코르티솔 검출 향상을 위한 타액 전처리용 휴대용 기기

요약

이 프로토콜은 코르티솔 검출 개선을 위한 신속한 타액 전처리 방법을 설명합니다. 휴대용 여과 장치를 사용해 뮤신 및 기타 간섭 물질을 제거하면서 표적 분석 물질을 보존합니다. 사전 처리된 타액은 모세혈관 흐름이 개선되어 보다 일관되고 재현 가능한 분석 성능을 가능하게 합니다.

초록

타액 코티솔 검출은 혈액 기반 분석에 대한 비침습적 대안을 제공합니다. 그러나 실질적인 구현은 타액의 고유 점도와 간섭 성분의 존재에 의해 제한됩니다. 특히 뮤신과 타액 단백질은 모세혈관 유도 흐름을 방해하고 후속 측면 유동 분석(LFA)의 신뢰성을 저하시켜 효과적이고 접근성 높은 사전 치료 전략을 필요로 합니다. 여기서는 현장 코르티솔 검출을 위한 휴대용 타액 전처리 장치인 SaliFilter를 소개합니다. 이 장치는 고분자량의 간섭 성분을 선택적으로 제거하면서 코르티솔을 포함한 소분자의 통과를 허용하는 여과 메커니즘을 사용합니다. 간단한 수동 압력으로 작동하여 외부 장비 없이 빠른 샘플 처리(~2분)를 가능하게 하여 분산 환경에 적합합니다. 장치의 성능은 탁도 측정, 단백질 정량, SDS-PAGE를 통해 점액과 타액 단백질의 효율적 제거가 확인되었습니다. 처리된 샘플은 모세관 흐름이 향상되어 안정적이고 신뢰할 수 있는 LFA 작동을 보였습니다. 정량적 분석 결과 신호 재현성이 향상되었고, 코티솔 검출은 임상적으로 관련 농도 범위 내에서 1.47 ng mL⁻¹ 의 검출 한계를 달성했습니다. 이 프로토콜은 분석 민감도와 신뢰성을 향상시키면서도 분석물의 무결성을 해치지 않는 효과적인 타액 전처리 전략을 확립합니다. 제안된 접근법은 타액 기반 진단에 실용적이고 휴대할 수 있는 솔루션을 제공하며, 현장 검사 및 자가 모니터링에도 잠재적으로 적용할 수 있습니다.

서론

부신 피질에서 분비되는 글루코코르티코이드 호르몬인 코티솔은 생리적 스트레스 평가에 중요한 바이오마커입니다. ^1,2. 이는 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 타액 등 여러 생물학적 체액에서 측정할 수 있으며, 임상 실무에서 가장 흔히 사용되는 것은 혈액과 타액입니다^. 혈액 기반 측정은 신뢰할 수 있는 정량적 정보를 제공하지만, 침습적 정맥 천자와 훈련된 인력이 필요해 빈번하거나 종단적인 모니터링에 적합성이 제한됩니다 ^4,5,6. 반면, 타액 코르티솔 측정은 비침습적이고 편리한 대안으로, 진료 현장 및 자가 모니터링 애플리케이션을 가능하게 합니다 ^7,8. 특히 타액 코르티솔 수치는 혈중 농도와 강한 상관관계를 보여, 타액이 신뢰할 수 있는 대리 샘플임을 뒷받침합니다⁹. 그러나 타액의 고유 점도와 간섭 성분의 존재는 분석 수행을 크게 저해하므로, 분석^{10, 11, 12} 전에 효과적인 전처리가 필요합니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 사전 치료 전략이 모색되었습니다. 원심분리는 뮤신, 단백질, 세포 잔해와 같은 큰 구성 요소를 제거하는 데 널리 사용됩니다. 하지만 부피가 큰 실험실 장비와 여러 처리 단계가 필요해 분산 환경에서의 적용 가능성이 제한됩니다^13,14. 버퍼 용액으로 희석하면 점도를 낮추고 시료 흐름을 개선할 수 있습니다^. 그럼에도 불구하고, 동시에 분석물 농도를 낮춰 분석 감도를 저하시킵니다. 그 결과, 기존 접근법은 신속하고 장비 필요 없는 표적 분석물의 처리 및 보존이 필수적인 현장 진료 적용에는 여전히 부족합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 시점에서 코티솔 검출을 위해 맞춤형 타액 전처리용 휴대용 기기인 SaliFilter를 개발했습니다. 이 장치는 고분자량 간섭물질을 선택적으로 제거하면서도 코티솔¹⁶을 포함한 소분자의 통과를 허용하는 여과 메커니즘을 사용합니다. 수동으로 조작하는 이 장치는 외부 계측기 없이도 빠르고 사용자 친화적인 처리를 가능하게 합니다. 간섭 성분을 제거함으로써 이 접근법은 측면 흐름 분석에서 모세관 흐름을 개선하여 분석 신뢰성을 높입니다. 이 프로토콜은 장치의 제작과 측면 흐름 분석을 이용한 코티솔 검출 전 신속한 타액 전처리에 적용하는 과정을 설명합니다.

프로토콜

상업적으로 획득한 식별 해제된 모인 인간 타액이 이 연구에서 사용되었습니다. 인간 참가자는 모집되지 않았으며, 기관 윤리 승인도 필요하지 않았습니다.

1. 타액 샘플 준비

1. 샘플 채취 전 최소 30분 동안 식사나 음료를 삼가도록 지시하세요.
2. 공급업체의 지침에 따라 타액 샘플을 준비하세요.
   참고: 본 연구는 프로토콜 수준의 검증을 위해 상업적으로 구할 수 있는 통합 인간 타액을 사용했습니다.
3. 사용 전에 침 샘플을 부드럽게 섞어 균질성을 확인하세요.
4. 침 샘플은 4°C에 보관하고 공급업체가 권장하는 보관 기간 내에 사용하세요.

2. RBCM 코팅막 준비 (그림 1A)

1. 이전에 보고된 프로토콜¹⁶에 따라 전혈에서 적혈혈을 분리합니다.
   1. 상업적으로 구할 수 있는 K2EDTA가 포함된 항응고된 인간 전혈을 RBCM 원으로 사용하세요.
   2. 800 × g 에서 전혈을 5분간 원심분리한 후, 혈장과 부피 코트를 제거한 후 적혈구 분획을 채취하세요.
   3. 분리된 적혈구 펠릿을 얼음처럼 차가운 1× 인산 완충 식염수(PBS)로 세 번 세척하고 부드러운 수동 혼합을 사용하세요.
   4. 세척한 적혈구 펠릿을 얼음처럼 차가운 0.25× PBS에 30분간 재현탁하여 용혈을 유도합니다.
   5. 용해된 현탁액을 20,000 × g 에서 30분간 원심분리하여 RBCM 펠릿을 수집하여 자유 헤모글로빈을 분리합니다.
   6. 수집한 RBCM 펠릿을 0.25× PBS로 세 번 더 세척한 후, 연한 분홍색 RBCM 펠릿은 −80°C에서 보관하여 추가 사용을 기다리세요.
2. 기공 크기가 30nm이고 직경이 13mm인 폴리에테르설폰(PES) 막을 준비합니다.
3. PES 막 한쪽에 2% (w/v) RBCM 용액 100 μL 증강합니다. 용액을 부드럽게 바르거나 점차 방울 방향으로 분사하여 멤브레인 표면 전체가 완전히 적셔질 때까지 사용하세요.
4. 50 °C에서 30분간 배양하여 균일한 코팅과 건조를 보장합니다.
5. 코팅된 막을 실온에 보관하고¹⁷번 준비 후 15일 이내에 사용하세요.
   참고: RBCM 코팅 PES 막의 상세 특성 분석은^{이전 연구에서} 기술되었습니다.

3. 살리필터 장치 제작 (그림 1B)

1. RBCM 코팅된 막을 지정된 필터 홀더에 넣으세요.
2. 흡입구와 출구 부품을 단단히 연결하여 장치를 조립하세요.
3. 장치 입구에 1mL 주사기를 연결하세요.
   주의: 작동 중 누수를 방지하기 위해 모든 부품을 단단히 밀봉해야 합니다.

4. 타액 전처리

1. 살리필터 장치에 연결된 주사기에 500 μL의 침을 주입하세요.
2. 침 샘플을 막을 통과시키기 위해 부드러운 수동 압력을 가하세요(~ 2분).
3. 콘센트에서 미리 처리된 침을 채취하세요.
4. 미리 처리된 샘플을 즉시 사용하거나 추가 분석 전까지 4°C에서 보관하세요.

5. 침 단백질의 SDS-PAGE 분석

1. 샘플 15 μL과 Laemmli 샘플 버퍼 5 μL을 혼합합니다.
2. 혼합물을 8% SDS-PAGE 겔의 별도 웰에 적재합니다.
3. 150V에서 40분간 전기영동을 수행하세요.
4. 젤을 Coomassie Blue로 2시간 동안 염색하세요.
5. 젤을 증류수에 하룻밤 동안 제거하세요.
6. 스마트폰이나 영상 시스템을 사용해 젤 이미지를 촬영하세요.

6. 측면 흐름 분석법(LFA)을 이용한 코티솔 검출

1. LFA 스트립의 샘플 패드에 150 μL 사전 처리된 침을 도포합니다.
2. 샘플이 스트립을 따라 10분간 이동하도록 두세요.
3. 스마트폰이나 영상 시스템을 사용해 검사 결과를 촬영하세요.
4. ImageJ에서 LFA 이미지를 열고 Image > Color > Split Channels를 사용해 RGB 채널을 분리하세요.
5. 테스트선 강도 분석에는 녹색 채널 이미지를 사용하세요.
6. 테스트 라인을 덮는 100× 10픽셀의 직사각형 관심 영역(ROI)을 선택하고 동일한 ROI 크기를 모든 스트립 이미지에 적용합니다.
7. 테스트라인 ROI의 평균 강도 값을 측정합니다. 동일한 ROI 크기를 가진 인접한 빈 막 영역을 선택하고 배경 강도를 측정합니다.
8. 정규화된 시험선 강도를 다음과 같이 계산합니다: 정규화 강도 = 시험선 강도 − 배경 강도.

7. 통계 분석

1. 별도 명시가 없는 한 정량적 데이터는 평균 표준편차(SD)± 제시하십시오. 오류 바를 SD로 정의하세요.
   참고: 본 연구에서 보고된 모든 N 값은 상업적으로 구한 인간 타액의 알리코트를 이용한 기술적 복제를 나타냅니다.
2. 코티솔 농도 0–8 ng mL⁻¹ 에서 얻은 정규화된 시험선 강도 값을 사용하여 선형 회귀 분석을 수행하고, 적합 곡선에서 결정계수(R²)를 계산합니다.
3. 다음 식으로 검출 한계(LOD)를 계산합니다: LOD = 3.3 × SE / |기울기|, 여기서 SE는 y-절편의 표준오차이고 |기울기| 는 선형 회귀 방정식에서 얻은 기울기의 절대값이다. 경쟁 LFA는 음의 기울기를 생성하므로 기울기의 절대값을 사용하세요.
   참고: 본 연구에서는 추론 통계 검정이 수행되지 않았으며, 유의성 기준도 적용되지 않았습니다.

결과

효과적인 타액 전처리는 점액과 단백질 등 후속 분석 성능을 저해하는 간헐 성분을 제거해야 합니다. SaliFilter의 여과 능력은 처음에 상업용 타액 채취 키트를 사용한 탁도 변화와 비교하여 평가되었습니다(그림 2A). 처리되지 않은 타액은 높은 탁도를 보였으나, SaliFilter 처리된 샘플은 눈에 띄게 투명해 점액과 부유 성분이 효율적으로 제거되었음을 나타냈다. 반면, 상업용 키트로 처리한 샘플은 투명도가 제한적으로 향상되었습니다.

단백질 제거는 280 nm에서 흡수도를 측정하여 정량적으로 평가했으며, 여과 후 약 69% 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 2B). 이 결과는 Bradford 분석에 의해 더욱 뒷받침되었으며, SaliFilter 처리 샘플에서 색상 강도가 현저히 감소하여 전체 단백질 농도가 약...

토론

타액 기반 진단은 혈액 분석에 대한 비침습적 대안을 제공합니다. 그러나 타액의 고유한 점도와 뮤신, 단백질과 같은 간섭 성분의 존재로 인해 이러한 광범위한 채택이 제한되어 왔습니다. 이러한 요인들은 모세관 유도 흐름을 방해하고 LFA를 포함한 단순 분석 플랫폼의 성능을 저해하여 효과적인 샘플 전처리가 필요합니다.

본 연구에서는 제안된 휴대용 여과 장치인 SaliFilter가 고분자량 간섭 물질을 효과적으로 제거하면서 코르티솔과 같은 작은 표적 분석물을 보존함을 입증합니다. RBCM 코팅은 PES 막에 생물학적으로 유래한 표면층으로서 점액과 단백질과 같은 고분자량 침 성분을 제거하는 데 기여합니다. 유동 방해 요소를 제거함으로써, 이 장치는 복잡하거나 기기 의존적인 전처리 없이 침 샘플을 LFA에 직접 통합할 수 있게 합니다. 이 발견은 원시 생물학적 샘플과 단순화된 진단 플랫폼 간의 간극을 메우는 전처리의 중요한 역할을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인공 타액	Solarbio, 중국	A7990
Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약	Bio-Rad, 미국	5000006	Bradford 분석용
쿠마시 블루	Abcam, 영국	ab119211	단백질 밴드 시각화용
코티솔 ELISA 키트	Abcam, 영국	ab154996
코티솔 LFA	사내
핫 플레이트	대한과학, 대한민국)
하이드로코르티손 (코티솔)	Sigma-Aldrich, 미국	PHR1014
Laemmli 시료 완충액	GenDEPOT, 미국	L1200-001	SDS-PAGE 전 단백질 변성용
멤브레인 홀더	GVS Filter Technology	1220950	직경 13mm 홀더
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Gels	Bio-Rad, 미국	1658000	겔 전기영동용
뮤신	Sigma-Aldrich, 미국	M2378
NanoDrop 2000 분광광도계	Thermo Fisher Scientific, 미국		단백질 분석용
PES 멤브레인	STERLITECH, 미국	PES00313100	0.03 마이크론, 13mm PES 멤브레인
인산염 완충 식염수 (PBS)	DUKSAN, 대한민국	LB004
풀링된 인간 타액	Innovative Research Inc., 미국	IRHUSL5ML
RBCM	사내
PAGE용 분리 겔 버퍼	Bio-Rad, 미국	1610798	분리 겔 준비용
Salivette Cortisol	SARSTEDT, 독일	51.1534.500	타액 수집 키트
PAGE용 스태킹 겔 버퍼	Bio-Rad, 미국	1610799	스태킹 겔 준비용
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, 미국	SSAL-601	타액 수집 키트
주사기	koreavaccine, 대한민국)		1 mL 부피
TEMED	Bio-Rad, 미국	1610800	아크릴아미드 중합용