마우스 노화 모델에서 약리학적 화합물이 미토콘드리아 형태에 미치는 영향 측정

요약

이 프로토콜은 이식형 삼투 미니펌프를 통해 투여된 약물이 노화 마우스 모델에서 미토콘드리아 형태에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다. 쥐 간의 3차원(3D) 초해상도 공초점 영상이 수행되었으며, 미토콘드리아 구조의 편향 없는 분할, 분류 및 정량 분석을 위한 파이프라인이 개발되었습니다.

초록

노화 관련 분자 손상 축적은 특히 에너지 소비가 많은 조직에서 미토콘드리아 형태 변화와 대사 기능 장애에 기여할 수 있습니다. 대사 기능 장애를 완화하고 건강하고 '젊은' 미토콘드리아 형태를 회복하는 약리학적 화합물은 포유류에서 건강 기간(즉, 노화 관련 만성 질환의 부담에서 벗어난 수명)을 연장하는 효과적인 기법이 될 수 있습니다. 여기서는 소수성 약리학적 화합물을 안정적으로 전달하기 위해 노령 쥐에서 피하 삼투압 펌프 이식을 수행하는 방법을 설명합니다. 그 후 조직을 고정, 냉동절부, 염색 및 초해상도 공초점 광학 현미경으로 영상화합니다. 마지막으로, 미토콘드리아 구조의 3차원 분할, 분류 및 정량적 측정을 위한 자동화 파이프라인이 제시됩니다. 따라서 이러한 방법들은 마우스 수명 전반에 걸쳐 다양한 조직에서 미토콘드리아 3차원 구조 변화를 정량적으로 평가하는 데 유용할 수 있습니다. 더불어, 이러한 기법들은 노화 관련 대사 기능 장애를 완화하는 소분자 약물의 재현 가능성을 높이는 데 도움을 줄 수 있습니다.

서론

미토콘드리아는 숙주 세포와 조직의 현재 대사 요구에 맞춰 시공간적으로 조직된 이중 막 결합 소기관입니다^1. 내막의 함출 부분인 크리스타(cristae)는 카디오리핀과 인산암 인지질(예: 카디오리핀, 인산절탄놀라민 등), 크리스타 끝의 ATP 합성효소 이합체 행, 크리스테 상단의 다이나민 유사 GTPase 광위축 1(OPA1)의 카디오리핀 결합 올리고머, 그리고 크리스테 접합부의 미토콘드리아 접촉 부위 및 크리스타 조직화 시스템(MICOS) 복합체 간의 동적 조정을 통해 형성되고 조직됩니다. 이 내막 구조들은 미토콘드리아를 개별^{기능 단위로} 하위 구획화하며, 미토콘드리아 막 전위 생성 호흡 복합체가 조립할 수 있는 표면적을 증가^{시킵니다.} 세포자멸 신호^{전달 3}, Ca²⁺, 활성산소종 항상성³, 지질 생합성⁴와 관련된 2차 세포 기능을 가진 동적 소기관으로서, 미토콘드리아 형태 구조는 산소 가용성 감소⁵와 소포체에서 Ca²⁺ 방출 증가와 같은 환경 변화에 매우 민감하다 ^6,7.

분자 손상 축적^{은 노화} 중 미토콘드리아 구조와 기능의 변화에 기여합니다. Kühlbrandt 그룹이 여러 모델 생물을 대상으로 수행한 선구적인 냉동전자 단층촬영(cryo-ET) 연구는 크리스타 밀도와 호흡 능력 사이에 명확한 상관관계가 있음을 보여주었으며, 나이에 따라 크리스타 밀도 감소와 ATP 합성효소 이합체 손실도 함께 나타났습니다 ^9,10. 더불어, 미토콘드리아 부피 변화는 미토콘드리아 핵분열 및 융합 역학 장애로 인해 발생할 수 있습니다¹¹, 지질 축적 증가¹², 부종 증가¹³. 골격근에서는 기대수명을 강력히 예측하는 VO₂ max^14,15가 근섬유 간 미토콘드리아 파편화와 크리스테 밀도¹⁶을 바탕으로 정확히 예측할 수 있습니다.

예상대로, 미토콘드리아의 노화와 관련된 구조적·기능적 변화는 여러 만성 질환의 발병에 기여할 수 있습니다^{17, 18, 19, 20}. 미토콘드리아 분열의 증가와 미토콘드리아 생합성 및 형태의 변화는 알츠하이머병과 파킨슨병 모두와 관련이 있습니다²⁰. 이러한 변화는 산화성 인산화 복합체에 교란을 일으켜 양성자 동력의 생성을 저해하고, 20,21,22종의 과도한 활성 산소 생성으로 이어진다. 노화 관련 심장 기능 장애 및 심부전에서는 미토콘드리아 파편화, 부기, 공포화, 그리고 크리스테 밀도 감소가 ATP 생성 감소에 기여합니다^23,24. 이러한 구조적 변화는 미토콘드리아 Ca²⁺ 처리 변화와 미토콘드리아 투과성 전이^공 6,7,13,25의 활동 증가와 관련이 있을 수 있습니다. 미토파지의 조절 요인으로서 노화 중 투과성 전이 공의 과도한 개방은 오히려 파괴적이며 통제되지 않는 세포 사멸로 이어질 수 있습니다¹³. 마지막으로, 미토콘드리아 지질 대사 및 미토포지의 노화 관련 결핍도 비알코올성 지방간 질환 발병에 기여할 수 있음이 알려져 있습니다²⁶. 특히, 간성 지방증은 산화 스트레스 증가와 도넛 유사 미토콘드리아 구조 형성 증가를 동반하는 것으로 나타났습니다 ^3,27.

따라서 특정 만성 질환을 앓는 개인의 삶의 질을 개선하기 위해 노화와 관련된 미토콘드리아 기능 저하를 표적으로 하는 치료제 개발에 상당한 관심이 있습니다. 포르지니티(엘라미프리타이드)는 내막 표면 전위를²⁸ 약화시키고 미토콘드리아 ATP 생성^29,30을 증가시키는 지질 상호작용 펩타이드로, 최근 바르트 증후군 치료를 위한 최초의 FDA 승인 미토콘드리아 표적 약물이 되었습니다. 바르트 증후군은 심장리핀 재형성 결함이 심근병증, 골격근 약화, 조기 사망에 기여하는 X-연관 질환입니다. 노년 마우스에서 단기 치료는 근육 생물학적 연령 변화를 감지하지^못했으나, 엘라미프레타이드 치료는 심장 박출률 및 전 방향 긴장^32,33, 근육 피로 및 힘 생성 33,34,35, 허약³² 등 노화 기능 지표에서 반복적으로 개선을 보였습니다. 장에서 유래한 엘라기탄닌인 우롤리틴 A는 미토파지(mitophagy)를 유도하는³⁶은 유산소 근지구력과 근력에도 임상적 개선을 보^였으며, 노령 쥐와 유도 심부전 모델에서 심장 기능 장애에 긍정적인 효과도 보였다³⁹. 메트포르민은 복합체 I⁴⁰과 상호작용하는 것으로 확인된 항당뇨제로, 칼로리 제한^41,42의 부분적 모방제로 작용하는 것으로 제안되었습니다. 그러나 메트포르민 치료가 이전 역학 데이터에서 암 위험 감소와 인지 저하 지연과 연관되어 있음에도 불구하고^(43,44), 비당뇨병 환자의 건강 수명과 수명에 미치는 영향은 아직 미해결 질문입니다⁴⁵. 마지막으로, NAD+ 전구체인 니코틴아마이드 리보사이드 치료는 미토콘드리아 생합성과 미토콘드리아 접힘 단백질 반응을 상향 조절하여^{에너지 생성을} 개선할 수 있으^나, UM-HET3 마우스에서의 장기 치료는 마우스 중간 수명 또는 90백분위수 수명에 유의미한 영향을 미치지 못했습니다⁵⁰.

여기서는 약리학적 화합물로 처리된 노화 마우스에서 조직을 미토콘드리아 형태의 초고해상도 공초점 영상을 위해 준비하는 방법을 설명합니다. 쥐에서 지속적인 약물 전달을 위한 삼투압 미니펌프 이식에 성공한 사례가 입증되었으며, 간이 치료가 외막 구조에 미치는 영향을 분석하였습니다. 마지막으로, 미토콘드리아 부피, 표면적, 구도의 편향 없고 재현 가능한 정량 측정과 미토콘드리아를 다양한 구조로 분류하는 분석 파이프라인을 제시합니다. 따라서 이 방법들은 포유류 생애 전반에 걸친 미토콘드리아 형태 변화 연구와 노화 관련 대사 건강 저하를 완화할 수 있는 약리학적 화합물 규명에 모두 적용 가능합니다.

프로토콜

연구 동물을 이용한 모든 절차는 실험동물 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었으며, 브리검 여성병원과 하버드 의과대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 프로토콜 번호 2016N000368. 이 프로토콜을 다른 국가에 적용하려는 연구자는 해당 지역의 기관 및 규제 기관과 상담하여 관련 동물 복지 규정 준수를 확인해야 합니다.

1. 피하 삼투압 펌프 이식

참고: 동물 수술은 경험 많고 훈련된 인력에 의해서만 시행되어야 하며, 동물의 스트레스와 고통을 최소화하기 위해 각별한 주의가 필요합니다. 승인된 동물 프로토콜에 명시된 대로만 연구 동물을 대상으로 한 절차를 수행하세요. 동물을 이용하는 모든 연구는 3R(대체, 감소, 정제)을 엄격히 준수해야 합니다. 이 프로토콜은 경미한 수술 절차로 분류되는 피하 삼투 펌프 이식을 상세히 설명합니다. 복막 내 삼투 펌프 이식도 가능하지만, 이는 더 복잡한 절차로 주요 수술 절차로 분류됩니다. 따라서 복막 내 이식을 지지하는 강력한 과학적 근거가 없는 한 피하 시술을 시행하는 것이 권장됩니다.

1. 삼투압 펌프 충전
   참고: 약물 용액 준비와 삼투압 펌프 충전은 멸균 기술을 사용하여 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 펌프 모델은 원하는 저류지 용량과 처리 공급 기간을 기준으로 선택해야 합니다. 본 연구에서는 모델 2004(~200 μL 저수지, 4주간 처리 전달)를 사용했습니다.
   1. 삼투압 펌프와 호환되는 용매에서 약물 용액을 준비합니다. https://alzet.com/formulating-the-solution/ 를 참고하세요. 주문한 삼투압 펌프 배치에 명시된 유량(μL/h)을 사용하여 목표 일일 용량을 달성하는 데 필요한 약물 농도를 결정합니다.
      참고: 50% v/v DMSO와 50% v/v PEG₃₀₀ 의 용액은 소수성 화합물을 안정적으로 용해시키며 삼투압 펌프와 호환됩니다. 모든 화합물과 용매는 가능하면 의약품 등급이어야 합니다.
   2. 0.22 μm 주사기 필터로 약물 용액을 소독하고 실온에서 보관하세요.
   3. 유량 감속기를 펌프에 넣고 마이크로퓨지 튜브에 맞게 눌러주세요. 흐름 감속기를 끝까지 누르지 마세요.
   4. 빈 마이크로퓨지 튜브에 분석 저울을 타고, 삼투 펌프의 무게를 기록합니다.
   5. 충전 튜브를 1mL 주사기에 연결하고 펌프 저장소 용량의 최소 1.5배를 끌어올립니다. 플런저를 아래로 당기고, 주사기를 튕겨 넣어 액체가 충전관 상단에 형성될 때까지 밀어 올리면 공기 방울을 제거하세요.
   6. 펌프를 세운 상태에서 유량 감속기를 제거하세요.
   7. 펌프 상단의 구멍을 통해 충전 튜브를 더 이상 넣을 수 없을 때까지 삽입하세요.
   8. 펌프를 세운 채로 천천히 플런저를 눌러 내리세요. 용액이 콘센트에 나올 때까지 계속 채우세요. 그 후 충전 튜브를 제거하고 섬세한 작업 물솜으로 남은 용액을 닦아내세요.
   9. 유량 감속기를 캡이 펌프 상단과 평평할 때까지 삽입하세요.
   10. 채워진 펌프를 다시 마이크로퓨지 튜브에 넣고 무게를 재세요. 용액의 무게를 측정하고 채움 부피가 저류층 부피의 최소 90%(밀리그램 단위 무게 차이≈ 마이크로리터 단위 부피 차이)인지 확인하세요.
   11. 15mL 원뿔형 튜브에 멸균 1× 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 5mL 채우고 미리 채워진 펌프를 추가합니다. 파라핀 필름으로 밀봉한 후, 삼투 펌프 모델에 요구되는 시간 동안 37°C에서 인큐베이션하여 펌프를 프라이밍합니다. 2004년형은 40 시간입니다.
2. 멜록시캄 제제
   참고: 이 작업은 멸균 기술을 사용하여 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 멜록시캄은 비스테로이드 항염증제(NSAID)로, 규제 물질은 아니지만 취득을 위해 규제 물질 허가가 필요할 수 있습니다.
   1. 27G 바늘과 3mL 루어록 주사기를 사용해 5 mL/mL 멜록시캄 스톡을 멸균 PBS를 사용해 5 mL 멸균 유리 바이알에 1 mg/mL로 희석합니다. 당일에 준비하고 실온에 보관하세요.
3. 수술 부위 준비
   참고: 생체 안전 캐비닛 내에서 삼투압 펌프 이식을 할 필요는 없으며, 수술 중 멸균을 유지하는 것도 불가능합니다. 하지만 수술 부위는 여전히 엄격한 청결 기준과 무균 절차를 준수해야 합니다. 수술 부위는 깨끗하고 잡동사니가 없으며, 방문객이 적어야 합니다. 이상적으로는 준비 부위(면도 및 문지르기 위함)와 수술 부위(즉, 펌프 이식 시술)가 모두 있어야 합니다.
   1. 수술 부위를 70% 에탄올로 완전히 소독한 후 종이 타월로 닦아주세요.
   2. 유리 구슬 멸균기를 켜고 250°C로 설정하세요. 15분에서 30분 정도 데우세요.
   3. 베이퍼라이저를 켜고 온열 패드를 65%로 설정하세요. 동물 체중을 설정하고 이소플루란 비율을 3.2%로 설정하세요.
   4. 온도 프로브 중 하나를 온열 패드 표면에 테이프로 붙이세요. 온열 패드를 35–37 °C까지 데우세요.
   5. 베이퍼라이저 주사기를 제거하세요. 초록색 탭을 끝까지 밀어 넣고, 이소플루란 병에 연결하고 플런저를 당겨서 이소플루란을 채우세요.
   6. 주사기를 증발기에 다시 연결하고 주사기를 프라이밍하세요.
   7. 회복을 위해 깨끗한 동물 우리 아래에 두 번째 온열 패드를 깔아두세요. 케이지를 온열 패드에 반쯤 끼우고 반쯤 떼어놓으세요.
4. 펌프 이식
   참고: 모든 수술 도구는 사전에 세척 및 오토클레이션되어야 합니다. 동물 간 외과 도구를 멸균할 때는 유리 구슬 멸균기가 사용될 수 있습니다. 이 방법은 최대 5마리의 동물 배치에만 사용할 수 있습니다. 멸균 기준이 충족되었는지 확인하기 위해 오토클레이브 표시 스트립을 반드시 포함하세요. 적절한 개인 보호 장비(PPE)에는 깨끗한 실험복, 수술용 마스크, 멸균 수술용 장갑, 그리고 모발 가리개가 포함됩니다. 수술을 받는 동물은 다른 동물의 시야에 들어가서는 안 됩니다.
   1. 쥐의 꼬리 밑부분을 잡아 마취실에 넣으세요. 튜브를 분리하고 이소플루란 유량(3.2%)을 챔버로 가동하세요. 온열 패드 위에 멸균된 드레이프 시트 두 장을 올려놓으세요.
   2. 쥐가 옆으로 돌 때까지 기다렸다가 호흡을 모니터링하세요. 호흡이 느려지고 이완되면, 이소플루란의 산소 순환을 멈추세요. 튜브를 챔버에 클립으로 고정하고, 사용할 노즈콘에서 튜브를 분리하세요. 이소플루란(2%)을 노즈콘으로 흐르기 시작하세요.
   3. 챔버에서 쥐를 꺼내 코를 가열 패드의 노즈콘에 넣으세요. 양쪽 눈에 안과 연고를 바르세요.
   4. 쥐를 저울에 무게 재고 다시 코원으로 돌아가세요. 투여할 1 mg/mL 멜록시캄의 용량을 정하세요. 5 mg/kg의 용량에서는 마우스 무게(그램)에 5를 곱해 투여할 마이크로리터 멜록시캄을 얻으세요.
   5. 1 mg/mL 멜록시캄 병뚜껑에 70% 에탄올을 뿌리고 섬세한 작업 물솜으로 닦아내세요. 그 후 0.3mL 인슐린 주사기를 사용해 올바른 양의 멜록시캄을 채취합니다. 주사기에서 모든 기포를 제거하세요.
   6. 한 손으로 쥐를 잡고 머리를 아래로 숙여 고정하세요. 바늘을 복부 오른쪽 하단 사분면에 30°에서 45° 각도로 넣고 베벨이 위를 향하게 합니다. 바늘이 제대로 꽂혔는지 확인하기 위해 흡인하세요.
   7. 흡인이 없으면 플런저를 부드럽게 누르고 멜록시캄을 복강 내 주사하세요.
   8. 마우스를 다시 코콘과 가열 패드로 돌려놓으세요. 수술용 클리퍼로 착상 부위 주변 부위(등 중간에서 윗부분)의 150%를 완전히 면도하세요. 끝나면 동물의 털을 부드럽게 진공청소기나 빗질로 제거하고 첫 번째 드레이프 시트를 버리세요.
      참고: 무균 수술을 위해서는 깨끗한 면도가 필요합니다. 최소한 절개 부위에는 동물 털이 전혀 없어야 합니다.
   9. 마우스를 외과의사의 머리를 향하도록 위치시키세요. 포비돈-요오드와 70% 에탄올을 번갈아 사용하고, 면촉 어플리케이터를 사용해 총 3회 도색합니다. 계획된 절개 부위 중앙에서 시작해 면봉 어플리케이터로 나선형으로 바깥쪽으로 뻗어가세요.
   10. 멸균된 창구형 수술용 커튼을 동물에게 덮고, 적절한 무균 기법을 사용해 수술용 장갑을 착용하세요.
   11. 절개를 하기 전에 조직 겸자로 양발을 단단히 꼬집어 페달 반사를 꼼꼼히 확인하세요. 여러 번 눌러야 진행하세요. 움직임이 없습니다. 이는 마취의 외과적 평면을 확인시켜 줍니다.
   12. 조직 겸자로 견갑골 중간 피부를 덮고, 작은 홍채 수술용 가위로 척추에 수직으로 1cm 절개를 내세요. 직선으로 절단하려면 아이리스 수술용 가위로 마우스와 90도 각도로 자릅니다.
   13. 절개 부위 내에 작은 정혈 겸자를 사용해 피하 조직을 확장하고 펌프를 위한 주머니를 만듭니다. 펌프 포켓이 동물 앞에서 떨어져 있고 동물의 약간 한쪽에 위치하도록 하세요. 정혈 겸자를 사용해 절개 부위 모든 면의 피부를 풀어주세요.
   14. 조직 겸자로 절개 부위를 열고 정혈 겸자로 펌프를 삽입하세요. 먼저 유량 감속기가 들어가는 펌프를 삽입하세요.
       주의: 펌프는 절개 부위에서 충분히 떨어져 삽입해야 하며, 절개 부위 주변 피부가 장력을 받지 않도록 해야 합니다. 적절한 위치가 아니면 상처 열개가 발생할 수 있습니다. 펌프는 동물이 회복되는 동안 위치가 바뀔 수도 있습니다.
   15. 조직 겸자를 사용해 피부를 부드럽게 텐트처럼 펴고 절개 부위 양쪽을 서로 평평하게 당기세요. 절개 한쪽 끝에서 시작하여 클립 부착기를 사용해 절개 부위 전체에 7mm 감긴 클립을 배치합니다(2–4개의 클립이 필요할 수 있습니다).
   16. 절개 부위에 다른 상처 클립으로 감당할 수 없는 너무 작은 틈이 있을 경우, 멸균 어플리케이터를 사용해 소량의 조직 접착제를 바르세요. 조직 겸자로 꽉 조여.
   17. 상처가 봉합되었는지 확인하기 위해 절개 부위 피부를 부드럽게 당기고 늘이세요. 그 다음 노즈콘으로 가는 이소플루란 흐름을 차단하고 관련 튜브를 잘라내세요. 쥐들을 온열 패드 위의 회수 케이지에 넣으세요.
   18. 쥐가 깨어나 움직일 때까지 완전히 관찰하세요. 동물들이 고통이나 고통을 느끼는지 자주 관찰하고, 회복할 때까지 다른 쥐들과 격리하세요.
   19. 24시간 후에는 복막 내 주사로 멜록시캄 5 mg/kg을 재투여합니다. (선택 사항) 동물 회복을 돕기 위해 일렉트로젤 보충제를 제공하거나, 사료를 우리 바닥에 놓으세요.
   20. 10일에서 14일 후에 다시 이소플루란으로 마취시키고, 안과 연고를 바른 뒤 클립을 제거하세요.
       참고: 상처 클립 위로 머리카락이 다시 자라지 않도록 이 기간 내에 클립을 제거해야 합니다. 또한 모든 삼투압 펌프는 정해진 지속 시간이 있습니다. 동물의 생존 기간이 끝날 때까지 펌프를 제거하거나 안락사시키는 것을 반드시 하세요. 더 긴 치료 기간을 위해서는 같은 동물에게 여러 차례 펌프 이식을 연속으로 시행할 수 있습니다.

2. 조직의 고정, 삽입 및 절편 절단

1. 조직 고정
   참고: 모든 동물 시술은 동물의 스트레스와 고통을 최소화하기 위해 경험 많은 인력이 시행해야 합니다. 안락사 챔버는 모든 동물 사이에 청소하여 남은 이산화탄소를 제거해야 합니다. 스트레스를 줄이기 위해 가능한 경우 동물은 집 우리에서 안락사시키는 것이 좋습니다. 마지막으로, 동물은 다른 쥐와 공간적으로 가까이 있거나 다른 쥐가 보이는 곳에서 안락사되어서는 안 됩니다. 생존 수술이 아닌 시술에는 깨끗한 수술 도구가 필요하지만, 반드시 멸균(즉, 오토클레이브)일 필요는 없습니다.
   1. 마우스를 유도실에 넣고 조절기를 열어 유량계가 의도된 유량(분당 챔버 부피의 ~40%–70%)에 도달할 때까지 유지합니다.
   2. 절차 내내 쥐를 관찰하며 뛰어내리는 등의 고통 징후가 없는지 확인하세요. 호흡 활동 중단 여부를 모니터링하고, 호흡 활동 중단 후 최소 2분간_CO2 유량을 유지합니다. CO2에 노출된 총 시간은 최소 5분이어야 합니다.
   3. 쥐를 회수하여 경추 탈구와 같은 2차 안락사 방법을 시행하세요.
   4. 동물의 팔다리를 23-G 바늘로 알루미늄 호일로 덮은 스티렌 폼에 고정하세요. 털을 적시려면 70% 에탄올을 뿌려 주세요.
   5. 복부 밑부분에 작은 절개를 하고 피부를 목까지 잘라내세요. 같은 절개를 따라 몸통을 열고 조심스럽게 갈비뼈를 자르세요.
   6. 복부 밑에서 시작해 U자형 절개를 하고 23-G 바늘로 피부를 고정하세요.
   7. 관련 장기를 해리하여 4% 파라포름알데히드(PFA) 5mL가 미리 채워진 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 로티세리에서 4°C에서 24시간 고정하세요.
      주의: PFA 용액은 위험합니다. 피부와의 접촉을 피하세요. 다룰 때 적절한 개인 보호 장비(PPE)는 실험복, 니트릴 장갑, 안전 고글을 포함합니다.
      참고: 조직에서 혈액을 관류해야 하거나 관류 고정이 필요한 경우, 앞서 설명한⁵¹번 경유 시 심장 관류를 수행하십시오. 여기서 시행하는 침수 고정술에서는 특히 큰 조직 조각에서 고정제가 조직을 통해 확산되기까지 시간이 걸릴 수 있습니다. 이로 인해 미토콘드리아 형태가 변할 수 있습니다; 더욱이 PFA에 집착하면 조직이⁵²번 수축할 수도 있습니다.
   8. 24시간 후에는 파라포름알데히드 용액을 제거하고 10mL 1× PBS에 조직을 헹구세요. 로티세리에서 실온에서 각각 10분씩 총 3회 연습하세요.
   9. PBS를 제거하고 30% 자당 10mL에 48시간 동안 로티세리에서 담가둡습니다. 자당의 침투는 조직이 가라앉을 때 완료됩니다.
      참고: 용매가 동물에게 전달되었는지 확인하려면 펌프에 남아 있는 양을 측정하세요.
2. 조직 삽입
   참고: 몰드 내 조직 위치와 방향을 반드시 기록하세요.
   1. 폴리스티렌 폼 용기에 드라이아이스를 채우고 그 위에 금속판을 평평하게 올려놓으세요.
   2. 몰드를 금속판 위에 올려놓고, 최적 절단 온도(OCT) 화합물(조직 임베딩 매체)으로 2/3–3/4 두께를 채우세요. 기포가 생기면 표면이나 모서리에 가는 건 고운 겸자로 가져가세요. 냉동 속도를 높이기 위해 드라이아이스 펠릿을 몰드 바로 옆에 놓으세요.
   3. 조직 임베딩 매체를 무게 보트에 넣고 조직을 섞으세요. 자당 용액은 절대 가져가지 않도록 하세요.
   4. 조직 임베딩 배지가 몰드 바닥에 완전히 얼어붙으면(완전히 불투명해야 합니다), 조직을 몰드 내부에 담가서 몰드의 어느 쪽이나 표면에도 닿지 않도록 합니다. 원하는 위치와 방향에 배치하세요.
   5. 조직 임베딩 배지가 완전히 얼어붙을 때까지 기다린 후 몰드를 -80 °C 냉동고로 옮기세요.
      참고: (일시정지) 내장된 조직은 최소 3개월 이상 보관할 수 있습니다.
3. 조직 절절
   참고: 배치별 절간 두께 변동을 줄이기 위해 분석할 모든 조직을 한 세션에서 절획해야 합니다.
   1. -80°C 냉동고에서 박힌 조직을 꺼내 드라이아이스가 채워진 폴리스티렌 폼 용기에 넣으세요.
   2. 크라이오스탯 챔버 온도와 시료 홀더를 각각 -24 °C와 -25 °C로 미리 냉각합니다.
   3. 새 미세토름 블레이드를 블레이드 홀더에 넣고 안티롤 플레이트를 삽입하세요. 청소를 쉽게 하려면 크라이오스탯 챔버에 종이 타월을 깔아두세요.
   4. 시료 척을 냉동 보존 챔버에서 꺼내 실온으로 데우세요.
   5. 면도날로 조직 몰드의 각 모서리를 조심스럽게 자르세요. 조직 매체 블록을 제거하기 위해 부드럽게 떼어내세요.
   6. 티슈 블록을 샘플 척에 단단히 눌러 앞뒤로 비틀어 주세요. 단단히 붙으면 표본 척을 냉동 보관실에 몇 분간 넣어 냉동합니다.
      참고: 조직 블록을 척 위에 올바른 방향으로 놓아 조직이 원하는 방향으로 절단되도록 하세요.
   7. 조직 블록이 시료 척에 완전히 고정되면, 척을 척 홀더에 넣고 단단히 고정하세요. 크라이오스탯 블레이드를 조직 블록 바로 앞에 위치시키고 닿지 않도록 하세요.
   8. 트림 설정을 50 μm로 설정하고 조직의 전체 단면이 노출될 때까지 블록을 다듬기 시작합니다.
   9. 트림 설정을 해제하고 단면 두께를 20 μm로 설정하세요. 이 두께로 몇 번 잘라낸 후 안티롤 플레이트를 내리세요. 천천히 부드럽게 구간을 80%에서 90% 정도 절단한 후 멈춥니다.
   10. 안티롤 플레이트를 들어 올려. 전하를 받은 유리 슬라이드를 꺼내 충전된 쪽을 조직 부위에 원하는 위치에 눌러 붙입니다.
       참고: 안티롤 플레이트를 들어 올린 후 조직 부분이 말려 올라가면, 가는 브러시로 펼쳐야 합니다.
   11. 척 홀더에서 척을 빼세요. 크라이오스탯에서 척을 분리하고 실온으로 데우세요. 척에서 티슈 블록을 꺼내 다시 몰드에 넣으세요.
   12. 조직 블록이 몰드에서 떨어지지 않도록 알루미늄 호일로 감싼 후 -80 °C 냉동실로 다시 보관하세요.
   13. 부착된 조직 절편을 -20°C에 놓으세요.
       참고: (일시정지) 조직 절편은 -20°C에서 무한정 보관할 수 있습니다.

3. 면역형광 염색

1. 냉동 절제부를 꺼내 인큐베이터에서 37°C에서 10분간 건조시킵니다.
2. 슬라이드를 세척하여 과도한 조직 매체를 제거하세요.
   1. 0.1% v/v Triton X-100 (PBS-T)를 포함한 1× PBS 1L 준비
   2. PBS-T를 스테인팅 병 3개에 채우세요.
   3. 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓으세요. 스테인팅 병에 10분간 담그세요. 이 과정을 총 3번 반복합니다.
3. 조직을 막아 착색을 하세요.
   1. 각 슬라이드를 섬세한 작업 물티슈로 부드럽게 두드려 말리세요. 슬라이드를 슬라이드 박스에 매달아 휴지를 위로 향하게 놓으세요.
   2. 1× PBS, 0.3% v/v Triton X-100, 5% w/v 소 혈청 알부민(BSA)으로 구성된 20mL 차단액을 준비합니다.
   3. 각 슬라이드에 블로킹 용액 1mL를 피펫팅하여 조직이 완전히 덮이도록 하세요.
   4. 실온에서 1시간 정도 배양하세요.
4. 조직을 1차 항체로 배양하세요.
   1. 각 슬라이드를 섬세한 작업 물티슈로 부드럽게 두드려 말리세요. 또 다른 섬세한 작업 닦기로 조직 사이에 남은 액체를 부드럽게 흡수하세요.
   2. 차단액에 1:200 희석된 Tom20 토끼 α쥐 항체를 제조합니다(슬라이드당 200 μL
   3. 슬라이드 박스 바닥에 종이 타월을 놓고 물로 완전히 적셔주세요.
   4. 슬라이드를 슬라이드 박스에 매달아 휴지를 위로 향하게 놓으세요. 각 슬라이드에 희석된 1차 항체 200 μL을 피펫팅하여 조직이 완전히 덮이도록 합니다.
   5. 커버 크기와 비슷한 크기의 파라핀 필름 조각을 절단해 사용할 슬립을 사용합니다. 각 슬라이드마다 파라핀 필름 한 장씩 잘라내세요.
   6. 각 슬라이드에 파라핀 필름을 붙여 항체 희석을 조직 절편에 분산시킵니다. 슬라이드 박스를 닫고 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
5. 인큐베이트 후에는 1차 항체로 슬라이드를 세척하세요.
   1. PBS-T를 스테인팅 병 3개에 채우세요. 슬라이드를 꺼내 파라핀 필름 조각을 제거하세요.
   2. 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓으세요. 스테인팅 병에 10분간 담그세요. 이 과정을 총 3번 반복합니다.
6. 슬라이드를 2차 항체에 인큐베이팅하세요.
   참고: 미토콘드리아의 특이적 표지를 확인하려면 각 그룹에서 최소 한 장의 슬라이드를 2차 항체만 염색하여 준비하십시오.
   1. 각 슬라이드를 섬세한 작업 물티슈로 부드럽게 두드려 말리세요. 또 다른 섬세한 작업 닦기로 조직 사이에 남은 액체를 부드럽게 흡수하세요.
   2. 염소 α-토끼 Alexa Fluor 568 항체와 5 μg/mL 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 블로킹 용액에 1:200 희석 추출하여 (슬라이드당 200 μL)를 준비합니다.
   3. 슬라이드를 슬라이드 박스에 매달아 휴지를 위로 향하게 놓으세요. 각 슬라이드에 희석된 2차 항체 200 μL을 피펫팅하여 조직이 완전히 덮이도록 합니다.
   4. 커버 크기와 비슷한 크기의 파라핀 필름 조각을 절단해 사용할 슬립을 사용합니다. 각 슬라이드마다 파라핀 필름 한 장씩 잘라내세요.
   5. 각 슬라이드에 파라필름 조각을 바르면 항체 희석이 조직 단편에 퍼집니다. 슬라이드 박스를 닫고 실온에서 4시간 또는 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
7. 표지 세탁해.
   참고: 커버슬립을 집어 들고 다룰 때는 플라스틱 핀셋을 사용하세요
   1. 커버슬립을 뜨거운 수돗물과 유리 세제(예: Contrad 70)가 담긴 비커에 하나씩 넣으세요. 파라핀 필름 한 조각으로 덮으세요.
   2. 욕조 초음파 검사기에서 30분간 초음파 검사를 하세요.
   3. 뜨거운 수돗물로 여러 번 헹구세요. 그 후 이중 증류수로 여러 번 더 헹구세요. 마지막 이중 증류수 세척에서 15분간 소닉테이트를 사용하세요.
   4. 커버슬립을 70% 에탄올에 넣고 보관하세요. 커버슬립을 장착할 준비가 되면 70% 에탄올에서 분리해 훈기 후드에서 자연 건조시키세요.
8. 인큐베이트 후 슬라이드를 2차 항체로 세척하세요.
   1. PBS-T를 스테인팅 병 3개에 채우세요. 슬라이드를 꺼내 파라핀 필름 조각을 제거하세요.
   2. 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓으세요. 스테인팅 병에 10분간 담그세요. 이 과정을 총 3번 반복합니다.
   3. 각 슬라이드를 섬세한 작업 물티슈로 부드럽게 두드려 말리세요. 또 다른 섬세한 작업 닦기로 조직 사이에 남은 액체를 부드럽게 흡수하세요.
9. 커버 슬립을 부착하세요.
   1. 슬라이드에 고르게 분산된 안티페이드 마운제트 2–3방울을 떨어뜨립니다.
   2. 기포를 피하려면 깨끗이 닦은 #1.5 커버슬립을 장축을 따라 슬라이드에 45° 각도로 들고 있습니다. 커버슬립을 부드럽고 천천히 슬라이드 위로 기울이세요. 모든 슬라이드에 대해 반복합니다.
   3. 슬라이드는 빛을 차단한 채 실온에서 18–60시간 경화시킵니다.
   4. 슬라이드는 빛을 차단한 채 4°C에서 보관하세요.
      참고: (일시정지) 슬라이드는 경화 기간 직후 또는 4 °C에서 보관할 경우 최대 1개월까지 촬영할 수 있습니다. 가장자리를 밀봉할 필요는 없습니다. #1.5 또는 #1.5H 커버슬립을 꼭 사용하세요. 다른 두께는 구면 수차를 유발해 이미지 품질을 떨어뜨릴 수 있습니다. DAPI는 넓은 여기 및 방출 스펙트럼을 가지므로 마운팅 매체를 사용하지 마십시오. 경화 시간은 시료 두께에 따라 달라집니다; 여기, 48 H.

4. 초해상도 영상

참고: 이 프로토콜은 ZEISS Axio Observer Z1을 기반으로 구축된 ZEISS Airyscan2 포인트 스캐닝 LSM 980 공초점 렌즈를 사용하며, 두 개의 다중 알칼리 광증배관(PMT)과 GaASP 32채널 스펙트럼 검출기, 환경 인클로저, 그리고 Plan Apo 63×/1.4 오일 차등 간섭 대비(DIC) III 대물렌즈를 탑재합니다.

1. 인수를 설정하세요.
   1. 단일 Airyscan SR 트랙을 추가하고 적절한 형광체를 선택하세요.
   2. 10인치 플레이트와 적절한 방출 대역 통과 필터를 선택하세요.
      참고: 10인치 플레이트는 이 현미경에만 특유의 제품으로, 적외선(IR) 검출기도 장착되어 있습니다.
   3. 적절한 레이저를 선택하세요. SR을 클릭하여 나이퀴스트 샘플링 기준을 2로 설정하세요(픽셀 크기는 0.05 μm로 조정해야 합니다).
   4. 라이브 버튼을 눌러 Airyscan 감지기를 정렬하세요(라이브 정렬 기능을 선택). 강도가 감지기 아이콘 중앙에 국소화되고 감지기가 초록색이 되면 클릭 멈추세요.
      참고: 모든 설정이 제대로 되어 있다면, 소프트웨어 왼쪽에 "Airyscan 설정이 성공적으로 최적화되었습니다"라는 메시지가 나타날 것입니다.
   5. 다시 라이브 를 켜서 레이저 세기 를 조정해 신호는 괜찮지만 픽셀이 포화되지 않도록 하세요(거리 표시기를 클릭). 최적화 후 멈추 세요.
      1. (선택 사항) 레이저 출력을 조절하지 않고 신호를 증가시키려면 이득을 올리세요.
2. 데이터 수집을 수행하세요.
   1. z-스택을 클릭하고 스텝 크기가 0.1 μm으로 설정되어 있는지 확인하고(그렇지 않으면 조정).
   2. 라이브 버튼을 눌러 z-스택의 하한과 상한을 설정하세요.
   3. 실험 시작을 클릭하세요.
   4. z-스택을 수집한 후에는 이미지 아래 Airyscan 탭으로 가서 Process 3D를 클릭하세요. 여기서 사용되는 잡음 제거 Weiner 필터 파라미터는 다양한 복제와 처리 그룹에 걸쳐 일관성을 유지하세요.
   5. 처리된 Airyscan z-stack을 저장하세요.
      참고: 두 개의 Airyscan SR 트랙을 사용할 경우, 현미경이 매 프레임마다 트랙을 전환하도록 하세요.

5. 미토콘드리아 형태를 정량화하기 위한 자동화 파이프라인 구축

참고: 이 프로토콜은 ZEISS arivis Pro Software 4.1.2를 사용하여 미토콘드리아 형태의 3D 정량화를 위한 자동 이미지 분석 파이프라인 개발을 설명합니다.

1. Airyscan에서 처리한 .czi 파일을 arivis 변환 도구를 사용해 .sis 형식으로 변환할 수 있습니다.
   참고: 전체 이미지가 크고 파라미터 최적화 중 처리 시간이 너무 길다면, 이미지 내에서 작고 대표적인 하위 영역을 잘라내어 최적화 기준으로 활용하세요. 이 잘린 이미지는 잘 분리된 미토콘드리아와 밀도가 높은 영역을 모두 포함해야 전체 이미지 필드를 정확하게 표현할 수 있습니다. 자른 이미지에서 만족스러운 분할이 이루어지면, 최적화된 파이프라인을 전체 이미지 세트에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 시간을 크게 절약할 수 있으며, 파이프라인 품질을 해치지 않으면서 모든 매개변수를 조정하는 것을 더 쉽게 할 수 있습니다.
2. 파이프라인을 설정하고 최적화하세요.
   1. 소프트웨어에서 대표적인 이미지(예: 대조군 이미지)를 엽니다.
   2. 분석을 위해 Tom20 면역형광 채널 을 입력으로 선택하세요.
   3. 세그먼테이션 전에 노이즈 제거 단계를 적용하세요. 여기서는 직경 5.42, 세기 0.5의 입자 강화 알고리즘이 사용되었다.
      참고: 입자 향상 필터는 구조를 보존하는 잡음 제거 알고리즘으로, 배경 잡음을 억제하면서 작고 대략 구형이거나 길게 늘어진 물체를 증폭하도록 설계되었습니다. 이 방법은 지정된 공간 규모(직경)에서 국소적 강도를 증강하여 특히 밝고 고립된 입자나 어두운 배경에 나타나는 미토콘드리아에 적합합니다. 직경 매개변수 값을 너무 작게 설정하면 노이즈가 증가하고, 너무 크면 인접한 물체들이 흐려집니다. 강도 매개변수는 향상 정도를 조절하며, 높은 값은 신호 증폭을 증가시키지만 너무 높게 설정하면 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 기본 값으로 시작해서 대표적인 관심 영역의 출력을 시각적으로 확인하면서 조정하세요. arivis Pro에는 여러 가지 잡음 제거 방법이 있습니다. 가우시안 스무딩은 고주파 잡음을 균일하게 줄이면서도 미세한 구조적 디테일을 흐리게 하는 간단하고 빠른 방법입니다. 중간 필터링은 날카로운 모서리를 보존하면서 소금과 후추 소음을 제거하는 데 더 효과적입니다. 입자 증강(여기서 사용됨)은 지정된 크기 범위에 맞는 구조물의 신호를 선택적으로 증폭하여 이산 형광 물체를 검출하는 것이 목적일 때 선호됩니다. 신호 대 잡음비가 낮거나 배경 이질성이 큰 이미지의 경우, 더 강한 노이징 제거 패스가 필요할 수 있습니다. 동일한 대표 이미지에 대해 두세 가지 방법을 테스트하고 하위 분할 품질을 비교하는 것이 권장됩니다.
   4. 3D 공간에서 물체를 감지하는 블롭 파인더 알고리즘을 사용해 개별 미토콘드리아를 분할합니다.
   5. 객체 크기와 감도 임계값 등 분할 매개변수를 조정하고, 검출된 객체와 소음 제거 이미지 간의 겹침을 시각적으로 점검하여 정확한 분할을 보장합니다. 여기서는 직경 0.244 μm, 확률 임계값 25%, 분할 감도가 22.22%, 정규화는 첫 시작 지점으로 설정되었습니다.
      참고: 분할 매개변수는 이미지 해상도와 복셀 크기에 따라 달라집니다. 이 연구에서 이미지 크기는 1354 × 1354 픽셀이었으며, XY 픽셀 크기는 0.049 μm, 복셀 크기는 0.049 × 0.049 × 0.100 μm³였습니다.
3. 특징 추출과 품질 관리를 수행합니다.
   1. 각 검출된 물체에 대해 부피(μm³), 표면적(μm²), 구형성(미토콘드리아와 같은 부피/표면적을 가진 구의 표면적) 등 형태학적 매개변수를 추출합니다.
   2. 시각적 검증을 위해 세그먼트된 객체를 TIFF 파일로 내보내세요.
   3. FIJI나 arivis로 내보낸 파일을 열고 원본 이미지와 겹쳐 세분화 정확도를 시각적으로 확인하세요.
   4. 각 샘플별로 개별 스프레드시트 파일로 정량적 측정값을 내보내세요.
4. 파이프라인을 적용하세요.
   1. 최적화된 파이프라인을 저장하세요. 예시 파이프라인은 보충 파일 1에서 확인할 수 있습니다.
   2. 이 파이프라인을 연구의 모든 실험 그룹에서 추가 이미지에 적용합니다.
   3. 필요하다면 모든 실험군 간의 일관된 성능을 보장하기 위해 분할 매개변수를 반복적으로 정제합니다.
   4. 최종 완료 후에는 연구 내 모든 이미지에 배치 모드로 파이프라인을 적용합니다.
5. 데이터 분석 수행
   1. 내보낸 데이터를 RStudio(버전 4.3.2)로 불러와 통계 분석을 수행하세요.
   2. 설치하지 않았다면, readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers, tidyverse 패키지를 설치하세요.
   3. 스크립트(보조 파일 2)를 업로드하여 모든 데이터셋을 병합하고, 데이터를 필터링하며(아래 참조), 부피, 표면적, 구형 값을 도표하고, 샘플별 하위 유형 비율로 분할된 미토콘드리아를 분석합니다.
   4. (선택 사항) 부피에 따라 분절된 미토콘드리아를 필터링하여 분절 인공과 잡음을 배제합니다.
      1. 적절한 필터를 결정하려면 부피 분포를 육안으로 점검하세요.
         참고: 모든 샘플은 매우 작은 부피(0.0003 μm³ 이하)에서 뚜렷한 급증을 보였으며, 이는 실제 미토콘드리아보다는 분할 잡음과 일치합니다.
      2. 하한을 확인하기 위해 후보 임계값(0.0009, 0.003, 0.005, 0.007, 0.01 μm³) 간의 입자 잔류를 평가합니다. 입자 수가 가장 급격히 감소한 것은 0.003 μm³ 이하로, 대부분의 노이즈 입자가 이 범위에 속함을 나타냅니다. 육안 검사 결과 0.003 μm³ 가 잡음 피크의 오른쪽 가장자리에 해당하는 것으로 확인되었습니다.
      3. 상한에서는 분포가 자연스럽게 10 μm³보다 훨씬 짧아졌으며; 이 제한을 설정하여 과도하게 분절된 미토콘드리아 네트워크와 같은 대형 인공물은 제외하도록 설정하세요. 최종 필터링은 0.003에서 10 μm³ 사이의 부피를 가진 입자를 유지했습니다.
         참고: 이 스크립트는 검출된 모든 미토콘드리아의 표본당 중앙값을 계산하여 분석 단위로 사용합니다. 이 접근법은 동일한 생물학적 샘플 내에서 개별 미토콘드리아가 독립적이지 않다는 점을 설명합니다.

결과

위에서 설명한 프로토콜은 20개월 된 수컷 UM-HET3 마우스를 대상으로 (그림 1)을 수행하였습니다. 쥐들은 2004년 모델의 삼투압 미니펌프⁵³을 사용해 차량(대조) 또는 화학 재프로그래밍 혼합물(처리됨)을 투여했습니다. 간은 절절 절단되어 Airyscan2 공초점 현미경으로 영상화한 후 분석 파이프라인을 이용해 z-스택을 처리했습니다.

3D 형광 이미지는 ZEISS arivis Pro Software 4.1.2를 사용해 처리 및 분석되었습니다. 미토콘드리아 분할 이전에 입자 강화 알고리즘을 적용하여 이미지의 노이즈를 제거하고 배경광, 초점이 맞지 않는 빛, 자가형광 및/또는 비특이적 결합에서 비롯된 형광을 제거했습니다. 입자 증강은 주어진 직경에서 신호를 선택적으로 증폭합니다. 노이즈 제거 후, 개별 미토콘드리아는 Blob Finder 알고리즘을 사용해 3D로 분할되었으며, 이 알고리즘은 정의된 크기 범위 내에서 국소적 강도 최대값을 기반으로 객체를 감지합니다. 마지막으로, 객체 분할은 각 2D 슬라이스를 이진 이미지로 축소합니다.

세분화 워크플로우를 설명하기 위해 그림 2 는 제어 및 처리된 샘플의 처리 파이프라인 각 단계에서 대표적인 광학 슬라이스를 제시합니다. 원시 형광 이미지는 특정 미토콘드리아 형광과 원치 않는 배경, 초점이 맞지 않은 빛, 자가형광이 혼합된 처리되지 않은 Tom20 신호를 보여줍니다. 입자 증강 잡음 제거를 적용한 후 배경 신호는 크게 줄었고, 남은 형광은 명확하고 명확한 구조에 국한된다(그림 2). 이로 인해 미토콘드리아 경계가 더 깔끔하게 표현되어 정확한 분할이 용이해집니다.

블롭 파인더 세분화의 출력은 녹색으로 표시됩니다. z-스택이 정확하게 분할되어 있음을 확인하기 위해, 노이즈가 제거된 2D 슬라이스와 관련된 세그먼트 이진 이미지를 겹쳐 보았습니다(그림 2). 분할 과정이 충분히 최적화된다면, 미토콘드리아 형광이 이진 객체와 강하고 일관된 공존 위치가 관찰될 수 있습니다. 분할 과정이 과분할(즉, 개별 미토콘드리아를 여러 객체로 분할하는 것) 또는 덜 분할(즉, 여러 미토콘드리아를 하나로 결합하는 것)라면, 분할 매개변수를 조정합니다. 삽입부의 시각적 검사는 고품질 분할을 확인하는데, 탐지된 물체는 소잡음화된 Tom20 형광 신호와 정확히 동일 위치하며, 과도한 분할, 물체 과도한 크기, 공간적으로 인접한 미토콘드리아가 부적절하게 단일 물체로 병합되거나 Tom20 신호가 없는 영역에서 가짜 물체 생성의 증거가 없다. 이 세분화 정확도는 대조 및 처리 샘플 모두에서 일관되게 달성되었으며, ZEISS arivis 소프트웨어에서 최적화된 파이프라인 매개변수가 강인하고 실험군 전반에 걸쳐 일반화될 수 있음을 입증했습니다. 이 결과들은 분할 접근법을 검증하고 그로부터 도출된 형태학적 측정의 신뢰성을 뒷받침합니다.

분할된 물체들은 부피, 구도, 표면적 등 미토콘드리아 매개변수를 측정할 수 있습니다(그림 3). 생물학적 샘플당 검출되는 많은 미토콘드리아와 세포 내 개별 소기관의 비독립성을 고려하기 위해, 표본당 중앙값이 계산되어 통계적 비교 단위로 사용되었습니다. 그룹 차이는 윌콕슨 검정을 사용하여 평가하였다. 처리된 샘플은 대조군에 비해 미토콘드리아 부피와 표면적이 유의미하게 증가했는데, 이는 화학적 재프로그래밍이 미토콘드리아 형태의 상당한 재형성을 유도함을 나타냅니다.

마지막으로, 분절된 미토콘드리아는^54,55 (그림 4)로 분류할 수 있습니다. 엘보우 방법⁵⁶은 k-평균 군집화^57,58의 최적 군집 수를 결정하는 데 사용되었다(그림 4A). 그 후 k = 4 클러스터를 사용하여 대조군과 처리군의 미토콘드리아 무작위 하위 샘플을 균등 다양체 근사 및 투영(UMAP) 차원 축소(그림 4B)를 통해 미토콘드리아 하위형(왼쪽)과 처리군(오른쪽)으로 색칠하여 그래프를 그렸습니다. 마지막으로, 대조군과 처리군의 각 미토콘드리아 아형(그림 4C)의 비율을 그래프로 표시하였다. 치료군에서는 분열된 미토콘드리아가 적었으나, 네트워크형 또는 길쭉한 미토콘드리아의 비율에는 유의미한 변화가 없었습니다.

그림 1: 프로토콜 개요. 쥐는 피하 삼투 미니펌프 이식을 통해 최대 6주간 약물 또는 차량으로 치료받습니다 (1). 치료 후에는 마우스 조직을 고정하고, 자당으로 침윤하며, OCT 화합물에 삽입한 후 냉동 절제(2)됩니다. 조직 절편은 Tom20에 대한 항체와 Alexa Fluor 568(3)로 표지된 2차 항체로 염색합니다. 초해상도 z-스택은 Airyscan2 점주사 공초점현미경에서 수집되며(4), 잡음 제거 처리된 z-스택은 arivis에서 분할되어 미토콘드리아 형태를 정량화합니다(5). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 미토콘드리아 분할 및 형태 분석을 위한 자동화 파이프라인.
대조(상부 패널)와 처리된 (하부 패널) 샘플에서 나온 대표적인 단일 광학 슬라이스. Tom20 면역형광 신호는 회색으로 표시되어 있습니다(왼쪽). 노이즈 제거 후 동일한 이미지가 회색으로 표시되고, 이어서 분할 출력이 검출된 미토콘드리아 객체를 녹색으로 강조합니다. 병합된 이미지는 잡음 제거 신호와 분할된 객체 간의 겹침을 보여줍니다. 인셋은 표시된 영역의 고배율 뷰를 보여주며, 노이즈 제거 효과와 세분화의 정확성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 대조군과 처리군의 미토콘드리아 형태. 박스 플롯은 표본당 중앙값의 중앙값 ± 4분위 간 범위(n=10)를 보여줍니다. 각 점은 하나의 생물학적 샘플을 나타내며, 그 샘플 내에서 검출된 모든 미토콘드리아의 중앙값으로 요약됩니다. 부피와 표면적은 로그₁₀ 축척으로 표시됩니다. 그룹들은 윌콕슨 랭크 합 검정을 사용하여 비교되었습니다. 유의수준: ns p ≥ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 미토콘드리아 아형의 비감독 형태계측 분류. (A) 클러스터 수 (k)에 따른 총 클러스터 내 제곱합(WSS)을 보여주는 엘보우 플롯, 무작위 10,000개의 미토콘드리아 하위 샘플에서 계산됨. k = 4에서의 전환점이 하위 분석을 위한 최적의 클러스터 수로 선택되었습니다. (B) (왼쪽) 미토콘드리아 형태계측 특징의 UMAP 차원 축소(n = 20,000개의 무작위 샘플링된 미토콘드리아), 할당된 하위 유형별로 색상 부여. 형태학적으로 구별되는 네 가지 아형이 확인되었다: 단편형(작고 구도가 높음), 길쭉한(길고 구형도가 낮음), 네트워크형(크고 불규칙한), 그리고 중간 형형이다. (오른쪽) 실험 그룹별로 색칠된 UMAP 투영(대조군 vs. 처리됨)은 각 군의 형태학적 공간 분포를 보여줍니다. (C) 각 실험 그룹 내 각 미토콘드리아 아형의 샘플당 비율. 각 데이터포인트는 하나의 생물학적 샘플을 나타냅니다(그룹당 n = 10개). 박스 플롯은 사분위 범위와 중앙값을 보여주며, 수염은 사분위 범위의 1.5배까지 확장됩니다. 하위 유형 비율은 Wilcoxon 랭크-합 검정을 사용해 그룹 간 비교되었고, 벤자미니-호흐버그 방법을 사용해 다중 비교에 대해 p-값을 보정하였습니다. NS P ≥ 0.05, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 예시 arivis 파이프라인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: 미토콘드리아 형태 및 아형 개체군을 정량화하는 R 스크립트.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜을 성공적으로 수행하기 위한 가장 중요한 두 단계는 (i) 삼투압 펌프 이식 중 절개 부위 닫힘과 (ii) 정확한 분할입니다. 전자의 경우, 펌프가 들어가기에 충분히 크지만 펌프가 동물의 옆구리를 따라 미끄러지지 않도록 피하 주머니를 특별히 조심해야 합니다. 절개 부위가 닫힐 때는 주변 피부에 긴장이 가해지지 않도록 펌프를 충분히 멀리 배치해야 하며, 이는 열열 현상을 유발할 수 있습니다. 동물 회복을 시작하기 전에 닫힌 절개 부위 주변 피부를 모든 방향으로 잡아당겨 상처가 충분히 닫혔는지 확인하세요. 상처 클립은 부착과 제거가 빠르기 때문에 유리합니다. 하지만 절개 부위를 제대로 닫지 못해 문제가 생기면 중단 봉합사를 사용할 수 있습니다. 후자의 경우, 정확한 분할을 위해서는 충분한 유사성이 있을 때까지 노이즈가 제거된 이미지와 분할 결과를 지속적으로 비교해야 합니다. 대조군과 처리된 동물의 Z-스택은 동일한 수집 매개변수를 사용해 반드시 동일한 영상 촬영 중에 채취되어야 합니다. 마찬가지로, 모든 처리 단계는 동일한 매개변수를 사용하여 모든 이미지에 적용되어야 합니다. 직경 세분화 매개변수는 탐지할 객체의 예상 크기를 정의합니다. 좋은 출발점은 한 번의 광학 단면을 이용해 수작업으로 검사한 몇몇 물체의 평균 미토콘드리아 폭을 측정하는 것입니다. 확률 임계값은 물체가 받아들여지기 위해 필요한 최소 탐지 신뢰도를 조절합니다. 낮은 값은 감도를 높이고 더 많은 물체를 감지하지만, 이 중 일부는 거짓일 수 있습니다. 반대로 값이 높을수록 특이성이 향상되지만, 신호가 낮은 객체가 손실될 수 있습니다. 권장 시작 범위는 25%에서 30%입니다. 마지막으로, 분할 감도는 공격적으로 접촉하거나 겹치는 물체가 개별 객체로 분리되는 방식을 결정합니다. 낮은 스플릿 감도는 클러스터된 미토콘드리아가 단일 합병 객체로 남게 됩니다. 반면, 높은 분할 민감도는 길거나 가지된 미토콘드리아가 조각으로 과도하게 쪼개질 수 있습니다. 일반적인 미토콘드리아 형태학 연구에서는 15%에서 30% 사이의 값이 합리적입니다. 정확한 분할이 여전히 어렵다면, FIJI⁶⁰의 Mitochondria^{Analyzer 59}를 사용하여 분할을 수행할 수 있습니다. Huygens Professional 소프트웨어와 맞춤형 Python 스크립트를 이용해 세포와 조직 내 미토콘드리아 형태를 정량화하는 반자동 파이프라인도 최근^{에 기술되었습니다}.

한 가지 제한은 Airyscan2 공초점 현미경의 해상도 한계로, XY에서 ~150 nm, Z-평면에서 ~350 nm입니다. 이로 인해 개별 크리스타 간 거리가 ~40–120 nm 62,63,64 정도로 측정되어 미토콘드리아 크리스타의 고해상도 이미징이 불가능합니다. 반면, 자극 방출 고갈(STED)은 측면으로 ~20–50 nm의 해상도 한계에 도달할 수 있으며, 개별 미토콘드리아 크리스테^{62, 63, 64}를 명확히 구별할 수 있습니다. 최근 여러 STED 염료가 개발되어 생세포와 고정 세포 모두에서 미토콘드리아 내막의 효과적인 염색과 영상화가 가능하다^{63, 64, 65}. 크리스타 형태 분석이 미토콘드리아 생체에너지 건강에 대한 통찰을 제공할 수 있기 때문에^, 이러한 데이터가 필요합니다. 그러나 미토콘드리아 형태는 포유류 조직과 세포 배양(아래에서 자세히 다룹니다)에 따라 크게 다르며, 현재 STED 영상 및 크리스테 구조 분석을 위한 조직 내막 염색 방법론은 없습니다.

온전한 조직에서 미토콘드리아 형태를 정량화하는 것은 세포 배양 시스템과 비교해 독특한 도전 과제를 제시합니다. 배양된 세포에서는 미토콘드리아가 일반적으로 세포질 전역에 잘 분리된 네트워크로 분포되어 있으며, 세포 간 중복은 최소화됩니다. 그러나 조직 절편이나 홀마운트 제제에서는 세포가 밀집되어 경계가 명확하지 않습니다. 세포 수준 분석이 필요한 경우, 형질막을 표적으로 하는 추가 형광 표지나 세포 유형별 마커를 포함하고, 이미지 분석 파이프라인에 해당 분할 단계를 포함하여 미토콘드리아 형태를 정량하기 전에 개별 세포 경계를 정의해야 합니다. 두 번째 중요한 차이점은 배양된 세포에서 미토콘드리아가 종종 연속적이고 상호 연결된 망상 네트워크를 형성하여 시각화하고 해석하기 쉽다는 점입니다. 조직에서는 이 패턴이 거의 관찰되지 않습니다. 예를 들어, 간 절편에서 나온 미토콘드리아는 세포질⁶⁶ 전체를 점유하는 점, 막대, 다발 패턴을 보입니다. 그러나 배양 내 간세포는 명확한 네트워크 형성을 가진 관 형태를 보인다⁶⁶. 마찬가지로, 배양 내 평활조직의 미토콘드리아와 평활근세포의 미토콘드리아를 비교할 때, 형태와 네트워크 패턴에서 뚜렷한 차이가 관찰된다⁶⁷. 3차원 구조와 세포 유형별 미토콘드리아 분포 차이가 결합되어, 이 조직 내 미토콘드리아는 길게 뻗은 네트워크가 아니라 이산적이고 밀집된 지점 또는 짧은 조각으로 보입니다. 따라서 조직과 세포 배양 간 형태학적 특징을 비교할 때는 두 가지 차이가 실제 생물학적 변이보다는 영상 맥락에 부분적으로 기인할 수 있으므로 데이터 해석을 신중하게 해야 합니다.

이 프로토콜의 하이라이트 중 하나는 광학 현미경을 이용해 조직 내 미토콘드리아 구조를 정량적으로 측정할 수 있다는 점입니다. 초해상도 광학 현미경 이미지에서 미토콘드리아 형태를 정량화하는 다른 방법들도 있지만, 많은 방법이 배양 세포에만 적합합니다. 더불어, 다른 분석 방법과 달리 여기서 제시된 파이프라인은 완전 자동화되어 있으며, 미토콘드리아 치수와 하위 유형 비율을 모두 정량화하고, 성공적으로 수행하는 데 거의 코딩 경험이 필요하지 않습니다. 주사/투과 전자현미경(SEM/TEM)과 냉동 전자전면요법(cryo-ET)은 이전에 조직 내 미토콘드리아 구조를 2D 및 3D 방식으로 촬영하는 데 사용된 바 있습니다 10,68,69. 그러나 전자의 경우, 시료 고정, 탈수, 박출 후 토착 구조물 보존에 대한 우려가 ^{있습니다.} 더불어, FIJI⁶⁰에서 미토콘드리아 매개변수를 수동으로 측정하는 것이 TEM^{이미지 72}의 경우 선호되는 분석 방법이기도 하며, 이는 상당한 작업이 필요하고 샘플 편향을 초래할 수 있습니다. 그러나 TEM 이미지에서 미토콘드리아 형태를 자동 정량화하는 딥러닝 방법은 최근에^73,74 제시된 접근법의 장점은 분석 파이프라인이 구축되면 사용자 입력이 거의 없거나 전혀 없이도 이미지를 일괄 처리할 수 있다는 점입니다. 후자의 경우, 고압 냉동이 조직 구조를 거의 원래 조건에서 보존할 수 있습니다⁷⁵. 하지만 냉동 ET 샘플 냉동, 절단, 분쇄, 데이터 수집, 데이터 처리 모두 광범위한 교육과 고도로 발전된 장비가 필요합니다. 반면, 초해상도 공초점 현미경은 상대적으로 접근성이 높고, 성공적으로 수행하는 데 더 적은 교육과 자원이 필요합니다.

삼투압 펌프 이식은 노령 쥐에서 안전하게 시행되어 다양한 약리학적 화합물이 노화 관련 생리적 기능 저하에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 또한, 여기 설명된 방법들은 다양한 기관에 일반화할 수 있습니다. 노화와 관련된 대사 기능 저하가 질병에 기여하며,^노화의 흔히 특징인 미토콘드리아 기능 장애에서 비롯된다는 점이 잘 알려져 있습니다. 더 나아가, 미토콘드리아 구조가 미토콘드리아의 생체에너지 용량과 대사 상태를 결정한다는 것으로 이해됩니다^77,78. 따라서 여기서 설명한 방법을 사용하여 쥐 노화 과정에서 미토콘드리아 구조에 미치는 화합물의 효과를 정량적으로 평가하는 것은 인간 건강 수명을 연장할 수 있는 치료제를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Airyscan2 포인트 스캐닝 공초점 현미경	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS 포인트 스캐닝 LSM 980 공초점 현미경은 ZEISS Axio Observer Z1 기반으로 제작되었으며 두 개의 다중 알칼리 PMT와 GaASP 32 채널 스펙트럼 검출기, 환경 인클로저, 그리고 Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III 목적을 갖추고 있습니다. 이 연구에서 사용된 현미경은 또한 두 개의 외부 NIR 검출기, 그리고 다음 레이저 라인을 갖추고 있습니다: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, 그리고 730 nm.
알루미늄 호일	Essendant	BWK7112
분석용 저울	Mettler Toledo	MR204
안티롤 유리 판	Gel Company	LGI70
Arivis Pro 소프트웨어	ZEISS	버전 4.1.2
배스 소니케이터	Branson Ultrasonics	71020-MT
소 혈청 알부민	Research Products International	A30075
원심분리 튜브, 15 mL	CELLTREAT	229411
충전된 현미경 슬라이드	Globe Scientific	1358W
클립 제거기	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
면봉 끝 도구	Puritan Medical	25-8061WC
크리오스타트	Leica Biosystems	CM3050 S
크리오스타트 블레이드	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	ddH2O에 5 mg/mL로 준비하고, 소량 분할하여 빛으로부터 보호하여 -20 °C에서 저장
디메틸 설폭사이드	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDip 슬라이드 염색 시스템	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
임베딩 몰드, 22 mm × 22 mm × 20 mm	Polysciences	18646A-1
에탄올, 200 프루프	Decon Labs	V1001
구멍이 있는 멸균 드레이프 시트	Dukal	20001
파인 포스펙스	Fine Science Tools	11445-12
유리 구슬 살균기	VWR	75999-324
양고항-토끼 Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
가열 패드	CVS	215313
지혈 포스펙스	World Precision Instruments	501705
몰입 오일 Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
유도 챔버	World Precision Instruments	EZ178
인슐린 주사기, 0.3 mL	BD	328431
아이리스 수술 가위	Sklar Surgical Instruments	47-1135
아이소플루란	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL 주사기	BD	309628
Luer-Lok 3 mL 주사기	BD	309657
Luer-Lok 50 mL 주사기	BD	309653
Meloxivet (멜록시캄)	Patterson Veterinary	07-894-8524
마이크로 원심분리 튜브, 1.5 mL	CELLTREAT	229443
현미경 슬라이드 박스	Heathrow Scientific	15994E
현미경 슬라이드 커버 유리, #1.5, 22 mm × 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
비-CO2 인큐베이터	Benchmark Scientific	H2200-H
비-구멍이 있는 멸균 드레이프 시트	Dukal	20-002
OCT 컴파운드	Sakura Finetek USA Inc	4583
안과 연고	Patterson Veterinary	07-888-2572
삼투압 미니펌프	Alzet	2004
파라필름	Bemis	PM999
파라포르말데하이드, 4% w/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1×	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES 주사기 필터, 0.22 μm	CELLTREAT	229747
포비돈 아이오딘 10% USP 면봉	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P3698