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방법 논문

일차 마우스 CD8+ T 세포 활성화 및 분화에서의 TCR 신호 강도와 지속 시간: 표준화된 인 비트로(In Vitro) 접근법

150 조회수

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DOI:

10.3791/71979

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2026년 8월 25일

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 일차 마우스 나이브(naive) CD8 T 세포를 활성화하는 체계적인 방법을 설명합니다.+ 단계별 TCR 자극법을 이용한 T 세포 분석으로, CD8 T 세포의 증식, 활성화 및 사이토카인 생성에 대한 종합적인 분석 가능+ 서로 다른 TCR 신호 강도에 따른 T 세포.

초록

T 세포 수용체(TCR) 신호의 강도와 지속 시간은 CD8⁺ T 세포의 활성화, 증식 및 기능적 분화를 결정짓는 핵심 요소입니다. 그러나 다양한 TCR 신호 입력이 T 세포의 운명을 어떻게 결정하는지 체계적으로 비교하는 표준화된 in vitro 모델은 여전히 제한적입니다. 본 연구는 플레이트에 코팅된 anti-CD3와 수용성 anti-CD28을 사용하고 interleukin-2 (IL-2)를 보충하여 primary mouse T 세포를 in vitro에서 활성화하는 재현 가능한 방법을 제시하며, anti-CD3 농도(신호 강도)와 자극 시간(신호 지속 시간)의 조절이 T 세포의 활성화 결과에 어떠한 영향을 미치는지 조사합니다. 우리는 C57BL/6 마우스에서 naive T 세포를 분리한 후, 다양한 anti-CD3 농도(0.1–10 µg/mL)와 시간(6–48 h)에 걸쳐 자극을 주는 프로토콜을 상세히 기술합니다. 우리는 mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1) 활성의 지표인 세포 내 인산화 S6 ribosomal protein (p-S6)을 통해 TCR 유도 초기 신호 전달을 평가하기 위해 유세포 분석을 수행하였으며, 이후 표면 활성화 마커(CD69, CD25, ICOS, PD-1), violet proliferation-tracking dye (CTV) 희석을 통한 세포 증식, 그리고 기능적 분화의 지표인 작동 분자 발현(Granzyme B, TNF-α)을 포함한 하위 이벤트를 평가했습니다. 이 방법은 재현 가능한 T 세포 자극을 수행하기 위한 명확한 단계별 시각적 가이드를 제공하여, 연구자들이 특정 TCR 신호 파라미터가 T 세포의 운명 결정을 어떻게 유도하는지 분석할 수 있게 합니다. 이러한 접근 방식은 T 세포 활성화 및 분화의 기전 연구를 지원할 뿐만 아니라, 입양 면역 요법을 위한 T 세포 컨디셔닝 및 in vitro 프라이밍 분석을 최적화하기 위한 플랫폼을 제공합니다. 비디오 시연과 상세한 프로토콜 설명을 통합함으로써, 본 프로토콜은 T 세포 면역학 연구의 방법론적 투명성과 재현성을 향상시킬 것입니다.

서론

T 세포는 병원체와 종양에 대한 보호 면역 반응에 필수적입니다. 나이브 T 세포는 장기적인 생존과 지속성을 유지하기 위해 정지 상태(quiescent state)로 활발하게 유지됩니다1. 항원 자극을 받으면 T 세포는 정지 상태에서 벗어나 클론 확장 및 작동 세포 분화를 거칩니다2. T 세포 수용체(TCR) 신호 전달은 적응 면역 반응을 개시하고 조절하는 핵심 과정 역할을 합니다3. 항원 제시 세포(APC) 표면에 제시된 펩타이드-주요 조직 적합성 복합체(pMHC) 분자를 특이적으로 인식하면 일련의 신호 전달 사건이 유발되어, T 세포의 클론 확장과 기능적 분화가 촉진됩니다4,5,6.

항원 친화도, 결합력 및 농도를 포함한 주요 요인에 의해 결정되는 TCR 자극의 강도는 T 세포 활성화의 정도, 이펙터 기능의 획득, 그리고 서로 다른 이펙터 또는 기억 T 세포 하위 집단으로의 분화 경로를 결정하는 데 결정적인 역할을 합니다7,8,9. TCR 의존적 T 세포 활성화를 연구하기 위한 현재의 인비트로(in vitro) 모델은 주로 플레이트 결합 또는 비드 접합 anti-CD3 및 anti-CD28 항체를 사용하여 TCR 결합과 공동 자극 신호를 동시에 제공합니다10,11. 이러한 시스템이 널리 사용되고는 있지만, 일반적으로 단일하며 종종 포화 농도인 anti-CD3 항체만을 사용하므로, 적정된 자극 구배를 통해 얻을 수 있는 TCR 신호 강도의 동적 범위를 포착하기보다는 T 세포 활성화에 대한 단순한 '전부 아니면 전무(all-or-nothing)' 식의 이분법적 비교만을 가능하게 합니다12,13.

본 프로토콜은 정량된 anti-CD3 농도 구배(0.1–10 µg/mL)와 일정 농도의 anti-CD28(1 µg/mL)을 사용하여, 단계별 TCR 신호 강도가 일차 마우스 CD8+ T 세포의 활성화, 증식 및 기능적 표현형을 어떻게 조절하는지 체계적으로 평가할 수 있는 표준화되고 재현 가능한 in vitro 시스템을 제공합니다. 이 접근 방식은 다매개변수 유세포 분석법을 중심으로 하며, 6시간에서 48시간까지의 시간 경과에 따라 mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1) 활성의 판독값인 세포 내 인산화 S6 ribosomal protein(p-S6)을 통한 상위 신호 전달과, CTV 희석으로 추적하는 증식, 활성화 표면 마커(CD69, CD25, inducible T-cell costimulatory [ICOS], programmed cell death protein 1 [PD-1]), 그리고 작동 분자 발현(Granzyme B, tumor necrosis factor-alpha [TNF-α])을 포함한 하위 세포 결과를 모두 포착합니다.

본 프로토콜은 플레이트에 결합된 anti-CD3 항체의 농도 구배를 이용하여 자극 강도를 정밀하게 조절함으로써, 생리적 조건에서 관찰되는 T 세포 수용체(TCR) 결합 친화도의 차이를 모사합니다. 이 방법은 TCR 가교 결합(crosslinking)에서 높은 효율을 보이며, 휴지기 일차 T 세포의 강력한 활성화를 유도합니다. 표준화된 코팅 절차를 통해 플레이트 표면에 항체가 균일하게 분포되도록 하여, 동일 배치 내 세포 간의 일관된 자극과 우수한 실험 재현성을 확보하였습니다. 이러한 방식은 T 세포 활성화를 위한 비용 효율적이고 조작이 간편한 접근법을 제공합니다.

하지만 이 접근 방식의 특정 한계점들을 인정해야 합니다. anti-CD3/CD28 항체에 의해 매개되는 자극은 생체 내(in vivo) 생리학적 상황과는 현저히 다릅니다. T 세포 활성화를 평가하기 위해 작용제성 anti-CD3 및 anti-CD28 항체만을 사용하는 실험 방법은 활성화에 대한 효과적인 판독값을 제공할 수 있지만, 생리학적 조건에서 발생하는 항원 제시 세포와 T 세포 간의 상호작용 및 공동 자극 미세환경을 완전히 재현하지는 못합니다14.

이러한 제한점에도 불구하고, 본 프로토콜은 TCR 신호 강도에 따른 T 세포 반응을 조사하기 위한 가치 있고 접근 가능한 도구로서 체계적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공하며, 더욱 복잡한 항원 특이적 모델을 보완할 수 있습니다.

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프로토콜

본 연구의 모든 동물 실험은 제3군 의과대학의 동물실험윤리위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 시약 및 플레이트 준비

  1. 멸균된 PBS를 사용하여 0.1, 0.5, 1, 5, 10 µg/mL 농도의 플레이트 결합용 anti-CD3를 준비합니다.
  2. 평평한 바닥의 96-well 플레이트의 각 well에 anti-CD3 코팅 용액 50 µL를 넣습니다.
  3. 실링 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  4. 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 세포를 추가하기 전에 각 well을 200 µL의 멸균된 PBS로 2회 세척합니다.

2. 마우스 비장에서 naive CD8+ T 세포의 분리

  1. 6~8주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.에서 구매)를 선택하고, CO2 흡입 후 경추 탈골법으로 안락사시킨다. 마우스는 12시간 명/암 주기 하에 식음료를 자유롭게 섭취할 수 있는 특정 병원균 제거(SPF) 조건에서 사육한다. 독립적인 실험당 최소 3마리의 마우스를 사용한다.
  2. 수술용 가위로 복막을 조심스럽게 절개하여 비장을 노출시킨 후, 포셉을 사용하여 비장을 잡아 수확하고 2% fetal bovine serum(FBS)가 첨가된 냉각된 RPMI 1640(R2)이 들어 있는 수집 접시에 넣는다. 세포 분리 전까지 접시를 얼음 위에 보관한다.
    참고: 모든 동물 사체와 세포 배양 폐기물은 지정된 생물학적 위험 폐기물 봉투에 수집하고, 폐기 전 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브 멸균한다.
  3. 수집 접시에서 비장을 꺼내 3 mL의 1 × ammonium-chloride-potassium (ACK) 용해 버퍼가 담긴 60 mm 접시로 옮긴다.
  4. 3 mL 시린지의 플런저를 사용하여 비장을 70 µm 세포 스트레이너로 부드럽게 으깨어 단일 세포 현탁액을 준비한다.
  5. 현탁액을 상온(RT)에서 1분 동안 배양한 후, 냉각된 R2 배지 3 mL를 추가하여 ammonium-chloride-potassium (ACK) 용해 버퍼를 중화시킨다.
  6. 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 4 °C에서 500 × g로 5분 동안 원심 분리한다.
  7. 원심 분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 펠렛을 10 mL의 유세포 분석 염색 버퍼(2% FBS 포함 PBS)에 재현탁한다.
  8. 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 새 15 mL 원추형 튜브로 여과한 다음, 4 °C에서 500 × g 로 5분 동안 다시 원심 분리한다.
    참고: 기능 분석을 위한 세포 생존력을 유지하기 위해 유세포 분석 염색 버퍼에서 sodium azide는 제외해야 한다. 모든 샘플은 4 °C로 유지하고 즉시 분석해야 한다.
  9. 상층액을 흡입하여 제거하고, 마우스 비장당 200 µL의 비오틴화 항체 칵테일(anti-CD16/32 (Fc block), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 및 anti-F4/80 포함)에 세포 펠렛을 재현탁한다.
  10. 철저한 혼합을 위해 5분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어주며 얼음 위에서 25분 동안 배양한다.
  11. 유세포 분석 염색 버퍼를 대량으로 사용하여 세포를 세척하고, 500 × g 로 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 버린다.
  12. 비오틴화 항체 칵테일에 사용한 것과 동일한 부피의 유세포 분석 염색 버퍼로 펠렛을 재현탁하고, 해당 부피의 절반만큼 streptavidin 코팅 마그네틱 비드를 추가한 뒤, 5분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어주며 얼음 위에서 15분 동안 배양한다.
  13. 튜브를 짧게 원심 분리하고 마그네틱 스탠드에 2~3분 동안 세워둔 후, 상층액(농축된 naive CD8+ T 세포)을 새 15 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮긴다.
  14. 수집된 세포를 유세포 분석 염색 버퍼로 한 번 세척하고, 다시 500 × g 로 5분 동안 원심 분리한다.
  15. 상층액을 버리고, 이후 응용 분석을 위해 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640(R10)에 펠렛을 재현탁한다.

3. 증식 추적을 위한 보라색 증식 추적 염료(CTV) 표지

  1. 사용 직전에 2 × 신선한 CTV 작동 용액(10 µM)을 준비합니다. 5 mM CTV 스톡 용액(dimethyl sulfoxide [DMSO] 내)을 볼텍싱하여 완전히 혼합한 후, 멸균 PBS로 희석하여 최종 농도가 10 µM이 되도록 합니다.
    주의: DMSO는 독성 화합물의 피부 흡수를 촉진하므로, DMSO로 준비된 CTV 스톡 용액은 흄 후드 내에서 니트릴 장갑을 착용하고 취급하십시오. 흡입 및 피부 접촉을 피하십시오.
  2. 분리된 naive CD8+ T 세포의 절반을 미리 냉각한 PBS에 8 × 107 cells/mL 밀도로 재현탁합니다.
  3. 세포 현탁액에 동일한 부피의 2 × CTV 작동 용액(10 µM)을 빠르게 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합하여, 최종 CTV 농도가 5 µM이 되도록 합니다.
  4. 세포를 실온의 암소에서 20분 동안 배양하며, 철저한 혼합을 위해 5분마다 튜브를 가볍게 반전시킵니다.
  5. 세포에 5배 부피의 배양 배지(최소 10% FBS 포함)를 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 배양하여 결합되지 않은 염료를 제거합니다.
  6. 세포를 500 × g에서 5분 동안 원심 분리하고, 펠릿을 anti-CD28(최종 농도: 1 µg/mL) 및 IL-2(최종 농도: 10 ng/mL)가 보충되어 미리 가온된 신선한 완전 배지 R10에 재현탁합니다.
  7. 미리 코팅된 96-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 250 µL(6 × 105 cells 포함)를 첨가합니다.
  8. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최대 48시간 동안 배양합니다.

4. 유세포 분석법을 통한 CTV 검출

  1. 6, 36, 48시간에 세포를 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 수집한다. 500에서 원심분리한다. × g 5분 동안 반응시키고 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척합니다.
  2. 표면 염색을 위해 세포를 다음의 성분과 함께 배양하십시오. 50 µL anti-CD8, 고정 가능 생존 염료(fixable viability dye) 및 anti-CD44를 포함하는 항체 칵테일을 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 처리함 암소에서.
    참고: 형광 표지 항체가 포함된 모든 상층액은 오염 제거를 위해 0.5% 차아염소산나트륨이 첨가된 지정 폐기물 용기에 수집하고, 기관의 생물학적 위험 폐기물 처리 규정에 따라 폐기하십시오.
  3. 세포를 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 다음 용액에 재현탁하십시오. 200 µL 유세포 분석기 데이터 수집을 위한 유세포 분석 염색 완충액.
  4. 3개의 레이저가 장착된 유세포 분석기(flow cytometer)로 시료를 분석하십시오. 보정(compensation) 매개변수를 설정하기 위해 염색된 세포를 사용하여 단일 염색 대조군 튜브를 준비하십시오.
  5. 다음의 게이팅 전략을 적용하십시오: 전방 산란광(FSC) 대 측방 산란광(SSC) 게이팅으로 데브리스(debris)를 제외하고, 싱글렛(singlet) 게이팅으로 더블렛(doublet)을 제거하며, 생존 세포(고정 가능 생존 염색 시약 음성)인 CD8+ 세포를 선택합니다.+ 분석용 T 세포.
  6. 최소 1개를 수집하십시오. × 104 gated CD8 (게이팅된 CD8)+ 샘플당 T 세포 이벤트 수. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 증식 분석 모듈을 사용하여 한 번 이상의 분열을 거친 세포의 비율을 계산하십시오.

5. 활성화 및 신호 전달을 위한 표면 및 세포 내 염색

  1. 나이브 CD8+ T 세포의 나머지 절반을 1 µg/mL의 anti-CD28과 10 ng/mL의 IL-2가 첨가된 R10에 2.4 × 106 cells/mL 농도로 재현탁한다.
  2. 미리 코팅된 96-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 250 µL(6 × 105 cells)를 분주한다.
  3. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최대 48시간 동안 배양한다.
  4. 지정된 시간대(6, 10, 12, 24, 36시간)에 세포를 96-well round-bottom 플레이트에 수집한다.
    참고: 6시간 시점은 초기 TCR 신호전달(phospho-S6) 및 CD69를 포착하기 위함이며, CD69는 전체 키네틱스를 파악하기 위해 12, 24, 36시간에도 추가로 분석한다. CD25, PD-1, ICOS는 10, 12, 24, 36시간에 모니터링하며, 48시간 시점은 증식(섹션 4) 및 사이토카인 검출(섹션 6)을 위해 남겨둔다.
  5. 500 × g에서 1분간 원심분리하고 세포 펠릿을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁한다.
  6. 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상층액을 제거한다. 세포를 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척한다.
  7. 표면 염색을 위해 anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS 및 고정 가능 생존 염료(fixable viability dye)가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 얼음 위 암소에서 30분 동안 반응시킨다.
  8. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세포를 유세포 분석 염색 완충액으로 3회 세척한다.
  9. 세포 펠릿을 200 µL의 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 재현탁하고, 실온(RT)의 암소에서 15분 동안 고정한다.
    주의: 증기 흡입을 방지하기 위해 파라포름알데히드를 사용하는 모든 단계는 흄 후드 내에서 수행한다. 고정액이 포함된 모든 액체 폐기물은 유해 화학물질 폐기용으로 표시된 별도의 용기에 수집한다.
  10. 500 × g에서 1분간 원심분리하고 유세포 분석 염색 완충액으로 1회 세척한다.
  11. 5 × lyse/fix 완충액을 실온에서 미리 데우고 증류수를 사용하여 1 × 작업 용액을 준비한다.
  12. 각 웰에 작업 용액(1 × lyse/fix 완충액) 200 µL를 넣고, 세포를 실온의 암소에서 30분 동안 반응시킨다.
  13. 인산화 에피토프(phospho-epitope) 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 2회 세척한다. 펠릿을 인산화 에피토프 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 재현탁하고 실온의 암소에서 10분 동안 반응시킨다.
  14. 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상층액을 제거한다.
  15. 세포 내 염색을 위해 anti-p-S6가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 실온의 암소에서 60분 동안 반응시킨다.
  16. 세포를 인산화 에피토프 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 3회 세척한다.
  17. 2차 항체 염색을 위해 anti-rabbit 2차 항체가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 얼음 위 암소에서 30분 동안 반응시킨다.
  18. 세포를 인산화 에피토프 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 3회 세척하고, 유세포 분석 염색 완충액으로 1회 세척한다.
  19. 세포 펠릿을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁하고 동일한 유세포 분석기로 샘플을 획득한다.
  20. 섹션 4.5에 기술된 것과 동일한 게이팅 전략을 적용하여 샘플당 최소 1 × 104개의 CD8+ T 세포를 수집한다.
  21. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 각 마커의 중앙 형광 강도(MFI)를 분석한다.

6. 세포 내 사이토카인 차단 및 검출

  1. 수확 5시간 전에 PMA (50 ng/mL), ionomycin (1 µg/mL), 단백질 수송 억제제 (monensin) (1:1000) 및 단백질 수송 억제제 (brefeldin A 기반) (1:1000)가 첨가된 신선한 R10을 웰당 100 µL씩 첨가한다. 가볍게 섞어 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 사이토카인 분비를 차단하고 세포 내에 축적되도록 한다.
  2. 원하는 시간대에 세포를 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 수집한다.
  3. 500 × g에서 1분간 원심분리하고 세포 펠렛을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁한다.
  4. 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상청액을 흡입하여 제거한다. 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척한다.
  5. 표면 마커 염색을 위해 anti-CD44, anti-CD8 및 고정 가능 생존 염색 시약이 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한다.
  6. 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 유세포 분석 염색 완충액으로 3회 세척한다.
  7. 고정 및 투과화 용액 200 µL를 첨가하여 세포를 투과화하고 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한다.
    주의: 증기 흡입을 방지하기 위해 고정/투과화 용액 (paraformaldehyde 포함)을 사용하는 모든 단계는 흄후드 내에서 수행한다. 고정제가 포함된 모든 액체 폐기물은 유해 화학 물질 폐기용으로 표시된 별도의 용기에 수집한다.
  8. 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상청액을 유해 화학 폐기물통에 버린다.
  9. 1 × 투과화/세척 완충액으로 세포를 3회 세척한다.
  10. 세포 내 사이토카인 염색을 위해 anti-TNF-α 및 anti-Granzyme B가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한다.
  11. 1 × 투과화/세척 완충액으로 세포를 3회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 마지막으로 유세포 분석 염색 완충액으로 1회 세척한다.
  12. 세포 펠렛을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁하고 동일한 유세포 분석기로 시료를 획득한다.
  13. 섹션 4.5에 설명된 것과 동일한 게이팅 전략을 적용하여 샘플당 최소 1 × 104개의 CD8+ T 세포를 수집한다. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 각 마커의 양성 백분율과 MFI를 분석한다.

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결과

서로 다른 강도의 anti-CD3 자극이 T 세포 활성화에 미치는 영향을 조사하기 위해, 마우스 비장세포를 분리하고 CD8+ T 세포를 정제하여 인 비트로(in vitro) 배양한 후, T 세포 활성화 분석 및 유세포 분석을 수행하였습니다. 데이터 분석을 위해, 먼저 FSC-A와 SSC-A의 조합을 사용하여 림프구를 게이팅(gating)하였으며, 이어서 FSC-H와 FSC-W를 통해 싱글렛(singlets)을 게이팅하고, 그 다음 SSC-H와 SSC-W를 사용하여 게이팅하였습니다. 이후 하위 분석을 위해 CD8과 고정 가능한 생존 염색(fixable viability dye)을 조합하여 살아있는 CD8+ T 세포를 추가로 게이팅하였습니다(그림 1A).

플레이트 결합 항체 자극 시스템이 in vitro에서 T 세포를 효과적으로 활성화하는지 검증하기 위해, 우리는 mTORC1 활성의 잘 알려...

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토론

본 프로토콜은 TCR 신호 강도에 따른 T 세포 반응을 연구하기 위한 체계적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 단계별 anti-CD3 코팅 전략을 통해 자극 강도를 정밀하게 제어함으로써, 연구자는 TCR 입력값과 하위 기능적 결과 사이의 정량적 관계를 분석할 수 있습니다. 주요 절차적 핵심 사항으로는 naive CD8⁺ T 세포의 정제, anti-CD3 코팅 농도의 정밀한 구배 제어, 그리고 웰당 세포 수의 엄격한 표준화가 포함됩니다. 실험 간 데이터 비교 가능성을 보장하기 위해, 일관된 기기 설정, 보정 매트릭스 및 게이팅 전략을 사용하고, 가능한 경우 동일한 항체 롯트와 고정 가능 생존 염색약 배치를 사용할 것을 권장합니다. 이러한 핵심 단계들의 신뢰도는 T 세포 표현형 역동성에 미치는 다양한 TCR 자극 강도의 영향을 실험 결과가 정확하게 반영할 수 있는지 여부를 직접적으로 결정합니다.

본 프로토콜에서는 anti-CD3 항체를 배양 플레이트 표면에 직접 코팅하여 TCR-C...

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공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 중국 국가자연과학재단(No. T2394504, LY)과 Lilin Ye 수석 과학자 연구 시작 펀드(No. R2045, LY)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL conical tubeLabgicCD-002-15A멸균된 15 mL 원추형 원심분리 튜브
4% paraformaldehydeBeyotimeP0099염색 전 세포 보존을 위한 4% 수성 고정액
60 mm dishLabgic1221160 mm 세포 배양 접시
70 µm cell strainerLabgicBS-70-CS단일 세포 현탁액 준비용 70 µm 나일론 메쉬 스트레이너
96-well round-bottom plateBeyotimeFPT016세포 배양 및 염색용 96-well 라운드 바텀 플레이트
ACK lysis bufferBeyotimeC3702염화암모늄 기반 적혈구 용해 완충액
anti-mouse CD25Biolegend101910유세포 분석용 APC-접합 anti-mouse CD25 항체, clone 3C7
anti-mouse CD28Bio X CellBE0015-1T세포 공동 자극용 정제된 anti-mouse CD28 항체, clone 37.51
anti-mouse CD3Bio X CellBP0001-1T세포 활성화용 정제된 anti-mouse CD3ε 항체, clone 145-2C11
anti-mouse CD69BD Biosciences553237활성화 마커 염색용 PE-접합 anti-mouse CD69 항체
anti-mouse CD8Invitrogen17-0081-82유세포 분석용 APC-접합 anti-mouse CD8a 항체, clone 53-6.7
anti-mouse GZMBBiolegend372212세포 내 유세포 분석용 PerCP/Cyanine5.5-접합 anti-human/mouse granzyme B 항체, clone QA16A02
anti-mouse ICOSBD Biosciences565886유세포 분석용 BV421-접합 anti-mouse ICOS (CD278) 항체
anti-mouse PD-1Biolegend135220유세포 분석용 BV605-접합 anti-mouse PD-1 (CD279) 항체, clone 29F.1A12
anti-mouse TNF-αInvitrogen46-7321-82세포 내 유세포 분석용 PerCP-eFluor 710-접합 anti-mouse TNF-α 항체, clone MP6-XT22
anti-mouse/human CD44Biolegend103030유세포 분석용 PE/Cyanine7-접합 anti-mouse/human CD44 항체, clone IM7
biotin anti-mouse CD11bBiolegend101204계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD11b 항체
biotin anti-mouse CD11cBiolegend117304계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD11c 항체
biotin anti-mouse CD16/32Biolegend156604계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD16/32 항체
biotin anti-mouse CD19Biolegend115504계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD19 항체
biotin anti-mouse CD4Biolegend100508계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD4 항체
biotin anti-mouse CD44Biolegend103004계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD44 항체
biotin anti-mouse CD45RBiolegend103204계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD45R/B220 항체
biotin anti-mouse CD49bInvitrogen13-5971-85계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD49b 항체
biotin anti-mouse F4/80Biolegend123106계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse F4/80 항체
biotin anti-mouse Ly6GBiolegend127604계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse Ly6G 항체
biotin anti-mouse NK1.1Biolegend108704계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse NK1.1 항체
biotin anti-mouse TER119Biolegend116204계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse TER-119 항체
C57BL/6 miceSibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/A실험에 사용된 6–8주령 수컷 마우스
Carbon dioxide (CO2) incubatorThermo Fisher3120포유류 세포 배양용 가습 CO2 인큐베이터
CellTrace Violet dyeInvitrogenC34557세포 증식 모니터링용 보라색 형광 염료
DMSOSigmaD2650디메틸 설폭사이드; 시약 스톡 용액 준비용 용매
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Alexa Fluor 488-접합 donkey anti-rabbit IgG (H+L) 2차 항체
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500세척 및 시약 준비용 Dulbecco’s 인산염 완충 식염수
Fetal bovine serum (FBS)GibcoC11995500BT포유류 세포 배양 배지용 혈청 보충제
Fixable Viability DyeInvitrogen65-0865-14유세포 분석 중 사멸 세포 제외를 위한 고정 가능 생존 염료
Fixation and Permeabilization SolutionBD Biosciences51-2090KZ세포 내 염색용 고정 및 투과화 시약
Flat-bottom 96-well plateLabgic11510세포 배양 및 자극 분석용 96-well 플랫 바텀 플레이트
Flow cytometerBD BiosciencesLSRFortessa-3 laser다색 형광 획득을 위한 3-레이저 유세포 분석기
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZ세포 내 사이토카인 염색용 Brefeldin A 기반 단백질 수송 억제제
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ세포 내 사이토카인 염색용 Monensin 기반 단백질 수송 억제제
Ionomycin calcium saltSigmaI3909-1ML세포 자극을 위해 PMA와 함께 사용되는 칼슘 이오노포어
Perm/Wash BufferBD Biosciences51-20911KZ세포 내 염색용 투과화 및 세척 완충액
Phosflow Lyse/Fix BufferBD Biosciences558049적혈구 용해와 백혈구 고정을 동시에 수행하는 5× 완충액
Phosflow Perm/Wash Buffer IBD Biosciences557885세포 내 인산화 단백질 염색용 메탄올 기반 투과화 완충액
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling4858Sphospho-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236)에 대한 토끼 단일클론 항체, clone D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGPhorbol 12-myristate 13-acetate; ex vivo 세포 자극용 활성제
Recombinant Mouse Interleukin-2Gibco200-02-50UGT세포 배양 및 증식을 위한 재조합 마우스 인터루킨-2
RPMI 1640Life-LabAC01L064포유류 세포 배양용 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지
Streptavidin Magnetic BeadsBEAVER22307비오틴-항체 기반 세포 제거용 스트렙타비딘 코팅 자성 비드
Flow cytometry staining bufferNot specifiedNot specified유세포 분석 염색 완충액; 공급업체 또는 제조법 미제공
Parafilm M laboratory filmAmcorPM996플레이트, 튜브 및 배양 용기 밀봉용 유연한 자가 밀봉 실험실 필름
Lyse/Fix BufferBD Biosciences558049적혈구 용해와 백혈구 고정을 동시에 수행하는 5× 완충액
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1유세포 분석 데이터 분석용 소프트웨어, 버전 10.8.1

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CD8+ T 세포인 비트로(in vitro) 자극Anti-CD3 자극Anti-CD28 공동 자극유세포 분석나이브 T 세포 분리mTORC1 활성T 세포 분화

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