907	RT-qPCR용
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140122	FACS 후 배양용
연동 펌프	Fisher Scientific	GP1000	심장 관류용
염화 칼륨 (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	생체 내 갑상선기능저하증 유도용
PowerTrack SYBR Green 마스터 믹스	Applied Biosystems	A46109	RT-qPCR용
프로피듐 아이오다이드	eBioscience	00-6990-50	FACS 중 생존성 염색용
QIAzol 용해 시약	Qiagen	79306	RNA 추출용
실리콘 튜브	Cole-Parmer	EW-96410-13	심장 관류용
스테레오 현미경	Nikon	SMZ-745T	전엽 해부용
StepOnePlus Real-Time PCR 시스템	Applied Biosystems	4376600	RT-qPCR용
외과 스푼	Fine Science Tools	10090-13	뇌하수체 노출 중 뇌 들어올리기용
Transcriptor First Strand cDNA 합성 키트	Roche	4379