산기 바이지 산의 역할 - PI3K/AKT 관련 신호를 통한 에탄올 유발 위상피세포 손상 완화

요약

본 연구는 산기 백지 산이 에탄올 유발 위 상피세포 손상에 대한 보호 효과와 PI3K/AKT 관련 신호 전달에 관여하는 효과를 평가하는 시험관 내 모델을 설명합니다.

초록

이 연구는 산기 바이지 산(SQBJ)이 에탄올 유발 위 상피세포 손상에 대한 보호 기전을 명확히 하고, 위궤양(GU)과의 잠재적 관련성을 탐구하는 것을 목표로 했습니다. 네트워크 약리학은 SQBJ의 활성 성분(전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼 [TCMSP], 경구 생체이용률[OB] ≥ 20%, 약물유사성 [DL] ≥ 0.1), 표적 지도(Universal Protein Resource [UniProt]), GU 관련 표적 수집(GeneCards/OMIM/DrugBank), 그리고 유전자 온톨로지(GO)/교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 강화 및 분자 결합을 통해 겹치는 표적을 분석하는 데 사용되었습니다. 에탄올 손상된 위 상피세포주-1(GES-1) 세포는 SQBJ 또는 PI3K 억제제 LY294002으로 처리하였다. 최적 SQBJ 농도를 결정하기 위해 CCK-8을 사용하였습니다. 네트워크 약리학 분석은 PI3K/AKT/MAPK 관련 연쇄 반응에서 농축된 126개의 공통 표적을 확인하고, 주요 SQBJ 성분과 PI3K/AKT 관련 단백질 간의 잠재적 상호작용을 제안했습니다. 에탄올 도전 세포에서 SQBJ는 염증 매개체 분비와 산화 스트레스를 줄여 세포 손상을 완화했으며, 이는 세포 내 활성 산소 종과 말론디알데히드 수치 감소로 입증되었습니다. SQBJ는 미토콘드리아 막 전위와 ATP 함량을 회복하고, B세포 림프종-2, 절단된 카스파제-3, Bcl-2 관련 X 단백질 수치의 세포자살사(apoptosis) 관련 변화를 감소시켰습니다. SQBJ는 또한 PI3K/AKT 및 MAPK 관련 신호 마커를 변조했습니다. 이러한 보호 효과는 LY294002에 의해 크게 약화되어 PI3K/AKT 관련 신호가 SQBJ 매개 세포보호에 관여함을 시사합니다. 이 발견들은 GU에서 SQBJ의 잠재적 적용을 위한 시험관 내 기전적 근거를 제공하지만, 에탄올 유발 위궤양의 동물 모델에서의 추가 검증이 필요합니다.

서론

위궤양(GU)은 전 세계적으로 매우 흔한 위장 질환으로, 국소적인 염증, 침식, 위 점막의 궤양이 특징입니다. 2021년 글로벌 질병 부담(GBD 2021) 분석에서 산출된 추정에 따르면, 소화성 궤양 질환(PUD)은 전 세계 수백만 명의 환자들에게 여전히 상당한 임상적·경제적 부담을 가하고 있습니다. 항감염제 치료제와 산 억제 프로톤 펌프 억제제(PPI)에 대한 광범위한 임상적 의존으로 PUD의 전반적인 유병률은 감소했으나, 일부 지역에서는 반등도 관찰되어 정체기에 이르렀^습니다. 특히 알코올(에탄올) 섭취는 헬리코박터 파일로리 (H. pylori) 감염과 비스테로이드 항염증제(NSAID) 사용과 무관하게 중요한 병원성 인자입니다. 장기간 과도한 음주는 위 점막을 손상시키고 궤양 발생을 가속화하며, 위암에 대한 취약성을 높여 이 상태를 심각한 국제 의료 위기로^{만듭니다.} 개발도상국에서는 알코올 관련 위 점막 손상 발생률이 증가하고 있으며, 알코올 섭취 증가와 생활습관 변화 등 여러 요인으로 효과적이고 안전한 예방 및 치료 전략이 시급히 필요합니다.

에탄올 유발 위 점막 손상의 병리학적 기전은 다인자적이고 다층적입니다. 위 점막과 직접 접촉하면 에탄올은 점액-중탄산염 장벽을 빠르게 파괴하여 통제되지 않는 세포 내 활성 산소종(ROS)의 급증을 유발합니다. 이 산화적 폭발은 이후 지질 과산화(말론디알데히드 상승, MDA 증가로 특징지어짐)를 유발하고, 위 내성 항산화제인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)와 글루타티온(GSH)을 고갈시키며, 궁극적으로 미토콘드리아 기능 장애를 유발합니다^. 축적된 증거에 따르면, 에탄올에 의해 유도되는 세포내 ROS는 주로 미토콘드리아에서 유래하며, 내부 미토콘드리아 막 전위(Δψm)의 붕괴와 아데노신 삼인산(ATP) 합성 억제와 밀접하게 연관되어 있습니다^. 한편, 산화 스트레스는 핵인자-카파 B(NF-κB)의 명령 아래 염증성 연쇄반응을 더욱 활성화시킵니다. 이 활성화는 이후 주로 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), C-반응성 단백질(CRP)과 같은 염증 매개체의 대량 분비를 촉진하여 '산화 스트레스-염증 반응'의 악순환을 형성합니다⁵. 이러한 근거에서 미토콘드리아에 의해 촉진되는 본질적인 세포자사멸 연쇄 반응이 촉진되며, 이는 Bcl-2와 Bax의 비율 변화와 시스테닐 아스파르테이트 특이적 단백질분해효소 3(Caspase-3)의 연속적인 효소 단백질분해 절단으로 나타나며, 이는 결국 위 점막 상피 세포의 대량 사멸과 궤양 형성으로 이어집니다⁶. 따라서 산화 스트레스, 염증 반응, 세포자멸사라는 세 가지 핵심 병리학적 연관성을 동시에 표적으로 하는 것은 알코올성 위 점막 손상의 효과적인 개입을 위한 핵심 전략입니다.

포스포이노시타이드 3-키나아제/단백질 키나제 B(PI3K/AKT) 신호 전달 경로는 세포의 수명, 증식, 계획적 사망을 조절하는 중심 조절 축으로, 위 점막 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다. 활성화 후 PI3K/AKT 신호전달은 여러 하류 기질을 인산화하고, 프로아폽토토틱 인자 Bad의 활성을 억제하여 세포 파괴성 사이토크롬 c의 미토콘드리아 탈출을 방해하며, ΔΨm 항상성을 유지하고 세포 생존을 촉진합니다^. 더 나아가, PI3K/AKT 연쇄 반응과 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 네트워크 사이에는 복잡한 길항적 교차 상호작용이 존재합니다: PI3K/AKT의 상향 활성화는 p38, c-Jun N-말단 키나아제(JNK), 세포외 조절 단백질 키나아제(ERK) 등 스트레스 키나제의 활성화를 억제하여 염증 신호 전달과 세포자사멸 연쇄 반응을 약화시킬 수 있습니다⁸. 여러 연구에서 PI3K/AKT 경로의 활동 감소는 위 점막 손상 모델에서 염증 악화와 세포자멸사 증가와 밀접한 관련이 있으며, 이 경로의 활성 회복은 점막 손상을 크게 완화할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 현재 에탄올 유발 위 점막 손상에서 PI3K/AKT의 정확한 조절 기전, 특히 MAPK 경로와의 시너지 관계에 대한 체계적인 인과적 실험적 검증은 부족하다.

현대 약물치료에서 PPI는 GU 임상 치료의 1차 선택지이지만, 장기 사용으로 인해 안전성 우려가 커지고 있습니다. 누적된 연구들은 만성 PPI 사용이 신장 질환, 심혈관 사건, 골다공증 골절, 영양소 결핍(철분, 마그네슘, 비타민 B12), 클로스트리디오이데스 디피실 감염, 심지어 위암 위험 증가 등 다양한 부작용과 연관되어 있습니다.¹⁰. 더불어, PPI 중단 후 반동 위산 과분비 현상은 대규모 약물 감시 데이터에 의해 확인되었습니다¹¹. 이러한 안전성 위험은 임상 및 기초 연구 커뮤니티 모두가 다중 표적 보호 기전, 최소한의 부작용, 장기 사용 적합성을 갖춘 대체 치료법을 적극적으로 탐색하게 만들었습니다. 특히 전통 중의학(TCM)의 천연 화합물은 '다성분, 다중 표적, 다중 경로'라는 전체론적 치료 개념¹²로 인해 큰 관심을 받고 있습니다.

산기 백지 분말(SQBJ)은 판낙스 노토긴삼 과 블레틸라 스트리아타 를 1:1 질량 비율로 조합한 고전적인 중의학 화합물입니다. 판낙스 노토긴삼 은 혈액순환을 촉진하고 출혈을 멈추며, 통증성 부기를 완화하는 효과로 잘 알려져 있습니다. 노토긴세노사이드 R1과 진세노사이드(Rg1, Rb1)를 포함한 주요 생리활성 성분들은 상당한 항염증, 항산화, 점막 수리 효과를 발휘합니다. 블레틸라 스트리아타 는 출혈을 멈추고 부기를 줄이며 손상된 조직의 재생을 촉진하는 수렴한 효과가 특징입니다. 동시에, 주요 활성 추출물인 Bletilla striata 다당류(BSP)는 JNK/p38 MAPK 연쇄반응을 억제하여 인터루킨-1β(IL-1β), TNF-α, IL-6의 발현을 감소시키고 위 점막¹³의 항산화 방어 능력을 향상시키는 효능을 입증했습니다. 축적된 문헌 증거는 Panax notoginseng. saponins(PNS)와 BSP의 공동 투여가 알코올성 위궤^{양 모델에서} 시너지 효과를 발휘한다는 것을 확인했으며, SQBJ 관련 제제는 역류 식도염과 소화성 궤양의 전임상 연구에서 점막 보호 효과가 유의미하게 나타났습니다¹⁵. 그러나 현재 SQBJ의 위 점막 보호 효과의 신호전달 경로 기전, 특히 PI3K/AKT 경로의 핵심 역할과 MAPK와의 조절 관계에 대한 체계적인 시험관 내 실험적 검증은 없습니다. 한편, SQBJ의 핵심 구성 화학물질과 기능성 수용체 간의 인과관계는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다.

이러한 공백을 해소하기 위해 본 연구는 네트워크 약리학과 시험관 내 실험 검증을 결합한 통합 연구 전략을 채택하여, 에탄올 도전 GES-1 세포주를 실험 플랫폼으로 사용하여 SQBJ의 위 상피 보호 효과의 분자 메커니즘을 조사하고, 산화 스트레스, 염증 반응, 세포자멸사 과정, PI3K/AKT 관련 신호 전달에 중점을 둡니다. 그리고 MAPK와 관련된 변경 사항들. 첫째, PI3K 억제제 LY294002을 사용해 PI3K/AKT 신호 전달의 관여를 예비적으로 평가했으며, 이 경로를 억제하면 SQBJ의 보호 효과가 약화되어 PI3K/AKT 관련 신호전달이 SQBJ 매개 세포보호에 기여함을 시사하였습니다. 둘째, PI3K/AKT 관련 변화와 MAPK 경로 조절 간의 연관성을 탐구하여, MAPK 신호 전달 변화가 PI3K/AKT 축의 기능적 반응에 대한 SQBJ 조절과 연관될 수 있다는 예비 증거를 제시하였습니다. 이 연구는 총합적으로 SQBJ가 에탄올 유발 위 상피 손상을 어떻게 완화하는지 평가하기위한 시험관 내 분자 틀을 확립하고, 알코올성 위 점막 손상에서 TCM 화합물의 추가 연구를 위한 예비 증거를 제공합니다. 그러나 이러한 세포 보호 효과가 생 체 내에서 전환될 수 있는지는 아직 동물 실험이 필요합니다. 알코올 유발 위궤양의 실험 모델 내 치료 효능(보충 그림 S1).

프로토콜

이 연구는 인간 참가자, 인간 조직 샘플, 임상 표본, 동물 실험을 포함하지 않았습니다. 네트워크 약리학 분석에는 공개 및 익명화된 데이터베이스 자원이 사용되었고, 시험관 내 실험에는 상업적으로 이용 가능한 GES-1 세포가 사용되었습니다. 따라서 공식적인 윤리적 승인과 사전 동의는 필요하지 않았습니다. 주요 시약, 항체, 분석 키트, 기기, 제조사, 카탈로그 번호, 연구 자원 식별자(RRID)에 관한 상세 정보는 해당 시 재료표에 요약되어 있습니다.

SQBJ 수성 추출물의 제조 및 품질 관리

허브 재료
Panax notoginseng(베르크), F. H. Chen(뿌리 및 지근경)과 Bletilla striata의 원료.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (덩이줄기)는 상업적 전통 중의학 공급업체로부터 획득한 후, 중국 약전(2025년판)에 따라 고위 한의학 약사에 의해 인증되었습니다. 바우처 표본(번호) SQBJ-20240301, 번호 PN-20240301, 번호. BS-20240301)는 우리 기관의 표본관에 보관되었습니다. 두 허브는 1:1의 질량 비율로 분쇄되어 SQBJ 가루를 준비했습니다.

SQBJ 수용성 추출물 제제
SQBJ 분말은 탈이온수로 1:10(g/mL) 비율로 1시간 동안 연속 역류 추출을 거쳤습니다. 그 후 수집한 추출물을 결합하여 4층의 의료용 거즈를 통과시켜 잔여 물질을 제거했습니다. 결과 여과액은 60°C의 저압 하에서 상대 밀도 1.05–1.10에 도달할 때까지 농축되었고, 이후 진공 동결 건조를 거쳐 SQBJ 수용성 추출물을 얻었으며, 최종 추출 수율은 18.2% ± 0.6%였습니다. 추출 분말은 밀봉되어 −20 °C에 보관된 후 혈청 무첨가 DMEM 배지에 용해된 후, 세포 실험 전에 멸균을 위해 0.22 μm 막 필터를 통과시켰습니다.

SQBJ 수성 추출물의 품질 관리
SQBJ 수성 추출물의 배치 간 일관성과 표준화를 평가하기 위해, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 지문 프로파일링과 함께 정량적 결정도 수행했습니다. 재료표 는 HPLC 시스템에 관한 포괄적인 기술 매개변수를 나열합니다. 두 가지 허브의 화학적 프로필을 바탕으로, 우리는 네 가지 대표적인 표지자를 표적으로 삼았습니다: 노토긴세노사이드 R1, 진세노사이드 Rg1, 긴세노사이드 Rb1, 그리고 밀리타린. 그러나 이 HPLC 기반 품질 관리 전략은 주로 여러 대표성 성분을 반영했으며, SQBJ 내 모든 활성 화합물의 포괄적인 화학 프로파일을 제공하지는 못했습니다.

크로마토그래피 분리는 위상 역방향 C18 컬럼(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)을 통해 달성되었습니다. 이 작업은 컬럼 온도는 30°C, 유량은 분당 1.0 mL, 주입 부피는 10 μL, 검출 파장은 203 nm로 유지되었습니다. 이동상 조성은 아세토니트릴(A)과 0.1% 인산수용액(B)으로 구성되었으며, 다음과 같은 구배 용출 과정을 사용했습니다: 0–15분, 19% A; 15–35분, 19%–35% A; 35–55분, 35%–55% A; 55–60분, 55%–19% A. 상세 기기 및 기둥 정보는 재료표에 제공되어 있습니다.

기준 물질 제제
정량적 분석을 수행하기 위해 우리는 순도 98%≥ 노토긴세노사이드 R1, 진세노사이드 Rg1, 긴세노사이드 Rb1, 밀리타린에 대한 상업용 표준을 확보하였습니다. 개별 기준 화학물질을 정밀하게 측정하여 단일 메탄올 스톡에 용해하여 각 성분에 대해 최종 농도가 50 μg/mL인 균일한 혼합 기준액을 얻었습니다.

샘플 준비:
SQBJ 수성 추출물 건식 분말(50 mg)을 정밀히 측정한 후 분석 등급 메탄올 25mL로 용해하였습니다. 이 혼합물은 제어된 기기 매개변수(출력: 250W; 주파수: 40 kHz) 하에서 30분간 초음파 욕조 처리를 거쳤습니다. 상온으로 평형화된 후, 액체는 0.22 μm 유기 여과막을 통과시켜 최종 분석 시험액을 얻었습니다.

내용 결정 결과:
SQBJ 수액 추출물의 세 차례 연속 배치에서 핵심 특성 성분의 평균 함량은 다음과 같았습니다: 노토긴세노사이드 R1 3.12 ± 0.11 mg/g, 진세노사이드 Rg1 8.45 ± 0.23 mg/g, 긴세노사이드 Rb1 5.26 ± 0.18 mg/g, 밀리타린 2.78 ± 0.09 mg/g, 각 성분 함량의 RSD는 배치 간 5%< 있어 추출물의 배치별 우수한 일관성을 확인했습니다.

윤리 및 준수 선언
이 연구 전반에는 동물 실험이나 인간 임상 표본, 조직 생검, 생체 대상자 포함은 포함되지 않았습니다. 네트워크 약리학 분석은 TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem, RCSB PDB 등 공개된 데이터베이스를 사용하여 수행되었습니다. 이 데이터베이스에서 수집된 모든 데이터는 공개적으로 접근 가능하고 익명화되었으며; 따라서 생물정보학 프로파일링은 공식적인 동의나 추가적인 윤리적 감독을 요구하지 않아도 된다.

현재의 시험관 내 실험은 상업적으로 이용 가능한 인간 위 점막 상피 세포주인 GES-1을 사용하여 수행되었습니다. 1차 인간 세포나 환자 유래 생물학적 물질은 사용되지 않았습니다. 이 세포주는 인증된 세포 저장소에서 획득되었으며, 기관의 생물안전성 및 세포 배양 지침에 따라 취급되었습니다. 이 연구는 확립된 세포주와 공개 데이터베이스만 포함했기 때문에 공식 기관 윤리 위원회의 승인에서 제외되었습니다. 모든 실험 절차는 관련 기관의 실험실 안전 및 연구 준수 요건에 따라 수행되었습니다.

네트워크 약리학 연구

활성 성분 표적의 식별 및 스크리닝
SQBJ의 두 성분인 Panax notoginseng 과 Bletilla striata.의 활성 성분은 공개된 데이터베이스에서 수집되었습니다. 이 연구에서 사용된 모든 데이터베이스 유래 정보는 공개적으로 접근 가능했으며 식별 가능한 개인 정보는 포함하지 않았습니다. 식물학적 이름을 쿼리로 사용하여 전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP)에서 후보 식물화학물질을 확인했습니다. 적합한 생리활성 분자를 식별하기 위해, 선별 프로토콜은 경구 생체이용률(OB) 20%의 임계값을 적용≥ 약물유사성(DL)≥ 0.1을 적용했습니다. 다음으로, 이러한 후보 구성 요소와 연관된 잠재적 하위 유전자 표적을 확인했으며, 유효한 유전자 표적이 일치하지 않은 성분은 제외했습니다. 모든 표적 유전자는 Universal Protein Resource(UniProt)를 통해 주석 및 표준화되어 참고 데이터베이스 검색이 Homo sapiens에만 한정되어 기능성 SQBJ 활성 구성 요소의 최종 표적 유전자 목록을 생성했습니다.

병리 관련 표적 검색
이 질환과 관련된 유전자를 수집하기 위해 우리는 GeneCards, 온라인 멘델리안 유전 인 인간(OMIM), DrugBank라는 세 개의 공개 데이터베이스를 검색어로 "위궤양"으로 검색했습니다. 이후 크로스 플랫폼 데이터셋이 통합되었고, 중복된 항목은 제거되어 위궤양 관련 표적 유전자의 표준화된 목록을 구축하였습니다.

성분, 표적, 질병에 대한 네트워크 구축
SQBJ 활성 성분과 위궤양 사이의 중첩 표적 유전자를 확인했습니다. 이후 네트워크 시각화 소프트웨어를 사용하여 다계층 상호작용 네트워크가 구축되었습니다. 노드 중요성을 평가하기 위해 통합 위상 평가 알고리즘은 각 노드의 위상 매개변수(정도 중심성과 간도 중심성을 포함)를 계산했습니다. 이 계산값을 바탕으로 위궤양 치료에서 SQBJ의 활성 성분과 주요 기능 표적을 확인하였습니다.

단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 지도화
SQBJ와 위궤양 간에 공유된 합의 표적을 STRING 데이터베이스와 교차 참조하였다. 우리의 쿼리는 다중 단백질 분석 템플릿을 지정하되, 분석 배경은 호모 사피엔스 로 제한했습니다. PPI는 최소 상호작용 신뢰 임계값인 중간 신뢰도(> 0.4)로 필터링되었습니다.

생성된 기능적 연결 기록은 TSV 파일로 내보내졌고, 이후 PPI 분석을 위한 전용 네트워크 시각화 소프트웨어에 통합되었습니다. 계산된 연결 지형을 바탕으로 네트워크 내 핵심 기능 노드를 각 노드의 특정 등급 값을 순위별로 평가했습니다.

하위 기능 주석 및 경로 매핑
공유 교차 노드의 생물학적 역할을 명확히 하기 위해, 우리는 웹 접근 가능한 생물정보학적 주석 도구를 활용하여 유전자 온톨로지(GO) 기능 풍부화 분석과 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 경로 풍부화 분석을 수행했습니다. 기능 분류는 유전자를 세 가지 고전적인 범주로 분류합니다: 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC), 분자 기능(MF). 온라인 생물정보학 플롯 플랫폼을 통해 SQBJ가 위궤양에 미치는 치료 효과와 관련된 주요 생물학적 과정과 신호 전달 경로를 지도화하기 위해 버블 플롯과 막대 차트를 생성했습니다.

계산적 분자 도킹 시뮬레이션
SQBJ의 핵심 활성 부품의 공간 기하학 파일은 공개 복합물 데이터베이스에서 다운로드되어 파일 처리 소프트웨어를 사용해 MOL2 파일로 저장되었습니다. 또한 단백질 데이터 뱅크를 쿼리하여 코어 타깃 단백질의 3차원 결정 구조도 얻었습니다. 이 고분자 구조들은 원래의 리간드와 물 분자를 제거하여 전처리되었고, 그 결과 깨끗한 모델은 PDB 형식으로 저장되었습니다. 수용체-리간드 결합 에너지를 시뮬레이션하기 위해, 핵심 활성 성분과 표적 단백질을 포함하는 도킹 검증은 표준 계산 분자 도킹 소프트웨어를 통해 수행되었습니다. 도킹 결과는 분자 시각화 소프트웨어를 사용해 최적화 및 렌더링되었습니다.

세포 배양
GES-1 인간 유래 위 상피세포는 RPMI-1640 배지를 이용해 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 37°C에서 5% CO₂ 함유 습습 환경에서 배양하였다. 우리는 원본 배양을 확립된 세포주로 확인했으며, 인증된 세포 저장소에서 초기 재고를 확보했습니다. 관찰된 합류 지점 80–90%에서 단일층은 PBS로 2번 세척한 후 0.25% 트립신-EDTA를 사용해 37°C에서 2분간 분리하였습니다. 효소 절단 반응을 종료하기 위해 같은 부피의 완전한 배지를 도입했습니다. 생성된 세포 현탁액은 1,000 × g 에서 5분간 원심분리한 후, 신선한 완전 배지에 재현탁하여 적절한 밀도로 재파종했습니다. 배양 물건들은 동일한 배양 조건으로 되돌려졌습니다. 전파 기간 동안 역위상차 현미경을 사용해 세포 생존성, 형태, 성장 상태를 평가했으며, 로그 성장 단계의 세포는 후속 분석을 위해 일상적으로 수집되었습니다.

에탄올 유도 GES-1 세포 손상 모델의 확립 및 치료
로그 상 GES-1 세포는 6웰 플레이트에 5×^{10 5} 셀/웰 또는 96웰 플레이트에 10⁴ 셀/웰 1× 시딩하여 하룻밤 배양하여 접착하였습니다. 에탄올 유발 손상은 보충되지 않은 RPMI-1640에 500 mmol/L 에탄올을 4시간 동안 노출함으로써 확인되었습니다. 이 조건은 예비 농도 및 시간 반응 실험을 바탕으로 선택되었습니다. 예비 분석에서 4시간 동안 250 mmol/L 에탄올은 경미한 손상만 유발했으며, 세포 생존율은 약 78.6 ± 5.4%로 유지되었고, 750 mmol/L 에탄올은 생존 가능성을 32.8 ± 4.7%로 감소시켜 과도한 세포독성을 나타냈다. 4시간 동안 500 mmol/L 에탄올에 노출되면 세포 생존율이 54.7± 4.9%로 감소했으며, 이는 재현 가능한 중등도에서 중증 손상을 발생시키면서도 충분한 생존 세포를 유지하여 후속 개입 및 기전적 분석에 적합했습니다. 따라서 4시간당 500 mmol/L 에탄올이 모델 구축을 위해 선택되었습니다. 이 상태는 급성 에탄올 유발 상피 손상을 시험관 내에서 시뮬레이션하는 데 사용되었으며, 생체 내에서 위 점막의 생리적 노출 패턴을 완전히 재현하지는 못합니다.

약리학적 개입을 위해 세 가지 농도의 SQBJ 수액(5, 10, 50 μg/mL)을 선택하여 에탄올 도전 후 즉시 투여하였습니다. PI3K 억제군에서는 세포가 20 μmol/L LY294002에 30분간 사전 배큐된 후 에탄올과 최적의 SQBJ 농도로 공동 처리되었습니다. 양성 대조군 코호트는 에탄올 노출 직후 20 μmol/L 오메프라졸을 투여받았습니다. 오메프라졸은 용량 동등한 비교제가 아닌 위장 보호제로 참고 사용되었습니다. 농도는 예비 세포독성 평가와 일반적으로 사용되는 시험관 내 중재 범위를 바탕으로 선정되었으며, 세포 보호에 대한 약리학적 참고 자료를 제공하기 위한 목적이었습니다. 대조 세포는 에탄올이나 추가 제제 없이 완전 배지에서 유지되었습니다. 모든 인큐베이션은 37°C에서 5% CO₂를 함유한 가습 환경에서 진행되었습니다. 각 실험 그룹은 최소 세 개의 복제 우물로 구성되었으며, 전체 프로토콜은 독립적으로 3회 실행되었습니다.

CCK-8 방법을 통한 최적 SQBJ 농도 결정
로그 상 HGE/GES-1 원소는 1 ×^4셀/ 우물 밀도의 96웰 벡터에 도금되어, 표준 조건(37 °C, 5% CO₂) 하에서 완전한 RPMI-1640 배지에서 하룻밤 배양하여 부착 상태를 보장했습니다. 배양 그룹은 네 그룹으로 무작위로 배분되었습니다: 차량 대조군(완전 매체만), 저용량 SQBJ 중재(5 μg/mL), 중용량 SQBJ 중재(10 μg/mL), 고용량 SQBJ 중재(50 μg/mL); 이 세 농도는 치료 스크리닝에 사용되었으며, SQBJ를 PBS에 용해하여 제조하였습니다. 모든 조건은 최소 세 개의 병렬 우물에서 분석되었고, 전체 프로토콜은 세 개의 서로 다른 실험 배치로 반복되었습니다. 지정된 처리 기간 후, 각 우물은 10 μL CCK-8 시약을 투여한 후 37 °C에서 2시간 배큐 기간을 가졌습니다. 450 nm에서의 광학 밀도(OD)는 마이크로플레이트 리더기를 사용해 측정되었습니다. 세포 생존율은 (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100%로 계산되어 이후 실험에서 가장 효과적인 SQBJ 농도를 식별할 수 있게 되었습니다.

qPCR
로그 상 GES-1 원소는 6웰 플레이트(5 × 10⁵ 셀/웰)에서 배양되어, 5% CO₂를 포함한 가습 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 유지하여 부착력을 확보했습니다. 그 후 세포는 사전에 정해진 최적 농도의 SQBJ에 노출되어 기저선(0시간)과 처리 후 6, 12, 24, 48시간에 채취하여 신호 전달 분자의 동적 반응을 측정했습니다. 시간 경과 결과를 바탕으로, 24시간 간격이 안정적인 세포 생존력을 유지하면서도 신호 전달 반응이 가장 강했기 때문에 이후 기전적 분석에 선택되었습니다. 각 시점은 세 개의 삼중정으로 표현되었고, 전체 실험은 독립적으로 3회 반복되었다.

특수 추출 시약을 사용해 총 RNA를 분리하고, 분광광도계를 사용해 농도와 수율의 질을 평가했습니다. 모든 샘플은 A₂₆₀/A₂₈₀ 흡수율이 1.8에서 2.0 범위 내에서 나타났습니다. gDNA 와이퍼가 포함된 역전사 키트를 사용해 총 RNA 1 μg에서 cDNA를 역전사하였습니다. 실시간 PCR 분석은 PI3K, AKT, p38, JNK, ERK 및 참조 유전자 GAPDH 프라이머를 사용한 정량적 PCR 시스템을 통해 수행되었습니다. PCR 시스템, 시약, 프라이머 합성 서비스에 대한 자세한 내용은 재료표에 자세히 나와 있습니다. 프라이머는 해당 인간 유전자의 특정 영역에 맞게 설계되었습니다. qPCR 프로토콜: 95 °C에서 30초간 핫스타트 활성화, 95 °C에서 5초간 변성 40회 사이클, 60 °C에서 30초간 어닐링/확장. 표적 유전자 mRNA 발현 계산은 상대 정량 PCR 방법을 이용한 ^2-ΔΔCt 방법에 의존했습니다.

엘리사
상청액은 1,200 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거했습니다. 염증 매개체(CRP, IL-6, TNF-α)와 산화 스트레스 지수(SOD, MDA, GSH)의 수준은 제조사의 구체적인 지침에 따라 상업용 ELISA 키트를 사용해 평가되었습니다. 이 표적들의 농도 프로필은 공급업체의 지침에 따라 상업용 분석 제형으로 검증되었습니다. 각 실험 그룹은 세 개의 복제 웰로 구성되었으며, 실험 데이터 재현성을 확인하기 위해 세 개의 별도 세포 배양 배치에 걸쳐 절차가 수행되었습니다. 간단히 100 μL 표준액 또는 정액 상원액을 미리 코팅된 반응판에 투여하고 37°C에서 90분간 배큐했습니다. 세 번의 연속 세척 사이클 후, 각 공동에는 37°C에서 60분간 배양하는 특이 검출 항체 100 μL를 투여한 후, 추가로 세 번의 세척 사이클을 거쳤습니다. 다음으로 기질 용액(100 μL)을 도입하고, 샘플을 15분간 빛으로부터 보호한 후 50 μL 정지 용액으로 효소 반응을 차단했습니다. 450 nm의 광학 밀도는 마이크로플레이트 리더를 통해 검출되었습니다. 농도는 해당 표준 곡선에서 보간되었습니다. 세포 수 차이나 처리로 인한 세포 생존력 변화로 인한 편향을 최소화하기 위해, MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α, IL-6 프로필을 BCA 분석법으로 측정한 각 분석 샘플의 단백질 함량에 대해 보정하고, 대조군과 비교하여 상대값으로 표현하였습니다.

DCFH-DA 형광 프로브를 이용한 GES-1 세포 내 ROS 검출
세포 내 활성 산소종(ROS) 수치를 정량화하기 위해 막 투과성 형광 생성 지표인 DCFH-DA를 사용했습니다. 채취된 세포는 10 μmol/L DCFH-DA가 포함된 보조되지 않은 RPMI-1640에 재현탁하여 표준 배양 조건(37 °C, 5% CO₂)에서 어둠 속에서 20분간 유지했습니다. 혈청 없는 배지로 세 차례 연속 세척하여 분리된 프로브를 제거한 후, 488 nm 여기와 525 nm 방출을 이용한 유세포 측정으로 형광 강도를 모니터링하였습니다. 상대 ROS 수준은 각 처리군의 평균 형광 강도로 보고되었으며, CCK-8 분석법을 이용한 병렬 웰에서 결정된 생존 세포 수와 정규화된 후 해당 대조군과 비교하여 표현되었습니다.

미토콘드리아 막 전위(ΔΨm) 측정
우리는 상업용 JC-1 분석 키트를 사용하여 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm) 변화를 평가했습니다. 간단히 말해, 채취한 세포는 새로 준비된 JC-1 작업 용액(키트에서 공급된 JC-1 염료와 염색 완충제의 동량 혼합물)에 재현탁하여 최종 세포 농도는 1 ×^{10 6} cells/mL로 만들었습니다. 표백을 방지하기 위해 빛을 차단한 37°C 습기 환경에서 20분간 배양한 후, 800 × g, 5분간 원심분리하여 1mL의 얼음 냉각 JC-1 염색 버퍼로 한 번 세척했습니다. 이후 유세포분석으로 형광을 획득하였습니다.

JC-1 응집체(온전한 ΔΨm을 나타내는 분량)는 FL2 채널을 통해 488nm 여기와 590 nm 방출 파장을 사용해 모니터링되었고, JC-1 단량체(ΔΨm 소산을 나타내는 분체)는 FL1 채널을 통해 488 nm 여기와 525 nm 방출 설정을 사용해 추적되었습니다. ΔΨm은 적색에서 녹색 형광 신호 비율로 표현되었으며; 값이 떨어지면 미토콘드리아 탈분극이 나타난다.

세포 내 ATP 수치 결정
미토콘드리아 기능은 ATP 검사 키트를 이용한 세포내 ATP 정량을 통해 평가하였습니다. 루시페린-루시퍼라제 생물발광 반응을 통해 ATP 함량을 결정하는데, 이는 미토콘드리아 활성에 직접적으로 비례합니다. 간단히 말해, 채취한 세포는 얼음 냉각 ATP 용해 완충제에 다시 현탁되어 5분간 얼음 위에 보관했습니다. 그 후 12,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리가 수행되었고, 이후 얻은 깨끗한 상정액 20 μL를 96웰 백색 불투명 마이크로플레이트에 옮겼습니다. 그 후 각 캐비티에 100 μL 신선하게 준비된 ATP 검출 작업 용액(루시퍼레이스 시약과 루시페린 기질의 혼합물)이 각 공동에 주입되었습니다. 생성된 발광 신호는 발광 마이크로플레이트 리더기로 신속히 포착되었습니다. 상대적인 ATP 수준을 얻기 위해 원시 발광 값을 상업용 BCA 단백질 분석 키트로 정량한 개별 상상구 총 단백질 농도로 정규화하여 세포 수 변동을 보정했습니다.

Annexin V/PI 이중 염색에 의한 세포 세포멸사의 검출
세포자멸 세포 검출은 제조사가 제시한 상업용 Annexin V-FITC/PI 세포 사멸 분석법 구성으로 수행되었습니다. 세척 후 펠릿은 Annexin V-FITC 결합 버퍼에 재현탁하여 세포 밀도 1×^{10 6} cells/mL(샘플당 195 μL)로 만들었습니다. 이후 각 독립 튜브에는 5 μL Annexin V-FITC 및 10 μL PI 염색 용액을 투여했습니다. 샘플은 부드럽게 소용돌이로 돌려 실온에서 어두운 환경에서 15분간 배양했습니다. 이 과정 후, 세포자사자멸 세포는 유세포계를 통해 모니터링되었습니다. 각각의 형광 채널은 생존 세포(Annexin V⁻/PI⁻), 초기 세포자멸 세포(Annexin V⁺/PI⁻), 후기 세포자멸/괴사 세포(Annexin V⁺/PI⁺) 간의 분화를 촉진했습니다. 각 그룹의 세포자멸사 세포 비율은 이러한 게이팅 매개변수에 따라 정량화되었습니다.

서부 블롯
막은 4°C에서 Bcl-2, Bax, 절단된 Caspase-3, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2, GADH에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 배양하였다. 항체는 인간 샘플과 웨스턴 블롯 적용에 대한 검증 정보를 바탕으로 선정되었습니다. RRID는 항체 등록부 또는 RRID 포털에 기록된 모든 항체에 대해 추가되었습니다. 표적 단백질 수치는 GAPDH로 정규화되었습니다. 표준 세척 프로토콜 후, 블롯은 상온에서 1시간 동안 HRP 결합된 2차 항체에 노출되었습니다. 밴드는 ECL 기질 용액을 사용하여 검출되었습니다. 웨스턴 블롯 밴드 회색 값은 디지털 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 평가되었습니다.

면역형광 염색
GES-1 단일층체는 24웰 플레이트 내 유리 커버슬립에 형성되어 지시된 처리 이전에 이루어졌습니다. 치료 후, 4% 파라포름알데히드를 실온에서 15분간 고정하고, 이어서 0.3% Triton X-100을 PBS에 넣어 막 투과를 10분간 하고, 5% 소 혈청 알부민으로 37°C에서 30분간 차단하였습니다. 이후 커버슬립을 4°C에서 하룻밤 배양하여 AKT, p38, JNK, ERK에 표적 한 1차 항체를 투여했습니다. 세 차례의 PBS 세척 후, 표본은 빛으로부터 보호된 형광 결합 항토끼 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 배양되었습니다. 핵을 시각화하기 위해 5분간 DAPI 대염색을 적용하였습니다. 이후 커버슬립에 안티페이드 시약을 부착하고, 공초점 레이저 주사 현미경을 이용해 표적 단백질의 세포 내 분포를 확인했습니다. 모든 면역형광 영상은 동일한 영상 매개변수 하에서 20× 대물렌즈를 사용해 촬영되었습니다. 50 μm에 해당하는 스케일 바가 모든 대표적인 면역형광 영상에 추가되었습니다.

통계 분석
정량적 값은 최소 세 번의 독립 실험 실행에서 나온 평균 ± 표준편차(SD)로 나타난다. 각 샘플은 3배로 검증되었다. 통계 분석은 전문 수치 분석 도구를 통해 수행되었습니다. 여러 코호트 간 뚜렷한 변이를 확인하기 위해, 우리는 Tukey의 사후 검정과 함께 일방향 분산분석(ANOVA)을 이용해 그룹 간 비교를 수행하였습니다. 양측 임계값 P< 0.05 통계적 유의성을 지정합니다.

결과

위궤양에서 SQBJ 매개 기전의 생물정보학 해리
SQBJ가 GU에 미치는 약리학적 작용을 탐구하기 위해, 우리는 처음에 그 주요 생리활성 성분에 해당하는 표적을 예측했습니다. R 프로그래밍을 사용하여 이 생체 활성 성분들 중 중복 항목을 추출하고 제거하여 최종 411개의 후보 표적을 도출했습니다. 이후 유전자카드(GeneCards)와 OMIM 플랫폼을 쿼리하여 GU 연관 병리학적 표적을 수집하여 1,643개의 뚜렷한 질환 특이적 좌위를 분리했습니다(보충 파일 1). 질병 표적과 SQBJ 구성 요소의 표적을 교차시켜 126개의 공통 주요 표적을 확인했습니다(그림 1A). 이 공유 표적을 사용하여 PPI 위상(그림 1B)과 그 그래픽 표현(그림 1C)을 평가하여 SQBJ-GU 표...

토론

본 연구의 주요 목적은 Panax notoginseng 과 Bletilla striata로 구성된 고전적 TCM 화합물인 SQBJ가 GES-1 세포 모델 내에서 에탄올 유발 위 점막 상피 손상에 대해 세포보호 작용을 수행하는지 평가하는 것이었습니다. 여기에는 PI3K/AKT 관련 신호 전달과 염증 매개체, 산화 스트레스 지표, 미토콘드리아 기능 장애, 세포자가멸 사건 감소가 포함됩니다. 본 연구의 주요 발견은 다음과 같습니다: 네트워크 약리학 분석에서 PI3K/AKT–MAPK 축이 GU 치료에서 SQBJ의 잠재적 기전적 중심점임을 확인했으며; 에탄올 도전 GES-1 세포에서는 10 μg/mL SQBJ 추출물이 용량 의존적 및 시간 의존적으로 세포 생존력을 회복하고, 염증 및 산화 바이오마커를 억제하며, 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)와 ATP 생성을 보존하고, Bcl-2/Bax/caspase-3 조절을 통해 세포자사멸사를 억제했습니다; 이...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Apoptosis assay	Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit	Beyotime	C1062L
ATP assay	Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027
Buffer	PBS	Solarbio	—
Cell digestion reagent	0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200072
Cell line	GES-1 human gastric mucosal epithelial cells	Cell Bank, Chinese Academy of Sciences	SCSP-533
Cell viability assay	CCK-8 reagent	—	—
Confocal microscope	LSM 880 confocal microscope	Zeiss	LSM 880
Culture medium	RPMI-1640	Gibco	—
ELISA kit	Human CRP ELISA Kit	R&D Systems	DCPR00
ELISA kit	Human IL-6 ELISA Kit	R&D Systems	DTAM00D
ELISA kit	Human TNF-α ELISA Kit	R&D Systems	—
Flow cytometer	FACSCalibur / FACSCanto II	BD Biosciences	—
Herbal material	Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber)	Anguo Traditional Chinese Medicine Market	Voucher No. BS-20240301
Herbal material	Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (root and rhizome)	Anguo Traditional Chinese Medicine Market	Voucher No. PN-20240301
Herbal material	Sanqi Baiji San powder	In-house preparation	Voucher No. SQBJ-20240301
HPLC column	ZORBAX SB-C18 column	Agilent Technologies	4.6 mm × 250 mm, 5 μm
HPLC system	1260 Infinity II HPLC system	Agilent Technologies	1260 Infinity II
IF secondary antibody	Alexa Fluor 594–conjugated anti-rabbit IgG	Invitrogen	A11012
Inverted microscope	CKX41 inverted phase-contrast microscope	Olympus	CKX41
Luminescence reader	Infinite 200 PRO microplate reader	Tecan	Infinite 200 PRO
Membrane	PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
Microplate reader	iMark microplate reader	Bio-Rad	iMark
Mitochondrial membrane potential kit	JC-1 Assay Kit	Beyotime	C2006
Nuclear stain	DAPI	Beyotime	C1002
Online platform	Online bioinformatics plotting platform	Bioinformatics online analysis platform	Online platform
Online platform	Web-based enrichment analysis platform	Metascape	Online platform
Oxidative stress assay	GSH Assay Kit	Beyotime	S0052
Oxidative stress assay	MDA Assay Kit	Beyotime	S0131
Oxidative stress assay	SOD Assay Kit	Beyotime	S0109
PI3K inhibitor	LY294002	MCE	S1105
Positive control drug	Omeprazole	MCE	HY-B0053
Primary antibody	AKT	Cell Signaling Technology	4691
Primary antibody	Bax	Cell Signaling Technology	5023
Primary antibody	Bcl-2	Cell Signaling Technology	15071
Primary antibody	Cleaved Caspase-3 Asp175	Cell Signaling Technology	9664
Primary antibody	ERK1/2	Cell Signaling Technology	4695
Primary antibody	GAPDH	Abcam	ab8245
Primary antibody	JNK / SAPK-JNK	Cell Signaling Technology	9252
Primary antibody	p-AKT Ser473	Cell Signaling Technology	4060
Primary antibody	p-ERK1/2 Thr202/Tyr204	Cell Signaling Technology	4370
Primary antibody	p-JNK Thr183/Tyr185	Cell Signaling Technology	4668
Primary antibody	p-p38 MAPK Thr180/Tyr182	Cell Signaling Technology	4511
Primary antibody	p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199	Cell Signaling Technology	4228
Primary antibody	p38 MAPK	Cell Signaling Technology	8690
Primary antibody	PI3K p85	Cell Signaling Technology	4257
Primer	AKT forward	—	—
Primer	AKT reverse	—	—
Primer	ERK forward	—	—
Primer	ERK reverse	—	—
Primer	GAPDH forward	—	—
Primer	GAPDH reverse	—	—
Primer	JNK forward	—	—
Primer	JNK reverse	—	—
Primer	p38 forward	—	—
Primer	p38 reverse	—	—
Primer	PI3K forward:	—	—
Primer	PI3K reverse	—	—
Protease inhibitor	PMSF	Beyotime	ST506
Protein assay	BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0010
Protein lysis buffer	RIPA buffer	Beyotime	P0013B
Public database	DrugBank	DrugBank Online	Online database
Public database	GeneCards	Weizmann Institute of Science	Online database
Public database	Online Mendelian Inheritance in Man	Johns Hopkins University	Online database
Public database	PubChem compound database	National Center for Biotechnology Information	Online database
Public database	RCSB Protein Data Bank	RCSB PDB	Online database
Public database	STRING protein interaction database	STRING Consortium	Online database
Public database	Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform	TCMSP	Online database
Public database	Universal Protein Resource	UniProt Consortium	Online database
Real-time PCR system	CFX96 Real-Time PCR System	Bio-Rad	CFX96
Reverse transcription kit	PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	Takara Bio	RR047A
RNA extraction reagent	TRIzol reagent	—	—
ROS probe	DCFH-DA	Beyotime	S0033
Secondary antibody	HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Cell Signaling Technology	7074
Software	Cytoscape	Cytoscape Consortium	3.9.1
Software	GraphPad Prism	GraphPad Software