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방법 논문

DNA-FISH 중기는 인간 암 세포주에서 균질하게 염색된 영역과 염색체 외 DNA를 구분하기 위해 확장됩니다

427 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71970

⸱

2026년 8월 4일

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 유전체 내에서 유전체 내 유전자 복제 수와 위치를 시각적으로 감지하는 DNA-FISH 중기 확산 프로토콜을 보고합니다. 이 접근법은 특히 염색체 외 DNA와 균질하게 염색된 영역을 포함하는 암세포주에서 증폭 상태의 단일 세포 해소를 가능하게 합니다.

초록

전체 유전체 시퀀싱은 염기쌍 해상도로 초점 DNA 증폭을 식별하지만, 증폭된 서열이 염색체 외 DNA(ecDNA, 이중 분)에 존재하는지, 아니면 염색체 통합 균질 염색 영역(HSR) 내에 존재하는지 판단할 수 없습니다. DNA 형광 현장 하이브리다이제이션(DNA-FISH) 중상 확산은 단일 세포 해상도에서 이러한 증폭 상태를 구별하는 데 여전히 금본위로 남아 있습니다. 여기서는 인간 암 세포주를 이용한 DNA-FISH 중기 확산 프로토콜을 제시하며, 세포 배양, 중기 정지, 저장성 치료, 고정, 염색체 확산, 형광 프로브 하이브리다이제이션, 형광 영상을 포함합니다. 프로토콜은 성공적인 염색체 분산을 검증하고 중기 확산 품질을 최적화하기 위한 중간 품질 관리 단계를 포함하여, 전문 세포유전학 전문 지식이 없는 실험실에서도 접근 가능한 워크플로우를 제공합니다. 결과는 유전자 좌위 특이적 프로브를 이용한 ecDNA 및 HSR 증폭 상태를 명확히 시각화하며, 해석에 영향을 미칠 수 있는 일반적인 기술적 인공물을 보여줍니다. 이 프로토콜은 암세포에서 종양유전자 증폭의 구조적 조직을 연구하기 위한 견고하고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.

서론

인간 게놈은 서열뿐 아니라 구조로도 조직되며, 서열 또는 구조 중 어느 하나가 변화하면 암 1,2,3,4로 이어질 수 있습니다. 종양유전자 증폭은 전체 종양의 약 40%에 존재하며, 종양 시작, 성장, 전이 및 약물 내성에 기여합니다5. 경우에 따라 증폭된 종양유전자는 염색체 외 DNA(ecDNAs, 이중 분이라고도 함)에 운반되는데, 이는 6,7,8,9 선염색체 밖에 위치한 원형의 자가 복제 이중 가닥 DNA 요소입니다. ecDNA는 수백 킬로베이스에서 메가베이스 크기가10,11입니다. 중심 이체가 없기 때문에 유사분열 시 비대칭적으로 분리되어 단일 핵12, 13, 14, 15, 16, 17, 18에 최대 100+개의 복사본이 존재합니다. 이러한 불균등한 분리는 딸세포 전반에 복제본 수 변동성을 발생시켜 빠른 종양 진화와 부진한 환자 결과17,19.

ecDNA는 균질 염색 영역(HSR)과 동역적인 관계를 유지한다(그림 1A)8,18. HSR은 8,10,18,20,21,22,23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 유전체의 단일 유전자로 재통합되어 발생하는 국소적 염색체 내 증폭입니다.31. 이 두 상태인 ecDNA와 HSR은 상호 변환이 가능하며, 이는 종양유전자 증폭이 구조적으로 가소성임을 밝혀낸다 24,25,32,33. 이 상호 전환은 치료적 의미가 있는데, ecDNA는 약물 32,33,34,35,36,37,38의 존재 하에서 HSR 상태로 전이될 수 있기 때문입니다. 이 전이가 HSR 상태로 전환된 세포는 치료압 하에서 약물에 내성을 갖게 됩니다33. HSR은 또한 악성 종양에서 양성 종양보다 더 자주 발생하는 것으로 보인다39. 임상적 관련성에도 불구하고, FDA 승인 전략은 HSR 상태를 표적으로 하지 않는데, 이는 이러한 증폭 구조를 구별하는 방법이 아직 충분히 활용되지 않았기 때문입니다.

ecDNA와 HSR 상태는 뚜렷한 임상적 결과를 가지지만, 현재의 시퀀싱 접근법으로는 이를 신뢰성 있게 구분하지 못합니다. 전체 유전체 시퀀싱(WGS)은 이제 염기쌍 해상도40의 증폭 영역을 식별합니다. WGS는 ecDNA와 HSR의 서열 구성을 정의하는 데 유용했지만, 공간 해상도는 대가로 희생되었습니다. 전통적인 세포유전학적 접근법과 달리, WGS만으로는 증폭된 서열이 ecDNA 위에 존재하는지, 아니면 HSR41, 42, 43처럼 염색체에 통합되는지 여부를 결정할 수 없습니다. 그 결과, 증폭의 공간적 맥락을 보존하는 방법들은 이러한 뚜렷한 상태의 생물학을 이해하는 데 필수적입니다.

지난 40년간 DNA 형광 제자리 하이브리다이제이션(DNA-FISH) 중상 확산은 ecDNA와 HSR 증폭 상태를 식별하고 구별하는 데 있어 금본위로 사용되어 왔습니다 42,44,45,46. 실제로 ecDNA와 HSR은 메타페이 기반 세포유전학적 분석을 통해 처음으로 확인되고 특성화되었습니다 7,47. 형광 탐침이 널리 사용되기 전에는 방사성 표지된 DNA 프로브를 이용한 현장 하이브리다이제이션이 수행되었으며, 이는 ecDNA와 HSR 시각화에도 사용되었습니다 48,49. WGS가 인기를 얻으면서 DNA-FISH 중기 확산은 점점 줄어들었습니다. 워크플로우의 많은 측면이 세포유학 문헌 전반에 흩어져 있으며, 최적화된 프로토콜은 일반적으로 개별 연구 그룹이나 세포유전학 연구실에서 유지되어 이 방법을 독점적으로 취급합니다50,51. 여기서는 단일 세포 수준에서 증폭 상태를 시각적으로 분해하기 위한 DNA-FISH 메타페이즈 확산 프로토콜을 설명합니다.

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프로토콜

모든 인간 세포 배양 절차는 기관 지침을 준수하여 수행되었습니다.

1. 콜세미드(N-메틸-N-디아세틸-콜히친)를 이용한 중기 세포 정지

  1. 약 2.0 × 106–2.0 × 107 개의 암세포 또는 기타 배양 세포로 시작합니다. 세포가 너무 적으면 중기 확산이 줄어들고, 세포가 너무 많으면 고정이 부족해질 수 있습니다.
  2. 실험 시스템에 적합한 콜세미드 배큐 시간을 결정합니다. 배양 시간은 얻는 중기 확산 수와 염색체 길이에 영향을 미치며, 최적의 조건은 세포 유형에 따라 다릅니다.
    참고: 잠복 기간이 짧아질수록 채취 시점에 중기 세포가 적게 정지됩니다. 더 긴 잠복 시간은 더 짧은 팔을 가진 더 응축된 염색체를 만들어 분석이 더 어려워집니다. 약 24시간의 두 배 성장 시간을 가진 암세포주에서는 45분에서 하룻밤까지 다양한 잠복 기간이 적절한 중기 확산을 생성합니다. 배열 시간이 느린 세포의 배양 시간을 최적화하세요. 2시간 배양이면 일반적으로 분석에 적합한 염색체 길이를 가진 충분한 중기 확산을 생성할 수 있습니다.
  3. 적절한 배양지에서 최종 농도인 10 μL/mL에 도달하기 위해 필요한 콜세미드 양을 계산합니다.
    참고: 중기 정지 최소 24시간 전에 세포를 전달하거나 시딩하여 로그 성장 상태를 유지하세요. 배양 세포가 70%–90% 합류할 때 콜세미드로 세포를 처리하세요.
  4. 콜세미드 스톡 용액을 멸균 초순수수로 1:1로 희석하세요. 적절한 양을 배양액에 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 45분에서 하룻밤 동안 배양합니다.

2. 수확 세포

  1. 신선한 카르노이 고정제(3:1 메탄올: 아세트산)를 준비하세요. 고정 시술 내내 고정제를 얼음 위에 보관하세요.
  2. 신선한 0.075 M KCl 용액을 준비하여 37 °C 물에 데웁니다.
  3. 세포를 알릿으로 수집하고 세포 수를 기록하세요. 이 값을 사용해 최종 부유 부피를 계산하세요.
    참고: 트립신화를 통해 부착 세포를 분리합니다. 현탁 세포를 15mL 원심분리관에 직접 옮깁니다. 콜세미드 및 콜세미드 함유 매체는 기관 유해 폐기물 지침에 따라 폐기됩니다.
  4. 세포를 PBS로 세척하세요.
  5. 세포를 10mL의 따뜻한 0.075 M KCl에 부드럽게 재현탁한 후 부드러운 역전(inversion)으로 혼합합니다. 이 저장성 치료는 세포를 부풀려 슬라이드 준비 중 염색체를 파열시키고 분산시킬 수 있게 합니다.
  6. 세포를 37°C 물욕에서 30분간 배양하세요.
  7. 얼음처럼 차갑게 차가운 카르노이 고정제(Carnoy's fixative) 2mL를 천천히 넣으면서 부드럽게 뒤집어 혼합하세요.
  8. 세포를 5분간 방치하세요.
  9. 500 × g 에서 실온(RT)에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
  10. 상환액을 조심스럽게 흡인하거나 피펫으로 제거하세요.
  11. 얼음처럼 차갑게 차가운 카르노이 고정액 10mL를 0.5mL 단위로 천천히 첨가하면서 각 첨가 후 부드럽게 섞으세요.
  12. 세포를 RT에서 10분간 방치하세요.
  13. 원심분리기는 650 × g 에서 RT 5분간 돌립니다.
  14. 2.10–2.13 단계를 두 번 반복하세요
  15. 마지막 세척 중에는 세포를 카르노이 고정액에 그대로 두세요.
    일시정지: 고정 셀 현탁을 −20 °C에 보관하거나 즉시 섹션 3으로 진행하세요.
    참고: 약 3× 10개의6 세포 미만을 포함하는 샘플의 경우, 더 큰 원뿔형 튜브 대신 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 고정을 수행하십시오. 0.075 M KCl과 카르노이 고정액의 부피를 10배로 줄이면서 모든 배큐 시간, 온도, 원심분리 조건을 유지하세요.

3. 테이블탑 드롭

  1. −20 °C에서 샘플을 채취하여 RT로 해동합니다.
  2. 원심분리기는 800 g × RT 7분간 돌립니다.
  3. 유리 슬라이드에 라벨을 붙이고 얼음 위에 올려놓으세요.
  4. 고정 전에 얻은 세포 수를 이용해 최종 농도는 약 5 ×10 6 cells/mL로 펠릿을 재현탁하는 데 필요한 카르노이 고정액의 부피를 계산합니다. 원심분리 후에는 피펫으로 상정액을 조심스럽게 제거하고, 계산된 고정액 부피를 펠릿 위에 남겨둡니다.
  5. P1000 피펫을 사용해 카노이 고정액에 고정된 세포를 재현탁하세요.
  6. 약 300 μL의 고정 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
  7. P200 피펫을 사용해 여러 번 피펫팅하여 샘플을 완전히 재현탁하세요.
  8. P200 피펫을 사용해 60 μL의 재현탁 세포를 흡인합니다.
  9. 피펫 팁을 얼음 위에 유리 슬라이드에서 약 1m 위에 대고 슬라이드 중앙을 겨냥하세요.
  10. 셀 현탁액 한 방울을 천천히 슬라이드에 뿌리세요.
    참고: 슬라이드 가장자리에 낙하 위치를 에탄올 저항성 마커로 표시하여 이후 단계에서 식별을 쉽게 하세요.
  11. 세포를 얼음 위에 10분간 말리세요.
  12. 슬라이드를 80°C의 슬라이드 인큐베이터 위에 10분간 올려놓으세요.
  13. 집게로 슬라이드를 빼서 식히세요.
  14. 10× 또는 20× 대물렌즈를 가진 위상 대비 현미경으로 슬라이드를 관찰하세요. 과도한 중복 없이 잘 분산된 여러 중기 확산의 존재를 확인하세요.

4. 미끄럼틀 전처리

  1. 세척 단계용 코플린 병을 준비하세요
    1. 각 시약을 신선하게 준비하세요: 70% 아세트산(40 mL), PBS(40 mL), PBS(45 mL), 70% 에탄올(40 mL), 85% 에탄올(40 mL), 100% 에탄올(40 mL).
  2. 유리 슬라이드를 70% 아세트산에 2분간 넣어 두세요.
  3. 유리 슬라이드를 PBS 40mL에 30초간 담가세요.
  4. 유리 슬라이드를 45mL PBS에 5분간 넣습니다.
  5. 유리 슬라이드를 70%, 85%, 100% 에탄올에 차례로 1분씩 탈수하세요.
  6. RT에서 슬라이드를 10분간 자연 건조하세요.

5. 탐사 준비

참고: 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 유전체 특이적 DNA-FISH 프로브를 사용하여 관심 있는 유전체 영역으로 하이브리드화합니다.

  1. 증폭된 유전자를 대상으로 한 프로브를 선택하세요. 제조사 지침에 따라 프로브와 하이브리다이제이션 버퍼를 해동하세요. 사용 전에 탐사선이 RT에 도달할 때까지 기다려 주세요.
  2. 각 유리 슬라이드마다 1 μL 프로브와 4 μL 하이브리다이저 버퍼를 포함한 프로브 혼합물을 준비합니다.
    참고: 최적의 프로브 농도는 제조사와 프로브에 따라 다를 수 있습니다. 여기서 명시된 농도는 이 연구에 사용된 프로브에 따라 최적화되었습니다. 하지만 각 새로운 유전자좌에 대해 프로브 농도를 최적화하세요.
  3. 유리 슬라이드의 각 드롭 위치 중앙에 프로브/하이브리다이제이션 버퍼 혼합물 5 μL을 적용합니다.
    참고: 프로브는 빛에 민감합니다. 남은 시술 동안 슬라이드를 어두운 서랍에 보관하여 작업 사이와 다른 슬라이드를 처리하는 동안 빛 노출을 최소화하세요.
  4. 샘플 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮어주세요.
  5. 커버슬립 가장자리는 고무 시멘트로 밀봉하세요.
  6. 유리 슬라이드를 습한 챔버에 넣으세요.
  7. 제조사 프로토콜에 따라 프로브를 하이브리드화하세요. 잡종 과정을 하룻밤(12–18시간) 진행시키세요.

6. 하이브리드화 후 세척, 카운터 스테인, 마운팅 및 이미징

  1. 세척 단계용 코플린 병을 준비하세요
    1. 각 시약을 신선하게 준비하세요: SSC 2× (40 mL), SSC 0.4× (40 mL), 에탄올 70% (40 mL), 에탄올 85% (40 mL), 100% 에탄올(40 mL), PBS (45 mL).
    2. SSC를 20× 스톡 용액(3 M NaCl, 0.3 M 시트레이트 나트륨, pH 7.0)으로 준비 및 저장하세요. 1L을 준비할 때, 175.3g NaCl과 88.2g 시트레이트나트륨을 초순수 1L에 녹입니다. 필요에 따라 2× SSC와 0.4× SSC 작업 용액을 준비하기 위해 재고를 희석하세요.
  2. 0.4× SSC 용액을 물욕에서 72 °C로 데우세요.
  3. 유리 슬라이드를 습한 챔버에서 분리하고 고무 시멘트를 조심스럽게 제거하세요.
  4. 유리 슬라이드를 2× SSC에 2분간 RT에서 놓고, 커버슬립을 조심스럽게 제거하세요.
  5. 유리 슬라이드를 미리 예열된 0.4× SSC 72°C에 2분간 넣습니다.
  6. 유리 슬라이드를 2× SSC에 1분간 RT에서 올려놓으세요.
  7. 유리 슬라이드를 70%, 85%, 100% 에탄올에 차례로 1분씩 탈수하세요.
  8. RT에서 슬라이드를 어두운 곳에서 10분간 자연 건조하세요.
  9. 1 mg/mL DAPI 1:1000을 PBS에 희석하여 최종 부피 1 mL로 만듭니다.
    참고: 이 알리코트는 최대 1주일간 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  10. 희석된 DAPI 10 μL을 각 유리 슬라이드에 표시된 드롭 위치에 피펫 주입합니다.
  11. DAPI 용액이 고르게 퍼지도록 샘플 위에 커버슬립을 조심스럽게 덮으세요.
  12. 슬라이드를 어둠 속에서 5분에서 10분 정도 부화시키세요.
  13. 유리 슬라이드를 PBS에 30초 동안 넣으세요.
  14. 커버 슬립을 벗기세요.
  15. 유리 슬라이드를 PBS에 2분간 넣으세요.
  16. 유리 슬라이드를 70%, 85%, 100% 에탄올에 각각 약 10초씩 잠시 담가서 탈수합니다.
  17. RT에서 슬라이드를 어두운 곳에서 10분간 자연 건조하세요.
  18. 각 유리 슬라이드에 15μL의 마운팅 매체를 넣고, 그 위에 커버슬립을 올려놓습니다.
  19. 장착 매체가 고르게 퍼지도록 한 후, 남은 부분은 부드럽게 닦아내세요.
  20. 커버슬립 가장자리는 매니큐어로 밀봉하세요.
  21. 어두운 곳에서 RT에서 15분간 마르게 하세요.
    일시정지: 슬라이드를 4°C에서 보관하여 장기 보관하세요.
  22. 슬라이드를 상상해 보세요.
    참고: 이미지는 60× 오일 침지 대물렌즈를 장착한 역형 형광 현미경으로 촬영되었습니다.
  23. 각 형광 채널마다 여러 개의 z-스택을 수집하여 메타상 확산 전체 깊이 전체에 걸쳐 신호를 포착합니다.
  24. 최대 우도 추정 알고리즘을 사용해 이미지 스택을 디컨볼링하여 신호 선명도를 높이고 초점 어긋난 형광을 줄입니다.
  25. 최종 이미지를 ImageJ에서 처리하고 분석한 후, 각 중상 확산에 대해 최적의 초점면을 선택한 후 후속 분석을 수행합니다.

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결과

이 프로토콜(그림 1B)은 세포유전학적 분석에 적합한 깨끗하고 잘 분산된 온전한 중기 염색체를 제공하며, 염색체와 DNA-FISH 신호가 형광 현미경으로 명확히 관찰됩니다. 저배율(10× 또는 20×)의 밝은 영역/위상 차이 현미경을 사용하는 것은 핵 파발과 염색체 분산 여부를 확인하는 중요한 품질 관리 단계입니다(그림 2). 성공적인 고정과 테이블탑 드롭은 슬라이드에 여러 번 눈에 띄는 염색체 폭발과 잘 분산된 중기 확산을 가져야 합니다. 고품질 중상 확산의 수확량은 세포주에 따라 다르며, 콜세미드 처리 기간에도 영향을 받습니다. 일반적인 기준으로서, 성공적인 준비는 일반적으로 20× 객관렌즈52를 사용하여 시야각당 중간에 약 3–5개의 세포가 터집니다. 비최적화 중기 확산은 종종 세포 ��집, 낮은 파열 핵 비율, 그...

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토론

잘 알려진 장점에도 불구하고, DNA-FISH 메타페이즈 확산 기술은 WGS 시대에는 저조하게 사용되고 있습니다. 증폭된 DNA의 물리적 조직은 기능적으로 중요하며, 이는 하류 생물학적 행동과 치료 반응에 영향을 미칠 수 있습니다 61,62,63,64. 국소 증폭된 종양유전자는 ecDNA나 HSR 내에 존재할 수 있으며, 이 두 증폭 상태는 기능적으로 동등하지 않습니다14, 65, 66, 67. 예를 들어, ecDN...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 NIH R00HG011467과 CPRIT RR23004 G.S.E.의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트의 영상 촬영은 NIH의 자금 지원을 받아 베일러 의과대학의 통합 현미경 코어(Integrated Microscopy Core)의 지원을 받았습니다(P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). 저자들은 초기에 조언을 해준 파벨 스탄키에비치 박사에게 감사를 표한다. 저자들은 또한 GBM39ec 및 GBM39hsr 세포주를 제공한 스탠퍼드 대학교의 Paul Mischel 박사에게 감사를 표합니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15-mL 원추형 원심분리기모든 출처NA원심분리. 
15-mL 원추형 튜브모든 출처NA세포 수집.
200 증류 에탄올모든 출처NA세척 단계. 
초산, 결정, 99.7%Millipore Sigma695092Carnoys 고정액 및 슬라이드 세척 단계.
안티페이드 마운팅 미디어FisherScientificNC9265087완료된 슬라이드 준비 후 슬라이드 장착
진공 배출구가 있는 생물학적 안전 캐비닛모든 출처NA화학 물질 저장.
콜세미드 (N-메틸-N-데아세틸-콜키신)Millipore Sigma10295892001튜불린 결합, 세포를 중기에 체결.
콥린 항아리모든 출처NA세척 단계. 
DAPI (4′,6-디아미디노-2-페닐인돌)Milipore SigmaD8417-1MG형광 DNA 염색.
EGFR/CON7 FISH 프로브 Empire GenomicsEGFR-CHR07염색체 특이적 형광 프로브. 
엘머'스 고무 시멘트모든 출처NA오버나이트 프로브 하이브리드화 중 커버슬라이드를 제자리에 유지.
에탄올 저항성 영구 마커모든 출처NA슬라이드 라벨링.
형광 현미경모든 출처NA슬라이드 이미징. 
유리 커버 슬립, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780슬라이드에서의 프로브 하이브리드화.
세정된 유리 슬라이드VWR48311-703중기 스프레드를 떨어뜨리고 DNA-FISH를 수행.
가습된 CO2 인큐베이터모든 출처NA생체 세포 배양.
하이브리드화 버퍼Empire GenomicsHyb-Buffer프로브와 함께 사용되는 버퍼. 
얼음 통모든 출처NACarnoy's 고정액을 차갑게 유지. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640G고정 전 세포 부풀리기. 
메탄올, 99.9%, HPLC 등급Millipore Sigma1060351000Carnoys 고정액을 위해. 
마이크로센트리퓨지모든 출처NA원심분리. 
마이크로센트리퓨지 튜브모든 출처NA고정 중 세포 및 프로브 준비를 위해. 
MYC / SE 8 프로브LeicaKI-10106염색체 특이적 형광 프로브. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023세척 단계. 
위상차 현미경모든 출처NA떨어뜨린 후 즉시 중기 스프레드 이미징
피펫 팁모든 출처NA피펫팅.
나트륨 염화물Millipore SigmaS9888SSC 버퍼를 위해.
나트륨 구연산염Millipore Sigma567446SSC 버퍼를 위해.
무균 초순수모든 출처NA세척 단계. 
ThermoBrite 프로그래머블 슬라이드 인큐베이터모든 출처NA슬라이드 배양.
집게모든 출처NA슬라이드 세척 단계. 
수욕모든 출처NAKCl 배양을 위해. 
```

참고문헌

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