본 연구는 대장암에서의 miR-192-5p를 평가하기 위해 공공 데이터셋, 쌍을 이룬 조직 검증, 세포 이동 분석, 타겟 네트워크 예측 및 면역 시그니처 분석을 통합적으로 수행하였습니다. 연구 결과, TCGA/GDC 발현 데이터와 국소 qRT-PCR 결과 사이에 불일치가 있음이 확인되었으며, miR-192-5p의 진단적, 예후적, 기능적 및 면역 관련 중요성에 대한 과도한 해석에 주의할 것을 제언합니다.
연구 논문
대장암에서 miR-192-5p의 임상적 유의성, 면역 침윤 양상 및 기능적 네트워크 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
대장암(CRC)은 microRNA가 종양 진행 및 바이오마커 발견에 기여할 수 있는 이질적인 악성 종양입니다. 본 연구에서는 TCGA/GDC 및 GEO 생물정보학 분석, 쌍을 이룬 조직의 qRT-PCR 검증, 표적 예측, 면역 시그니처 분석 및 HT29 상처 치유 실험을 통합하여 대장암에서 miR-192-5p의 임상적 유의성, 면역 연관성 및 기능적 네트워크를 평가하였습니다. 616개의 종양 샘플과 11개의 정상 COADREAD 샘플을 포함한 TCGA/GDC miRNA-seq 데이터의 재분석 결과, 정상 샘플보다 종양 샘플에서 데이터베이스 수준의 hsa-mir-192 신호가 더 높게 나타났습니다(Mann-Whitney p = 9.96 x 10-8). 11쌍의 TCGA 사례에서도 동일한 경향이 관찰되었으나(종양-정상 차이 중앙값 = 3.13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0.0029), 쌍을 이룬 임상 조직의 국소 qRT-PCR 분석에서는 대장암 조직에서 성숙한 miR-192-5p의 발현이 더 낮음이 확인되었습니다. TCGA 기반 ROC 분석은 강력한 종양-정상 분리 능력을 보여주었지만, 균형 재표집 및 leave-one-normal-out 분석을 통해 정상 샘플 수의 제한으로 인해 이 결과를 주의 깊게 해석해야 함이 확인되었습니다. 임상 병리학적 분석 결과 TCGA 코호트에서 N 병기 및 연령과의 연관성이 시사되었으나, 요약 표에서 T 병기와 M 병기는 유의하지 않았으며, 전체 생존 분석에서는 유의미한 예후 연관성이 나타나지 않았습니다. TCGA RNA-seq를 이용한 후보 허브 유전자 분석은 탐색적인 발현, 상관관계 및 생존 증거를 제공하였으나 miR-192-5p의 직접적인 표적화는 입증하지 못했습니다. 면역 시그니처 분석에서는 이질적이며 대부분 약한 상관관계가 나타났습니다. 기능적으로 miR-192-5p mimic transfection은 HT29의 상처 폐쇄를 감소시켰습니다. 이러한 결과는 miR-192-5p가 대장암과 생물학적 관련성이 있음을 나타내지만, 그 발현 방향과 임상적 해석은 플랫폼에 따라 다르며 추가적인 실험적 검증이 필요함을 시사합니다.
서론
대장암(CRC)은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양 중 하나이며, 암 관련 사망의 주요 원인으로 남아 있습니다1,2. 대장 내시경, 분변 면역 화학 검사, SEPT9 메틸화 검사, 혈중 종양 표지자 및 분자 프로파일링을 통해 대장암의 검출과 임상 관리가 개선되었으나3,4, 종양 생물학, 치료 반응 및 환자 예후에는 여전히 상당한 이질성이 존재합니다5,6,7. 따라서 대장암의 생물학적 특성을 규명하는 데 도움이 되는 바이오마커는 위험 성층화 및 보다 개별화된 치료 전략 개발에 기여할 수 있습니다8.
마이크로RNA(miRNA)는 길이가 약 19–24 뉴클레오타이드인 작은 비코딩 RNA로, 주로 전사 후 조절 메커니즘을 통해 유전자 발현을 조절합니다9. miRNA 발현의 불균형은 암세포의 증식, 이동, 침습, 세포사멸, 면역 상호작용 및 치료 반응에 영향을 미칠 수 있습니다10. miR-192-5p는 조직 유형, 분자적 배경 및 실험 시스템에 따라 발암성 또는 종양 억제성 연관성을 보이며, 다양한 질병과 암에서 상황 의존적인 방식으로 작용하는 것으로 보고되었습니다11,12,13,14,15,16. 대장암(CRC)의 경우, 이전 연구들에서 임상 검체 내 miRNA 프로파일의 변화와 대장암 세포의 악성 표현형에 대한 기능적 조절이 보고된 바 있습니다12,14,15. 하지만 공공 데이터베이스 분석 결과가 항상 동일한 발현 방향을 보여주는 것은 아니며, 대장암에서 miR-192-5p의 임상적 유의성, 타겟 네트워크 및 면역 관련성에 대해서는 신중한 평가가 필요합니다.
본 연구에서는 TCGA/GDC 및 GEO 생물정보학 분석, 짝지어진 임상 조직에서의 qRT-PCR 검증, in vitro 이동 분석, 후보 표적 유전자 예측, 경로 풍부도 분석 및 면역 시그니처 상관관계 분석을 통합하여 CRC 내 miR-192-5p를 평가하였습니다. 본 연구는 성숙한 miR-192-5p가 CRC 조직에서 발현이 감소하며 종양 억제 효과를 나타낼 수 있다는 가설을 바탕으로 수행되었습니다. 재분석한 TCGA/GDC miRNA-seq 신호에서 반대되는 발현 방향이 나타났으므로, 결과는 단일한 결정적 발현 패턴이라기보다 탐색적이며 플랫폼 의존적인 것으로 해석됩니다.
프로토콜
본 연구는 헬싱키 선언을 준수하여 수행되었습니다. 2021년 10월 21일 내몽골 의과대학교 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 연구에 참여한 모든 대상자로부터 서면 동의서를 받았습니다.
임상 검체 수집
2017년 12월부터 2020년 2월 사이에 근치적 절제술을 받은 45명의 환자로부터 쌍을 이룬 CRC 및 인접 비암성 조직을 수집하였다. 모든 환자는 수술 전 방사선 치료나 화학 요법을 받지 않았으며, 다른 악성 종양이 있는 환자는 제외되었다. 인접 비암성 조직은 종양 경계로부터 최소 5 cm 떨어진 곳에서 수집하였다. 시료는 수술적 제거 직후 즉시 냉동하여 RNA 추출 전까지 액체 질소에 보관하였다. 코호트는 남성 환자 27명과 여성 환자 18명으로 구성되었으며, 13명은 60세 미만, 32명은 60세 이상이었다. 임상병리학적 변수에는 종양 직경, TNM 병기, 분화도, 혈관 종양 혈전, 림프절 전이 및 수술 전 CEA 수치가 포함되었다.
공공 데이터 수집 및 전처리
TCGA-COAD 및 TCGA-READ에 대한 오픈 액세스 miRNA-seq, RNA-seq 및 임상 데이터는 Genomic Data Commons 포털에서 확보하였다. 일차 종양 및 정상 고형 조직 샘플은 GDC 샘플 유형에 따라 식별하였다. 전이성 및 재발성 종양 샘플은 종양-정상 차이 발현 분석에서 제외하였다. TCGA miRNA-seq 파일의 경우, 본 분석에서 검출된 데이터베이스 수준 항목은 hsa-mir-192였으며, 발현 값은 log2(RPM + 1)로 분석하였다(여기서 RPM은 매핑된 miRNA 리드 백만 개당 리드 수를 나타낸다). 매칭된 샘플이 있는 경우에는 비쌍 및 쌍 종양-정상 분석을 모두 수행하였다. 후보 표적 유전자 스크리닝에는 GEO 데이터셋 GSE89076 및 GSE156355가 사용되었다. GEO의 차이 발현 유전자는 보정된 p < 0.05 및 절대 log2 fold-change ≥ 2를 기준으로 스크리닝하였다. 원고 전체에 걸쳐 데이터셋 이름의 일관성을 확인하였다.
진단, 임상병리 및 생존 분석
TCGA-COAD, TCGA-READ 및 통합 COADREAD 코호트에서 종양-정상 조직 간의 탐색적 분리 능력을 평가하기 위해 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 사용하였다. 정상 샘플의 수가 적었기 때문에, 5,000회 반복 균형 종양-정상 재표집 및 leave-one-normal-out 분석을 포함한 추가 민감도 분석을 수행하였다. 임상병리학적 연관성 분석을 위해, 일차 종양 샘플을 TCGA miR-192 발현 수준의 중앙값을 기준으로 고발현군과 저발현군으로 나누었다. 샘플 크기가 허용되는 경우, 통합 COADREAD 코호트와 COAD 및 READ 각각에 대해 분석을 반복하였다. 전체 생존율은 log-rank 검정을 이용한 Kaplan-Meier 분석과 단변량 Cox 회귀 분석을 사용하여 평가하였다. 예후 결론이 과장되는 것을 방지하기 위해 진단, 임상병리학 및 생존 분석 결과를 각각 별도로 보고하였다.
후보 표적 유전자 및 허브 유전자 분석
miRWalk 예측 결과와 GSE89076 및 GSE156355의 차별 발현 유전자를 통합하여 후보 표적 유전자를 식별하였습니다. 이 세 가지 소스의 교집합을 후속 탐색적 분석을 위해 유지하였습니다. STRING을 사용하여 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 구축하였으며, Cytoscape 기반의 cytoHubba 및 MCODE 분석을 통해 노드 차수(node degree)와 모듈 연결성에 따라 허브 유전자를 선정하였습니다. 선정된 허브 유전자(KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3, KIF5C)는 TCGA RNA-seq 데이터를 사용하여 추가로 평가되었습니다. 종양-정상 조직 간의 발현 차이, TCGA miR-192 발현과의 Spearman 상관관계 및 전체 생존율과의 연관성을 보충 탐색적 분석으로 요약하였습니다. 이 유전자들은 후보 표적으로만 간주되었으며, 생물정보학 데이터로부터 직접적인 결합, 구조 효과(rescue effect) 또는 하위 단백질 수준의 조절을 추론하지는 않았습니다.
GO 및 KEGG 풍부성 분석
후보 유전자 세트 및 유의미한 네트워크 모듈에 대해 Gene Ontology (GO) 및 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 풍부성 분석을 수행하였습니다. GO 용어는 생물학적 과정, 세포 구성 성분 및 분자 기능 범주로 분류되었습니다. p < 0.05인 풍부성 결과는 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였으며, 이는 실험적으로 검증된 메커니즘이라기보다 가설 생성 단계의 경로 신호로 해석하였습니다.
RNA 추출 및 qRT-PCR 분석
제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 45쌍의 CRC 및 인접 비암성 조직 샘플에서 총 RNA를 추출하였습니다. RNA 순도와 농도는 분광 광도계로 측정하였으며, A260/A280 값이 1.8에서 2.1 사이인 샘플을 역전사 단계에 사용하였습니다. qRT-PCR은 TransGen Biotech의 miRNA 역전사 시스템과 SYBR Green 기반 miRNA qPCR 시약을 사용하여 수행하였습니다. 역전사와 qPCR 증폭은 시약 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다. 각 qRT-PCR 반응은 기술적 반복(technical triplicate)으로 3회 실시하였습니다. 내부 참조 물질로는 RNU6B를 사용하였습니다. miR-192-5p 프라이머는 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (forward) 및 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (reverse)였으며, RNU6B 프라이머는 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (forward) 및 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (reverse)였습니다. qPCR 플랫폼에서 지원하는 경우, 증폭 특이성을 평가하기 위해 용해 곡선(melt-curve) 분석을 사용하였습니다. 상대적 발현량은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였습니다. 쌍을 이룬 종양 및 인접 조직 결과는 쌍을 이룬 임상 측정값으로 분석하였습니다.
세포 배양 및 형질전환
인간 CRC 세포주 HT29는 저자 연구실의 세포 보관소에서 얻었으며, 인증을 거쳐 마이코플라스마 오염이 없음을 확인하였다. HT29 세포는 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin 및 100 µg/mL streptomycin이 첨가된 McCoy's 5A 배지에서 37 oC, 5% CO2 분위기로 배양하였다. 세포는 합류도가 약 80%에 도달했을 때 계대 배양하였다. miR-192-5p mimics와 음성 대조군 올리고뉴클레오타이드 con238은 Sangon Biotech(중국 상하이)에서 구입하여 일시적 형질전환에 사용하였다. HT29 세포를 6-well plate에 분주하고, 세포 밀도가 약 20–30%에 도달했을 때 최종 올리고뉴클레오타이드 농도 50 nM과 시약 제조사의 지침에 따른 지질 기반 형질전환 프로토콜을 사용하여 형질전환을 수행하였다. 정확한 시약 대 올리고뉴클레오타이드 비율과 시약 양은 저자 연구실 기록에 사용된 제조사 권장 프로토콜을 따랐다. 세포를 표준 배양 조건에서 형질전환 복합물과 함께 배양하였으며, 실험 일정에 따라 형질전환 후 하위 형질전환 이미지 분석 및 상처 치유 분석(wound-healing assays)을 수행하였다. 본 연구에는 HT29 세포 데이터만 포함되었다.
상처 치유 분석
형질전환된 HT29 세포를 6-well 플레이트에 분주하고 단층이 완전히 형성될 때까지 배양하였습니다. 멸균된 200 µL 피펫 팁을 사용하여 선형 스크래치를 생성하였으며, 떨어져 나온 세포들은 PBS로 세척하여 제거하였습니다. 이후 이동성 평가 기간 동안 증식과 관련된 영향을 줄이기 위해 배지를 무혈청 배지로 교체하였습니다. 상처 부위의 이미지는 0 h, 24 h, 48 h 시점에서 촬영하였습니다. 상처 치유 분석(Wound-healing assay)은 세 번의 독립적인 생물학적 반복 실험으로 수행되었으며, 각 그룹과 시점별로 여러 개의 현미경 시야를 측정하였습니다. 상처 너비는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 현미경 이미지로부터 정량화하였으나, 원래 측정에 사용된 정확한 소프트웨어 버전은 소스 기록에 명시되어 있지 않았습니다. 상처 치유율은 [(0 h에서의 상처 너비 - 해당 시점의 상처 너비) / 0 h에서의 상처 너비] x 100%로 계산하였습니다. 가용한 원고 데이터에 별도의 증식 대조군 실험이 포함되어 있지 않으므로, 상처 치유 결과는 이동성과 관련된 것으로 해석하되 증식 효과를 완전히 배제한 것은 아니라고 판단하였습니다.
면역 시그니처 상관관계 분석
TCGA miR-192 발현과 면역 관련 시그니처 간의 연관성을 원발성 종양 RNA-seq 데이터를 사용하여 재평가하였습니다. miRNA 및 RNA-seq 데이터가 모두 확보된 총 425개의 종양 샘플을 시그니처 점수 상관관계 분석에 포함했습니다. 허위 발견율(false-discovery rate) 보정 후, miR-192 발현은 Tfh 세포(rho = -0.205, FDR = 0.00049), 활성화된 수지상 세포(rho = -0.186, FDR = 0.00098), Treg 세포(rho = -0.185, FDR = 0.00098), 형질세포양 수지상 세포(rho = -0.169, FDR = 0.0027) 및 대식세포(rho = -0.149, FDR = 0.0092)를 포함한 여러 면역 시그니처와 통계적으로 유의미하지만 약한 음의 상관관계를 보였습니다. 양의 상관관계는 주로 호산구(rho = 0.139, FDR = 0.0155) 및 Th17 세포 시그니처(rho = 0.121, FDR = 0.0296)에서 관찰되었습니다. 이러한 결과는 균일한 양의 면역 침윤 패턴보다는 이질적이고 전반적으로 약한 면역 연관성이 있음을 나타냅니다.
통계 분석
통계 분석은 GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 및 R software 3.6.3을 사용하여 수행되었습니다. 연속형 변수는 적절한 경우 평균 ± 표준편차 또는 중앙값과 사분위수 범위로 요약되었습니다. 종양 조직과 인접 조직 샘플이 매칭된 경우, 짝지은 검정(paired tests)을 사용하여 짝지은 조직 비교를 분석했습니다. 정규성 가정을 충족하지 않는 경우에는 비모수 검정을 사용했습니다. 탐색적 진단 판별을 위해 ROC 곡선, 균형 재표집(balanced resampling) 및 leave-one-normal-out 분석이 사용되었습니다. 범주형 임상 병리학적 연관성에는 카이제곱 검정을, 생존 분석에는 log-rank 및 Cox 모델을, 면역 및 허브 유전자 분석에는 Spearman 상관분석을 사용했습니다. 양측 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였으며, 면역 시그니처 상관관계에 대해서는 거짓 발견율(false-discovery rate) 보정 결과를 보고했습니다.
결과
공공 데이터 세트 및 쌍을 이룬 임상 조직에서의 발현 분석
GDC 유래 TCGA-COAD 및 TCGA-READ miRNA-seq 데이터를 사용하여 miR-192의 발현 패턴을 재평가하였습니다(그림 1). 해당 파일에서 데이터베이스 수준의 항목은 성숙한 hsa-miR-192-5p 종으로 직접 표기되지 않고 hsa-mir-192로 주석 처리되었으므로, 이 공공 데이터베이스 결과는 TCGA miR-192 신호로 해석되었습니다. 통합 COADREAD 코호트에서 616개의 원발성 종양과 11개의 고형 조직 정상 샘플을 분석하였습니다. 종양 샘플은 정상 샘플보다 높은 miR-192 발현을 보였습니다(중앙값 16.05 vs 13.46 log2[RPM + 1], Mann-Whitney p = 9.96 x 10-8). 동일하게 종양에서 더 높게 나타나는 경향이 COAD 단독(종양 455개 및 정상 샘플 8개, p = 9.89 x 10-8) 및 READ 단독(종양 161개 및 정상 샘플 3개, p = 1.94 x 10-5) 분석에서도 관찰되었습니다. 쌍을 이룬 TCGA 분석에서도 11개의 일치 사례에서 종양 발현이 더 높게 나타났습니다(종양-정상 차이 중앙값 = 3.13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0.0029). 이러한 결과는 CRC 조직에서 성숙한 miR-192-5p 발현의 감소를 뒷받침하는 국소 쌍 qRT-PCR 결과와 여전히 일치하지 않았습니다(그림 2).
진단 성능 및 임상병리학적 연관성
위에서 설명한 종양 샘플과 정상 샘플 간의 판별 정의를 사용하여 TCGA 기반 ROC 분석을 반복 수행하였다(그림 3). AUC는 COADREAD 통합 코호트의 경우 0.968, COAD 단독의 경우 0.947, READ 단독의 경우 0.994였다. 추가적인 균형 재표본 추출(balanced resampling) 결과, 중앙값 AUC는 COADREAD 0.983, COAD 0.984, READ 1.000으로 나타났다. 그러나 95% 신뢰 구간이 COADREAD(0.868–1.000)와 COAD(0.781–1.000)에서 넓게 나타났으며, READ의 경우 정상 샘플이 3개만 포함되었다. Leave-one-out 정상 분석 또한 ROC 추정치가 작은 정상군 규모에 민감하게 반응함을 보여주었다. 따라서 ROC 결과는 임상 진단 바이오마커로서의 충분한 근거가 아니라, 종양-정상 분리에 대한 탐색적 근거로만 유지되었다. TCGA miR-192 발현 중앙값을 기반으로 한 임상병리학적 연관성 분석 결과, N stage (p = 0.019) 및 연령 (p = 0.004)과는 유의미한 연관성이 있었으나, T stage (p = 0.110) 및 M stage (p = 0.932)는 유의하지 않았다(표 1).
생존 분석
전체 생존 분석 결과, CRC에서 TCGA miR-192 발현과 유의미한 예후적 연관성은 나타나지 않았습니다(그림 3). 통합 COADREAD 코호트에서 중앙값 기준(median-cut) Kaplan-Meier 비교는 유의하지 않았으며(log-rank p = 0.857), 단변량 Cox 회귀 분석에서도 유의미한 연관성이 관찰되지 않았습니다(log2 발현 단위당 HR = 0.934, p = 0.374). COAD(log-rank p = 0.889; Cox p = 0.493) 및 READ(log-rank p = 0.807; Cox p = 0.716)에서도 동일한 결론이 관찰되었습니다. 따라서 본 데이터는 CRC에서 miR-192가 강력한 예후 바이오마커라는 주장을 뒷받침하지 않습니다.
후보 표적 유전자 및 기능적 풍부도 분석
후보 표적 유전자 분석은 miRWalk 예측 결과와 GEO 데이터셋 GSE89076 및 GSE156355의 차별 발현 유전자를 통합하여 수행되었습니다. 이 스크리닝을 통해 후속 네트워크 및 풍부도 분석을 위한 93개의 후보 유전자를 식별하였습니다(그림 4). 단백질 상호작용 분석을 통해 KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 및 KIF5C를 탐색적 허브 유전자로 선정하였습니다(그림 5). TCGA RNA-seq 민감도 분석 결과, KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1 및 CDK1은 정상 조직보다 종양 조직에서 더 높게 발현된 반면, PLP1, NRXN1, GRIK3 및 KIF5C는 종양 조직에서 더 낮게 발현되었습니다. TCGA miR-192 발현과의 상관관계 분석 결과는 혼재되어 나타났습니다. CDCA5, CCNB1 및 CDK1은 양의 상관관계를 보였고, PLP1, NRXN1 및 KIF5C는 음의 상관관계를 보였습니다. 풍부도 분석에서는 cytochrome P450에 의한 약물 대사, cytochrome P450에 의한 외인성 물질 대사, 레티놀 대사, 글루탐산성 시냅스 관련 용어 및 시냅스 전 조직화와 관련된 대표적인 용어들이 강조되었습니다(그림 6). 이러한 결과는 허브 유전자 네트워크의 생물학적 연관성을 뒷받침하지만, miR-192-5p의 직접적인 표적 작용을 입증하는 것은 아닙니다.
세포 이동 분석
miR-192 상향 조절의 기능적 효과를 평가하기 위해 HT29 세포에 miR-192 mimic을 transfection하였습니다. 형광 현미경을 통해 miR-192-5p mimic transfection 그룹과 음성 대조군 transfection 그룹에서 transfection이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였습니다(Figure 7). wound-healing assay 결과, 24 h와 48 h 모두에서 miR-192가 transfection된 HT29 세포의 이동 속도는 transfection되지 않은 HT29 세포 및 음성 대조군 transfection 세포보다 낮았습니다(Figure 8). 24 h에서 이동 속도는 miR-192 transfection 그룹의 경우 9.75 +/- 2.43%였으며, 이는 untransfected 그룹의 15.69 +/- 3.47% 및 음성 대조군 그룹의 15.45 +/- 3.92%와 대비되었습니다 (P = 0.010). 48 h에서 이동 속도는 miR-192 transfection 그룹이 20.04 +/- 2.54%였으며, 두 대조군은 각각 26.84 +/- 7.65%와 27.98 +/- 6.78%였습니다 (P = 0.021). 이러한 결과는 miR-192 상향 조절이 in vitro에서 HT29 세포의 이동을 억제함을 시사합니다.
면역 시그니처 상관관계 분석
TCGA miR-192 발현과 면역 관련 시그니처 사이의 연관성을 원발성 종양 RNA-seq 데이터를 사용하여 재평가하였다(그림 9). miRNA 및 RNA-seq 데이터가 일치하는 총 425개의 종양 샘플이 시그니처 점수 상관관계 분석에 포함되었다. miR-192 발현은 Tfh 세포(rho = -0.205, p = 2.15e-05), 활성화된 수지상 세포(rho = -0.186, p = 0.00011), Treg 세포(rho = -0.185, p = 0.00013), 형질세포양 수지상 세포(rho = -0.169, p = 0.00046), 대식세포(rho = -0.149, p = 0.0020), Tcm 세포(rho = -0.136, p = 0.0050), NK CD56bright 세포(rho = -0.132, p = 0.0065), Tem 세포(rho = -0.129, p = 0.0078)를 포함한 여러 면역 세포 시그니처와 약한 음의 상관관계를 보였다. 호산구(rho = 0.139, p = 0.0040) 및 Th17 세포(rho = 0.121, p = 0.0129) 시그니처에 대해서는 약한 양의 상관관계가 관찰되었다. 따라서 CRC에서 miR-192의 면역 연관성은 이질적인 것으로 보이며, 면역 침윤 전반에 걸쳐 일관되게 양성이라고 설명해서는 안 된다.
데이터 가용성
본 연구에서 분석된 공공 데이터셋은 GDC/TCGA 포털과 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스의 등록 번호 GSE89076 및 GSE156355를 통해 이용 가능합니다. 본 연구 중에 생성된 드라이랩(dry-lab) 분석 및 재분석 결과는 Supplementary Table 1에 제공됩니다. raw qRT-PCR Ct 값, 상처 너비 측정치, 원본 현미경 이미지 및 관련 실험 데이터를 포함하여 qRT-PCR 및 상처 치유 분석을 뒷받침하는 기초 실험 데이터는 Supplementary Folder 1에 제공됩니다.
그림 1: TCGA에서의 miR-192 범암(Pan-cancer) 발현 개요. x축은 종양 약어를 나타내며, y축은 miR-192의 상대적 발현량을 나타냅니다. 파란색은 정상 조직을, 빨간색은 종양 조직을 나타냅니다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시됩니다: * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001; NS = 유의하지 않음. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: CRC 데이터셋 및 쌍을 이룬 조직에서의 miR-192/miR-192-5p 발현. (A>) CRC 종양 샘플이 정상 샘플보다 데이터베이스 수준의 hsa-mir-192 신호가 더 높음을 보여주는 TCGA/GDC miRNA-seq 분석. (B>) CRC 조직이 인접한 비암성 조직보다 성숙한 miR-192-5p 발현이 더 낮음을 보여주는 쌍을 이룬 국소 조직 샘플의 qRT-PCR 분석. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 3: TCGA hsa-mir-192 발현을 기반으로 한 탐색적 진단 및 생존 분석. (A–C) Kaplan-Meier 생존 곡선. 생존 분석 결과 유의미한 예후적 연관성은 나타나지 않았다. (D) TCGA 코호트 내 종양-정상 조직 판별을 위한 ROC 곡선. 정상 샘플의 수가 적기 때문에 AUC 해석에 주의가 필요하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 후보 표적 유전자 스크리닝 및 단백질 상호작용 분석. (A) miRNA 표적 예측 결과와 GSE89076 및 GSE156355의 차등 발현 유전자 간의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. (B) 93개 후보 유전자의 단백질-단백질 상호작용 네트워크. 노드는 유전자를 나타내며, 엣지는 예측되거나 큐레이션된 유전자 간 연관성을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 후보 표적 네트워크를 이용한 허브 유전자 스크리닝. (A,B) 모듈 스크리닝을 통해 식별된 네트워크 모듈. (C) 네트워크 연결성에 기반한 허브 유전자 순위. (D) 모듈 및 차수 기반 스크리닝을 통합하여 선정된 후보 허브 표적. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 6: 후보 유전자 및 유의미한 네트워크 모듈에 대해 선택된 GO 및 KEGG 농축 항목. 버블 플롯은 대표적인 농축 생물학적 기능 및 경로를 요약하여 보여줍니다. 농축 결과는 탐색적이며 실험적 검증이 필요합니다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 7: HT29 세포 transfection 이미지. (A) 대표적인 HT29 세포. (B) miR-192-5p mimic이 transfection된 HT29 세포의 형광 이미지. (C) 음성 대조군인 con238이 transfection된 HT29 세포의 형광 이미지. 스케일 바 = 100 µm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: HT29 세포에서의 상처 치유 분석(Wound-healing assay). (A) 형질전환되지 않은 HT29 세포, miR-192-5p mimic가 형질전환된 HT29 세포, 그리고 con238이 형질전환된 HT29 세포에서 0 h, 24 h, 48 h 시점에 촬영한 대표적인 스크래치 이미지. (B) 백분율로 표시된 24 h 및 48 h에서의 상처 치유 속도 정량화. 스케일 바 = 100 µm. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 9: CRC 종양 샘플에서 TCGA miR-192 발현과 면역 관련 시그니처 점수 사이의 상관관계. 분석 결과, 여러 개의 약한 음의 상관관계와 주로 호산구 및 Th17 세포 시그니처에서의 양의 상관관계가 나타나며 이질적인 면역 연관성을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 특성 | TCGA miR-192의 낮은 발현 | TCGA miR-192의 고발현 | p 값 | 방법 |
| n | 308 | 308 | ||
| T 병기, n (%) | 0.11 | 카이제곱 검정 | ||
| T1 | 9 (1.5%) | 11 (1.8%) | ||
| T2 | 44 (7.2%) | 59 (9.6%) | ||
| T3 | 209 (34.1%) | 211 (34.4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4.4%) | ||
| N 병기, n (%) | 0.019 | 카이제곱 검정 | ||
| N0 | 156 (25.5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14.4%) | 63 (10.3%) | ||
| 질소 가스 | 61 (10%) | 54 (8.8%) | ||
| M 단계, n (%) | 0.932 | 카이제곱 검정 | ||
| M0 | 214 (39.9%) | 234 (43.7%) | ||
| M1 | 41 (7.6%) | 47 (8.8%) | ||
| 연령, 중앙값 (사분위수 범위) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0.004 | 윌콕슨 |
표 1: CRC에서 TCGA miR-192 발현 그룹과 임상병리학적 특성 간의 연관성. 고발현 및 저발현 그룹은 TCGA miR-192 발현 수준의 중앙값으로 정의하였다. 요약된 표에서 N 병기와 연령은 유의미했으나, T 병기와 M 병기는 유의미하지 않았다.
보충 표 1: 본 연구를 위해 생성된 드라이랩(Dry-lab) 재분석 결과입니다. 워크북에는 TCGA/GDC 발현 비교, 균형 ROC 민감도 분석, leave-one-normal-out 분석, 임상 병리학적 연관성 분석, 생존 분석, 허브 유전자 발현 및 상관관계 요약, 면역 시그니처 상관관계 결과가 포함되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 폴더 1: qRT-PCR, 세포 형질전환 및 상처 치유 실험을 뒷받침하는 가공되지 않은 실험 데이터.이 파일에는 원고에 제시된 분석에 사용된 원래의 qRT-PCR Ct 값, 유세포 분석/형질전환 데이터, 상처 너비 측정값 및 대표 현미경 이미지가 포함되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 연구에서는 공공 데이터셋 분석, 국소 조직 검증, 타겟 네트워크 예측, 면역 시그니처 분석 및 in vitro 이동 실험을 결합하여 대장암(CRC)에서 miR-192-5p의 임상적 및 생물학적 관련성을 평가하였습니다. 분석 과정에서 검증된 TCGA 샘플 정의를 사용하였으며, 가능한 경우 COAD와 READ를 구분하였고, log2(RPM + 1) miRNA 값을 사용하였으며, 쌍을 이룬 비교와 쌍을 이루지 않은 비교를 구분하고, ROC 견고성을 테스트하였으며, 허브 유전자 RNA-seq 민감도 분석을 추가하였습니다. 핵심 결과는 공공 TCGA/GDC miR-192 신호와 국소 성숙 miR-192-5p qRT-PCR 결과가 서로 반대되는 발현 방향을 가리킨다는 점이며, 이는 데이터베이스 수준의 전구체 주석과 성숙 miRNA 측정값을 구분해야 할 필요성을 강조합니다9,11.
이러한 불일치는 단순히 불균등한 표본 크기만으로 설명되어서는 안 됩니다. TCGA 정상군 규모는 작았지만, 비쌍체, 쌍체, COAD 전용 및 READ 전용 분석 모두 TCGA/GDC에서 동일하게 종양 내 발현이 더 높은 경향을 보였습니다. 샘플 출처의 차이, 시퀀싱과 qRT-PCR 플랫폼의 차이, 데이터베이스 수준의 hsa-mir-192 주석과 성숙한 hsa-miR-192-5p 측정치의 차이, RNA 처리 과정, 종양 순도, 인접 조직의 정의 및 인구통계학적 특성 등 여러 요인이 영향을 미쳤을 수 있습니다. 바이오마커 해석 및 종양 이질성에 관한 유사한 우려 사항들이 CRC 연구에서 강조된 바 있습니다5,6,7,8. 따라서 본 연구 결과는 CRC에서 miR-192-5p가 단일한 보편적 발현 방향을 갖기보다는 맥락 및 플랫폼에 따라 다르게 해석되어야 함을 뒷받침합니다.
진단 분석 결과 또한 주의 깊게 해석해야 합니다. TCGA 기반의 ROC 분석에서 높은 AUC가 도출되었으나, 통합 COADREAD 코호트 내 정상 샘플이 11개에 불과하여 비교 대상에 정상 샘플보다 종양 샘플이 훨씬 더 많이 포함되었습니다. 균형 재표집(Balanced resampling)에서도 여전히 높은 중앙값 AUC 수치가 나타났으나, 각 균형 비교가 소규모의 정상군에 의해 제한되었기 때문에 구간이 넓게 형성되었습니다. 따라서 ROC 결과는 TCGA/GDC 내에서 종양과 정상 조직 간의 탐색적 분리를 뒷받침하지만, miR-192-5p를 임상 진단 바이오마커로 확립하기에는 불충분합니다. 이러한 해석은 탐색적 바이오마커 신호와 임상적으로 검증된 진단 또는 예후 바이오마커 사이의 일반적인 구분과 일치합니다4,8.
생존 분석 결과, COADREAD, COAD 또는 READ에서 miR-192 발현과 전체 생존율 사이에 유의미한 연관성이 나타나지 않았습니다. 이번 분석에서 miR-192가 일부 임상 병리학적 변수와 연관이 있을 수 있으나, 가용한 데이터로는 강력한 예후 바이오마커라는 결론을 뒷받침하기 어렵습니다. 예후 바이오마커는 마커 상태가 임상적으로 관련 있는 다양한 상황에서 독립적이고 재현 가능하게 결과와 연관되어 있다는 증거가 필요하므로 이러한 구분이 중요합니다8.
인 비트로(in vitro) 상처 치유 분석은 miR-192의 상향 조절이 HT29 세포의 이동을 감소시킬 수 있다는 기능적 근거를 제공합니다. 이 결과는 대장암(CRC) 세포에서의 잠재적인 종양 억제 기능 및 국소 qRT-PCR 경향과 일치합니다. 이전 연구들 또한 miR-192 관련 경로를 포함한 miRNA가 상피-간엽 이행, 세포 운명 및 이동 관련 표현형을 조절하는 역할을 한다는 점을 뒷받침해 왔습니다.15,16,17하지만 기능적 데이터는 여전히 불충분합니다. 기전적 종양 억제 모델을 뒷받침하기 위해서는 적어도 하나 이상의 추가적인 CRC 세포주에서의 반복 형질전환, 상처 치유 분석을 위한 증식 대조군, Transwell 이동/침습 분석, 선정된 표적의 이중 루시퍼레이즈 검증, 표적 mRNA 및 단백질 측정, 그리고 구조 실험을 포함한 추가적인 습식 실험 검증이 필요할 것입니다.
허브 유전자 분석은 가설 생성 단계로 간주되어야 합니다. TCGA RNA-seq 보완 분석 결과, 유지된 허브 유전자들에서 종양-정상 조직 간의 강한 발현 차이가 나타났으나, miR-192와의 상관관계는 혼재되어 있었습니다. CDCA5, CCNB1, CDK1을 포함한 여러 세포 주기 유전자들은 miR-192와 음의 상관관계가 아닌 양의 상관관계를 보였으며, 이는 단순한 직접적 miRNA-표적 억제 모델과는 일치하지 않습니다. 반면, PLP1, NRXN1, KIF5C는 음의 상관관계를 나타냈습니다. 이러한 결과는 네트워크의 생물학적 관련성을 뒷받침하지만, 루시퍼레이스 분석, 단백질 수준 확인 및 레스큐 검증 없이는 직접적인 표적 작용을 결론지을 수 없음을 나타냅니다. 이러한 신중한 해석은 in silico 표적-네트워크 분석의 탐색적 성격과 일치합니다10,11.
면역 분석 결과는 더욱 신중한 해석이 필요함을 뒷받침합니다. 종양 RNA-seq 면역 시그니처 점수 분석 결과, miR-192 발현은 여러 면역 시그니처와 음의 상관관계를 보였으며, 주로 호산구 및 Th17 세포 시그니처와 양의 상관관계를 보였습니다. 대부분의 상관관계는 허위 발견율(false-discovery rate) 보정 후에도 약하게 나타났습니다. 면역 시그니처 분석법은 벌크 발현 데이터로부터 경로 또는 세포 상태의 농축(enrichment)을 추론하는 방식이므로, 이러한 결과는 탐색적인 것으로 간주해야 하며 직교 면역 프로파일링(orthogonal immune-profiling) 접근법을 통한 검증이 필요합니다13.
본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 첫째, 국소 검증 코호트의 규모가 상대적으로 작았으며 단일 센터에서 수집되었습니다. 둘째, 공공 데이터셋 분석과 국소 qRT-PCR 검증에 서로 다른 플랫폼과 측정 수준이 사용되었습니다. 셋째, TCGA 정상 miRNA-seq 샘플 수가 적어 진단적 추론에 제한이 있었습니다. 넷째, 허브 유전자 및 면역 분석이 계산적으로 수행되었으므로 실험적 검증이 필요합니다. 다섯째, 가용한 기능 실험이 HT29 상처 치유 데이터로 제한되었습니다. 이러한 한계점들로 인해, 본 연구는 miR-192-5p가 CRC에서 검증된 진단, 예후 또는 기전적 바이오마커라는 확정적인 증거라기보다 통합적인 탐색적 분석으로 제시되는 것이 타당합니다6,8.
요약하자면, miR-192-5p는 CRC와 생물학적 관련성이 있는 것으로 보이나, 그 발현 패턴과 임상적 해석은 복잡합니다. TCGA/GDC 분석에서는 CRC 종양 샘플에서 miR-192 신호가 더 높게 나타난 반면, 지역 쌍 조직 코호트의 qRT-PCR 분석에서는 성숙한 miR-192-5p의 발현이 더 낮게 나타났습니다. ROC 분석은 탐색적인 종양-정상 조직 분리 가능성을 보여주었으나, TCGA 정상군 그룹의 크기가 작아 제한적이었습니다. 전체 생존율과의 유의미한 상관관계는 관찰되지 않았습니다. 허브 유전자 및 면역 분석은 가설 생성의 근거를 제공하며, HT29 상처 치유 데이터는 miR-192-5p의 상향 조절이 세포 이동을 감소시킬 수 있음을 시사합니다. miR-192-5p가 CRC의 검증된 진단, 예후 또는 기전적 바이오마커로 간주되기 위해서는 추가적인 독립 코호트 분석과 표적 습식 실험이 필요합니다.
공개 사항
저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.
감사의 글
저자들은 기술 지원을 제공해 준 내몽고 의과대학교 종양 분자 진단 실험실에 감사를 표합니다. 본 연구는 옌청시 보건위원회 과학 연구 프로젝트(Grant No. YK2023101)의 지원을 받았으며, 해당 프로젝트를 통해 논문 게재료를 지원받았습니다.
재료
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