연구 논문

Rab27A의 N6-메틸라데노신 변형은 난소절제된 마우스 모델에서 아반세포 분화에 영향을 줌으로써 골다공증을 촉진합니다

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DOI:

10.3791/71964

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2026년 8월 11일

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

YTHDC1은 m6A 변형 Rab27A의 세포질 배출을 촉진하는 반면, IGF2BP2 세포질 내 Rab27A를 안정화시켜 파반세포 분화를 촉진하고 골다공증에 기여합니다.

초록

골다공증에 대한 새로운 치료법 개발은 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. Rab27A는 파반 분화 과정에서 상향 조절되며, N6-메틸아데노신(m6A) 변형은 정형외과 질환에서 중요한 후생유전학적 조절자로 부상하고 있습니다. 생물정보학 분석 결과 Rab27A는 여러 m6A 변형 부위를 포함하고 여러 m6A 관련 단백질과 상호작용한다고 예측했습니다. 난소 절제(OVX) 마우스 모델을 사용하여 Rab27A가 파반 분화 및 골다공증에서 어떤 역할을 하는지 평가하기 위해 녹다운 실험이 수행되었습니다. Rab27A 고갈은 골다공증을 완화시키고 OVX 마우스에서 골 형성률을 14.73%에서 28.13%(P < 0.05)로 증가시켰습니다. 웨스턴 블롯 및 정량적 PCR 검사는 Rab27A 녹다운이 TRAP, NFATc1, c-FOS 산골세포 표지자 단백질과 mRNA 발현을 감소시켜 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)와 핵 인자 κB 리간드(RANKL) 수용체에 의해 유도되는 골수 유래 대식세포(BMM)의 분화를 억제함을 보여주었습니다. TRAP 염색은 M-CSF 및 RANKL 유도 후 Rab27A 고갈이 TRAP 활성을 24.1%에서 12.9%로 유의하게 감소시켰음을 보여주< 0.01. RNA 면역침전 분석법은 Rab27A와 m6A 리더 단백질인 YTHDC1 및 IGF2BP2 간의 상호작용을 확인했습니다. 핵 및 세포질 분획 결과, YTHDC1이 m6A 변형 Rab27A의 세포질 방출을 촉진한다는 것이 입증되었습니다. 또한 q-PCR 및 웨스턴 블롯 분석 결과, YTHDC1 또는 IGF2BP2의 녹다운이 Rab27A 발현을 감소시키고 TRAP, NFATc1, c-FOS의 발현을 감소시켜 M-CSF와 RANKL에 의해 유도된 파절반 분화를 억제하는 것으로 나타났습니다. 종합적으로 이 결과들은 YTHDC1 매개 세포질 배출과 IGF2BP2 매개 m6A 변형 Rab27A의 안정화가 OVX 마우스 모델에서 파반세포 분화를 촉진하고 골 손실에 기여함을 시사합니다.

서론

골다공증(OP)은 뼈 미세구조의 악화와 골밀도 감소를 특징으로 하는 흔한 골격 질환으로, 전 세계적으로 골절 위험이 증가합니다 1,2,3. 골다공증 골절은 주로 팔뚝, 상완골, 고관절, 척추에서 발생하며, 특히 노인층에서 더 흔합니다. 이러한 골절은 삶의 질을 크게 저하시키며, 환자와 그 가족,의료 시스템에 상당한 신체적, 심리적, 사회경제적 부담을 가합니다. 따라서 골다공증의 예방, 관리 및 치료는 여전히 주요 임상 및 공중보건 우선순위로 남아 있습니다.

골다공증을 위한 다양한 치료 전략이 개발되었으며, 일반적으로 골형성제와 항흡수 치료제 두 가지 범주로 분류할 수 있습니다 4,5. 전통적인 항흡수제로는 비스포스포네이트, 랄록시펜, 스트론튬 라넬레이트가 있으며, 최신 약물로는 데노수맙, 오다나카티브, 사라카티닙이 있습니다. 골 형성 치료법으로는 부갑상선 호르몬(PTH 1–84)이 있으며, MK-5442, AMG 785, BHQ 880과 같은 추가 후보 치료법도 임상 개발 중입니다. 이러한 치료법들이 효과적일 수 있지만, 많은 치료법이 심각한 부작용, 제한된 장기 효능, 또는 장기 사용 제한과 연관되어 있습니다. 예를 들어, 아미노비스포스포네이트와 데노수맙의 장기 투여는 정상적인 골 재형성을 저해할 수 있습니다. 따라서 더 안전하고 효과적인 치료 표적을 찾는 것은 골다공증 연구에서 중요한 목표로 남아 있습니다.

Rab 단백질은 세포 내 소포 수송과 세포 신호 전달의 핵심 조절자이며, 바이러스 감염, 자가포식, 세포골격 조직 등 다양한 생물학적 과정에 참여합니다10. 최근 몇 년간 Rab 계열 단백질이 골대사와 골다공증에서 차지하는 역할에 대한 관심이 점점 커지고 있습니다. Rab44는 핵인자 κB 리간드(RANKL) 처리 대식세포 11의 수용체 활성화자인 활성화된 T 세포 1의 세포 내 Ca2⁺ 신호 전달과 활성화 핵인자 활성화(NFATc1)를 조절하여 아반세포 분화를 조절하는 것으로 보고되었습니다. 쇄골세포는 대식세포 계통 전구체에서 유래한 다핵세포로, 뼈 흡수와 골격 항상성에 필수적인 역할을 합니다 12,13,14,15,16,17,18,19. 따라서 골다공증에 대한 새로운 치료법 개발에 있어 파반세포 분화를 지배하는 분자 기전을 이해하는 것이 매우 중요합니다.

Rab27A는 Rab GTPase 계열의 중요한 구성원으로, 분비 및 면역 세포에서 널리 발현됩니다. 이 물질은 소포 수송, 외세포 배출, 세포 내 신호전달 20,21,22,23,24,25,26,27에서 중요한 역할을 합니다. 이전 연구들은 Rab27A가 기도 염증 중 호산구 탈과립을 조절하고, 활성화된 대식세포에서 NADPH 산화제 활성과 관련된 소포 동원을 조절한다는 것을 입증했습니다20.23. 특히, 누적된 증거에 따르면 Rab27A 발현은 파세포 분화 과정에서 유의미하게 상향 조절된다. Shimada-Sugawara 등은 골수 유래 대식세포(BMMs)가 파반골로 분화하는 과정에서 Rab27A 발현이 증가한다고 보고했으며, 이는 골세포형성에 잠재적 역할을 시사한다고 제안했다28. 종합적으로 이 결과들은 Rab27A가 소포 수송과 세포 내 신호 전달 경로를 조절함으로써 파반세포 형성과 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다28,29.

N6-메틸아데노신(m6A)은 진핵생물 메신저 RNA와 비암호화 RNA에서 가장 풍부한 내부 RNA 변형이며, RNA 대사와 유전자 발현을 조절하는 중요한 역할을 합니다. 포유류에서 최초로 확인된 mRNA 변형으로서, m6A는 RNA 안정성, 스플라이싱, 수송, 번역 등 다양한 생물학적 과정에 관여하고 있습니다. Wang 등은 보존된 서열 모티프 내에서 흔히 발생하는 m6A 변형이 YTH 도메인 포함 단백질에 의해 인식되어 mRNA 안정성과 대사 조절에 기여함을 입증했다30. 더 나아가, m6A 변형은 게놈 안정성, 전사 조절, 염색질 조직, 암 진행, 면역 반응 등 다양한 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 연구들은 뼈 관련 질환과 골다공증에서 m6A 신호전달의 중요한 역할도 강조했습니다.

m6A 리더 단백질 중에서 YTHDC1은 RNA 처리와 핵 배출을 조절하는 핵 리더 역할을 하며, 인슐린 유사 성장 인자 2 mRNA 결합 단백질 2(IGF2BP2)는 세포질 내 m6A 변형 전사체를 안정화합니다. Chen 등은 YTHDC1이 m6A 변형 circNSUN2의 핵 방출을 촉진하며, 이 물질이 IGF2BP2와 상호작용하여 HMGA2 mRNA를 안정화하고 대장암 전이를 촉진한다는 것을 입증했다. 이러한 발견은 YTHDC1과 IGF2BP2의 조정된 조절이 m6A 변형 전사체의 운명을 조절하는 일반적인 메커니즘일 수 있음을 시사합니다.

본 연구는 Rab27A mRNA 내에서 예측된 m6A 변형 부위를 조사하고, YTHDC1 및 IGF2BP2과의 상호작용을 조사하였습니다. YTHDC1은 m6A 변형 Rab27A 전사체의 핵 배출을 용이하게 하는 반면, IGF2BP2 세포질 내 Rab27A와 상호작용하여 안정성을 높였습니다. 이 조절 기전을 통해 Rab27A는 파반 골세포 분화를 촉진하고 골다공증의 진행에 기여했습니다. 종합적으로, 이 연구 결과는 YTHDC1, IGF2BP2, Rab27A가 조골세포 분화에 관여하는 이전에 인식되지 않은 m6A 의존적 조절 경로를 규명합니다. 이 결과는 골다공증의 분자 발병 기전에 대한 새로운 통찰을 제공하며, m6A 매개 Rab27A 조절을 표적으로 하는 새로운 치료 전략 개발을 촉진할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 사우스웨스트 의과대학 산하 병원 동물보호 및 활용 위원회(승인 번호 2024-Ethics-042)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 ARRIVE 지침, 1986년 영국 동물(과학 절차)법 및 관련 지침, EU 지침 2010/63/EU, 그리고 NIH 간행물 8023호, 1978년 개정판에 따라 수행되었습니다. 쥐들은 무작위로 실험 그룹에 배정되었고, 배정 순서는 조사자에게 숨겨졌습니다. 조직학적 평가, 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT) 영상 분석, 통계 분석을 포함한 모든 데이터 수집 및 분석은 그룹 배정에 눈이 채워진 연구자들에 의해 수행되었습니다. 분석에서 동물이나 샘플은 제외되지 않았습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약, 장비, 소프트웨어 및 기타 자원은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 난소 절제술(OVX) 모델의 구성

8주 된 24마리의 야생형 암컷 C57BL/6 마우스를 골다공증 모델을 구축하기 위해 사용되었습니다. 1주일간의 적응 기간 후, 쥐들은 샴 그룹 또는 OVX 그룹 중 하나에 무작위로 배정되었습니다. OVX 모델은 앞서 설명한 양측 난소 절제술을 통해 확립되었습니다 34,35. 가짜 수술을 한 쥐들은 난소 제거 없이 수술로 노출되었습니다.

대퇴골 내 유전자 전달 시, 이전에 보고된 대로 sh-Rab27A 또는 sh-NC를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 OVX 수술 후 7일 후에 주입하였다 36,37. 간단히 말해, 마취 하에 22게이지 바늘을 사용해 슬개를 통해 대퇴골에 농축된 렌티바이러스 입자(1 ×10 6 transducing unit/mL)를 주입했습니다. 각 마우스는 20 μL의 렌티바이러스 현탁액을 투여했습니다. 절개 부위는 이후 봉합되었고, 회복 기간 내내 동물들을 모니터링했습니다.

모든 동물 실험은 특정 병원체가 없는 조건에서 수행되었습니다. 대퇴부 검체는 수술 후 8주 후에 채취되었습니다. 그룹당 최소 6마리의 쥐가 조직학적 분석과 RNA 또는 단백질 추출에 사용되었습니다.

2. 체내 마이크로 CT 영상

미세 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)은 소완골 형태를 평가하기 위해 시행되었습니다. 각 마우스의 오른쪽 경골은 생후 14주 때 OVX 수술 전에 생 체 내에서 스캔되었습니다. 추적 검사는 22주까지 매주 시행되었습니다. 미세 CT 분석에는 그룹당 최소 6마리의 쥐가 포함되었습니다.

쥐들은 복막 내 펜토바르비탈나트륨(체중 50 mg/kg)으로 마취하였다. 발가락 꼬집는 반사가 없고 호흡 수를 지속적으로 모니터링함으로써 적절한 마취가 확인되었으며, 영상 검사 내내 유지되었습니다. 모든 안락사 절차는 승인된 동물 프로토콜, 기관 동물 복지 지침, 그리고 실험실 동물 안락사에 관한 국가 규정에 따라 진행되었습니다.

생후 24주에 쥐들은 깊은 마취 후 경추 탈구로 안락사되었으며, 두 경골 모두 동일한 영상 프로토콜을 사용해 체 외 스캔을 위해 채취되었습니다. 스캐닝 매개변수에는 10.4 μm의 복셀 크기, 55 kV의 전압, 145 μA의 전류, 32mm 시야각, 투영당 1500/750 샘플, 그리고 100 ms 적분 시간이 포함되었습니다.

이미지는 1200 mg HA/cm3 팬텀을 기준으로 보정된 3차 다항 빔 경화 보정 알고리즘을 사용해 처리되었습니다. 골량 분율(BV/TV), 소모 두께(Tb.Th), 그리고 소뇌 수(Tb.N)는 성장판 근처의 원위 대퇴골 골골단에서 정량화되었습니다.

3. 플라스미드 트랜스펙션

sh-Rab27A 및 sh-NC 플라스미드는 렌티바이러스 생산에 사용되어 생성되었습니다. 렌티바이럴 패키징 플라스미드와 shRNA 구성체는 제조사의 지침에 따라 HEK293T 세포에 공동 형질전환되었습니다. 바이러스 역가는 이전에 대퇴골 투여 전에 결정되었으며,36. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다.

4. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색

대퇴골 표본은 4% 파라포름알데히드에 24시간 고정, 10% EDTA에서 4주간 탈석화, 30% 자당/PBS에 냉동 보호, 파라핀에 박혀 5 μm 두께로 절획하였습니다. 조직 절편은 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 광학 현미경으로 검사했습니다. 그룹당 최소 6마리의 쥐가 분석되었습니다.

5. 타르산염 저항성 산성 인산효소(TRAP) 염색

대퇴부 부위의 TRAP 염색은 제조사 지침38에 따라 수행되었습니다. 골수 유래 대식세포(BMMs)에서의 TRAP 활성은 TRAP 염색 검사법을 사용하여 평가되었습니다. 성숙한 파골세포는 최소 3개의 핵을 포함하는 TRAP 양성 다핵 세포로 정의되었습니다. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었으며, 각 복제에는 세 가지 기술적 복제가 있었습니다.

6. q-PCR

총 RNA는 제조사 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용해 분리되었습니다. 상보적 DNA는 역전사효소를 이용해 합성되었고, SYBR Green 화학을 이용한 실시간 정량 PCR에 적용되었습니다. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었으며, 각 복제에는 세 가지 기술적 복제가 있었습니다.

프라이머 서열은 다음과 같다:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTGTGTTCGACCT; R, GGCACCTGGTTTCAAAAT

트랩: F, TGTTGACAGGGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

C-FOS: F, TACTACCATTCCCCCACCACCACCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGAGGATGTTCCGAATC

β-액틴: F, GGGAAATCGTGGTGGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. 서부 블롯팅

세포나 조직은 프로테아제 억제제를 보완한 RIPA 버퍼를 사용해 용해했습니다. 단백질 농도는 브래드포드 분석법을 사용해 측정하였다. 동일한 양의 단백질(20 μg)을 SDS-PAGE에 의해 분리하여 폴리비닐리덴 플루오르오라이드(PVDF) 또는 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였습니다. 막은 5% 무지방 우유로 실온에서 1시간 동안 차단한 후, 4°C에서 TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 또는 β-actin에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 배양했습니다. 세척 후, 멤브레인은 적절한 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅되었습니다. 단백질 밴드는 표준 검출 절차를 사용하여 시각화하였습니다. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다.

8. 세포 배양

앞서 설명한 대로 골수 유래 대식세포(BMMs)는 분리되었습니다. 마우스 대퇴골에서 채취한 골수 세포는 최소 필수 배지에 10% 태아 소 혈청, 30 ng/mL 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF), 1% 페니실린/스트렙토마이신을 37°C에서 5% CO₂ 함유의 습습 환경에서 하룻α밤 배양했습니다. 비부착 세포는 30 ng/mL M-CSF를 포함한 기질 세포 없는 시스템에서 수집 및 배양하였습니다. 3일 후, 부착 세포를 BMM으로 채취하여 30 ng/mL M-CSF와 50 ng/mL 수용체 활성화 핵인자-κB 리간드(RANKL)를 72시간 동안 추가로 배양하여 진골세포 분화를 유도했습니다.

9. RNA 간섭(RNAi)

소규모 간섭 RNA(siRNA)는 제조사 지침에 따라 지질 기반 형질염색 시약을 사용해 합성 및 형질전환되었습니다. 세포는 6웰 플레이트에서 웰당 2×4 세포 밀도로 시딩된 후 형질전환을 진행했습니다. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다.

목표 시퀀스는 다음과 같았습니다:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCACACAAGCCAATT

10. 면역형광

세포는 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하고, 0.1% Triton X-100으로 10분간 투과시켰습니다. 5% 소 혈청 알부민으로 30분간 차단한 후, 세포는 4°C에서 1차 항체와 함께 하룻밤 배양하였다.

세척 후에는 실온에서 30분간 형광포체 결합 2차 항체를 도포했습니다. 핵은 DAPI로 염색되었고, 공초점 현미경으로 이미지를 획득했습니다. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다.

11. 핵 및 세포질 분리

핵 및 세포질 분획은 제조사의 지침에 따라 분리되었습니다. 세포는 얼음 위에 10분간 용해한 후 4°C에서 500 × g 에서 3분간 원심분리했습니다. 세포질 성분이 포함된 상청액은 수집되었고, 핵을 포함한 펠릿은 별도로 세척 및 처리되었습니다.

12. RNA 결합 단백질 면역침전(RIP)

RNA 면역침전(RIP) 분석은 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다. 잠시 세포를 얼음 위에 30분간 용해했습니다. 원심분리 후, 상청액은 항체 및 단백질 A/G 아가로스 구슬과 함께 하룻밤 배양되었다. 세척 후에는 면역침전된 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 분석하고, 공동면역침전된 RNA는 정량적 실시간 PCR로 분석되었습니다. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다.

13. Rab27A mRNA 안정성 분석법

총 RNA는 IGF2BP2 넉다운 후 지정된 시점에서 추출되었습니다. 이후 역전사 및 실시간 정량 PCR이 수행되었습니다. Rab27A mRNA 수치는 0시점에서 해당 si-NC 그룹으로 정규화되었습니다. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다.

14. 통계 분석

모든 실험은 최소 세 개의 생물학적 복제체를 사용하여 독립적으로 수행되었습니다. q-PCR, RNA 간섭, TRAP 염색, 서부 블롯팅 및 기타 세포 기반 분석의 경우, 각 생물학적 복제에는 별도 명시가 없는 한 세 개의 기술적 복제가 포함되었습니다. 데이터는 표준편차(SD)± 평균으로 제시됩니다.

통계 분석은 GraphPad Prism 버전 9.0과 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 두 그룹 간의 비교는 양측 학생 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. 여러 그룹 간 비교는 양방향 분산분석(ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 다중 비교 사후 검정을 사용하여 다중 비교를 조정하였습니다. P 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

Rab27A 노크다운은 생체 내 골다공증을 감소시켰습니다.

골다공증에서 Rab27A의 역할을 조사하기 위해, 이전에 보고된 방법34,40을 사용해 난소 절제(OVX) 마우스 모델에서 Rab27A 크녹다운이 수행되었습니다. 전체 연구 설계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 마이크로 컴퓨터 단층촬영 분석 결과, OVX 마우스에서 골밀도, 골부피 분율(BV/TV), 섬유질 두께(Tb.Th), 그리고 섬유골 수(Tb.N)가 Sham 대조군에 비해 유의하게 감소함을 보였습니다(그림 2A). 이 결과는 골다공증 모델의 성공적인 확립을 확인시켜 주었습니다. Rab27A 넉다운은 측정된 모든 뼈 구조 매개변수를 유의미하게 회복시켜, OVX에 의해 유발된 골 손실과 미세구조 악화가 감소함을 나타냈다(그림 2A).

조직학적 검사도 이러한 결과를 뒷받침했다. 헤마톡실린과 에오신 염색은 OVX 마우스에서 Sham 그룹과 비교했을 때 뚜렷한 트라베클라 골 손실과 트라베클 구조 파괴를 확인하였다(그림 2B). 반면, Rab27A 고갈은 트라베클 악화를 완화하고 뼈 형태를 부분적으로 회복시켰습니다(그림 2B). Rab27A가 파반 분화에 관여한 것으로 밝혀졌기 때문에, 파반 활성은 타르산염 저항성 산성 인산효소(TRAP) 염색을 통해 평가되었습니다. TRAP 활동은 OVX 마우스에서 샴 대조군에 비해 현저히 높았으며, Rab27A 넉다운 후에는 유의하게 감소하였습니다(그림 2C).

이후 파반 관련 표지자의 발현을 조사하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과, OVX 마우스에서 Rab27A, TRAP, NFATc1, c-FOS 단백질 농도가 유의하게 증가했으며, Rab27A 고갈 후에는 감소함이 확인되었습니다(그림 2D). 전사 수준에서 일관된 결과가 나왔으며, 정량적 실시간 PCR(q-PCR)은 Rab27A, TRAP, NFATc1, c-FOS mRNA 발현에서도 유사한 발현 양상을 보였습니다(그림 2E).

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그림 1: 산골파반 분화 및 골다공증 진행 과정에서 ythdc1 및 IGF2BP2 매개 조절의 실험 설계 및 제안된 조절 기전의 개요. 난소 절제(OVX) 마우스 모델과 핵인자-κB 리간드(RANKL)/대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF) 유도 분화 모델을 사용하여 Rab27A가 파세포형성에서 어떤 역할을 하는지 조사하였습니다. Rab27A 노크다운, 핵 및 세포질 분획, RNA 면역침전 분석을 통해 골세포 분화 마커(TRAP, NFATc1, c-FOS), Rab27A 발현 및 세포 내 위치 분석을 평가하였습니다. YTHDC1은 m6A 변형 Rab27A의 세포질 배출을 촉진하는 반면, IGF2BP2 세포질 내 Rab27A를 안정화시켰다. 이러한 조정된 조절 메커니즘은 함께 조골파세포 분화를 촉진하고 OVX 모델에서 골 손실에 기여했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: Rab27A 노크다운 결과 생체 내 골다공증 감소. (A) 소모골 형태측정 분석. 골밀도, 골부피 분율(BV/TV), 소나무 두께(Tb.Th), 그리고 소나무로개 수(Tb.N)를 정량화하였다. **P < 0.01, ***P < 0.001. (B) Rab27A 고갈 후 대퇴골 조직학적 평가. 원위 대퇴골의 구조적 변화를 평가하기 위해 헤마톡실린과 에오신(HE) 염색이 시행되었습니다. OVX와 OVX + sh-NC 그룹이 대조군으로 활동했습니다. 스케일 바 = 50 μm. ***P < 0.001. (C) 대퇴골 부위의 TRAP 염색. TRAP 활성은 파반 조골 활성을 평가하기 위해 이루어졌습니다. OVX와 OVX + sh-NC 그룹이 대조군으로 활동했습니다. 스케일 바 = 50 μm. ***P < 0.001. (D–E) Rab27A 고갈 후 Rab27A, TRAP, NFATc1, c-FOS의 발현. 단백질 발현은 웨스턴 블롯팅(D)으로, mRNA 발현은 q-PCR(E)로 결정되었습니다. β-액틴은 적재 제어 역할을 했다. **P < 0.01, ***P < 0.001. 샴 그룹 은 난소 절제술 없이 난소 노출 수술을 받았고, OVX 그룹은 양측 난소 절제술을 받았습니다. sh-NC, 음성 대조군 단검 RNA. 각 실험 그룹에는 6마리의 쥐가 포함되었습니다. 데이터는 평균 표준± 기준으로 제시됩니다. 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

Rab27A의 넉다운은 M-CSF와 RANKL에 의해 유도된 BMMs의 파세포 분화를 억제했습니다

Rab27A가 조골세포 형성 중 역할을 더 평가하기 위해, 골수 유래 대식세포(BMMs)를 대식세포 집락자극인자(M-CSF)와 핵인자 κB 리간드 수용체 활성화자(RANKL)로 자극하여 아반파세포 분화를 유도하였다28.

정량적 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯 분석 결과, M-CSF와 RANKL 자극은 Rab27A mRNA와 단백질 발현을 유의미하게 증가시킨 반면, si-Rab27A를 통한 형질전환은 Rab27A 발현을 효과적으로 감소시켰습니다(그림 3A, B). TRAP 염색은 M-CSF 및 RANKL 치료 후 쇄골세포 활성이 현저히 증가하는 것으로 나타났습니다. Rab27A 노크다운은 유도군에 비해 TRAP 활성을 유의하게 감소시켰습니다(그림 3C).

이후 산골 분화 지표의 발현도 조사하였다. 정량적 실시간 PCR 분석 결과, TRAP, NFATc1, c-FOS mRNA 수준은 아반파세포 유도 후 유의하게 증가했으며 Rab27A 고갈로 인해 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 3D). 서부 블롯팅을 통해 단백질 수준에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(그림 3E).

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그림 3: M-CSF와 RANKL에 의해 유도된 골수 유래 대식세포(BMMs)의 파반 분화 억제된 Rab27A 노크다운. (A–B) 진골 유도 후 Rab27A 발현. Rab27A mRNA(A)와 단백질(B) 수준은 각각 q-PCR과 서부 블롯팅으로 결정되었습니다. β-액틴은 적재 제어 역할을 했다. P < 0.001. (C) BMM에서 유래한 파반구의 TRAP 염색. M-CSF와 RANKL에 의해 유도된 TRAP 활성 증가는 Rab27A 격퇴 후 억제되었다. 스케일 바 = 50 μm. ***P < 0.001. (D–E) Rab27A 고갈 후 파반 분화 표지자의 발현. TRAP, NFATc1, c-FOS mRNA 수준은 q-PCR(D)으로 결정되었고, 단백질 수준은 서부 블롯팅(E)으로 측정되었습니다. β-액틴은 적재 제어 역할을 했다. **P < 0.01, ***P < 0.001. 대조군, 미처리 세포; si-NC, 음성 대조군 siRNA. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다. 데이터는 평균 표준± SD로 제시됩니다. 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

m6A 변형 Rab27A의 세포질 방출은 YTHDC1에 의해 촉진되었습니다

m6A 변형이 Rab27A 조절에 미치는 잠재적 관여를 조사하기 위해 생물정보학 분석이 수행되었습니다. Rab27A 전사체 내에서 여러 예측된 m6A 변형 부위가 확인되었습니다(그림 4A). 또한 상호작용 예측 분석은 Rab27A와 m6A 리더 단백질인 YTHDC1 및 IGF2BP2 간의 잠재적 연관성을 시사했다(그림 4B).

YTHDC1과 Rab27A mRNA 간의 상호작용을 검증하기 위해 RNA 면역침전(RIP) 분석법이 수행되었습니다. Rab27A mRNA는 면역글로불린 G(IgG) 대조군과 비교하여 항YTHDC1 항체로 면역침전된 복합체에서 유의하게 풍부해졌습니다(그림 4C).

YTHDC1은 RNA배출에 관여하는 핵 m6A 리더 역할을 하기 때문에 핵 및 세포질 분획 분석이 수행되었습니다. YTHDC1 노크다운은 Rab27A mRNA의 핵 보유를 유의미하게 증가시키면서 세포질 풍부도를 감소시켰습니다(그림 4D).

YTHDC1이 Rab27A 발현에 미치는 영향도 추가로 평가하였다. 정량적 실시간 PCR 분석 결과, YTHDC1 고갈이 Rab27A mRNA 발현을 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 4E). 일관되게, 웨스턴 블롯 분석에서는 YTHDC1 넉다운 후 Rab27A 단백질 발현이 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 4F).

figure-results-4
그림 4: m6A 변형 Rab27A의 세포질 방출은 YTHDC1에 의해 촉진되었다. (A) SRAMP 예측 도구를 사용하여 Rab27A 내에서 예측된 m6A 변형 부위를 확인함. (B) StarBase를 통해 Rab27A와 m6A 리더 단백질 YTHDC1 및 IGF2BP2 간의 예측된 상호작용을 확인함. (C) YTHDC1과 Rab27A mRNA 간 상호작용을 입증하는 RNA 면역침전(RIP) 분석법. **P < 0.01. IgG는 음성 대조군 역할을 했습니다. Rab27A 농축은 입력 비율에 정규화되었습니다. YTHDC1 면역블롯 밴드는 면역침전 효율을 반영합니다. (D) YTHDC1 노크다운 후 Rab27A의 핵 보존 증가를 입증한 핵 및 세포질 분획 분석. **P < 0.01, ***P < 0.001. (E–F) YTHDC1 녹다운 후 YTHDC1과 Rab27A의 발현. mRNA 발현은 q-PCR (E )로, 단백질 발현은 서부 블롯팅 (F )으로 결정되었습니다.β-액틴은 적재 제어 역할을 했다. **P < 0.01. si-NC, 음성 대조군 siRNA. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다. 데이터는 평균 표준± 기준으로 제시됩니다. 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

IGF2BP2과의 상호작용을 통한 Rab27A 안정화

IGF2BP2와 Rab27A 간의 상호작용은 RIP 분석법을 사용하여 조사되었습니다. Rab27A mRNA는 IgG 대조군에 비해 항IGF2BP2 항체로 면역침전된 복합체에서 유의하게 농축되어 IGF2BP2와 Rab27A mRNA 간의 연관성을 시사합니다(그림 5A).

면역형광 분석 결과, IGF2BP2와 Rab27A가 주로 세포질 내에서 공존 위치가 있음이 입증되었습니다(그림 5B). IGF2BP2이 Rab27A 발현에 미치는 기능적 효과를 확인하기 위해 siRNA를 사용해 침묵IGF2BP2 처리하였습니다. 정량적 실시간 PCR 분석 결과, IGF2BP2 고갈 후 Rab27A mRNA 수치가 유의미하게 감소하는 것이 확인되었습니다(그림 5C). 이러한 결과와 일치하게, 웨스턴 블롯 분석 결과, IGF2BP2 다운 후 Rab27A 단백질 발현이 감소하는 것이 나타났습니다(그림 5D).

이후 IGF2BP2가 Rab27A mRNA 안정성에 미치는 영향이 평가되었습니다. IGF2BP2 고갈은 Rab27A mRNA의 반감기를 크게 단축시키고 전사체 안정성을 감소시켰습니다(그림 5E).

figure-results-5
그림 5: IGF2BP2과의 상호작용을 통한 Rab27A 안정화. (A) IGF2BP2와 Rab27A mRNA 간의 연관성을 입증하는 RNA 면역침전 분석. IgG는 음성 대조군 역할을 했습니다. Rab27A 농축은 입력 비율에 정규화되었습니다. P < 0.001. (B) 세포질 내 Rab27A와 IGF2BP2의 공동 위치 확인을 위한 면역형광 분석. 핵은 DAPI로 염색되었습니다. 스케일 바 = 20 μm. (C–D) IGF2BP2 고갈 후 Rab27A의 하향 조절. Rab27A mRNA 농도는 q-PCR(C)으로 결정되었고, 단백질 농도는 웨스턴 블롯팅(D)으로 측정되었습니다. β-액틴은 적재 제어 역할을 했다. **P < 0.01, ***P < 0.001. (E) IGF2BP2 다운 후 Rab27A mRNA 안정성. Rab27A mRNA 수준은 0 h에서 대응하는 si-NC 그룹으로 정규화되었습니다. **P < 0.01. si-NC, 음성 대조군 siRNA. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다. 데이터는 평균 표준± 기준으로 제시됩니다. 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

YTHDC1 또는 IGF2BP2의 침묵은 M-CSF와 RANKL에 의해 유도된 BMM의 아세포 분화를 억제했습니다

YTHDC1, IGF2BP2, Rab27A 간의 기능적 관계를 추가 조사하기 위해 BMM에서 녹다운 실험이 수행되었습니다.

M-CSF와 RANKL 자극은 Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2의 mRNA 발현을 유의하게 증가시켰습니다(그림 6A). 이에 상응하게, 이 분자들의 단백질 발현도 아반파세포 유도 후 상승했다(그림 6B). YTHDC1 또는 IGF2BP2 중 하나를 침묵시키면 Rab27A 발현이 유의하게 감소했으나, 한 조절 인자의 다운은 다른 조절자의 발현에 큰 영향을 미치지 않았습니다.

TRAP 염색은 YTHDC1 또는 IGF2BP2의 감소가 M-CSF와 RANKL에 의해 유도된 쇄골세포 활동을 유의미하게 억제함을 보여주었습니다(그림 6C). 더불어, YTHDC1 또는 IGF2BP2 녹다운 후 TRAP, NFATc1, c-FOS의 발현이 감소한 것이 실시간 PCR 분석으로 확인되었습니다(그림 6D). 웨스턴 블롯 분석 결과 단백질 수준에서 유사한 감소가 확인되었습니다(그림 6E).

이 결과들은 YTHDC1과 IGF2BP2가 Rab27A 발현 조절을 통해 파반 분화를 촉진한다는 것을 시사합니다.

figure-results-6
그림 6: YTHDC1 또는 IGF2BP2의 침묵은 M-CSF와 RANKL에 의해 유도된 BMM의 아세포 분화 억제. (A–B) YTHDC1 또는 IGF2BP2 다운 후 Rab27A 발현. Rab27A mRNA(A)와 단백질(B) 수준은 각각 q-PCR과 서부 블롯팅으로 결정되었습니다. β-액틴은 적재 제어 역할을 했다. P < 0.001. (C) YTHDC1 또는 IGF2BP2 고갈 후 골파세포 활동 억제를 보여주는 TRAP 염색. 스케일 바 = 50 μm. **P < 0.01, ***P < 0.001. (D–E) YTHDC1 또는 IGF2BP2 고갈 후 발현된 파반 분화 마커. TRAP, NFATc1, c-FOS mRNA 수준은 q-PCR(D)으로 결정되었고, 단백질 수준은 서부 블롯팅(E)으로 측정되었습니다. β-액틴은 적재 제어 역할을 했다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 대조군, 미처리 세포; si-NC, 음성 대조군 siRNA. 세 번의 독립적인 생물학적 복제가 수행되었습니다. 데이터는 평균 표준± SD로 제시됩니다. 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

데이터 가용성:

본 연구에서 사용되거나 분석된 데이터셋(서부 블롯 데이터, 영상 데이터셋, 정량적 분석, 소스 파일 포함)은 보충 파일 1에 제공되었습니다.

보충 파일 1: 이 연구의 데이터셋 및 원시 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

산골 세포 분화는 뼈 재형성, 골 흡수, 골절 수리, 골격 항상성12˒15˒17˒18˒42˒43에서 중요한 역할을 합니다. 과도한 파반 활성은 골다공증의 주요 원인으로, 파반 분화를 조절하는 조절 경로를 규명하는 것이 중요한 연구 목표입니다. 파반 기능을 겨냥한 여러 항흡수 치료법이 임상 효능을 입증했으며, 6,44,45. 예를 들어, 데노수맙은 골절 발생률 감소와 유리한안전성 프로필과 연관되어 있으며, 카텝신 K 억제제 ONO-5334는 난소절제된 비인간 영장류에서 골밀도와 뼈 강도에 유익한 효과를 보였습니다44. 본 연구는 YTHDC1, Rab27A, IGF2BP2와 관련된 이전에 인식되지 않은 m6A 의존적 조절 기전을 규명하여 골파세포 분화와 골다공증 진행을 촉진합니다. 이 발견들은 골파세포형성의 분자 조절에 대한 새로운 통찰을 제공하며, 골다공증의 잠재적 치료 표적을 제안합니다.

Rab27A는 이전에 소포 수송과 세포 내 신호 전달을 통해 파반세포 분화 및 뼈 흡수에 관여했으며, 주요 수용체의 내체체 재활용을 통해 RANKL에 의해 유도된 신호 전달 연쇄 반응에도 영향을 미칠 수 있다28,29. 이 보고서들과 일치하게, Rab27A 발현은 파반 분화 과정에서 현저히 증가한 반면, Rab27A 고갈은 시험관 내 분화 억제와 생체 내 골다공증 관련 골 손실을 완화했습니다. 이 발견들은 Rab27A가 파반 생물학에서 중요한 역할을 한다는 것을 지지하며, Rab27A 활성이 m6A 의존적 메커니즘을 통해 조절된다는 이전 관찰을 더욱 확장시켰습니다. 종합적으로 이 연구 결과들은 m6A가 변형된 Rab27A가 전사 후 수준에서 이러한 과정을 조절하여 골 흡수 활동에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다.

축적된 증거는 m6A 변형이 뼈 관련 질환의 발병과 진행에 기여한다는 것을 시사합니다32. 생물정보학적 분석은 Rab27A mRNA 내에서 여러 추정되는 m6A 변형 부위를 확인했으며(그림 4A), 기능적 연구는 YTHDC1과 IGF2BP2가 Rab27A 발현과 파반 분화를 조절한다는 것을 입증했습니다(그림 4–6). 이 발견들은 m6A 변형이 골파세포형성 중 Rab27A 기능을 조절하는 중요한 상류 조절 메커니즘임을 시사합니다. Rab27A 내에서 여러 예측 m6A 부위가 확인되었으므로, 향후 연구는 Rab27A 조절에 개별 부위 또는 여러 부위 조합이 필요한지 여부를 결정해야 합니다. m6A 결핍 Rab27A 돌연변이체의 구축과 이후의 구조 실험은 이 경로에서 m6A 변형의 기능적 중요성에 대한 직접적인 증거를 제공할 것입니다.

기전적으로 본 연구는 YTHDC1이 Rab27A mRNA와 상호작용하여 핵 배출을 촉진함을 입증했습니다. 세포질 전위 후 IGF2BP2는 Rab27A mRNA와 직접 결합하여 전사체 안정성을 향상시킵니다. 따라서 YTHDC1 또는 IGF2BP2 소모는 Rab27A 발현을 감소시키고 아반 분화를 억제했습니다. 이 발견들은 YTHDC1과 IGF2BP2가 mRNA 수송과 안정성을 조정하여 Rab27A 발현을 유지하기 위해 협력한다는 모델을 뒷받침합니다. 이 조절 메커니즘은 m6A 매개 골세포 분화 조절에 대한 현재의 이해를 확장시키며, 이 경로의 여러 구성 요소를 잠재적 치료 표적으로 식별합니다.

몇 가지 한계점을 인정해야 합니다. 첫째, Rab27A가 파반 분화를 조절하는 것으로 나타났지만, 그 잠재적 영향이 조골세포 기능에 미치는 영향은 아직 조사되지 않았습니다. 골 항상성은 파반파세포 매개 골 흡수와 골세포 매개 골 형성 간의 균형에 달려 있으므로, 향후 연구에서는 Rab27A가 골세포 분화 또는 활동에도 영향을 미치는지 평가해야 합니다. 둘째, 본 연구는 주로 기능 상실 접근법에 의존했다. Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2의 상보적 과발현과 m6A 결핍 Rab27A 돌연변이를 이용한 구조 실험은 제안된 조절 모델을 더욱 강화할 것입니다. 셋째, Rab27A mRNA 내 여러 추정 m6A 부위가 생물정보학적 접근법을 통해 예측되었으나, Rab27A 기능을 조절하는 특정 부위는 아직 확인되지 않았으며 실험적 검증이 필요합니다. 마지막으로, 다른 m6A 리더 단백질, RNA 결합 단백질 또는 신호 전달 경로가 산골세포 분화 과정에서 Rab27A 조절에 참여하는지 여부를 규명하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

면역 조절은 골다공증 발병기전의 중요한 요소로 부상했습니다46,47. Rab27A는 면역세포 분비, 세포독성 과립 방출, 호중구 탈과립, 조직 미세환경 조절 등 기능을 확립했습니다 48,49,50,51,52,53,54,55. Rab27A, 면역 조절, 골 항상성 간의 관계를 추가 조사하면 골다공증의 발병 기전에 대한 추가 통찰을 제공할 수 있습니다.

향후 조사는 몇 가지 핵심 분야를 우선시해야 합니다. 첫째, Rab27A 내 예측된 m6A 부위의 체계적 돌연변이 유발이 YTHDC1 및 IGF2BP2 매개 조절에 관여하는 기능적 결합 부위를 규명해야 합니다. 둘째, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2의 과발현과 m6A 결핍 Rab27A 돌연변이를 이용한 구조 실험이 YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 조절축의 직접적 기여를 확립하는 데 필수적입니다. 셋째, 추가 골다공증 모델에서 이 경로의 검증과 골세포에서 Rab27A 기능 평가가 본 연구 결과를 더욱 입증하는 데 중요할 것입니다.

결론적으로, 본 연구는 산골세포 분화와 골다공증 진행을 촉진하는 새로운 YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 조절 축을 확인하였습니다. YTHDC1은 m6A 변형 Rab27A mRNA의 핵 배출을 촉진하는 한편, 세포질 내 Rab27A mRNA의 안정성IGF2BP2 향상시켰습니다. 이러한 조정된 조절 이벤트들은 Rab27A 발현을 증가시키고 골파세포형성을 촉진했습니다. 종합적으로 이 연구 결과들은 골다공증에서 m6A 매개 조절에 대한 현재의 이해를 확장시키고, YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 경로를 표적으로 하는 치료 전략 개발의 기초를 제공합니다.

공개 사항

저자들은 상속된 재정적 이해관계나 이해 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 펑저우 인민병원과 서남의과대학 간 과학기술전략협력프로젝트(보조금 번호 2023PZXNYD01)의 재정 지원을 받아 리엔탕에 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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