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방법 논문

올리고뉴클레오타이드 전달 평가를 위한 인간 유도 다능성 줄기세포 유래 심장 기반 심장 실험 모델로 활용

219 조회수

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

2026년 8월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간이 유도한 다능성 줄기세포로부터 자기조직화 심근세포 기반 심장 유사체를 생성하여 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 현미경 흡수를 평가할 수 있게 합니다.

초록

올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 심혈관 질환 치료에 상당한 잠재력을 가진 빠르게 발전하는 약물군을 대표합니다; 그러나 심장 조직에 효율적인 전달을 달성하는 것은 여전히 중요하고 해결되지 않은 과제로 남아 있습니다. 주요 장애물은 올리고뉴클레오타이드 세포 흡수와 세포 내 분포를 정량적으로 평가할 수 있는 견고하고 생리학적으로 적합한 인간 in vitro 모델의 제한적 가용성입니다. 인간 유도 다능 줄기세포(iPSC)로부터 자기조직화 3D 심장유사체를 생성하고, 이를 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 흡수 평가 플랫폼으로 적용하는 상세한 단계별 프로토콜이 제시되었습니다. 이 프로토콜은 Wnt/β-카테닌 신호를 시간적으로 조절하여 현탁 배양에서 방향성 심장 분화를 안내하여, 중배엽, 심장 중배엽, 심근세포 전구기 단계에 걸쳐 iPSC를 순차적으로 지정할 수 있게 합니다. 이러한 조건에서 세포는 자발적으로 박동하는 공동체 내 3차원 구조로 조립되어 정식 심근세포 표지를 표현합니다. 결과적으로 생성된 카디오이드는 올리고뉴클레오타이드 흡수 효율을 영상 기반 평가를 위한 확장 가능하고 실험적으로 다루기 쉬운 플랫폼을 제공하여 심장 응용을 위한 전달 전략 개발 및 최적화를 지원합니다.

서론

주로 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)와 소량 간섭 RNA(siRNA)를 기반으로 하는 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 유전성 및 후천성 질환을 포함한 다양한 질환 치료에 혁신적이고 매우 특이적인 접근법으로 빠르게 부상하고 있습니다. 1,2,3. 이러한 모달리티는 표적 전사체에 서열 특이적 결합을 통해 mRNA 수준에서 유전자 발현을 직접 조절할 수 있게 하여, 기존 소분자 치료로는 접근하기 어려운 질병 관련 유전자의 유전자 침묵 또는 스플라이싱 교정을 가능하게합니다. 따라서 올리고뉴클레오타이드 기반 유전자 치료제는 심혈관 질환을 포함한 여러 질환 영역에서 다양한 병원성 기전을 표적으로 삼을 수 있는 다목적 플랫폼을제공합니다. 현재까지 ASO, siRNA, 접합 전환 약물 등 여러 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제가 임상용으로 승인되었습니다7. 이러한 진전에도 불구하고, 전임상 및 임상 환경에서의 치료 효능은 비효율적인 세포 내 전달로 인해 여전히 제약을 받고 있습니다. 현재 추정치에 따르면 내화된 올리고뉴클레오타이드 중 1% 미만만이 내체체 구획을 벗어나 세포질에 도달해 목표 RNA와 결합하여 기능 활성을 제한합니다 9,10. 이 한계는 특히 심장 조직에서 두드러지는데, 세포 내 흡수와 이동이 잘 알려져 있지 않습니다.

역사적으로 심혈관 치료제의 전임상 평가는 동물 모델에 크게 의존해 왔으며, 이는 생 체 내 약물동학, 생체 분포, 효능 및 안전성 평가에 필수적입니다. 그러나 심장 생리학, 유전자 조절, 세포 반응에서의 중요한 종간 차이는 인간에서 치료 효능과 독성을 정확히 예측하는 데 종종 제한적입니다. 이러한 한계는 생리학적 관련성이 향상된 인간 기반 시험관 내 모델 개발을 촉진했습니다. 그중 인간 유도 다능 줄기세포(iPSC) 기술은 심혈관 질환 모델링에 혁명을 일으켰으며, 이를 통해 심혈관 계통으로 분화할 수 있는 사실상 무한한 세포 공급원을 제공했습니다. 인간 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CMs)는 인간 심근의 분자적, 구조적, 기능적 특성을 많이 재현하며, 질병 기전, 약물 반응, 신흥 치료 기법 연구를 위한 널리 채택된 플랫폼이되었습니다. 그러나 인간 iPSC-CMs의 기존 2차원 배양에는 중요한 한계가 있습니다. 대부분의 분화 프로토콜은 성체 세포가 아닌 태아 세포와 유사한 심근세포를 생성하며, 미성숙한 구조적, 전기생리적, 대사적, 수축성 특성을 보입니다12.

더불어, 단층 배양은 심근 세포 기능에 영향을 미치는 3차원(3D) 조직 구조, 다세포 상호작용, 세포외 기질 구성이 부족합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 점점 더 정교해지는 3D 심장 모델이 개발되었습니다. 이 중 iPSC-CM을 생체 소재 스캐폴드 내에 삽입하고 기계적 및 전기적 자극을 적용하여 생성되는 인공 심장 조직(EHT)은 구조적·기능적 성숙을 촉진하면서 토착 심근의 생체역학적 환경을 보다 가깝게 재현합니다. EHT는 질병 모델링과 약물 검사를 위한 생리학적으로 매우 중요한 플랫폼을 제공하지만, 생성에는 일반적으로 전문적인 생명공학 전문성과 전용 장비가 필요합니다. 반대편에서는 체외 심장 조직 절편이 원래 조직 구조와 세포 구성을 가장 충실히 보존하지만 1차 심장 조직 접근에 의존하고, 배양 내 생존성이 제한적이며, 쉽게 확장하기 어렵습니다.

최근에는 심장 오가노이드가 심장 조직 조직과 기능의 핵심 측면을 재현하는 접근 가능한 3D 모델 시스템으로 등장했습니다14. 카디오이드는 주로 심근세포로 구성된 자가 조립식 심장 오가노이드로, 내성 특성화, 공간 패턴 형성, 형태 발생을 거쳐 챔버 형태의 공동 구조를 형성합니다15,16. 심경 형성 방법은 일반적으로 Wnt 신호가 처음에 활성화되어 중배엽 특정화를 유도하고, 이후 억제하여 심장 계통 확신을 촉진하는 데 의존합니다. 카디오이드는 정적 또는 교반 현탁 배양에서 생성될 수 있으며, 이는 확장 가능한 생산을 지원하고 조직 자기조직을 강화합니다 15,16,17,18,19. 내피, 심외 또는 기타 세포 유형을 포함하는 더 복잡한 다계통 심장 오가노이드는 생리학적 관련성을 더욱 높이지만, 더 정교한 분화 프로토콜, 더 긴 배양 기간, 광범위한 최적화가 필요하다13,14.

인간 iPSC로부터 자기조직화 심근세포 기반 심장을 생성하고 이를 적용하여 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 평가하는 간단하고 재현 가능하며 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 심혈관 응용을 위한 올리고뉴클레오타이드 화학 및 전달 전략을 최적화하려는 연구자들에게 매우 유용할 것입니다. 이 연구에 사용된 모든 자료는 재료표에 나열되어 있습니다.

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프로토콜

1. 분별을 위한 iPSC의 배양 및 준비

주의: 모든 세포 및 배지는 인증된 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 개방 취급을 수행하십시오. 실험복과 장갑을 착용하세요. 작업 표면과 액체 폐기물은 적절한 소독제로 소독하세요.

  1. iPSC를 유지하세요.
    1. 제조사 지침에 따라 적절한 기저막 매트릭스를 가진 코트 배양 플레이트.
    2. iPSC에 명확하고 급식자가 없는 다능성 줄기세포 배지를 공급하고 배지를 24시간마다 교체합니다.
    3. 배양물을 과잉 수합 이하로 유지하며, 세포가 70–80% 수합에 도달하면 배양 배지를 유지합니다.
      참고: iPSC가 고품질의 미분화 형태를 유지하고 마이코플라즈마가 없는 것으로 확인된 후 분화를 시작해야 합니다.
  2. 분화 전 전달.
    1. iPSC를 해동하고 세포를 확장한 후 최소 두 번의 통과 후 심장 분화를 시작합니다.
    2. 효소 없는 해리 방법인 PBS-EDTA를 사용하는 통로 세포, iPSC 유지 치료와 호환됩니다.
      일시정지: iPSC를 70–80% 합류율에 도달할 때까지 배양 내에서 유지하며, 자발적 분화 징후 없이 전형적인 형태를 유지합니다.

2. 마이크로웰 플레이트 내 iPSC 응집체 제제

  1. iPSC를 단일 세포 현탁액에 해리시킵니다.
    1. 배지를 천공하고 1× PBS 1mL로 세포를 한 번 세척합니다.
    2. 세포 박리 용액(Accutase)을 6웰 플레이트의 웰당 500 μL에 첨가하고 37 °C에서 5–7분간 배양합니다.
    3. 웰당 세척 배지 1.5mL를 추가하고 부드럽게 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
    4. 현탁액을 15mL 원뿔관에 옮기고 200 × g에서 실온에서 3 분간 원 심분리기를 사용하세요.
    5. 상청액을 흡인한 후 세포 펠릿을 급식기 없는 iPSC 배지에 ROCK 억제제(마지막 10 μM)를 보충하여 재현탁합니다.
      참고: 각 iPSC 라인의 해리 인복 시간을 5분 후에 확인하고 필요 시 짧은 간격으로 확장하여 조정하세요.
  2. 셀 수를 세고 도금 밀도를 준비하세요.
    1. 표준 세포 계수 방법을 사용하여 생존 가능한 세포를 세세요.
    2. 800 μm 마이크로웰 집적 플레이트(24웰 형식, ~300 마이크로웰/웰)의 각 웰마다 0.9 ×10 6 셀/mL의 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
      참고: iPSC 라인마다 집계 크기나 분화 효율이 다르므로, 웰당 셀 수를 최적화해야 합니다.
  3. 마이크로웰 플레이트를 프라이밍하고 기포를 제거하세요.
    1. 각 웰에 ROCK 억제제를 포함한 피더 프리 iPSC 배지 500 μL(최종 10 μM)을 추가합니다.
    2. 마이크로웰 플레이트를 300 × g에서 실온에서 3 분간 원 심분리하여 마이크로웰 내 기포를 제거하세요.
      중요: 모든 기포를 완전히 제거하여 각 마이크로웰 바닥에 고르게 세포가 침착되고 효율적인 골재 형성을 지원해야 합니다.
  4. iPSC를 마이크로웰에 씨앗 뿌리세요.
    1. 각 웰에 각각 1.0mL의 단세포 현탁액(0.9 × 106 셀/mL)을 추가하면, 웰당 0.9 × 106 셀에 해당합니다.
    2. P1000을 사용해 웰 내에서 3–5번 부드럽게 재현탁하고 기포 유입을 피하세요.
    3. 플레이트를 200× g에서 실온에서 3 분간 원 심분리하여 마이크로웰에 셀을 펠릿 넣습니다.
    4. 세포가 마이크로웰에 침착했는지 현미경으로 확인한 후 플레이트를 37°C에 5% CO₂에 24시간 동안 배치하세요.
      중요: 원심분리 후 플레이트를 조심스럽게 다루세요. 플레이트를 흔들거나 흔들지 마세요. 이는 마이크로웰에서 세포가 떠올릴 수 있습니다.

3. 마이크로웰 내 iPSC 응집체 확장

  1. 골재를 흐트러뜨리거나 이탈시키지 않도록 조심스럽게 흡입하고 매질을 교체하세요.
    1. 플레이트를 기울이고 P1000 피펫을 사용해 각 웰에서 약 1.0mL의 배지를 천천히 흡입하여 골집체가 마이크로웰에 고정되도록 합니다.
    2. P1000 피펫을 사용해 남은 ~500 μL 배지를 천천히 흡입합니다.
    3. 각 웰에 피더 프리 iPSC 배지 1.5mL를 혈청학적 피펫을 사용해 천천히 분사하여 각 웰에 추가합니다.
    4. 37°C, 5% CO₂에서 배양하고 매체 교체를 매일 반복하세요.
      중요: 매지를 유정 벽에 공급하고 골재로 직접 흐르는 것을 방지하세요.

4. iPSC 집합체의 심장 분화 (0일차부터 12일차까지)

  1. 중배엽 유도 (0일차).
    1. 3.1.1–3.1.2 단계에 설명된 부드러운 흡인 방법을 사용하여 배지를 제거합니다.
    2. 기저 배지 1.5mL를 2% B27에서 인슐린을 뺀 2% 보완제와 Wnt/β-카테닌 경로 활성화제(CHIR99021, 최종 농도: 11 μM)를 첨가합니다.
      참고: 글리코겐 합성효소 키나제-3(GSK-3)의 소분자 억제제인 CHIR99021 10 mM 스톡 용액을 준비하세요. 최종 농도가 11 μM을 얻으려면, 1.65 μL 스톡 용액을 1.5 mL의 배지에 첨가합니다.
  2. 유도분만 후 중간 정도의 변화 (첫날).
    1. CHIR99021 첨가 후 24시간 후에 각 웰에서 매지를 부드럽게 흡입합니다.
    2. 신선한 기저 배지 1.5mL를 2% B27에서 인슐린을 뺀 상태로 웰당 추가한 후 48시간 배양합니다.
      중요: Wnt 변조 단계의 타이밍을 엄격히 준수해야 하며, 편차가 미분 효율을 저해할 수 있습니다.
      참고: Wnt/β-카테닌 경로 활성화제에 노출되면 일부 세포 사멸이 예상됩니다. 만약 광범위한 집합체 손실이 관찰된다면, 향후 실험에서 활성제 농도를 낮추는 것을 고려할 수 있습니다.
  3. WNT 억제를 통한 심장 입고 (3일차).
    1. 각 웰에서 사용한 매지 760 μL을 멸균 50 mL 원뿔 튜브로 옮겨 조절 배지를 준비합니다.
    2. 각 웰마다 2% B27에서 인슐린을 제외한 신선한 기저 배지 760 μL을 조절된 배지를 담은 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다.
    3. 혼합 배지에 Wnt 경로 억제제인 IWP4를 최종 농도인 5 μM까지 첨가한 후, 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
    4. 각 웰에서 남은 배지를 조심스럽게 흡인한 후, IWP4를 보충한 조절된 배지당 1.5mL를 추가합니다.
    5. 37°C에서 5% CO₂와 함께 48시간 부양하세요.
      참고: Wnt 경로 억제제 IWP4의 1 mM 재고 용액을 준비하십시오. 최종 농도가 5 μM을 얻기 위해서는 각 웰마다 총 배지 1.52 mL(760 μL 조절 배지 + 760 μL 신선 기저 배지)당 7.6 μL 스톡 용액을 첨가합니다.
  4. 마이크로웰에서 중간 변화 (5일차).
    1. 3.1.1–3.1.2 단계에 설명된 부드러운 흡기 방식을 사용하여 매체를 대체합니다.
    2. 각 웰에 2% B27에서 인슐린을 제외한 1.5mL의 기저 배지를 추가한 후, 5% CO₂와 함께 37°C에서 48시간 배양합니다.
  5. 마이크로웰에서 6웰 플레이트로 골재를 옮기세요 (7일차).
    1. 각 우물에서 매질을 3.1.1–3.1.2 단계에 설명된 부드러운 흡기 방법으로 조심스럽게 흡입하세요.
    2. 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 2% B27과 인슐린을 보충한 기저배지 1.0mL를 추가합니다. P1000 피펫을 사용해 매체를 부드럽게 위아래로 다섯 번 움직이면서 피펫 팁을 원을 그리며 움직여 마이크로웰 내 응집체를 떨어뜨리고 현탁액으로 옮깁니다.
    3. 골재 현탁액을 처리되지 않은 6웰 배양판의 단일 웰로 옮깁니다.
    4. 마이크로웰 플레이트의 각 웰을 추가로 1.0mL의 신선한 배지를 두세 번 헹구어 남은 응집체를 회수하고, 각 헹구를 6웰 플레이트의 동일한 웰로 옮깁니다.
    5. 37°C에서 5% CO₂와 함께 72시간 배양하세요.
      참고: 집합체 이동 후 죽은 세포와 세포 잔해가 존재할 것으로 예상됩니다. 대부분의 이물질은 이후 매질 변화 과정에서 제거됩니다.
  6. 현탁 배양 중 중간 변화 (10일차).
    1. 판을 부드럽게 흔들어 느슨하게 붙은 골재를 떼어내세요.
    2. 중력에 의해 골재가 우물 바닥에 가라앉도록 판을 기울이세요.
    3. 사용된 배지를 조심스럽게 흡입하여 골재를 건드리거나 흡입하지 마세요.
    4. 각 웰에 2% B27과 인슐린을 첨가한 신선한 기저배지 2.0mL를 추가하고, 37°C에서 5% CO₂와 함께 48–72시간 배양합니다.
      참고: 자발적인 구타는 보통 10일째 이후로 관찰됩니다.
      멈춤 지점: 박동 카디오이드는 2-3일마다 배지를 교체하여 현탁 배양에서 장기간 성숙을 유지할 수 있습니다.

5. 심장의 현미경적 특성 분석

참고: 이 방법은 냉동절개를 이용한 심근 세포의 조직학적 특성 분석 워크플로우를 제공합니다. 결과된 절편들은 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 통해 전체 조직 구조를 평가하고, 면역형광 표지로 심근세포 정체성을 평가하는 등 다양한 조직학적 분석에 활용될 수 있습니다.

  1. 고정과 냉동절.
    1. 카디오이드를 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 하룻밤 고정하세요.
      주의: 파라포름알데히드는 독성이 있으며 발암 가능성이 높습니다; 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 연기 후드에서 다루세요. 모든 파라포름알데히드 함유 폐기물(고정제 및 세척제)을 알데히드/화학 유해 폐기물용 명확히 라벨이 붙은 용기에 수집하고, 기관 유해 폐기물 절차에 따라 폐기하십시오.
      안전: 모든 파라포름알데히드 고정 및 취급은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 연기 후드에서 수행해야 합니다.
    2. PBS로 세 번 세척한 후, 고정된 카디오이드를 30% 자당에 담근 4°C에서 밤새 세척하세요.
    3. 카디오이드를 젤라틴에 박고 냉동한 뒤, 10 μm 두께의 냉동 절제본을 현미경 슬라이드에 절단합니다. 사용 전까지 구간을 −20 °C에서 보관하세요.
  2. 면역 표지.
    1. 상온에서 15분간 구간을 해동하세요.
    2. 37°C에서 PBS로 10분간 두 번 세척하세요.
    3. 각 슬라이드의 관심 영역을 소수성 펜으로 동그라미 그려 차단액과 항체 용액을 보존하는 웰을 만듭니다.
    4. 절단부를 2–3분간 투과성 완충제(PB)에서 재수화하세요; 코플린 병에 0.1% Tween-20을 함유한 PBS입니다.
    5. 슬라이드를 PB에서 분리하고 남은 용액을 빼낸 후 슬라이드를 습한 챔버에 넣으세요.
      중요: 이 시점부터는 구간이 마르지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.
    6. 5% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 200–300 μL PB로 습한 챔버에서 90분간 차단합니다.
    7. 차단액을 제거하고 4°C에서 100 μL 100 μL의 1차 항체(항-cMYBP-C; 1:50)를 차단용액(1% FBS 함유 PB)에 희석한 상태로 분할을 배양합니다.
    8. 슬라이드를 PB로 세 번 세척한 후, 녹색 형광 항생쥐 2차 항체(1:200), 원적색 형광 팔로이딘(1:400), DAPI(1 μg/mL)와 함께 실온에서 2시간 배양합니다.
    9. PB로 세 번 세척한 후 안티페이드 마운팅 매체로 장착하세요.
      주의: 형광염료 함유 용액(2차 항체, 팔로이딘, DAPI 염색액 및 해당 세척액)을 용기에 수집하여 기관 지침에 따라 화학 폐기물로 폐기하십시오.
  3. 이미지 획득.
    1. 10× 및 63×/1.40 유류 침수 대물렌즈를 사용하여 초해상도 영상을 위한 배열 검출기가 장착된 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 획득합니다.
    2. 원적색 형광체, 녹색 형광체, 핵 염색을 각각 4.0%, 4.0%, 4.0%, 4.0%, 1.0% 레이저 투과율로 각각 639 nm, 488 nm, 405 nm 레이저 라인으로 여기시킵니다.
    3. 픽셀 크기가 0.0353 × 0.0353 μm2, 단방향 스캔, 스캔 속도 6, 줌 1.7, 라인 평균 1, 픽셀당 0.935 μs의 픽셀 체류 시간을 가진 단일 광학 섹션을 획득합니다.
    4. 자동 위너 필터링을 이용한 배열 검출기 초해상도 이미지 처리를 적용합니다.

6. 형광 올리고뉴클레오타이드 흡수 분석

  1. 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 팔미산에 결합한 스톡 용액을 준비하여 지친성을 증가시킵니다.
    1. 뉴클레아제가 없는 물에서 최종 농도인 1 mM까지 동성화된 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 재구성합니다. 소용돌이를 잠시 가하고 3,000 × g 에서 30초간 원심분리하여 튜브 바닥에서 용액을 수집합니다.
    2. 1 mM 스톡 용액을 일회용 알리코트로 준비하여 빛으로부터 보호한 채 −20 °C에서 보관하세요.
    3. 실험 당일, 1 mM 스톡 1 μL을 1 mL의 카디오이드 배양 배양액에 첨가하여 최종 올리고뉴클레오타이드 농도인 1 μM을 얻습니다. 부드러운 판 교반으로 혼합합니다.
  2. 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 1 μM)를 혈청 무첨가 배지에서 37°C, 5% CO₂에 24시간 배양합니다.
  3. 심장을 인산염 완충식염수(PBS)로 세 번 세척하여 세포외 올리고뉴클레오타이드를 제거합니다.
  4. 카디오이드를 4% 파라포름알데히드에 상온에서 20분간 고정하고, PBS로 세 번 세척한 후 형광 표지로 이어서 영상 촬영을 합니다.
  5. 빛으로부터 보호한 채 빛으로부터 보호된 상태에서 5 μg/mL 밀 생아 응집체(WGA)와 녹색 형광체, 1 μg/mL DAPI가 결합된 PBS에 온전한 고정 심장 세포를 배양합니다. PBS로 세 번 세척한 후 안티페이드 마운팅 매체를 사용하세요.
    주의: 6.2단계의 표지된 올리고뉴클레오타이드 배양지와 WGA/DAPI 염색액을 포함한 모든 올리고뉴클레오타이드 및 형광 염료 함유 배지와 세척액을 별도의 용기에 수집하여 기관 지침에 따라 화학/생물학적 위험 폐기물로 폐기하십시오.
  6. 올리고뉴클레오타이드 흡수 및 분포의 공초점 이미지를 획득합니다.
    1. 레이저 주사 공초점 현미경과 초해상도 이미징용 배열 검출기, 40× 수중 대물렌즈를 사용하여 공초점 이미지를 획득할 수 있습니다. 이미지를 8섹션 z-스택으로 획득하며, z-단계 크기는 2 μm, 총 깊이는 16 μm입니다.
    2. 핵 염색, 멤브레인 마커, 원적색 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 각각 0.9%, 0.2%, 3.0% 레이저 투과율로 각각 405nm, 488nm, 639nm 레이저 라인으로 여기시킵니다.
    3. 복셀 크기가 0.0449× 0.0449 × 2 μm3, 양방향 스캔, 스캔 속도 5, 라인 평균 1, 픽셀당 1.51 μs의 픽셀 체류 시간을 가진 이미지를 획득할 수 있습니다. 자동 위너 필터링을 이용한 Airyscan/초해상도 이미지 처리를 적용하세요.
    4. 모든 획득 설정(레이저 파워, 검출기 이득, z-스텝, 복셀 크기)을 모든 z-위치와 모든 샘플에서 일정하게 유지하여 조건 간 올리고뉴클레오타이드 신호를 유효하게 비교할 수 있도록 해야 합니다.

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결과

그림 1 은 분화 작업 흐름을 요약하고, iPSC 집집에서 자기조직성 심장 형성에 이르기까지 프로토콜의 각 단계에서 예상되는 특징적인 형태학적 변화를 보여줍니다. 현탁 기반 마이크로웰 집적은 대량의 크기가 제어되는 카디오이드를 병렬로 생성하는 간단하고 표준화된 접근법을 제공합니다. 성공적인 분화는 균일한 크기의 집합체가 생성되고, 이어서 내부 공동이 형성되며 자발적인 파동이 시작되는 것이 특징이며, 보통 10일째부터 나타납니다. 이러한 형태학적 특징들은 심장 생성의 효율성과 재현성을 평가하는 실질적인 품질 관리 기준을 제공합니다.

심근 구조와 조직 조직은 냉동절부의 조직학적 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 그림 2에서 보듯, 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 성공적으로 분화된 심성 세포에 대해 하나 이상의 내부...

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토론

올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 수십 년간 발전한 올리고뉴클레오타이드 화학의 발전으로 강력한 유전자 표적 기법 범주로 부상했으며, 표적 특이성, 대사 안정성, 면역원 내약성을 향상시켰습니다 7,8. 임상적으로 승인된 RNA 치료제가 증가하고 있음에도 불구하고, 비효율적인 세포내 전달 때문에 광범위한 적용은 여전히 제한되고 있습니다 7,8. 크기, 전하, 친수성 때문에 올리고뉴클레오타이드는 원형질막을 가로질러 수동적으로 확산되지 않고 대신 엔도사이틱 경로를 통해 내부화됩니다 9,10. 흡수 후, 내부화된 올리고뉴클레오타이드의 대다수(~99%)는 내체체 구획<...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

노보노르디스크 재단 최적화 올리고 탈출 챌린지 센터의 구성원들, 특히 올리고뉴클레오타이드 설계 및 합성에 대해 Knud Jensen, 정량적 영상 및 세포 내 수송 분석에 귀중한 지침을 제공해 주신 Nikos S. Hatzakis와 Tomas Kirchhausen에게 감사드립니다. 이 연구는 노보 노르디스크 재단 최적화 올리고 탈출 챌린지 센터(NNF23OC0081287)의 지원을 받았습니다. M.F.는 포르투갈 과학기술재단(FCT, 2020.04836.BD)으로부터 펠로우십을 받았습니다. 기술 지원을 제공해 주신 GIMM 생물영상 및 GIMM 조직병리학 플랫폼(포르투갈 리스본)에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

참고문헌

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

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