본 후향적 환자-대조군 연구에서는 다낭성 난소 증후군 여성의 혈청 miR-146a, miR-642a, miR-2861 및 대사 마커를 평가하였다. miRNA, 아디포카인, 인슐린 저항성, 염증 및 테스토스테론의 협응적 변화가 관찰되었으며, 결합 바이오마커 모델은 개별 마커보다 더 강력한 판별 성능을 보였다.
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본 후향적 환자-대조군 연구에서는 다낭성 난소 증후군 여성의 혈청 miR-146a, miR-642a, miR-2861 및 대사 마커를 평가하였다. miRNA, 아디포카인, 인슐린 저항성, 염증 및 테스토스테론의 협응적 변화가 관찰되었으며, 결합 바이오마커 모델은 개별 마커보다 더 강력한 판별 성능을 보였다.
다낭성 난소 증후군(PCOS)은 가임기 여성에게 흔히 나타나는 내분비 및 대사 장애이지만, 혈중 마이크로RNA(miRNA)와 영양 관련 단백질 사이의 관계는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 PCOS 환자의 혈청 miR-146a, miR-642a 및 miR-2861과 대사 및 염증 마커 간의 연관성을 조사하였습니다. 연구 대상은 PCOS 여성 62명과 건강한 대조군 71명이었습니다. 혈청 miR-146a, miR-642a 및 miR-2861은 정량적 실시간 PCR로 측정하였으며, 아디포넥틴(ADPN), 렙틴(LEP), 레티놀 결합 단백질 4(RBP4), 인슐린 저항성-정량적 평가 지수(HOMA-IR), 인터루킨-6(IL-6) 및 테스토스테론(T) 수준 또한 평가하였습니다. 방법론적 검증을 통해 시료 처리 조건, 분석 정밀도 및 분석 방법 간의 일치도를 평가하였습니다. 대조군과 비교했을 때, PCOS 여성은 miR-146a 발현은 증가하고 miR-642a 및 miR-2861 발현은 감소한 것으로 나타났습니다. ADPN 수치는 감소한 반면, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 및 T 수치는 상승하였습니다. miR-146a는 ADPN과 음의 상관관계를 보였고, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 및 T와는 양의 상관관계를 보였습니다. miR-642a는 RBP4, HOMA-IR 및 IL-6와 음의 상관관계를 보였으며, miR-2861은 ADPN과 양의 상관관계를 보였습니다. 방법론적 검증 결과, 분석 안정성, 정밀도 및 방법 간 일치도는 수용 가능한 수준이었습니다. 세 가지 miRNA와 ADPN, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 및 T를 결합한 모델은 곡선 아래 면적(AUC) 0.929, 민감도 82.26%, 특이도 94.37%를 달성하였습니다. 이러한 결과는 PCOS에서 혈중 miRNA와 대사 마커의 협응적 변화를 보여주며, 이들의 결합된 진단 잠재력에 대한 추가 평가를 뒷받침합니다.
PCOS는 가임기 여성에게 가장 흔하게 나타나는 내분비 및 대사 질환입니다. 전 세계 유병률은 6%에서 20% 사이로 추정됩니다. 영향을 받는 여성의 약 70%가 인슐린 저항성을 보이며, 절반 이상이 과체중 또는 비만입니다1. PCOS는 배란 장애, 불임, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환 및 기타 장기적인 합병증을 유발하여 생식 건강과 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있습니다2. 그 발병 기전이 완전히 밝혀지지는 않았으나, 일반적으로 PCOS는 유전적 감수성, 만성 저강도 염증, 인슐린 신호 전달 경로의 이상 및 국소 난소 미세환경의 파괴를 포함한 여러 요인이 관여하는 것으로 간주됩니다. 이러한 배경에서 질병의 진행을 반영하는 특이적 분자 마커를 식별하는 것은 PCOS의 조기 진단 및 정밀 개입에 있어 분명한 가치가 있습니다3,4.
MiRNA는 길이가 약 22 뉴클레오타이드인 비코딩 RNA의 일종입니다. 이러한 분자들은 mRNA의 분해를 촉진하거나 번역을 억제함으로써 전사 후 유전자 발현을 조절합니다. 따라서 이 분자들은 세포 성장, 분화, 염증 반응 및 대사 조절을 포함한 많은 세포 과정에 매우 중요합니다5,6. 이전 연구들에 따르면 PCOS 환자의 혈청에서 miR-146a, miR-642a 및 miR-2861의 특징적인 조절 장애가 나타났습니다. miR-146a의 상향 조절은 TLR4/NF-κB 경로의 표적 조절을 통해 만성 염증 반응을 매개할 수 있으며7, miR-642a 및 miR-2861의 발현 감소는 인슐린 저항성 및 난소 과립막 세포 기능 저하와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다8,9. 영양 관련 단백질인 ADPN, LEP 및 RBP4는 대사 균형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이들의 수치 변화는 지질 처리 방식, 신체의 인슐린 민감도 및 염증 상태에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이는 PCOS에서 나타나는 대사 문제의 분자적 기초의 핵심 부분으로 간주됩니다10,11. 그러나 지금까지 발표된 대부분의 연구는 PCOS와 관련하여 miRNA 또는 영양 관련 단백질을 개별적으로 조사했으며12,13, 이 둘 사이의 분자적 관계는 아직 체계적으로 규명되지 않았습니다.
본 연구에서는 PCOS 환자를 대상으로 3가지 miRNA와 6가지 핵심 바이오마커의 발현 수준을 측정하고, 이들 마커 간의 상관관계 및 임상 생화학적 지표와의 연관성을 분석하였으며, 나아가 miRNA가 영양 관련 단백질과의 연관성을 통해 PCOS의 병리적 과정에 참여하는지 탐색하였습니다. 본 연구 결과는 PCOS의 분자적 기초에 대한 현재의 이해를 넓히고, 영양 및 대사 조절을 목표로 하는 치료법의 잠재적 표적을 제시하며, PCOS의 조기 스크리닝, 효능 모니터링 및 개별 맞춤형 관리를 위한 실험적 근거를 제공할 수 있을 것입니다.
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Statement of ethics
The study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki and was approved by the Medical Ethics Committee of Ganzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine (approval no. GZSZYYKYLL20240092, Date: 2024-12-20).
All materials, reagents, assay kits, and equipment used in this protocol are listed in the Table of Materials.
Study design
This retrospective case-control study included 62 patients with PCOS diagnosed at the gynecology outpatient clinic of Ganzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine between June 2024 and August 2025 and 71 healthy women of reproductive age examined at the hospital’s health management center during the same period. Controls were selected to achieve group-level comparability in age; BMI was not used as a matching variable and was evaluated as a baseline characteristic.
Study subjects
Inclusion criteria: The inclusion criteria for the PCOS group were as follows: (1) age >18 years; (2) diagnosis of PCOS according to the modified Rotterdam criteria endorsed by the 2023 International Evidence-based Guideline, requiring at least two of the following three features after exclusion of related disorders: oligo-ovulation or anovulation, defined as menstrual cycles longer than 35 days or fewer than eight cycles per year; clinical hyperandrogenism and/or biochemical hyperandrogenism, with biochemical hyperandrogenism defined as a serum total T concentration above the assay-specific upper reference limit; and polycystic ovarian morphology, defined as at least 20 follicles in one ovary or an ovarian volume of at least 10 mL when complete follicle counting was not feasible14; (3) complete electronic medical records; (4) no hormone replacement therapy, hypoglycemic agents, or immunosuppressants during the preceding 3 months; and (5) availability of a fasting serum sample collected at enrollment and stored in the institutional biobank.
The inclusion criteria for the control group were as follows: (1) attendance for a health examination during the same period; (2) regular menstrual cycles; (3) normal ovarian morphology on transvaginal ultrasonography; (4) no history of endocrine disorders, gynecological disease, infertility, or clinically significant hepatic or renal dysfunction; and (5) availability of a fasting serum sample collected on the day of examination and stored in the institutional biobank.
The exclusion criteria were as follows: (1) endometriosis, uterine fibroids, ovarian tumors, pelvic inflammatory disease, or other gynecological disorders; (2) thyroid dysfunction, Cushing syndrome, hyperprolactinemia, congenital adrenal hyperplasia, or other endocrine disorder that could account for ovulatory dysfunction or hyperandrogenism; (3) severe cardiac, hepatic, renal, or pulmonary dysfunction, malignant tumors, autoimmune diseases, or hematologic disorders; (4) pregnancy, delivery, or abortion within the preceding 6 months; (5) use of glucocorticoids, oral contraceptives, or other medications affecting glucose or lipid metabolism during the preceding 3 months; (6) psychiatric disorders or cognitive impairment; (7) missing key clinical information; and (8) severe serum hemolysis, defined as a hemoglobin concentration >2.0 g/L, lipemia, jaundice, more than one freeze–thaw cycle, or interrupted sample storage. Thyroid dysfunction, hyperprolactinemia, and non-classic congenital adrenal hyperplasia were excluded using thyroid-stimulating hormone, serum prolactin, and 17-hydroxyprogesterone measurements, respectively; follicle-stimulating hormone was reviewed where appropriate, while Cushing syndrome or an adrenal tumor was investigated when clinically indicated. The same pre-analytical procedure was applied to all clinical samples, and no sample included in the primary analysis underwent more than one freeze–thaw cycle.
Serum sample collection and storage
Fasting venous blood (10 mL) was collected in the morning into anticoagulant-free tubes, allowed to clot at room temperature for 30 min, and centrifuged at 1,505 x g for 15 min at 4 °C. Serum was divided into 200 µL aliquots and stored at −80 °C until analysis. The same pre-analytical procedure was applied to all clinical samples, and no sample included in the primary analysis underwent more than one freeze–thaw cycle.
Preparation of samples for methodological validation
Ten pooled serum samples from healthy volunteers were used to evaluate the effects of centrifugation speed (1,505, 3,000, and 4,000 x g for 15 min), freeze–thaw frequency (0, 1, 3, and 5 cycles), storage temperature (4 °C, −20 °C, and −80 °C for 7 days), storage duration (1, 3, 6, and 12 months at −80 °C), and hemolysis (<0.1, 0.1–0.5, and 0.5–2.0 g/L hemoglobin).
Laboratory testing
All laboratory assays were performed by the same trained technician under standardized environmental conditions and according to prespecified operating procedures. Serum miRNAs were quantified by qRT-PCR; ADPN, LEP, and RBP4 were measured by sandwich ELISA; T and IL-6 were measured by chemiluminescence-based immunoassays; and glucose-metabolic variables were obtained using routine automated laboratory methods.
Serum miRNA quantification by qRT-PCR
Total RNA was extracted from 200 µL of serum using TRIzol reagent. Spectrophotometric RNA concentration and A260/A280 purity data were not available for the archived serum RNA preparations. qRT-PCR assay acceptability was therefore assessed by the presence of a single specific melting-curve peak and concordance among three technical replicates. After chloroform phase separation, isopropanol precipitation, and two washes with 75% ethanol, the RNA pellet was dissolved in enzyme-free water. The 20 µL reaction system contained 4 µL of 5x buffer, 1 µL of reverse transcriptase, 1 µL of 10 µM stem-loop primer, and 5 µL of RNA template. The reaction conditions were 16 °C for 30 min, 42 °C for 30 min, and 85 °C for 5 s. The reverse-transcribed products were stored at −20 °C. Quantitative PCR was carried out using the TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II kit. Each 20 µL reaction contained 10 µL of 2× SYBR mixture, 0.8 µL each of forward and reverse primers (10 µM), and 2 µL of cDNA template. Amplification was performed on an Applied Biosystems 7500 real-time PCR system under the following conditions: pre-denaturation at 95 °C for 30 s; 40 cycles of 95 °C for 5 s and 60 °C for 30 s; melting curve analysis was then performed to confirm amplification specificity. U6 snRNA served as the internal reference gene, and relative expression levels of miR-146a, miR-642a, and miR-2861 were calculated using the 2-ΔΔCt method. Each sample was tested in triplicate. The sequences of all primers used in this study are listed in Table 1.
Serum protein marker detection
Serum ADPN, LEP, and RBP4 concentrations were measured by double-antibody sandwich ELISA using the Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit (analytical sensitivity, 0.891 ng/mL; assay range, 3.9–250 ng/mL), Human Leptin Quantikine ELISA Kit (analytical sensitivity, 7.8 pg/mL; assay range, 15.6–1,000 pg/mL), and Human RBP4 Quantikine ELISA Kit (analytical sensitivity, 0.628 ng/mL; assay range, 1.56–100 ng/mL), respectively. Each assay was specific for the corresponding human analyte, and serum samples were diluted according to the manufacturer’s instructions. Absorbance was measured at 450 nm, and concentrations were calculated using four-parameter logistic standard curves. The intra-assay or inter-assay CVs were 2.5% or 3.2% for ADPN, 2.7% or 3.4% for LEP, and 2.6% or 3.3% for RBP4.
T measurement
Serum T was measured by electrochemiluminescence immunoassay using a Roche Cobas e601 automated immunoassay analyzer.
Glucose-metabolic and inflammatory measurements
Fasting plasma glucose, fasting insulin, and HbA1c values were obtained from same-day routine clinical laboratory records rather than from the archived serum aliquots used for the miRNA and metabolic protein assays. Fasting plasma glucose was measured by the glucose oxidase method, fasting insulin by immunoturbidimetry, and HbA1c by high-performance liquid chromatography. HOMA-IR was calculated as [fasting plasma glucose (mmol/L) × fasting insulin (mIU/L)]/22.5. Serum IL-6 was measured by chemiluminescence immunoassay.
Methodological validation
The alternative-method comparisons were performed to determine whether the primary measurements were robust to assay platform and were not used to generate the principal between-group results. Expression levels of the three miRNAs and five biochemical markers were measured under the different processing conditions described above, and the coefficient of variation for each indicator was calculated as CV = (standard deviation/mean) x 100%. A CV <15% was considered acceptable for evaluating the stability of assay results under different sample processing and storage conditions. Within-day precision was assessed by repeated measurement of the same pooled serum sample 10 times on a single day, whereas between-day precision was determined from measurements performed once daily over five consecutive days. For each indicator, the mean, standard deviation, and corresponding CV were calculated. For analytical agreement testing, five biochemical analytes—ADPN, LEP, RBP4, IL-6, and T—were measured in the validation samples using the primary assay and a Roche chemiluminescence-based immunoassay platform. Bland–Altman analysis was used to calculate the 95% limits of agreement. The primary qRT-PCR assay was used for all clinical miRNA measurements, whereas the miScript SYBR Green PCR Kit was used only as an orthogonal method in the analytical agreement experiment; Pearson correlation coefficients were calculated between the two qRT-PCR systems.
Statistical analysis
Data analysis was performed using statistical software. All continuous variables were first tested for normality with the Shapiro-Wilk test. Data with a normal distribution are expressed as mean ± standard deviation. Comparisons between two groups were made with the independent-samples t test, while comparisons among multiple groups were performed using one-way analysis of variance, followed by the LSD-t test for pairwise comparisons. Data not conforming to a normal distribution are presented as median (interquartile range) [M (P25, P75)]. Comparisons between two groups were then performed with the Mann-Whitney U test, and comparisons among multiple groups with the Kruskal-Wallis H test. Categorical data were presented as frequencies and percentages. We used the χ2 test or Fisher’s exact test to compare the groups. Correlations between variables were assessed using Pearson correlation analysis or Spearman rank correlation analysis according to data distribution. As an exploratory analysis, Pearson correlations between each miRNA and the six metabolic markers were repeated within non-obese (BMI <28 kg/m2) and obese (BMI ≥28 kg/m2) PCOS subgroups. Correlation coefficients were compared using Fisher’s r-to-z transformation, and the resulting between-subgroup p values were adjusted using the Benjamini–Hochberg false-discovery-rate procedure. We evaluated diagnostic performance using receiver operating characteristic (ROC) curves and the area under the curve (AUC). In addition, we analyzed combined detection using a logistic regression model. All tests were two-sided, and p < 0.05 was considered statistically significant.
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연구 대상군의 기저 특성
본 연구에는 PCOS 환자 62명과 건강한 대조군 71명이 포함되었습니다. 두 그룹은 연령, 인종 구성 및 기타 기저 특성에서 유사하였습니다 (p > 0.05). 반면, 생리 주기는 대조군보다 PCOS 그룹에서 유의미하게 더 길었으며 (p < 0.001), 이는 PCOS의 전형적인 임상 증상과 일치합니다 (표 2).
혈청 miRNA 발현 수준
혈청 miRNA 분석 결과, PCOS 환자와 건강한 대조군 사이에 발현 프로파일의 뚜렷한 차이가 있음이 밝혀졌다. PCOS 군에서 2^-ΔΔCt 방법으로 계산한 miR-146a의 상대적 발현 값은−ΔΔ임계 사이클(Ct) 방법은 2.15였습니다. ± 0.49이며, 이는 대조군과 비교하여 35.22% 증가한 수치입니다...
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표준화된 혈청 생화학 분석 및 qRT-PCR을 사용하여, 본 연구에서는 PCOS 환자 62명과 건강한 대조군 71명의 혈청 샘플을 분석하였습니다. 그 결과, PCOS에서 miRNA 및 영양 관련 단백질 발현의 특징적인 조절 장애 패턴을 발견하였으며, 이들 사이에 유의미한 전사 후 연관성이 있음을 확인하였습니다. 모든 실험은 엄격한 방법론적 검증을 거쳤습니다. 검출 시스템의 정밀도, 안정성 및 방법 간 일치도는 모두 고품질 실험실에서 기대되는 표준을 충족하였으며, 이는 본 연구 결과의 신뢰성을 뒷받침합니다.
PCOS의 생화학적 특징으로는 만성적인 저등급 염증과 인슐린 저항성이 있으며, 이러한 비정상적인 대사 미세환경은 영양 관련 단백질 발현의 불균형을 유도하는 중요한 요인이 됩니다15,16. 신체에서 가장 큰 내분비 기관인 지방 조직은 자가분비, 파라크린 및 내분비 작용을 통해...
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저자들은 이해 상충이 없음을 밝힙니다.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| -80 °C 초저온 냉동고 | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | 혈청 샘플의 장기 저온 보관 |
| Adiponectin (ADPN) ELISA 키트 | R&D Systems (USA) | DY1065 | 혈청 ADPN 농도의 정량적 검출 |
| 자동 생화학 분석기 | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | 공복 혈당, 인슐린 및 당화혈색소 검출 |
| 자동 마이크로플레이트 리더 | Tecan (Switzerland) | Infinite M200 Pro | ELISA 실험을 위한 450 nm에서의 흡광도 측정 |
| 혈당 검출 키트 | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | 글루코스 산화효소법을 이용한 혈청 공복 혈당 검출 |
| Cobas e601 화학발광 면역 분석기 | Roche (Germany) | Cobas e601 | 혈청 테스토스테론 및 IL-6의 전기화학발광 검출 |
| 효소 제거 냉동 보존 튜브 | Axygen (USA) | MCT-150-C | 혈청 샘플 분주, -80 °C 초저온 보관 |
| Eppendorf Research plus 피펫 | Eppendorf (Germany) | Research plus 0.5-1,000 μL | 혈청 흡입, RNA/시약 피펫팅, 샘플 분주 |
| 당화혈색소 (HbA1c) 키트 | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 혈청 HbA1c 검출 |
| IL-6 검출 키트 | Roche (Germany) | 5200057190 | 혈청 인터루킨-6의 정량 |
| 인슐린 검출 키트 | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | 면역탁도법을 이용한 혈청 공복 인슐린 검출 |
| Leptin (LEP) ELISA 키트 | R&D Systems (USA) | DY398 | 혈청 LEP 농도의 정량적 검출 |
| 저온 고속 원심분리기 | Xiangyi Instrument (China) | TDZ5-WS | 지정된 원심력에서의 샘플 원심분리 |
| miScript SYBR Green PCR 키트 | Qiagen (Germany) | 218073 | miRNA 검출을 위한 방법론적 일관성 검증 |
| PrimeScript RT 역전사 키트 | TaKaRa (Japan) | RR036A | cDNA 합성을 위한 miRNA 역전사 |
| 실시간 형광 정량 PCR 장비 | Applied Biosystems (USA) | 7500 | miRNA qRT-PCR 증폭 및 형광 검출 |
| Retinol binding protein 4 (RBP4) ELISA 키트 | R&D Systems (USA) | DY6005 | 혈청 RBP4 농도의 정량적 검출 |
| SPSS 통계 소프트웨어 | IBM (USA) | 25 | 데이터 정규성 검정, 그룹 간 비교, 상관관계 및 ROC 분석 |
| SYBR Premix Ex Taq II 키트 | TaKaRa (Japan) | RR420A | miRNA 형광 정량 PCR 증폭 |
| Testosterone (T) 검출 키트 | Roche (Germany) | 5200067190 | 혈청 테스토스테론 수치의 정량 |
| TRIzol 총 RNA 추출 시약 | Invitrogen (USA) | 15596026 | 혈청 샘플로부터의 총 RNA 추출 |
| 항응고제 없는 진공 채혈관 | BD Biosciences (USA) | 367812 | 혈청 분리를 위한 공복 주정중정맥 혈액 채취 |
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