올리고뉴클레오타이드 전달 평가를 위한 인간 유도 다능성 줄기세포 유래 심장 기반 심장 실험 모델로 활용

요약

이 프로토콜은 인간이 유도한 다능성 줄기세포로부터 자기조직화 심근세포 기반 심장 유사체를 생성하여 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 현미경 흡수를 평가할 수 있게 합니다.

초록

올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 심혈관 질환 치료에 상당한 잠재력을 가진 빠르게 발전하는 약물군을 대표합니다; 그러나 심장 조직에 효율적인 전달을 달성하는 것은 여전히 중요하고 해결되지 않은 과제로 남아 있습니다. 주요 장애물은 올리고뉴클레오타이드 세포 흡수와 세포 내 분포를 정량적으로 평가할 수 있는 견고하고 생리학적으로 적합한 인간 in vitro 모델의 제한적 가용성입니다. 인간 유도 다능 줄기세포(iPSC)로부터 자기조직화 3D 심장유사체를 생성하고, 이를 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 흡수 평가 플랫폼으로 적용하는 상세한 단계별 프로토콜이 제시되었습니다. 이 프로토콜은 Wnt/β-카테닌 신호를 시간적으로 조절하여 현탁 배양에서 방향성 심장 분화를 안내하여, 중배엽, 심장 중배엽, 심근세포 전구기 단계에 걸쳐 iPSC를 순차적으로 지정할 수 있게 합니다. 이러한 조건에서 세포는 자발적으로 박동하는 공동체 내 3차원 구조로 조립되어 정식 심근세포 표지를 표현합니다. 결과적으로 생성된 카디오이드는 올리고뉴클레오타이드 흡수 효율을 영상 기반 평가를 위한 확장 가능하고 실험적으로 다루기 쉬운 플랫폼을 제공하여 심장 응용을 위한 전달 전략 개발 및 최적화를 지원합니다.

서론

주로 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)와 소량 간섭 RNA(siRNA)를 기반으로 하는 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 유전성 및 후천^{성 질환을} 포함한 다양한 질환 치료에 혁신적이고 매우 특이적인 접근법으로 빠르게 부상하고 있습니다. ^1,2,3. 이러한 모달리티는 표적 전사체에 서열 특이적 결합을 통해 mRNA 수준에서 유전자 발현을 직접 조절할 수 있게 하여, 기존 소분자 치료로는 접근하기 어려운 질병 관련 유전자의 유전자 침묵 또는 스플라이싱 교정을 가능하게^합니다. 따라서 올리고뉴클레오타이드 기반 유전자 치료제는 심혈관 질환을 포함한 여러 질환 영역에서 다양한 병원성 기전을 표적으로 삼을 수 있는 다목적 플랫폼을^{제공합니다.} 현재까지 ASO, siRNA, 접합 전환 약물 등 여러 올리고뉴클레오타이드 기반 치료제가 임상용으로 승인되었습니다⁷. 이러한 진전에도 불구하고, 전임상 및 임상 환경에서의 치료 효능은 비효율적인 세포 내 전달로 인해 여전히 제약을 받고 있습니다^. 현재 추정치에 따르면 내화된 올리고뉴클레오타이드 중 1% 미만만이 내체체 구획을 벗어나 세포질에 도달해 목표 RNA와 결합하여 기능 활성을 제한합니다 ^9,10. 이 한계는 특히 심장 조직에서 두드러지는데, 세포 내 흡수와 이동이 잘 알려져 있지 않습니다.

역사적으로 심혈관 치료제의 전임상 평가는 동물 모델에 크게 의존해 왔으며, 이는 생 체 내 약물동학, 생체 분포, 효능 및 안전성 평가에 필수적입니다. 그러나 심장 생리학, 유전자 조절, 세포 반응에서의 중요한 종간 차이는 인간에서 치료 효능과 독성을 정확히 예측하는 데 종종 제한적입니다. 이러한 한계는 생리학적 관련성이 향상된 인간 기반 시험관 내 모델 개발을 촉진했습니다. 그중 인간 유도 다능 줄기세포(iPSC) 기술은 심혈관 질환 모델링에 혁명을 일으켰으며, 이를 통해 심혈관 계통으로 분화할 수 있는 사실상 무한한 세포 공급원을 제공했습니다. 인간 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CMs)는 인간 심근의 분자적, 구조적, 기능적 특성을 많이 재현하며, 질병 기전, 약물 반응, 신흥 치료 기법 연구를 위한 널리 채택된 플랫폼이^{되었습니다.} 그러나 인간 iPSC-CMs의 기존 2차원 배양에는 중요한 한계가 있습니다. 대부분의 분화 프로토콜은 성체 세포가 아닌 태아 세포와 유사한 심근세포를 생성하며, 미성숙한 구조적, 전기생리적, 대사적, 수축성 특성을 보입니다¹².

더불어, 단층 배양은 심근 세포 기능에 영향을 미치는 3차원(3D) 조직 구조, 다세포 상호작용, 세포외 기질 구성이 부족합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 점점 더 정교해지는 3D 심장 모델^{이 개발되었습니다}. 이 중 iPSC-CM을 생체 소재 스캐폴드 내에 삽입하고 기계적 및 전기적 자극을 적용하여 생성되는 인공 심장 조직(EHT)은 구조적·기능적 성숙을 촉진하면서 토착 심근의 생체역학적 환경을 보다 가깝게 재현^합니다. EHT는 질병 모델링과 약물 검사를 위한 생리학적으로 매우 중요한 플랫폼을 제공하지만, 생성에는 일반적으로 전문적인 생명공학 전문성과 전용 장비가 필요합니다. 반대편에서는 체외 심장 조직 절편이 원래 조직 구조와 세포 구성을 가장 충실히 보존하지만 1차 심장 조직 접근에 의존하고, 배양 내 생존성이 제한적이며, 쉽게 확장하기 어렵습니다.

최근에는 심장 오가노이드가 심장 조직 조직과 기능의 핵심 측면을 재현하는 접근 가능한 3D 모델 시스템으로 등장했습니다¹⁴. 카디오이드는 주로 심근세포로 구성된 자가 조립식 심장 오가노이드로, 내성 특성화, 공간 패턴 형성, 형태 발생을 거쳐 챔버 형태의 공동 구조를 형성합니다^15,16. 심경 형성 방법은 일반적으로 Wnt 신호가 처음에 활성화되어 중배엽 특정화를 유도하고, 이후 억제하여 심장 계통 확신을 촉진하는 데 의존합니다. 카디오이드는 정적 또는 교반 현탁 배양에서 생성될 수 있으며, 이는 확장 가능한 생산을 지원하고 조직 자기조직을 강화합니다 ^{15,16,17,18,19}. 내피, 심외 또는 기타 세포 유형을 포함하는 더 복잡한 다계통 심장 오가노이드는 생리학적 관련성을 더욱 높이지만, 더 정교한 분화 프로토콜, 더 긴 배양 기간, 광범위한 최적화가 필요하다^13,14.

인간 iPSC로부터 자기조직화 심근세포 기반 심장을 생성하고 이를 적용하여 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 평가하는 간단하고 재현 가능하며 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 심혈관 응용을 위한 올리고뉴클레오타이드 화학 및 전달 전략을 최적화하려는 연구자들에게 매우 유용할 것입니다. 이 연구에 사용된 모든 자료는 재료표에 나열되어 있습니다.

프로토콜

1. 분별을 위한 iPSC의 배양 및 준비

주의: 모든 세포 및 배지는 인증된 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 개방 취급을 수행하십시오. 실험복과 장갑을 착용하세요. 작업 표면과 액체 폐기물은 적절한 소독제로 소독하세요.

1. iPSC를 유지하세요.
   1. 제조사 지침에 따라 적절한 기저막 매트릭스를 가진 코트 배양 플레이트.
   2. iPSC에 명확하고 급식자가 없는 다능성 줄기세포 배지를 공급하고 배지를 24시간마다 교체합니다.
   3. 배양물을 과잉 수합 이하로 유지하며, 세포가 70–80% 수합에 도달하면 배양 배지를 유지합니다.
      참고: iPSC가 고품질의 미분화 형태를 유지하고 마이코플라즈마가 없는 것으로 확인된 후 분화를 시작해야 합니다.
2. 분화 전 전달.
   1. iPSC를 해동하고 세포를 확장한 후 최소 두 번의 통과 후 심장 분화를 시작합니다.
   2. 효소 없는 해리 방법인 PBS-EDTA를 사용하는 통로 세포, iPSC 유지 치료와 호환됩니다.
      일시정지: iPSC를 70–80% 합류율에 도달할 때까지 배양 내에서 유지하며, 자발적 분화 징후 없이 전형적인 형태를 유지합니다.

2. 마이크로웰 플레이트 내 iPSC 응집체 제제

1. iPSC를 단일 세포 현탁액에 해리시킵니다.
   1. 배지를 천공하고 1× PBS 1mL로 세포를 한 번 세척합니다.
   2. 세포 박리 용액(Accutase)을 6웰 플레이트의 웰당 500 μL에 첨가하고 37 °C에서 5–7분간 배양합니다.
   3. 웰당 세척 배지 1.5mL를 추가하고 부드럽게 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
   4. 현탁액을 15mL 원뿔관에 옮기고 200 × g에서 실온에서 3 분간 원 심분리기를 사용하세요.
   5. 상청액을 흡인한 후 세포 펠릿을 급식기 없는 iPSC 배지에 ROCK 억제제(마지막 10 μM)를 보충하여 재현탁합니다.
      참고: 각 iPSC 라인의 해리 인복 시간을 5분 후에 확인하고 필요 시 짧은 간격으로 확장하여 조정하세요.
2. 셀 수를 세고 도금 밀도를 준비하세요.
   1. 표준 세포 계수 방법을 사용하여 생존 가능한 세포를 세세요.
   2. 800 μm 마이크로웰 집적 플레이트(24웰 형식, ~300 마이크로웰/웰)의 각 웰마다 0.9 ×^{10 6} 셀/mL의 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
      참고: iPSC 라인마다 집계 크기나 분화 효율이 다르므로, 웰당 셀 수를 최적화해야 합니다.
3. 마이크로웰 플레이트를 프라이밍하고 기포를 제거하세요.
   1. 각 웰에 ROCK 억제제를 포함한 피더 프리 iPSC 배지 500 μL(최종 10 μM)을 추가합니다.
   2. 마이크로웰 플레이트를 300 × g에서 실온에서 3 분간 원 심분리하여 마이크로웰 내 기포를 제거하세요.
      중요: 모든 기포를 완전히 제거하여 각 마이크로웰 바닥에 고르게 세포가 침착되고 효율적인 골재 형성을 지원해야 합니다.
4. iPSC를 마이크로웰에 씨앗 뿌리세요.
   1. 각 웰에 각각 1.0mL의 단세포 현탁액(0.9 × 10⁶ 셀/mL)을 추가하면, 웰당 0.9 × 10⁶ 셀에 해당합니다.
   2. P1000을 사용해 웰 내에서 3–5번 부드럽게 재현탁하고 기포 유입을 피하세요.
   3. 플레이트를 200× g에서 실온에서 3 분간 원 심분리하여 마이크로웰에 셀을 펠릿 넣습니다.
   4. 세포가 마이크로웰에 침착했는지 현미경으로 확인한 후 플레이트를 37°C에 5% CO₂에 24시간 동안 배치하세요.
      중요: 원심분리 후 플레이트를 조심스럽게 다루세요. 플레이트를 흔들거나 흔들지 마세요. 이는 마이크로웰에서 세포가 떠올릴 수 있습니다.

3. 마이크로웰 내 iPSC 응집체 확장

1. 골재를 흐트러뜨리거나 이탈시키지 않도록 조심스럽게 흡입하고 매질을 교체하세요.
   1. 플레이트를 기울이고 P1000 피펫을 사용해 각 웰에서 약 1.0mL의 배지를 천천히 흡입하여 골집체가 마이크로웰에 고정되도록 합니다.
   2. P1000 피펫을 사용해 남은 ~500 μL 배지를 천천히 흡입합니다.
   3. 각 웰에 피더 프리 iPSC 배지 1.5mL를 혈청학적 피펫을 사용해 천천히 분사하여 각 웰에 추가합니다.
   4. 37°C, 5% CO₂에서 배양하고 매체 교체를 매일 반복하세요.
      중요: 매지를 유정 벽에 공급하고 골재로 직접 흐르는 것을 방지하세요.

4. iPSC 집합체의 심장 분화 (0일차부터 12일차까지)

1. 중배엽 유도 (0일차).
   1. 3.1.1–3.1.2 단계에 설명된 부드러운 흡인 방법을 사용하여 배지를 제거합니다.
   2. 기저 배지 1.5mL를 2% B27에서 인슐린을 뺀 2% 보완제와 Wnt/β-카테닌 경로 활성화제(CHIR99021, 최종 농도: 11 μM)를 첨가합니다.
      참고: 글리코겐 합성효소 키나제-3(GSK-3)의 소분자 억제제인 CHIR99021 10 mM 스톡 용액을 준비하세요. 최종 농도가 11 μM을 얻으려면, 1.65 μL 스톡 용액을 1.5 mL의 배지에 첨가합니다.
2. 유도분만 후 중간 정도의 변화 (첫날).
   1. CHIR99021 첨가 후 24시간 후에 각 웰에서 매지를 부드럽게 흡입합니다.
   2. 신선한 기저 배지 1.5mL를 2% B27에서 인슐린을 뺀 상태로 웰당 추가한 후 48시간 배양합니다.
      중요: Wnt 변조 단계의 타이밍을 엄격히 준수해야 하며, 편차가 미분 효율을 저해할 수 있습니다.
      참고: Wnt/β-카테닌 경로 활성화제에 노출되면 일부 세포 사멸이 예상됩니다. 만약 광범위한 집합체 손실이 관찰된다면, 향후 실험에서 활성제 농도를 낮추는 것을 고려할 수 있습니다.
3. WNT 억제를 통한 심장 입고 (3일차).
   1. 각 웰에서 사용한 매지 760 μL을 멸균 50 mL 원뿔 튜브로 옮겨 조절 배지를 준비합니다.
   2. 각 웰마다 2% B27에서 인슐린을 제외한 신선한 기저 배지 760 μL을 조절된 배지를 담은 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다.
   3. 혼합 배지에 Wnt 경로 억제제인 IWP4를 최종 농도인 5 μM까지 첨가한 후, 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
   4. 각 웰에서 남은 배지를 조심스럽게 흡인한 후, IWP4를 보충한 조절된 배지당 1.5mL를 추가합니다.
   5. 37°C에서 5% CO₂와 함께 48시간 부양하세요.
      참고: Wnt 경로 억제제 IWP4의 1 mM 재고 용액을 준비하십시오. 최종 농도가 5 μM을 얻기 위해서는 각 웰마다 총 배지 1.52 mL(760 μL 조절 배지 + 760 μL 신선 기저 배지)당 7.6 μL 스톡 용액을 첨가합니다.
4. 마이크로웰에서 중간 변화 (5일차).
   1. 3.1.1–3.1.2 단계에 설명된 부드러운 흡기 방식을 사용하여 매체를 대체합니다.
   2. 각 웰에 2% B27에서 인슐린을 제외한 1.5mL의 기저 배지를 추가한 후, 5% CO₂와 함께 37°C에서 48시간 배양합니다.
5. 마이크로웰에서 6웰 플레이트로 골재를 옮기세요 (7일차).
   1. 각 우물에서 매질을 3.1.1–3.1.2 단계에 설명된 부드러운 흡기 방법으로 조심스럽게 흡입하세요.
   2. 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 2% B27과 인슐린을 보충한 기저배지 1.0mL를 추가합니다. P1000 피펫을 사용해 매체를 부드럽게 위아래로 다섯 번 움직이면서 피펫 팁을 원을 그리며 움직여 마이크로웰 내 응집체를 떨어뜨리고 현탁액으로 옮깁니다.
   3. 골재 현탁액을 처리되지 않은 6웰 배양판의 단일 웰로 옮깁니다.
   4. 마이크로웰 플레이트의 각 웰을 추가로 1.0mL의 신선한 배지를 두세 번 헹구어 남은 응집체를 회수하고, 각 헹구를 6웰 플레이트의 동일한 웰로 옮깁니다.
   5. 37°C에서 5% CO₂와 함께 72시간 배양하세요.
      참고: 집합체 이동 후 죽은 세포와 세포 잔해가 존재할 것으로 예상됩니다. 대부분의 이물질은 이후 매질 변화 과정에서 제거됩니다.
6. 현탁 배양 중 중간 변화 (10일차).
   1. 판을 부드럽게 흔들어 느슨하게 붙은 골재를 떼어내세요.
   2. 중력에 의해 골재가 우물 바닥에 가라앉도록 판을 기울이세요.
   3. 사용된 배지를 조심스럽게 흡입하여 골재를 건드리거나 흡입하지 마세요.
   4. 각 웰에 2% B27과 인슐린을 첨가한 신선한 기저배지 2.0mL를 추가하고, 37°C에서 5% CO₂와 함께 48–72시간 배양합니다.
      참고: 자발적인 구타는 보통 10일째 이후로 관찰됩니다.
      멈춤 지점: 박동 카디오이드는 2-3일마다 배지를 교체하여 현탁 배양에서 장기간 성숙을 유지할 수 있습니다.

5. 심장의 현미경적 특성 분석

참고: 이 방법은 냉동절개를 이용한 심근 세포의 조직학적 특성 분석 워크플로우를 제공합니다. 결과된 절편들은 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 통해 전체 조직 구조를 평가하고, 면역형광 표지로 심근세포 정체성을 평가하는 등 다양한 조직학적 분석에 활용될 수 있습니다.

1. 고정과 냉동절.
   1. 카디오이드를 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 하룻밤 고정하세요.
      주의: 파라포름알데히드는 독성이 있으며 발암 가능성이 높습니다; 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 연기 후드에서 다루세요. 모든 파라포름알데히드 함유 폐기물(고정제 및 세척제)을 알데히드/화학 유해 폐기물용 명확히 라벨이 붙은 용기에 수집하고, 기관 유해 폐기물 절차에 따라 폐기하십시오.
      안전: 모든 파라포름알데히드 고정 및 취급은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 연기 후드에서 수행해야 합니다.
   2. PBS로 세 번 세척한 후, 고정된 카디오이드를 30% 자당에 담근 4°C에서 밤새 세척하세요.
   3. 카디오이드를 젤라틴에 박고 냉동한 뒤, 10 μm 두께의 냉동 절제본을 현미경 슬라이드에 절단합니다. 사용 전까지 구간을 −20 °C에서 보관하세요.
2. 면역 표지.
   1. 상온에서 15분간 구간을 해동하세요.
   2. 37°C에서 PBS로 10분간 두 번 세척하세요.
   3. 각 슬라이드의 관심 영역을 소수성 펜으로 동그라미 그려 차단액과 항체 용액을 보존하는 웰을 만듭니다.
   4. 절단부를 2–3분간 투과성 완충제(PB)에서 재수화하세요; 코플린 병에 0.1% Tween-20을 함유한 PBS입니다.
   5. 슬라이드를 PB에서 분리하고 남은 용액을 빼낸 후 슬라이드를 습한 챔버에 넣으세요.
      중요: 이 시점부터는 구간이 마르지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.
   6. 5% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 200–300 μL PB로 습한 챔버에서 90분간 차단합니다.
   7. 차단액을 제거하고 4°C에서 100 μL 100 μL의 1차 항체(항-cMYBP-C; 1:50)를 차단용액(1% FBS 함유 PB)에 희석한 상태로 분할을 배양합니다.
   8. 슬라이드를 PB로 세 번 세척한 후, 녹색 형광 항생쥐 2차 항체(1:200), 원적색 형광 팔로이딘(1:400), DAPI(1 μg/mL)와 함께 실온에서 2시간 배양합니다.
   9. PB로 세 번 세척한 후 안티페이드 마운팅 매체로 장착하세요.
      주의: 형광염료 함유 용액(2차 항체, 팔로이딘, DAPI 염색액 및 해당 세척액)을 용기에 수집하여 기관 지침에 따라 화학 폐기물로 폐기하십시오.
3. 이미지 획득.
   1. 10× 및 63×/1.40 유류 침수 대물렌즈를 사용하여 초해상도 영상을 위한 배열 검출기가 장착된 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 획득합니다.
   2. 원적색 형광체, 녹색 형광체, 핵 염색을 각각 4.0%, 4.0%, 4.0%, 4.0%, 1.0% 레이저 투과율로 각각 639 nm, 488 nm, 405 nm 레이저 라인으로 여기시킵니다.
   3. 픽셀 크기가 0.0353 × 0.0353 μm², 단방향 스캔, 스캔 속도 6, 줌 1.7, 라인 평균 1, 픽셀당 0.935 μs의 픽셀 체류 시간을 가진 단일 광학 섹션을 획득합니다.
   4. 자동 위너 필터링을 이용한 배열 검출기 초해상도 이미지 처리를 적용합니다.

6. 형광 올리고뉴클레오타이드 흡수 분석

1. 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 팔미산에 결합한 스톡 용액을 준비하여 지친성을 증가시킵니다.
   1. 뉴클레아제가 없는 물에서 최종 농도인 1 mM까지 동성화된 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 재구성합니다. 소용돌이를 잠시 가하고 3,000 × g 에서 30초간 원심분리하여 튜브 바닥에서 용액을 수집합니다.
   2. 1 mM 스톡 용액을 일회용 알리코트로 준비하여 빛으로부터 보호한 채 −20 °C에서 보관하세요.
   3. 실험 당일, 1 mM 스톡 1 μL을 1 mL의 카디오이드 배양 배양액에 첨가하여 최종 올리고뉴클레오타이드 농도인 1 μM을 얻습니다. 부드러운 판 교반으로 혼합합니다.
2. 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드(최종 농도 1 μM)를 혈청 무첨가 배지에서 37°C, 5% CO₂에 24시간 배양합니다.
3. 심장을 인산염 완충식염수(PBS)로 세 번 세척하여 세포외 올리고뉴클레오타이드를 제거합니다.
4. 카디오이드를 4% 파라포름알데히드에 상온에서 20분간 고정하고, PBS로 세 번 세척한 후 형광 표지로 이어서 영상 촬영을 합니다.
5. 빛으로부터 보호한 채 빛으로부터 보호된 상태에서 5 μg/mL 밀 생아 응집체(WGA)와 녹색 형광체, 1 μg/mL DAPI가 결합된 PBS에 온전한 고정 심장 세포를 배양합니다. PBS로 세 번 세척한 후 안티페이드 마운팅 매체를 사용하세요.
   주의: 6.2단계의 표지된 올리고뉴클레오타이드 배양지와 WGA/DAPI 염색액을 포함한 모든 올리고뉴클레오타이드 및 형광 염료 함유 배지와 세척액을 별도의 용기에 수집하여 기관 지침에 따라 화학/생물학적 위험 폐기물로 폐기하십시오.
6. 올리고뉴클레오타이드 흡수 및 분포의 공초점 이미지를 획득합니다.
   1. 레이저 주사 공초점 현미경과 초해상도 이미징용 배열 검출기, 40× 수중 대물렌즈를 사용하여 공초점 이미지를 획득할 수 있습니다. 이미지를 8섹션 z-스택으로 획득하며, z-단계 크기는 2 μm, 총 깊이는 16 μm입니다.
   2. 핵 염색, 멤브레인 마커, 원적색 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 각각 0.9%, 0.2%, 3.0% 레이저 투과율로 각각 405nm, 488nm, 639nm 레이저 라인으로 여기시킵니다.
   3. 복셀 크기가 0.0449× 0.0449 × 2 μm³, 양방향 스캔, 스캔 속도 5, 라인 평균 1, 픽셀당 1.51 μs의 픽셀 체류 시간을 가진 이미지를 획득할 수 있습니다. 자동 위너 필터링을 이용한 Airyscan/초해상도 이미지 처리를 적용하세요.
   4. 모든 획득 설정(레이저 파워, 검출기 이득, z-스텝, 복셀 크기)을 모든 z-위치와 모든 샘플에서 일정하게 유지하여 조건 간 올리고뉴클레오타이드 신호를 유효하게 비교할 수 있도록 해야 합니다.

결과

그림 1 은 분화 작업 흐름을 요약하고, iPSC 집집에서 자기조직성 심장 형성에 이르기까지 프로토콜의 각 단계에서 예상되는 특징적인 형태학적 변화를 보여줍니다. 현탁 기반 마이크로웰 집적은 대량의 크기가 제어되는 카디오이드를 병렬로 생성하는 간단하고 표준화된 접근법을 제공합니다. 성공적인 분화는 균일한 크기의 집합체가 생성되고, 이어서 내부 공동이 형성되며 자발적인 파동이 시작되는 것이 특징이며, 보통 10일째부터 나타납니다. 이러한 형태학적 특징들은 심장 생성의 효율성과 재현성을 평가하는 실질적인 품질 관리 기준을 제공합니다.

심근 구조와 조직 조직은 냉동절부의 조직학적 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 그림 2에서 보듯, 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 성공적으로 분화된 심성 세포에 대해 하나 이상의 내부 공동이 조밀한 세포층으로 둘러싸인 잘 조직된 3차원 조직이 드러나며, 이는 챔버 형태의 조직과 일치합니다. 성공적인 카디오이드는 일반적으로 괴사 부위가 없고 구조적 파편화도 최소화됩니다. 반면, 최적이 아닌 분화는 종종 구별할 수 없는 불규칙하거나 붕괴된 구조를 만들어 조직 자기조직 기능 저하를 나타냅니다.

심근세포 분화는 냉동절부의 면역형광 염색을 통해 추가로 평가할 수 있습니다. 그림 3A–B에 나타난 것처럼, 성공적인 심형은 근절 표지 cMYBP-C의 광범위한 발현을 보이며, 근절 특징인 고도로 질서정연하고 주기적인 줄무늬로 조직되어 있습니다. 이 줄무늬 구조들은 조직 전반에 넓게 분포되어 있으며, 심근세포의 종축을 따라 정렬되어 있어 효율적인 심장 분화를 반영합니다. 반면, 최적이 아닌 심장 염색은 약하고 반드문드럽거나 영역적으로 제한된 근근 염색을 보이며, 주로 말초 부위에 국한되어 있고, 광범위한 영역에서는 감지 신호가 부족하여 심근세포 분화가 비효율적임을 나타낸다.

형광 표지된 올리고뉴클레오타이드의 흡수는 생세포 영상 또는 고정 심장의 공초점 현미경으로 평가할 수 있습니다. 그림 4에서 보듯, 성공적인 흡수는 세포 내 올리고뉴클레오타이드 관련 형광이 이산된 지점으로 분포되어 있어 내체체 위치와 일치하는 것이 특징입니다. WGA는 세포막을 구분하고, DAPI는 핵을 카운터 스테인하여 세포 내 올리고뉴클레오타이드 위치 확인을 가능하게 합니다. 올리고뉴클레오타이드 흡수의 정성적 시각화 외에도, 획득된 이미지 스택은 눈점당 형광 강도, 세포당 점당 점자 수, 올리고뉴클레오타이드 양성 세포 비율 등 정량적 분석에 활용될 수 있습니다. 그림 5A–C에서 보듯, Z-스택 영상은 3차원 조직 전반에 걸친 올리고뉴클레오타이드 분포를 평가할 수 있게 하며, 표면에서 심근 내부까지 이어지는 여러 광학 단면에서 형광이 감지되어 효과적인 조직 침투를 나타냅니다.

그림 1: 인간 iPSC 유도 심장 생성 워크플로우. 인간 유도 다능성 줄기세포(iPSCs)는 마이크로웰 플레이트(Day−2)에 집결되어 Wnt 신호의 시간적 조절을 통한 방향성 심장 분화를 받습니다. 중배엽 유도는 0일째에 기저배지에서 Wnt 경로 활성CHIR99021제를 투여하고 인슐린 제외 B27을 보충하여 투여한 후 1일째에 활성화제를 제거하여 시작됩니다. 심장 전격은 Wnt 경로 억제제인 IWP4 치료로 3일째에 유도되며, 5일째에 제거됩니다. 7일째에는 골집체를 6웰 플레이트로 옮기고, 인슐린을 포함한 B27을 보충한 기저 배지에서 유지합니다. 14일째에는 자기조직화 카디오이드가 형성되어 올리고뉴클레오타이드 흡수 분석을 포함한 하위 응용 분야에 적합합니다. 이 이미지는 저자들이 Biorender를 사용하여 제작했으며, 필요한 저작권 라이선스가 첨부되어 있습니다. 지정된 시점에 촬영된 대표적인 밝시야 이미지는 균일한 크기의 iPSC 집합체에서 공동적이고 자기조직화되는 심장으로 예상되는 형태학적 진행을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 2: 인간 iPSC 유래 심장병의 조직학적 특성 분석. 14일차 심장 세포의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 냉동절부 검사는 내부 공동이 조밀한 세포층으로 둘러싸여 챔버 형태 조직과 일치합니다. 이미지는 이미징 현미경을 사용해 촬영되었습니다. 분화 결과의 정량화 결과, 심장 ± 94.0% 2.6%가 자발적 박동을 보였고, 60.3± 20.6%는 하나 이상의 눈에 띄는 내부 공동을 포함하고 있었습니다. 데이터는 세 가지 독립 분별± 평균 SD로 제시되며, 각 분화별로 약 115개의 심전체가 분석됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 3: 심근세포 분화의 면역형광 특성 분석. 14일차 심장 세포의 대표적인 냉동 절제. (A) 세포핵 분포를 보여주는 DAPI 염색. (B) DAPI(파란색)로 표지된 핵과 심장 미오신 결합 단백질 C(cMYBP-C, 녹색)에 대한 항체로 표지된 근절을 보여주는 면역형광 영상으로, 분화된 심근세포에서 조직화된 근절 구조를 보여준다. 이미지는 10×/0.30 건식 대물렌즈(왼쪽)와 63×/1.40 오일 침지 대물렌즈(오른쪽)를 사용해 레이저 스캔 공초점 형광 현미경으로 획득하였습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 확대판을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 4: 카디오이드에 의한 올리고뉴클레오타이드 흡수 영상. 14일차 카디오이드에서 형광 표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO, 노란색)의 세포 내 위치를 보여주는 공초점 이미지. 세포막은 형광 밀 배아 응집(WGA, 마젠타)로 표지되며, 핵은 DAPI(파란색)로 염색됩니다. ASO 관련 형광은 세포 내 분기점(화살표)으로 감지됩니다. 하단 패널에는 형광 ASO로 인큐베이팅되지 않은 음성 대조군 카디오이드가 나타난다. 오른쪽 패널의 이미지는 왼쪽 패널의 박스 영역을 고배율로 볼 수 있는 뷰에 해당합니다. 대표적인 이미지는 40× 수중 대물렌즈를 사용한 배열 검출기 초해상도 영상을 이용한 레이저 주사 공초점 현미경으로 획득되었습니다. 스케일 바 = 10 μm(왼쪽)와 5 μm(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 심장 전반에 걸친 올리고뉴클레오타이드 침투 평가. (A) 심장 내부에서 점점 깊어지는 광학 단면을 획득하는 도식. 이 이미지는 저자들이 Biorender를 사용하여 제작했으며, 필요한 저작권 라이선스가 첨부되어 있습니다. (B) 조직 표면에 대해 0 μm, 6 μm, 10 μm z-위치에서 형광 표지된 ASO의 분포를 보여주는 대표성 공초점 이미지. 영상 설정은 모든 z-위치에 걸쳐 일정하게 유지되었습니다. 스케일 바 = 10 μm. (C) 각 영상 깊이에서 적어도 하나의 ASO 관련 점상 신호를 포함하는 세포 비율을 정량화하면, 조직 전반에 걸쳐 올리고뉴클레오타이드 흡수가 비슷했으며, 0 μm, 6 μm, 10 μm에서 각각 83.1 ± 2.5%, 84.9 ± 4.5%, 84.0 ± 4.5% ASO 양성 세포가 나타났습니다. 데이터는 세 개의 카디오이드에서 평균 ± SD로 제시되며, 각 카디오이드당 세 개의 광학 단면을 분석하고 총 1,305개의 세포를 정량화합니다. 대표적인 이미지는 40× 수중 대물렌즈를 사용한 배열 검출기 초해상도 영상을 이용한 레이저 주사 공초점 현미경으로 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

영상 1: 타임랩스 시퀀스. 초당 40프레임으로 촬영된 영상은 심장 세포에서 자발적인 수축 활동을 보여줍니다. 영상 촬영은 sCMOS 카메라가 장착된 광시각 현미경을 사용해 수행되었습니다. 이 영상을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

토론

올리고뉴클레오타이드 기반 치료제는 수십 년간 발전한 올리고뉴클레오타이드 화학의 발전으로 강력한 유전자 표적 기법 범주로 부상했으며, 표적 특이성, 대사 안정성, 면역원 내약성을 향상시켰습니다 ^7,8. 임상적으로 승인된 RNA 치료제가 증가하고 있음에도 불구하고, 비효율적인 세포내 전달 때문에 광범위한 적용은 여전히 제한되고 있습니다 ^7,8. 크기, 전하, 친수성 때문에 올리고뉴클레오타이드는 원형질막을 가로질러 수동적으로 확산되지 않고 대신 엔도사이틱 경로를 통해 내부화됩니다 ^9,10. 흡수 후, 내부화된 올리고뉴클레오타이드의 대다수(~99%)는 내체체 구획 ^9,10에 격리되어 남아 있습니다. 내체체 수송은 초기 엔도좀에서 후기 엔도좀, 그리고 궁극적으로 리소좀까지 성숙 과정을 거치며; 그러나 올리고뉴클레오타이드가 세포질로 빠져나가는 정확한 구획은 아직 완전히 밝혀지지 않았으며, 여러 엔도체체 집단이 관련될 수^{있습니다.} 이 제한된 세포질 방출은 중요한 속도 제한 장벽을 나타내며, 올리고뉴클레오타이드 흡수, 세포 내 이동, 내도체체 탈출의 정량적 평가를 가능하게 하는 생리학적으로 중요한 실험 시스템의 필요성을 강조합니다²⁰.

여기서 설명한 프로토콜은 인간 iPSC 유래 카디오이드와 올리고뉴클레오타이드 흡수의 영상 기반 측정값을 결합하여 이 필요를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이 시스템의 견고성은 재현성과 실험 결과에 직접적인 영향을 미치는 여러 중요한 단계에 의존합니다. 첫째, 시작 iPSC 배양의 질이 성공적인 심장 분화의 핵심 결정 요인입니다. 저자들은 장기적인 유전체 안정성을 보장하기 위해 주기적인 핵형 분석을 권장하며, 군체 형태, 무결성, 성장 역학에 대한 정기적인 평가를 실시할 것을 권장합니다. 고품질 배양은 조밀하고 명확한 군체, 매끄러운 경계, 최소한의 자발적 분화, 그리고 꾸준한 번식이 특징입니다. 불규칙한 군집 가장자리, 이질적인 세포 형태, 분화 부위를 보이는 배양은 분화 시작 전에 폐기하고 저통로 냉동 스톡으로 대체해야 합니다.

두 번째 중요한 단계는 마이크로웰 플레이트를 이용한 iPSC 집합체의 통제된 형성으로, 이는 재현 가능한 심장 분화에 필수적인 균일하고 크기가 정의된 3차원 구조의 생성을 촉진합니다²¹. 마이크로웰 기반 집집은 직경이 정의된 배아체(최적 200–230 μm)를 생성하여, Wnt 신호의 시간적 조절 과정에서 세포 간 상호작용과 형태원 구배에 대한 노출을 표준화합니다. 우리의 경험에 따르면, 이 크기는 개별 마이크로웰당 약 3,000개의 세포를 시딩함으로써 일관되게 달성되며(Step 2.2), 이 조건은 상업적으로 이용 가능한 군주와 사내에서 재프로그래밍된 군주를 포함한 여러 인간 iPSC 군주에서 경험적으로 최적화되고 검증되었습니다. 하지만 iPSC 증식 속도는 다양할 수 있기 때문에 원하는 골재 크기를 유지하기 위해 최적의 파종 밀도를 조정해야 할 수 있습니다. 이러한 매개변수를 제어하지 못하면 구조가 이질적이고, 생존 가능성이 감소하며, 분화 효율이 저하될 수 있습니다.

그림 2에 나타난 조직학적 분석은 심근 형성에 대한 편리한 품질 관리 평가를 제공합니다. 특히, 내부 공동이 없거나 붕괴되거나 파편화된 구조가 존재하는 경우, 분화 단계에서 Wnt 신호의 시간적 조절이 최적이 되지 않거나 불충분함을 나타낼 수 있습니다(4.1–4.3단계). 일부 실패한 분화 실험에서는 비수축성 세포 집단이 심각형 세포 내부나 주변에서 나타납니다. 이 세포들은 밝은 영역 현미경에서 보통 노란빛을 띠며 부착 밀도가 낮은 배양 플레이트에 부착하는 경향이 있습니다. 반면, 심근세포가 풍부한 심장 세포는 일반적으로 회색이며 3차원 구조로 조밀하게 유지되며 쉽게 부착되지 않습니다. 만약 상당수의 집합체가 이러한 밀착적이고 수축성 없는 표현형을 보인다면, 분화는 최적이 아닌 것으로 간주되어야 합니다. 이 경우 문제 해결은 분화 전 iPSC 군집 형태를 검토하고, −1일과 0일차 사이의 집합 크기를 확인하며, 필요 시 특정 iPSC 계통에 맞는 파종 밀도와 CHIR99021 및 IWP4 농도를 재최적화하는 것부터 시작해야 합니다.

10일째에서 12일째까지 저하거나 없는 자연 박동은 보통 비효율적인 중배엽 유도 또는 심장 명칭을 반영하며, 가장 흔한 것은 Wnt 조절자의 부적절한 농도나 시기, 또는 CHIR99021 치료 후 과도한 세포 사멸 때문입니다(Step 4.2). 우리의 경험에 따르면, 각 iPSC 라인에 대해 9–13 μM 범위 내에서 CHIR99021 적정하고 스톡 용액의 농도와 활도를 검증하면 분화 효율이 크게 향상될 수 있습니다. 그림 3에 나타난 사르코메릭 단백질 조직의 면역형광 분석은 심근세포 분화에 대한 편리한 품질 관리 평가를 제공합니다. 특히 심장 말초 부위에 제한적으로 약하거나 반죽박죽인 근절 단백질 염색은 일반적으로 불완전하거나 이질적인 심근세포 분화를 나타냅니다. 이 경우 고정 전 현탁-배양 성숙 기간(Step 4.6 및 일시정지)을 연장하고 고정 및 항체 염색 상태를 확인하는 것이 권장됩니다.

이 심장 모델은 기존의 2차원 심근세포 배양보다 상당히 개선된 3차원 인간 심장 미세환경을 제공하지만, 성인 인간 심장의 복잡성을 완전히 재현하지는 못합니다. 심장 세포는 인간 심장 발달의 초기 단계를 나타내며, 심근세포는 미성숙하고 태아와 유사한 표현형¹⁴를 유지합니다. 더불어, 조직은 혈관 관류, 신경 지배, 거주 면역 세포, 그리고 성숙한 심근의 완전한 챔버 특이적 구조가 결여되어 있습니다. 따라서 이 플랫폼은 통제된 실험 조건에서 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수 및 세포 내 분포를 조사하는 데 적합하지만, 흡수 반응학과 전달 메커니즘을 직접 생체 환경에 적용할 때는 주의가 필요합니다. 향후 추가적인 심장 세포 유형, 혈관망, 조직 성숙 전략의 도입은 이 플랫폼의 생리학적 중요성을 더욱 높일 것입니다.

본 프로토콜에서 기술된 카디오이드에 의한 올리고뉴클레오타이드 흡수를 신뢰성 있게 평가하려면 ASO 농도, 배양 시간, 영상 획득 설정의 최적화 및 표준화가 필요하며, 이는 그림 4 와 그림 5에 나타난다. 형광체의 선택은 특히 중요한데, 염료는 밝기, 광안정성, 환경 영향에 대한 민감도가 다르기 때문입니다. 본 연구에서는 고밝기와 광안정성을 가진 원적색 실리콘-로다민 형광체인 Janelia Fluor 646 (JF646)²²를 사용했으며, 3차원 시료에서 조직 자가형광을 최소화하면서 강력한 신호 검출을 제공하였습니다. 이러한 특성들은 생체 또는 고정된 카디오이드에서 올리고뉴클레오타이드 흡수를 영상화하는 데 적합합니다. 특히 형광체 결합은 올리고뉴클레오타이드 행동, 즉 흡수 및 운송에 영향을 미칠 수 있으므로 각 실험 시스템에 대해 검증되어야 합니다.

현재 형태의 이 프로토콜은 올리고뉴클레오타이드 흡수에 대한 정성적 및 정량적 평가를 모두 제공합니다. 세포 내 ASO 관련 지점의 초점 영상은 심장 세포 내 올리고뉴클레오타이드 위치를 시각화할 수 있게 하며, 흡수 효율은 Fiji/ImageJ의 Cell Counter 플러그인을 이용해 ASO 양성 세포의 비율을 수동으로 측정하여 측정합니다. 이 접근법은 여기서 제시된 중간 처리량 분석에 적합하지만, 수동 이미지 분석은 노동 집약적이며 특히 대규모 데이터셋에 적용될 경우 관찰자 편향에 노출될 수 있습니다. 최근 3차원 현미경을 위한 자기 지도 딥러닝의 발전은 이러한 한계를 극복할 수 있는 유망한 기회를 제공합니다. AI 기반 영상 분석은 복잡한 3차원 환경에서 이질적인 세포 내 구조를 정확히 분할, 식별 및 추적할 수 있어, 올리고뉴클레오타이드 흡수와 세포 내 수송, 내도체체 역학을 포함한 자동 정량화를 가능하게 합니다²³. 이러한 접근법을 향후 프로토콜 구현에 도입하면 처리량, 재현성, 분석 정밀도가 향상될 것입니다.

앞으로는 인간 iPSC 유래 카디오이드와 정량적 영상, 머신러닝 기반 영상 분석, 단일 입자 방법론의 통합이 인간 심장 조직에서 올리고뉴클레오타이드 전달을 조절하는 메커니즘을 연구하는 강력한 틀을 제공합니다. 생리학적으로 중요한 3차원 심장 모델과 세포 내 조직 및 역학을 해소할 수 있는 첨단 분석 도구를 결합하면, 올리고뉴클레오타이드 흡수, 세포 내 운송, 그리고 적절한 보조 분석법을 통해 내도체체 탈출의 포괄적 정량적 특성 분석이 가능해집니다. 이러한 통합 접근법은 전달 효율성을 결정하는 요인의 체계적 식별을 촉진하고, 올리고뉴클레오타이드 화학체 및 전달체의 합리적 최적화를 지원하며, 심혈관 질환 맥락에서 신흥 올리고뉴클레오타이드 치료제를 평가할 수 있는 확장 가능한 플랫폼을 제공할 것으로 기대됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021