본 프로토콜은 일차 마우스 나이브(naive) CD8 T 세포를 활성화하는 체계적인 방법을 설명합니다.+ 단계별 TCR 자극법을 이용한 T 세포 분석으로, CD8 T 세포의 증식, 활성화 및 사이토카인 생성에 대한 종합적인 분석 가능+ 서로 다른 TCR 신호 강도에 따른 T 세포.
방법 논문
일차 마우스 CD8+ T 세포 활성화 및 분화에서의 TCR 신호 강도와 지속 시간: 표준화된 인 비트로(In Vitro) 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
T 세포 수용체(TCR) 신호의 강도와 지속 시간은 CD8⁺ T 세포의 활성화, 증식 및 기능적 분화를 결정짓는 핵심 요소입니다. 그러나 다양한 TCR 신호 입력이 T 세포의 운명을 어떻게 결정하는지 체계적으로 비교하는 표준화된 in vitro 모델은 여전히 제한적입니다. 본 연구는 플레이트에 코팅된 anti-CD3와 수용성 anti-CD28을 사용하고 interleukin-2 (IL-2)를 보충하여 primary mouse T 세포를 in vitro에서 활성화하는 재현 가능한 방법을 제시하며, anti-CD3 농도(신호 강도)와 자극 시간(신호 지속 시간)의 조절이 T 세포의 활성화 결과에 어떠한 영향을 미치는지 조사합니다. 우리는 C57BL/6 마우스에서 naive T 세포를 분리한 후, 다양한 anti-CD3 농도(0.1–10 µg/mL)와 시간(6–48 h)에 걸쳐 자극을 주는 프로토콜을 상세히 기술합니다. 우리는 mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1) 활성의 지표인 세포 내 인산화 S6 ribosomal protein (p-S6)을 통해 TCR 유도 초기 신호 전달을 평가하기 위해 유세포 분석을 수행하였으며, 이후 표면 활성화 마커(CD69, CD25, ICOS, PD-1), violet proliferation-tracking dye (CTV) 희석을 통한 세포 증식, 그리고 기능적 분화의 지표인 작동 분자 발현(Granzyme B, TNF-α)을 포함한 하위 이벤트를 평가했습니다. 이 방법은 재현 가능한 T 세포 자극을 수행하기 위한 명확한 단계별 시각적 가이드를 제공하여, 연구자들이 특정 TCR 신호 파라미터가 T 세포의 운명 결정을 어떻게 유도하는지 분석할 수 있게 합니다. 이러한 접근 방식은 T 세포 활성화 및 분화의 기전 연구를 지원할 뿐만 아니라, 입양 면역 요법을 위한 T 세포 컨디셔닝 및 in vitro 프라이밍 분석을 최적화하기 위한 플랫폼을 제공합니다. 비디오 시연과 상세한 프로토콜 설명을 통합함으로써, 본 프로토콜은 T 세포 면역학 연구의 방법론적 투명성과 재현성을 향상시킬 것입니다.
서론
T 세포는 병원체와 종양에 대한 보호 면역 반응에 필수적입니다. 나이브 T 세포는 장기적인 생존과 지속성을 유지하기 위해 정지 상태(quiescent state)로 활발하게 유지됩니다1. 항원 자극을 받으면 T 세포는 정지 상태에서 벗어나 클론 확장 및 작동 세포 분화를 거칩니다2. T 세포 수용체(TCR) 신호 전달은 적응 면역 반응을 개시하고 조절하는 핵심 과정 역할을 합니다3. 항원 제시 세포(APC) 표면에 제시된 펩타이드-주요 조직 적합성 복합체(pMHC) 분자를 특이적으로 인식하면 일련의 신호 전달 사건이 유발되어, T 세포의 클론 확장과 기능적 분화가 촉진됩니다4,5,6.
항원 친화도, 결합력 및 농도를 포함한 주요 요인에 의해 결정되는 TCR 자극의 강도는 T 세포 활성화의 정도, 이펙터 기능의 획득, 그리고 서로 다른 이펙터 또는 기억 T 세포 하위 집단으로의 분화 경로를 결정하는 데 결정적인 역할을 합니다7,8,9. TCR 의존적 T 세포 활성화를 연구하기 위한 현재의 인비트로(in vitro) 모델은 주로 플레이트 결합 또는 비드 접합 anti-CD3 및 anti-CD28 항체를 사용하여 TCR 결합과 공동 자극 신호를 동시에 제공합니다10,11. 이러한 시스템이 널리 사용되고는 있지만, 일반적으로 단일하며 종종 포화 농도인 anti-CD3 항체만을 사용하므로, 적정된 자극 구배를 통해 얻을 수 있는 TCR 신호 강도의 동적 범위를 포착하기보다는 T 세포 활성화에 대한 단순한 '전부 아니면 전무(all-or-nothing)' 식의 이분법적 비교만을 가능하게 합니다12,13.
본 프로토콜은 정량된 anti-CD3 농도 구배(0.1–10 µg/mL)와 일정 농도의 anti-CD28(1 µg/mL)을 사용하여, 단계별 TCR 신호 강도가 일차 마우스 CD8+ T 세포의 활성화, 증식 및 기능적 표현형을 어떻게 조절하는지 체계적으로 평가할 수 있는 표준화되고 재현 가능한 in vitro 시스템을 제공합니다. 이 접근 방식은 다매개변수 유세포 분석법을 중심으로 하며, 6시간에서 48시간까지의 시간 경과에 따라 mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1) 활성의 판독값인 세포 내 인산화 S6 ribosomal protein(p-S6)을 통한 상위 신호 전달과, CTV 희석으로 추적하는 증식, 활성화 표면 마커(CD69, CD25, inducible T-cell costimulatory [ICOS], programmed cell death protein 1 [PD-1]), 그리고 작동 분자 발현(Granzyme B, tumor necrosis factor-alpha [TNF-α])을 포함한 하위 세포 결과를 모두 포착합니다.
본 프로토콜은 플레이트에 결합된 anti-CD3 항체의 농도 구배를 이용하여 자극 강도를 정밀하게 조절함으로써, 생리적 조건에서 관찰되는 T 세포 수용체(TCR) 결합 친화도의 차이를 모사합니다. 이 방법은 TCR 가교 결합(crosslinking)에서 높은 효율을 보이며, 휴지기 일차 T 세포의 강력한 활성화를 유도합니다. 표준화된 코팅 절차를 통해 플레이트 표면에 항체가 균일하게 분포되도록 하여, 동일 배치 내 세포 간의 일관된 자극과 우수한 실험 재현성을 확보하였습니다. 이러한 방식은 T 세포 활성화를 위한 비용 효율적이고 조작이 간편한 접근법을 제공합니다.
하지만 이 접근 방식의 특정 한계점들을 인정해야 합니다. anti-CD3/CD28 항체에 의해 매개되는 자극은 생체 내(in vivo) 생리학적 상황과는 현저히 다릅니다. T 세포 활성화를 평가하기 위해 작용제성 anti-CD3 및 anti-CD28 항체만을 사용하는 실험 방법은 활성화에 대한 효과적인 판독값을 제공할 수 있지만, 생리학적 조건에서 발생하는 항원 제시 세포와 T 세포 간의 상호작용 및 공동 자극 미세환경을 완전히 재현하지는 못합니다14.
이러한 제한점에도 불구하고, 본 프로토콜은 TCR 신호 강도에 따른 T 세포 반응을 조사하기 위한 가치 있고 접근 가능한 도구로서 체계적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공하며, 더욱 복잡한 항원 특이적 모델을 보완할 수 있습니다.
프로토콜
본 연구의 모든 동물 실험은 제3군 의과대학의 동물실험윤리위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 시약 및 플레이트 준비
- 멸균된 PBS를 사용하여 0.1, 0.5, 1, 5, 10 µg/mL 농도의 플레이트 결합용 anti-CD3를 준비합니다.
- 평평한 바닥의 96-well 플레이트의 각 well에 anti-CD3 코팅 용액 50 µL를 넣습니다.
- 실링 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 세포를 추가하기 전에 각 well을 200 µL의 멸균된 PBS로 2회 세척합니다.
2. 마우스 비장에서 naive CD8+ T 세포의 분리
- 6~8주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.에서 구매)를 선택하고, CO2 흡입 후 경추 탈골법으로 안락사시킨다. 마우스는 12시간 명/암 주기 하에 식음료를 자유롭게 섭취할 수 있는 특정 병원균 제거(SPF) 조건에서 사육한다. 독립적인 실험당 최소 3마리의 마우스를 사용한다.
- 수술용 가위로 복막을 조심스럽게 절개하여 비장을 노출시킨 후, 포셉을 사용하여 비장을 잡아 수확하고 2% fetal bovine serum(FBS)가 첨가된 냉각된 RPMI 1640(R2)이 들어 있는 수집 접시에 넣는다. 세포 분리 전까지 접시를 얼음 위에 보관한다.
참고: 모든 동물 사체와 세포 배양 폐기물은 지정된 생물학적 위험 폐기물 봉투에 수집하고, 폐기 전 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브 멸균한다. - 수집 접시에서 비장을 꺼내 3 mL의 1 × ammonium-chloride-potassium (ACK) 용해 버퍼가 담긴 60 mm 접시로 옮긴다.
- 3 mL 시린지의 플런저를 사용하여 비장을 70 µm 세포 스트레이너로 부드럽게 으깨어 단일 세포 현탁액을 준비한다.
- 현탁액을 상온(RT)에서 1분 동안 배양한 후, 냉각된 R2 배지 3 mL를 추가하여 ammonium-chloride-potassium (ACK) 용해 버퍼를 중화시킨다.
- 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮기고 4 °C에서 500 × g로 5분 동안 원심 분리한다.
- 원심 분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, 펠렛을 10 mL의 유세포 분석 염색 버퍼(2% FBS 포함 PBS)에 재현탁한다.
- 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 새 15 mL 원추형 튜브로 여과한 다음, 4 °C에서 500 × g 로 5분 동안 다시 원심 분리한다.
참고: 기능 분석을 위한 세포 생존력을 유지하기 위해 유세포 분석 염색 버퍼에서 sodium azide는 제외해야 한다. 모든 샘플은 4 °C로 유지하고 즉시 분석해야 한다. - 상층액을 흡입하여 제거하고, 마우스 비장당 200 µL의 비오틴화 항체 칵테일(anti-CD16/32 (Fc block), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 및 anti-F4/80 포함)에 세포 펠렛을 재현탁한다.
- 철저한 혼합을 위해 5분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어주며 얼음 위에서 25분 동안 배양한다.
- 유세포 분석 염색 버퍼를 대량으로 사용하여 세포를 세척하고, 500 × g 로 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 버린다.
- 비오틴화 항체 칵테일에 사용한 것과 동일한 부피의 유세포 분석 염색 버퍼로 펠렛을 재현탁하고, 해당 부피의 절반만큼 streptavidin 코팅 마그네틱 비드를 추가한 뒤, 5분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어주며 얼음 위에서 15분 동안 배양한다.
- 튜브를 짧게 원심 분리하고 마그네틱 스탠드에 2~3분 동안 세워둔 후, 상층액(농축된 naive CD8+ T 세포)을 새 15 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮긴다.
- 수집된 세포를 유세포 분석 염색 버퍼로 한 번 세척하고, 다시 500 × g 로 5분 동안 원심 분리한다.
- 상층액을 버리고, 이후 응용 분석을 위해 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640(R10)에 펠렛을 재현탁한다.
3. 증식 추적을 위한 보라색 증식 추적 염료(CTV) 표지
- 사용 직전에 2 × 신선한 CTV 작동 용액(10 µM)을 준비합니다. 5 mM CTV 스톡 용액(dimethyl sulfoxide [DMSO] 내)을 볼텍싱하여 완전히 혼합한 후, 멸균 PBS로 희석하여 최종 농도가 10 µM이 되도록 합니다.
주의: DMSO는 독성 화합물의 피부 흡수를 촉진하므로, DMSO로 준비된 CTV 스톡 용액은 흄 후드 내에서 니트릴 장갑을 착용하고 취급하십시오. 흡입 및 피부 접촉을 피하십시오. - 분리된 naive CD8+ T 세포의 절반을 미리 냉각한 PBS에 8 × 107 cells/mL 밀도로 재현탁합니다.
- 세포 현탁액에 동일한 부피의 2 × CTV 작동 용액(10 µM)을 빠르게 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합하여, 최종 CTV 농도가 5 µM이 되도록 합니다.
- 세포를 실온의 암소에서 20분 동안 배양하며, 철저한 혼합을 위해 5분마다 튜브를 가볍게 반전시킵니다.
- 세포에 5배 부피의 배양 배지(최소 10% FBS 포함)를 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 배양하여 결합되지 않은 염료를 제거합니다.
- 세포를 500 × g에서 5분 동안 원심 분리하고, 펠릿을 anti-CD28(최종 농도: 1 µg/mL) 및 IL-2(최종 농도: 10 ng/mL)가 보충되어 미리 가온된 신선한 완전 배지 R10에 재현탁합니다.
- 미리 코팅된 96-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 250 µL(6 × 105 cells 포함)를 첨가합니다.
- 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최대 48시간 동안 배양합니다.
4. 유세포 분석법을 통한 CTV 검출
- 6, 36, 48시간에 세포를 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 수집한다. 500에서 원심분리한다. × g 5분 동안 반응시키고 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척합니다.
- 표면 염색을 위해 세포를 다음의 성분과 함께 배양하십시오. 50 µL anti-CD8, 고정 가능 생존 염료(fixable viability dye) 및 anti-CD44를 포함하는 항체 칵테일을 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 처리함 암소에서.
참고: 형광 표지 항체가 포함된 모든 상층액은 오염 제거를 위해 0.5% 차아염소산나트륨이 첨가된 지정 폐기물 용기에 수집하고, 기관의 생물학적 위험 폐기물 처리 규정에 따라 폐기하십시오. - 세포를 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척한 후, 다음 용액에 재현탁하십시오. 200 µL 유세포 분석기 데이터 수집을 위한 유세포 분석 염색 완충액.
- 3개의 레이저가 장착된 유세포 분석기(flow cytometer)로 시료를 분석하십시오. 보정(compensation) 매개변수를 설정하기 위해 염색된 세포를 사용하여 단일 염색 대조군 튜브를 준비하십시오.
- 다음의 게이팅 전략을 적용하십시오: 전방 산란광(FSC) 대 측방 산란광(SSC) 게이팅으로 데브리스(debris)를 제외하고, 싱글렛(singlet) 게이팅으로 더블렛(doublet)을 제거하며, 생존 세포(고정 가능 생존 염색 시약 음성)인 CD8+ 세포를 선택합니다.+ 분석용 T 세포.
- 최소 1개를 수집하십시오. × 104 gated CD8 (게이팅된 CD8)+ 샘플당 T 세포 이벤트 수. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 증식 분석 모듈을 사용하여 한 번 이상의 분열을 거친 세포의 비율을 계산하십시오.
5. 활성화 및 신호 전달을 위한 표면 및 세포 내 염색
- 나이브 CD8+ T 세포의 나머지 절반을 1 µg/mL의 anti-CD28과 10 ng/mL의 IL-2가 첨가된 R10에 2.4 × 106 cells/mL 농도로 재현탁한다.
- 미리 코팅된 96-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 250 µL(6 × 105 cells)를 분주한다.
- 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최대 48시간 동안 배양한다.
- 지정된 시간대(6, 10, 12, 24, 36시간)에 세포를 96-well round-bottom 플레이트에 수집한다.
참고: 6시간 시점은 초기 TCR 신호전달(phospho-S6) 및 CD69를 포착하기 위함이며, CD69는 전체 키네틱스를 파악하기 위해 12, 24, 36시간에도 추가로 분석한다. CD25, PD-1, ICOS는 10, 12, 24, 36시간에 모니터링하며, 48시간 시점은 증식(섹션 4) 및 사이토카인 검출(섹션 6)을 위해 남겨둔다. - 500 × g에서 1분간 원심분리하고 세포 펠릿을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁한다.
- 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상층액을 제거한다. 세포를 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척한다.
- 표면 염색을 위해 anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS 및 고정 가능 생존 염료(fixable viability dye)가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 얼음 위 암소에서 30분 동안 반응시킨다.
- 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세포를 유세포 분석 염색 완충액으로 3회 세척한다.
- 세포 펠릿을 200 µL의 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 재현탁하고, 실온(RT)의 암소에서 15분 동안 고정한다.
주의: 증기 흡입을 방지하기 위해 파라포름알데히드를 사용하는 모든 단계는 흄 후드 내에서 수행한다. 고정액이 포함된 모든 액체 폐기물은 유해 화학물질 폐기용으로 표시된 별도의 용기에 수집한다. - 500 × g에서 1분간 원심분리하고 유세포 분석 염색 완충액으로 1회 세척한다.
- 5 × lyse/fix 완충액을 실온에서 미리 데우고 증류수를 사용하여 1 × 작업 용액을 준비한다.
- 각 웰에 작업 용액(1 × lyse/fix 완충액) 200 µL를 넣고, 세포를 실온의 암소에서 30분 동안 반응시킨다.
- 인산화 에피토프(phospho-epitope) 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 2회 세척한다. 펠릿을 인산화 에피토프 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 재현탁하고 실온의 암소에서 10분 동안 반응시킨다.
- 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상층액을 제거한다.
- 세포 내 염색을 위해 anti-p-S6가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 실온의 암소에서 60분 동안 반응시킨다.
- 세포를 인산화 에피토프 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 3회 세척한다.
- 2차 항체 염색을 위해 anti-rabbit 2차 항체가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 얼음 위 암소에서 30분 동안 반응시킨다.
- 세포를 인산화 에피토프 염색용 1 × 투과화/세척 완충액으로 3회 세척하고, 유세포 분석 염색 완충액으로 1회 세척한다.
- 세포 펠릿을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁하고 동일한 유세포 분석기로 샘플을 획득한다.
- 섹션 4.5에 기술된 것과 동일한 게이팅 전략을 적용하여 샘플당 최소 1 × 104개의 CD8+ T 세포를 수집한다.
- 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 각 마커의 중앙 형광 강도(MFI)를 분석한다.
6. 세포 내 사이토카인 차단 및 검출
- 수확 5시간 전에 PMA (50 ng/mL), ionomycin (1 µg/mL), 단백질 수송 억제제 (monensin) (1:1000) 및 단백질 수송 억제제 (brefeldin A 기반) (1:1000)가 첨가된 신선한 R10을 웰당 100 µL씩 첨가한다. 가볍게 섞어 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 사이토카인 분비를 차단하고 세포 내에 축적되도록 한다.
- 원하는 시간대에 세포를 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 수집한다.
- 500 × g에서 1분간 원심분리하고 세포 펠렛을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁한다.
- 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상청액을 흡입하여 제거한다. 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액으로 2회 세척한다.
- 표면 마커 염색을 위해 anti-CD44, anti-CD8 및 고정 가능 생존 염색 시약이 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 세포를 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한다.
- 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 유세포 분석 염색 완충액으로 3회 세척한다.
- 고정 및 투과화 용액 200 µL를 첨가하여 세포를 투과화하고 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한다.
주의: 증기 흡입을 방지하기 위해 고정/투과화 용액 (paraformaldehyde 포함)을 사용하는 모든 단계는 흄후드 내에서 수행한다. 고정제가 포함된 모든 액체 폐기물은 유해 화학 물질 폐기용으로 표시된 별도의 용기에 수집한다. - 500 × g에서 1분간 원심분리하고 상청액을 유해 화학 폐기물통에 버린다.
- 1 × 투과화/세척 완충액으로 세포를 3회 세척한다.
- 세포 내 사이토카인 염색을 위해 anti-TNF-α 및 anti-Granzyme B가 포함된 항체 칵테일 50 µL와 함께 얼음 위 암소에서 30분 동안 배양한다.
- 1 × 투과화/세척 완충액으로 세포를 3회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 마지막으로 유세포 분석 염색 완충액으로 1회 세척한다.
- 세포 펠렛을 200 µL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁하고 동일한 유세포 분석기로 시료를 획득한다.
- 섹션 4.5에 설명된 것과 동일한 게이팅 전략을 적용하여 샘플당 최소 1 × 104개의 CD8+ T 세포를 수집한다. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 각 마커의 양성 백분율과 MFI를 분석한다.
결과
서로 다른 강도의 anti-CD3 자극이 T 세포 활성화에 미치는 영향을 조사하기 위해, 마우스 비장세포를 분리하고 CD8+ T 세포를 정제하여 인 비트로(in vitro) 배양한 후, T 세포 활성화 분석 및 유세포 분석을 수행하였습니다. 데이터 분석을 위해, 먼저 FSC-A와 SSC-A의 조합을 사용하여 림프구를 게이팅(gating)하였으며, 이어서 FSC-H와 FSC-W를 통해 싱글렛(singlets)을 게이팅하고, 그 다음 SSC-H와 SSC-W를 사용하여 게이팅하였습니다. 이후 하위 분석을 위해 CD8과 고정 가능한 생존 염색(fixable viability dye)을 조합하여 살아있는 CD8+ T 세포를 추가로 게이팅하였습니다(그림 1A).
플레이트 결합 항체 자극 시스템이 in vitro에서 T 세포를 효과적으로 활성화하는지 검증하기 위해, 우리는 mTORC1 활성의 잘 알려진 하위 리드아웃이자 TCR 신호 전달 하위의 PI3K-mTOR 및 MEK-ERK MAPK 경로가 수렴하는 지점인 리보솜 단백질 S6의 인산화(p-S6)를 조사하였습니다15,16. 이러한 결과와 일관되게, anti-CD3 농도(0.1–10 µg/mL)가 증가함에 따라 자극 후 6시간 시점에서 p-S6 수준이 농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰하였으며(그림 1B), 이는 플레이트 결합 anti-CD3 시스템이 신호 강도에 의존적인 방식으로 TCR-mTORC1-S6 축을 활성화함을 확인시켜 줍니다. 이러한 초기 인산화 사건은 이후의 T 세포 증식 및 작동 세포 분화를 지원하는 mTORC1 의존적 대사 경로의 관여와 일치합니다.
세포 증식은 0.1–10 µg/mL 농도 구배의 anti-CD3로 TCR을 자극하고, 자극 후 6, 36, 48 h의 세 시점에서 CTV 희석 유세포 분석법을 통해 평가하였다. 초기 신호 전달 시점인 6 h에서는 모든 자극 조건에서 최소한의 증식성 희석만이 관찰되었다. 36 h가 되었을 때, 저농도 자극군(0.1 µg/mL)은 여전히 뚜렷한 클론 확장을 유도하지 못했으나, 중농도 및 고농도 자극군(5 및 10 µg/mL)은 명확하게 구분되는 CTV 희석 피크를 보여 세포 주기 진행이 시작되었음을 나타냈다. 48 h에서는 자극 농도에 따른 증식 표현형의 차이가 가장 두드러졌다. 약한 TCR 자극(0.1 µg/mL)에서는 증식 세포가 1.25%에 불과했으며 희석되지 않은 단일 CTV 피크가 나타나 활성화가 최적 수준에 미치지 못했음을 보여주었다. 중간 정도의 자극(1–5 µg/mL)은 세 개의 구분된 분열 피크를 유도하였으며, 증식 분율은 70.8%에서 84.0%까지 증가했다. 강한 자극(10 µg/mL)에서는 가장 높은 증식 분율(89.5%)에 도달하였고, 최대 분열 세대 수가 나타나 증식 포화 상태가 검출됨을 입증하였다(Figure 2).
다음으로 초기 활성화 마커인 CD69와 CD25의 발현을 조사하였습니다. 특히, 본 연구에서는 중앙 형광 강도(MFI)를 기준으로 CD69 발현이 신속하고 용량 의존적으로 상향 조절됨을 확인하였습니다. 중간 및 강한 자극(5 및 10 µg/mL) 하에서 CD69는 24 h에 빠르게 증가한 후, 24 h에서 36 h 사이에 점진적으로 감소하였습니다. 반면, 약한 자극(0.1, 0.5 및 1 µg/mL) 하에서는 전체 자극 기간 동안 CD69가 점진적으로 증가하였습니다. 이상의 CD69 발현 역학 프로파일은 초기 T 세포 활성화 마커로서의 역할과 일치합니다(그림 3A)17. 흥미롭게도, CD25 발현은 용량 및 시간 의존적인 방식으로 점진적으로 증가하는 것이 관찰되었습니다(그림 3B). 이전 연구들과 일치하게, 특히 최적 자극 시 CD25의 상향 조절은 CD69보다 느리게 나타났습니다18,19.
TCR 자극 강도가 CD8+ T 세포의 억제성 수용체 및 공자극 분자 발현에 미치는 조절 효과를 추가로 조사하기 위해, PD-1과 ICOS의 발현 수준을 분석하였습니다. PD-1의 유도성 발현은 고강도 TCR 자극에 의존합니다. 저강도 자극군(0.5–1 µg/mL)에서는 전체 자극 기간 동안 PD-1이 낮은 수준으로 발현되었습니다. 반면, 중-고강도 자극군(5–10 µg/mL)에서는 PD-1 발현이 10 h부터 점진적으로 증가하여 36 h에 정점에 도달하였습니다(그림 4A). ICOS의 발현 또한 자극 강도가 증가함에 따라 이에 상응하여 상승하였으며, 36 h의 5–10 µg/mL 조건에서 최대 수준에 도달하였습니다(그림 4B). 이러한 결과는 고강도 TCR 자극이 PD-1 및 ICOS의 발현 수준을 유의미하게 상향 조절할 수 있음을 시사합니다.
마지막으로, 자극 후 24시간 및 48시간 시점에서 PMA와 ionomycin으로 재자극했을 때 자극된 T 세포의 기능적 능력을 조사하였습니다. 24시간째에 TNF-α 및 Granzyme B의 생성을 정량화한 결과, TNF-α+, Granzyme B+ 및 TNF-α+Granzyme B+ 세포의 빈도가 anti-CD3 농도에 의존적으로 점차 증가하는 것을 관찰하였습니다(Figure 5A, B). 일관되게 TNF-α와 Granzyme B의 MFI 또한 농도 의존적인 증가를 보였으며, 고강도 자극(10 µg/mL) 하에서 최대치에 도달하였습니다(Figure 5C). 이는 단계적인 TCR 신호 강도에 의해 유도된 농도 의존적 초기 이펙터 분화를 반영합니다. 그러나 48시간째에는 이러한 양상이 뚜렷하게 역전되었습니다. 더 높은 anti-CD3 농도에서 TNF-α+Granzyme B+ 세포의 비율이 유의하게 감소하였고, 세포당 이펙터 분자의 발현 수준이 하향 조절되었습니다.
제시된 모든 데이터는 3회의 독립적인 실험을 대표하는 결과입니다. 통계 분석은 Tukey의 사후 검정을 포함한 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 또는 이원 분산 분석(two-way ANOVA)을 사용하여 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었습니다. 세포 생존율은 일관되게 90%를 초과하였으며, 샘플당 최소 1 × 104개의 살아있는 CD8+ T 세포 이벤트를 수집하였습니다.
그림 1: CD8+ T 세포의 in vitro 활성화 및 유세포 분석. (A) 마우스 비장 세포에서 정제된 CD8+ T 세포를 다양한 농도의 anti-CD3 (0.1–10 µg/mL)와 일정 농도의 anti-CD28 (1 µg/mL)을 조합하여 6~48시간 동안 in vitro에서 자극한 후, 세포 활성화에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 전방 산란광(FSC) 및 측방 산란광(SSC) 게이팅을 통해 세포 파편을 제외하였고, 싱글렛 게이팅을 통해 더블렛을 제외하였으며, 최종적으로 fixable viability dye 음성인 CD8+ T 세포를 게이팅하여 후속 분석에 사용하였다. (B) 명시된 농도의 anti-CD3 (0.1–10 µg/mL)와 일정 농도의 anti-CD28 (1 µg/mL)로 자극한 지 6시간 후 CD8+ T 세포 내 리보솜 단백질 S6의 인산화(p-S6) 정도. 대표 히스토그램(왼쪽) 및 MFI 요약 그래프(오른쪽). 유세포 분석 플롯은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 데이터는 mean ± SEM으로 표시하였다. 통계 분석: Tukey의 사후 검정을 포함한 반복 측정 일원 분산 분석(repeated-measures one-way ANOVA). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, 유의하지 않음. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 2: 단계별 TCR 자극 하에서 일차 마우스 CD8+ T 세포의 보라색 증식 추적 염료(CTV) 기반 증식 분석. CTV로 라벨링하고 0.1–10 µg/mL의 농도 구배의 anti-CD3로 6~48시간 동안 인비트로(in vitro) 자극한 CD8+ T 세포. 세포 증식은 유세포 분석을 통해 CD8+ T 세포 내 CTV 형광의 희석 및 감쇠를 기반으로 평가되었다. 히스토그램은 각 농도 그룹의 CTV 형광 분포를 보여주며, 하나 이상의 분열을 거친 세포의 백분율이 표시되어 있다. 유세포 분석 플롯은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: anti-CD3 자극 후 CD8+ T 세포에서 조기 활성화 마커 CD69 및 CD25의 발현 역학. Naive CD8+ T 세포를 표시된 농도(0.1–10 µg/mL)의 plate-bound anti-CD3와 일정 농도의 anti-CD28 (1 µg/mL)로 자극하였다. CD69는 6, 12, 24, 36 h에서, CD25는 10, 12, 24, 36 h에서 측정하여 유세포 분석으로 분석하였다. 왼쪽 패널은 표시된 시점의 대표적인 히스토그램을 보여주며, 오른쪽 패널은 시간에 따른 MFI의 동적 변화를 나타낸다. (A) CD69. (B) CD25. 유세포 분석 플롯은 3회의 독립적인 실험의 대표값이다. 데이터는 mean ± SEM으로 표시되었다. 통계 분석: Tukey의 사후 검정을 포함한 반복 측정 이원 분산 분석(repeated-measures two-way ANOVA). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, 유의미하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: anti-CD3 자극 후 CD8+ T 세포에서 억제성 수용체 PD-1 및 공자극 분자 ICOS의 발현 역학. Naive CD8+ T 세포를 표시된 농도(0.1–10 µg/mL)의 플레이트 결합 anti-CD3와 일정 농도의 anti-CD28(1 µg/mL)로 자극하였다. 세포를 10, 12, 24, 36시간에 수확하여 유세포 분석으로 분석하였다. 왼쪽 패널은 표시된 시점의 대표 히스토그램을 보여주며, 오른쪽 패널은 시간에 따른 MFI의 동적 변화를 나타낸다. (A) PD-1. (B) ICOS. 유세포 분석 도표는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계: Tukey 사후 검정을 이용한 반복 측정 이원 분산 분석(repeated-measures two-way ANOVA). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, 유의성 없음. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 5: CD8+ T 세포의 세포 내 사이토카인 생성은 TCR 강도에 따라 달라진다. Naive CD8+ T 세포를 증가하는 농도의 anti-CD3 (0.1–10 µg/mL)와 일정한 농도의 anti-CD28 (1 µg/mL)로 자극했다. 자극 후 24시간 및 48시간에, 사이토카인 분비를 차단하여 세포 내에 축적시키기 위해 PMA 및 ionomycin 존재 하에 단백질 수송 억제제(monensin 및 brefeldin A)와 함께 5시간 동안 배양한 후 세포를 회수했다. (A) 등고선 도표(Contour plots)는 표시된 각 농도 및 시점에서 TNF-α 및 Granzyme B 양성 세포의 빈도를 보여준다. 자극하지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용했다. (B) TNF-α+, Granzyme B+, 및 TNF-α+ Granzyme B+ 세포의 비율. (C) TNF-α 및 Granzyme B의 MFI. 유세포 분석 도표는 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 통계 분석: Tukey의 사후 검정을 포함한 반복 측정 이원 분산 분석(repeated-measures two-way ANOVA). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns, 유의하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 프로토콜은 TCR 신호 강도에 따른 T 세포 반응을 연구하기 위한 체계적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 단계별 anti-CD3 코팅 전략을 통해 자극 강도를 정밀하게 제어함으로써, 연구자는 TCR 입력값과 하위 기능적 결과 사이의 정량적 관계를 분석할 수 있습니다. 주요 절차적 핵심 사항으로는 naive CD8⁺ T 세포의 정제, anti-CD3 코팅 농도의 정밀한 구배 제어, 그리고 웰당 세포 수의 엄격한 표준화가 포함됩니다. 실험 간 데이터 비교 가능성을 보장하기 위해, 일관된 기기 설정, 보정 매트릭스 및 게이팅 전략을 사용하고, 가능한 경우 동일한 항체 롯트와 고정 가능 생존 염색약 배치를 사용할 것을 권장합니다. 이러한 핵심 단계들의 신뢰도는 T 세포 표현형 역동성에 미치는 다양한 TCR 자극 강도의 영향을 실험 결과가 정확하게 반영할 수 있는지 여부를 직접적으로 결정합니다.
본 프로토콜에서는 anti-CD3 항체를 배양 플레이트 표면에 직접 코팅하여 TCR-CD3 복합체를 교차 결합시키는 플레이트 고정 항체 자극법을 사용하였습니다. 이 방법은 비용 효율적이고, 항체가 균일하게 분포하며, 웰 간 변동성이 최소화되어 재현성이 매우 뛰어납니다. 특히, 코팅 항체 농도를 적정함으로써 자극 강도를 정밀하게 단계별로 조절할 수 있는데, 이는 리간드 밀도가 일반적으로 포화 수준으로 고정되어 미세한 신호 조절이 제한적인 비드 결합 자극법과 구별되는 특징입니다14. 하지만 플레이트 고정 자극은 항원 제시 세포의 pMHC 복합체에 의해 유도되는 일시적이고 친화도 의존적인 결합과는 근본적으로 다른, 생리적 범위를 넘어서는 지속적인 TCR 교차 결합을 유발합니다. pMHC 기반 자극은 생리적으로 더 적합하지만, 기술적으로 까다롭고 멀티머 제작을 위한 전문 지식이 필요하며 비용이 상당히 많이 듭니다. 세포 분리를 위해 우리는 간단하고 신속하며 비용 효율적인 음성 면역 자성 선택법을 사용하였습니다. 이 방법은 FACS에 비해 순도는 낮지만, 분리된 세포의 생리적 상태를 저하시킬 수 있는 기계적 스트레스와 형광 표지를 피할 수 있다는 장점이 있습니다20,21.
프로토콜 수행 중 발생할 수 있는 주요 문제는 낮은 분리 순도, 약한 증식, CTV로 인한 세포 독성, 배양 후 낮은 생존율 및 불균일한 염색입니다. 순도가 낮을 경우, 비오틴화 항체 칵테일 및 스트렙타비딘 코팅 비드와 세포를 충분히 혼합하고, 필요 시 자기 분리 시간을 연장하며, 새로운 시약 로트(lot)마다 비드 대 항체 비율을 최적화하십시오. 가장 높은 anti-CD3 농도에서도 증식이 최소한으로 관찰된다면, 분리된 naive 세포의 생존율과 순도(특히 CD44hi 오염 여부)를 확인하고, anti-CD3 코팅 과정(4 °C에서 하룻밤 동안 배양하는 동안 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉하고 항체가 균일하게 도포되었는지 확인)을 점검하며, T 세포 확장을 지원하는 데 필수적인 사이토카인인 IL-2 농도를 검증하십시오. CTV로 인한 세포 독성이 나타나면, 분열 피크의 해상도를 명확하게 유지하면서 염색 농도를 낮추고, 잔류 유리 염료를 제거하기 위해 켄칭(quenching) 단계를 5 min 동안 엄격히 얼음 위에서 수행하십시오22,23. 배양 후 생존율이 낮을 경우, 세포 밀도를 조절하고 충분한 배지 부피를 확보하며 멸균 기술을 유지하십시오. 염색이 불균일하거나 유세포 분석 변동성이 높게 나타나면, 항체 칵테일을 마스터 믹스로 준비하고, 모든 염색된 샘플을 빛으로부터 보호하며, 반복 실험 전반에 걸쳐 동일한 항체 로트와 고정 가능 생존 염료 배치를 사용하십시오.
그럼에도 불구하고, 본 프로토콜에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 인 비트로(in vitro) 시스템으로서, 이차 림프 기관의 복잡한 조직 미세환경, 세포 간 상호작용 또는 사이토카인 환경을 재현할 수 없습니다. 배양 기간이 48 h로 제한되어 있어 초기 활성화 사건으로 분석이 한정되며, 후기 분화, 소진 또는 기억 세포 형성의 평가는 불가능합니다. 또한, 본 프로토콜은 유세포 분석 결과에 크게 의존하므로, 독립적인 실험 간에 기기 설정, 보정 매트릭스 및 게이팅 전략의 엄격한 표준화가 요구됩니다. 더욱이, 이 anti-CD3/CD28 기반 시스템으로 얻은 결과는 오직 CD8+ T 세포에서 유래한 것이며, 활성화 임계값, 공동 자극 요구 사항 및 하위 분화 경로가 다른 것으로 알려진 CD4+ T 세포에 직접적으로 일반화하기 어려울 수 있습니다12,24,25. 아울러, T 세포의 기저 활성화 상태는 공생 미생물군의 차이로 인해 개별 마우스 군집마다 다를 수 있으며, 이는 연구 간 결과를 해석할 때 고려해야 할 실험실 간 변동성의 잠재적 원인이 됩니다.
여기서 설명하는 단계별 자극 시스템을 통해 연구자들은 서로 다른 리드아웃에서 관찰되는 고유한 반응 패턴에 근거하여 특정 실험 목적에 맞게 TCR 신호 강도를 조절할 수 있습니다. 이 데이터는 anti-CD3 농도와 수확 시간의 선택이 다루고자 하는 생물학적 질문에 따라 결정되어야 함을 보여줍니다. 즉시 초기 활성화 마커의 경우, CD69 상향 조절은 모든 농도에서 이르면 6–12 h에 검출 가능하지만 뚜렷한 역학적 차이를 보입니다. 고농도(5–10 µg/mL)는 급격한 정점 이후 감소를 유도하는 반면, 저농도(0.5–1 µg/mL)는 점진적이고 지속적인 증가를 유도합니다. 증식 분석의 경우, 1 µg/mL 미만의 농도는 최적이 아니며 내부 음성 대조군으로 사용될 수 있는 반면, 5–10 µg/mL는 48 h에 CTV 희석을 통해 검출 가능한 강력한 클론 확장을 안정적으로 유도합니다. 공동 억제 수용체 PD-1과 공동 자극 분자 ICOS의 발현에는 고강도 자극(5–10 µg/mL)이 필요하며 36 h에 정점에 도달하므로, 이들 분자를 조사하는 연구에서는 더 이른 시간대나 저용량 조건을 피해야 합니다. 이펙터 기능 리드아웃(TNF-α 및 Granzyme B)의 경우, 자극 강도와 사이토카인 생성 사이의 관계는 시간에 의존적이며 독특한 이상성 패턴을 따릅니다. 24 h에는 이펙터 분자 생성이 anti-CD3 농도와 정비례하여, 고용량일수록 더 많은 사이토카인 출력을 유도합니다. 그러나 48 h가 되면, 모든 조건에서 사이토카인 생성 세포의 절대 수준은 24 h에 비해 상당히 증가하지만 용량-반응 관계는 역전됩니다. 즉, 저자극 농도(0.5–1 µg/mL)가 고용량(5–10 µg/mL)보다 상대적으로 더 높은 빈도의 TNF-α⁺ Granzyme B⁺ 세포를 생성합니다. 이러한 역전 현상은 지속적이고 강한 TCR 신호 전달이 초기 이펙터 분화를 촉진함에도 불구하고, 세포당 사이토카인 생성 능력의 유지에는 상대적인 제약을 가할 수 있음을 시사하며, 이는 잠재적으로 활성화 유도 소진 또는 반응 저하의 시작을 반영하는 것일 수 있습니다.
종합적으로, 이러한 경험적 관찰 결과는 본 프로토콜을 특정 하위 엔드포인트를 기반으로 자극 조건을 사전 선택할 수 있게 함으로써 실험 설계 효율성과 데이터 해석력을 향상시키는 참조 프레임워크로 설정합니다. 기본적인 기전 연구 외에도, 이 시스템은 TCR 신호 강도의 정밀한 조절이 유리한 작동 또는 기억 표현형으로의 분화를 유도하는 데 도움이 될 수 있는 입양 면역 요법을 위한 T 세포 증식 프로토콜의 최적화에 정보를 제공할 수 있습니다26,27,28.
공개 사항
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
감사의 글
본 연구는 중국 국가자연과학재단(No. T2394504, LY)과 Lilin Ye 수석 과학자 연구 시작 펀드(No. R2045, LY)의 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 mL conical tube | Labgic | CD-002-15A | 멸균된 15 mL 원추형 원심분리 튜브 |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099 | 염색 전 세포 보존을 위한 4% 수성 고정액 |
| 60 mm dish | Labgic | 12211 | 60 mm 세포 배양 접시 |
| 70 µm cell strainer | Labgic | BS-70-CS | 단일 세포 현탁액 준비용 70 µm 나일론 메쉬 스트레이너 |
| 96-well round-bottom plate | Beyotime | FPT016 | 세포 배양 및 염색용 96-well 라운드 바텀 플레이트 |
| ACK lysis buffer | Beyotime | C3702 | 염화암모늄 기반 적혈구 용해 완충액 |
| anti-mouse CD25 | Biolegend | 101910 | 유세포 분석용 APC-접합 anti-mouse CD25 항체, clone 3C7 |
| anti-mouse CD28 | Bio X Cell | BE0015-1 | T세포 공동 자극용 정제된 anti-mouse CD28 항체, clone 37.51 |
| anti-mouse CD3 | Bio X Cell | BP0001-1 | T세포 활성화용 정제된 anti-mouse CD3ε 항체, clone 145-2C11 |
| anti-mouse CD69 | BD Biosciences | 553237 | 활성화 마커 염색용 PE-접합 anti-mouse CD69 항체 |
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| anti-mouse TNF-α | Invitrogen | 46-7321-82 | 세포 내 유세포 분석용 PerCP-eFluor 710-접합 anti-mouse TNF-α 항체, clone MP6-XT22 |
| anti-mouse/human CD44 | Biolegend | 103030 | 유세포 분석용 PE/Cyanine7-접합 anti-mouse/human CD44 항체, clone IM7 |
| biotin anti-mouse CD11b | Biolegend | 101204 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD11b 항체 |
| biotin anti-mouse CD11c | Biolegend | 117304 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD11c 항체 |
| biotin anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 156604 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD16/32 항체 |
| biotin anti-mouse CD19 | Biolegend | 115504 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD19 항체 |
| biotin anti-mouse CD4 | Biolegend | 100508 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD4 항체 |
| biotin anti-mouse CD44 | Biolegend | 103004 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD44 항체 |
| biotin anti-mouse CD45R | Biolegend | 103204 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD45R/B220 항체 |
| biotin anti-mouse CD49b | Invitrogen | 13-5971-85 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse CD49b 항체 |
| biotin anti-mouse F4/80 | Biolegend | 123106 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse F4/80 항체 |
| biotin anti-mouse Ly6G | Biolegend | 127604 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse Ly6G 항체 |
| biotin anti-mouse NK1.1 | Biolegend | 108704 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse NK1.1 항체 |
| biotin anti-mouse TER119 | Biolegend | 116204 | 계통 제거용 비오틴-접합 anti-mouse TER-119 항체 |
| C57BL/6 mice | Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | N/A | 실험에 사용된 6–8주령 수컷 마우스 |
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| Golgi Stop | BD Biosciences | 51-2092KZ | 세포 내 사이토카인 염색용 Monensin 기반 단백질 수송 억제제 |
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909-1ML | 세포 자극을 위해 PMA와 함께 사용되는 칼슘 이오노포어 |
| Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 51-20911KZ | 세포 내 염색용 투과화 및 세척 완충액 |
| Phosflow Lyse/Fix Buffer | BD Biosciences | 558049 | 적혈구 용해와 백혈구 고정을 동시에 수행하는 5× 완충액 |
| Phosflow Perm/Wash Buffer I | BD Biosciences | 557885 | 세포 내 인산화 단백질 염색용 메탄올 기반 투과화 완충액 |
| Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) Rabbit Monoclonal Antibody | Cell Signaling | 4858S | phospho-S6 리보솜 단백질 (Ser235/236)에 대한 토끼 단일클론 항체, clone D57.2.2E |
| PMA | Sigma | P1585-1MG | Phorbol 12-myristate 13-acetate; ex vivo 세포 자극용 활성제 |
| Recombinant Mouse Interleukin-2 | Gibco | 200-02-50UG | T세포 배양 및 증식을 위한 재조합 마우스 인터루킨-2 |
| RPMI 1640 | Life-Lab | AC01L064 | 포유류 세포 배양용 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 |
| Streptavidin Magnetic Beads | BEAVER | 22307 | 비오틴-항체 기반 세포 제거용 스트렙타비딘 코팅 자성 비드 |
| Flow cytometry staining buffer | Not specified | Not specified | 유세포 분석 염색 완충액; 공급업체 또는 제조법 미제공 |
| Parafilm M laboratory film | Amcor | PM996 | 플레이트, 튜브 및 배양 용기 밀봉용 유연한 자가 밀봉 실험실 필름 |
| Lyse/Fix Buffer | BD Biosciences | 558049 | 적혈구 용해와 백혈구 고정을 동시에 수행하는 5× 완충액 |
| FlowJo | BD Biosciences | v10.8.1 | 유세포 분석 데이터 분석용 소프트웨어, 버전 10.8.1 |
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