글루코코르티코이드 수용체를 통한 만성 폐쇄성 폐질환 치료에 대한 β-시토스테롤의 네트워크 약리학 및 실험 연구

요약

β-시토스테롤은 COPD를 완화하고 덱사메타손의 효능을 증강했으며, 글루코코르티코이드 수용체가 이 효과를 매개했습니다. 또한 β-시토스테롤은 CSE 자극 기관지 상피세포와 담배 연기로 유발된 COPD 생쥐에서 염증, 산화 스트레스, 세포 노화를 감소시켰습니다.

초록

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 지속적인 염증, 산화 스트레스, 진행성 폐 기능 저하를 특징으로 하는 흔한 호흡기 질환입니다. COPD에서 β-시토스테롤의 치료 잠재력은 아직 명확하지 않습니다. 본 연구는 β-시토스테롤이 COPD에 대해 보호 효과를 가지고 그 근본 기전을 밝히는 것을 목표로 했습니다. 데이터베이스 스크리닝 결과 글루코코르티코이드 수용체(GR)가 β-시토스테롤의 잠재적 표적으로 확인되었습니다. 담배 연기에 의한 COPD 마우스 모델과 담배 연기 추출물(CSE) 자극 BEAS-2B 세포 모델이 확립되었습니다. 폐 기능, 폐 손상 관련 표지자, 염증, 산화 스트레스, 세포 노화 등을 (RT-qPCR), DCFH-DA 형광 탐침 분석법, 노화 탐지 키트를 사용하여 평가하였습니다. β-시토스테롤 단독 또는 덱사메타손(DEX)과 병용했을 때의 효과도 평가하였다. β-시토스테롤은 폐 기능을 유의미하게 개선하고, 폐 손상 관련 표지자를 정상화하며, CSE 자극 BEAS-2B 세포와 담배 연기에 노출된 쥐에서 염증, 산화 스트레스, 세포 노화를 완화시켰습니다. 이러한 보호 효과는 GR 발현 증가와 함께 나타났습니다. 더불어, β-시토스테롤은 DEX에 대한 반응성을 높였으며, β-시토스테롤과 DEX의 병용 치료는 DEX 단독 치료보다 폐 기능, 폐 손상 지표, 염증, 활성산소종 수치, 세포 노화 측면에서 더 큰 개선을 보였습니다. 종합적으로 이 결과들은 β-시토스테롤이 GR 발현을 상향 조절하고 DEX의 치료 효능을 높여 COPD 관련 병리학적 변화를 적어도 부분적으로 완화하며, COPD 치료에 보조 전략으로서의 잠재력을 강조합니다.

서론

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 지속적인 기도 염증, 치포 손상, 되돌릴 수 없는 기류 폐색이 특징인 진행성 호흡기 질환으로, 호흡 기능을 저해하고 삶의 질을 저하시킵니다^1. 이 질환의 유병률은 나이가 들수록 크게 증가하며, 65세 이상에서는⁴²세 미만의 약 5배에 달하는 위험이 있습니다. 이러한 인구통계학적 추세는 질병 발생률, 사망률, 장애 증가와 연관되어 있습니다^. 역학 예측에 따르면 2030년까지 COPD는 전 세계 사망 원인 중 네 번째로 큰 원인이 될 수 있으며, 전체 사망자의 약 5%를 차지할 수^{있습니다.} 현재 확인된 위험 요인으로는 유전적 감수성, 폐이형성증, 미세먼지 노출, 만성 기관지염, 호흡기 감염 등이 포함됩니다^.

위험 요인 중 담배 연기는 COPD⁸의 가장 중요한 병원성 인자입니다. 이 성분에는 기관지 상피 손상을 일으키고, 염증 세포 침투를 촉진하며,^{폐 조직 재}형성을 유발할 수 있는 수천 가지 화학물질이 포함되어 있습니다. 장기간 노출은 지속적이고 되돌릴 수 없는 상피 손상을 유발하고, 다수의 염증성 화학물질 분비를 촉진하며, ROS(통로성 생성)를 크게 증가시키고, 세포 세포자멸사를 유도할 수 있습니다^. 많은 연구에서 인터루킨-8(IL-8)과 종양 괴사 인자-α(TNF-α)과 같은 염증성 화학인의 증가, 과도한 ROS 생성 및 세포 노화가 COPD의 중증도와 밀접한 관련이 있음을 보여주었습니다^11,12. 이는 COPD에서 보호 및 치료 효과를 발휘하기 위해 이러한 주요 병원성 인자를 효과적이고 안전하게 조절할 수 있는 약물의 필요성을 강조합니다.

식물성 스테롤은 식물 세포막에 널리 존재하는 천연 생리 활성 화합물입니다. 그중 β시토스테롤이 가장 풍부하며, 채소, 견과류, 씨앗, 올리^{브유 등} 지질이 풍부한 식물성 식품에 널리 분포되어 있습니다. 연구들은 쥐와 쥐에서 β-시토스테롤을 최대 1000 mg/kg까지 투여했을 때 세포독성 또는 유전자 독성과 관련이 없음을 확인했습니다¹⁷. 더욱이 연구에 따르면 β-시토스테롤은 항산화 효소와 인간 에스트로겐 수용체에 작용하여 항산화 특성을 보인다¹⁸.

β-시토스테롤은 항염증¹⁹, 소열제²⁰, 진통²¹, 항당뇨 효과¹³ 등 광범위한 약리학적 활성을 보인다. 또한 대장염, 장 염증 등 다양한 질병 모델에서 치료 잠재력을 보여주었으며(²²), 항동맥경화(²³ ) 및 면역조절 특성을 지니고 있습니다^. 게다가 안전성도 우수합니다. 이러한 특성 때문에 β시토스테롤은 잠재적 약물 후보로서 상당한 관심을 끌고 있습니다. 그러나 COPD에서 그 정확한 역할과 기전은 여전히 대부분 불분명합니다.

따라서 본 연구는 COPD에서 β-시토스테롤의 잠재적 치료 효과와 기전을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 구체적으로, 담배 연기 추출물(CSE) 유도 BEAS-2B 세포 손상 모델을 사용하여 β-시토스테롤이 CSE 매개 세포 손상을 효과적으로 완화할 수 있는지 평가하여 COPD 치료 전략에 적합한 새로운 후보 분자를 규명하였습니다.

프로토콜

이 연구는 실험 및 임상 연구를 위한 기본 및 임상 약리학 및 독성학 지침에 따라 수행되었습니다²⁵. 모든 동물 실험 프로토콜은 저장성 의과대학 제2부속병원 동물윤리위원회(승인번호 20230102)의 승인을 받았으며, 모든 실험은 동물윤리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다.

네트워크 약리학을 통한 주요 구성 요소 및 표적 스크리닝

Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., 그리고 Adenophora stricta Miq의 활성 성분. 중의학 시스템 약리학 데이터베이스(TCMSP; 2024년 3월 12일 접속)에서 검색되었습니다. 후보 화합물은 다음 ADME 기준에 따라 선별되었습니다: 경구 생체이용률(OB) ≥ 30%, 약물 유사성(DL) ≥ 0.18, Caco-2 투과성 ≥ −0.4²⁵. 세 가지 기준을 모두 충족하는 화합물은 후속 분석을 위해 후보 활성 성분으로 유지되었습니다.

β-시토스테롤의 표준 단순화 분자 입력 라인 입력 시스템(SMILES) 구조는 PubChem(2024년 3월 18일 접속)에서 얻어져 SwissTargetPrediction(2024년 3월 21일 접속)에 가져와 표적 예측을 위해 수행되었습니다. 호모 사피엔스가 대상 종으로 선정되었습니다. 잠재적 표적은 데이터베이스 내 β-시토스테롤과 알려진 리간드 간의 2D 및 3D 구조적 유사성을 바탕으로 예측되었습니다. 확률이 0인 예측 대상은 유지하고, 중복된 항목은 제거되었습니다.

COPD 관련 유전자는 치료적 표적 데이터베이스(TTD; 2024년 3월 25일 접속)와 비교 독성유전체학 데이터베이스(CTD; 2024년 3월 28일 접속)에서 "만성 폐쇄성 폐질환" 키워드를 사용하여 검색하였습니다. 중복 유전자를 제거한 후, COPD 관련 유전자를 예측된 β-시토스테롤 표적과 교차하여 β-시토스테롤의 COPD 치료 효과에 잠재적으로 관여할 수 있는 후보 표적을 식별하였습니다.

β-시토스테롤과 일반 평면성 평면서의 분자 결합

SDF 형식의 β-시토스테롤의 3차원 구조는 PubChem 데이터베이스(2026년 6월 2일 접속)에서 확인되었으며, 글루코코르티코이드 수용체(GR)의 결정 구조는 구조 생물정보학 단백질 데이터 뱅크(RCSB PDB; 2026년 6월 3일 접속)에서 얻었습니다. 리간드와 수용체 구조의 표준 준비 후, CB-Dock2 온라인 플랫폼을 통해 분자 도킹이 수행되었습니다(2026년 6월 3일 접속). 준비된 리간드와 수용체 파일은 플랫폼에 업로드되었고, 도킹 계산은 기본 매개변수를 사용해 수행되었습니다.

유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG)의 기능적 풍부화 분석

β-시토스테롤의 모든 예측 표적 유전자는 GO 기능 풍부화 및 KEGG 경로 풍부도 분석을 수행하였습니다. 유의미하게 풍부해진 생물학적 과정, 세포 구성 요소, 분자 기능, 신호 전달 경로를 포함한 농축 결과는 정렬되어 보충 파일 1 에 저장되어 이후 생물정보학 분석을 위해 사용되었습니다.

동물 모델링과 그룹화

표본 크기는 이전 연구에서 G*Power 소프트웨어를 이용한 사전 검정력 분석(α = 0.05, 검정력 = 0.80)을 기반으로 한 6마리의 동물로 설정되었으며, n=6만으로도 유사한 실험 조건에서 생물학적 관련 차이를 감지하기에 충분함을 입증했다²⁶. 6주에서 8주(20± 2g) 수컷 C57BL/6 마우스는 무작위로 다섯 그룹에 배정되었습니다: 대조군, COPD 모델 그룹, COPD + 덱사메타손(DEX) 그룹, COPD + β-시토스테롤 그룹, COPD + DEX + β-시토스테롤 그룹. 쥐들은 표준 실험실 조건(25°C, 12시간 밝고 어둠 주기)에서 표준 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있었으며, 실험 전 1주일간 적응을 허용했습니다.

COPD 모델 설립을 위해, 쥐들은 전신 담배 연기 노출 챔버(63cm × 55cm × 45cm)에 넣고 12주간 일반 담배 연기에 노출되었습니다. 각 담배에는 10mg 타르, 0.9mg 니코틴, 10mg 일산화탄소가 들어 있었습니다. 연기 노출은 주 5일, 하루 두 번, 오전 9시 30분과 오후 3시에 진행되었으며, 세션²⁷당 90분간 18개의 담배에서 연기가 발생했습니다.

중재의 치료 효과를 평가하기 위해, 담배 연기 노출 8주 후 약물 투여를 시작하고 나머지 4주간 계속하였습니다. 9주차부터 해당 치료군의 쥐들은 흡연 노출 1시간 전에 DEX(1 mg/kg)²⁸ 또는 β-시토스테롤(50 mg/kg)^29,30을 매일 위내 투여를 받았다. 이전 약물동학 연구에서는 설치류에서 β-시토스테롤에 대해 약 4%의 경구 생체이용률이 보고되었습니다³¹. 또한 여러 마우스 연구에서 20에서 50 mg^{/kg 사이의} 용량을 사용했습니다. 따라서 전임상 연구에서 일반적으로 사용되는 범위 내에서 충분한 전신 노출을 보장하기 위해 50 mg/kg의 용량을 선택했습니다.

대조군 쥐는 여과된 실내 공기에 노출되었고, 모델 및 처리군 쥐는 동등한 양의 정상 식염수 매개체를 받았습니다. 실험 기간 말에는 쥐들이 이소플루란으로 깊은 마취를 받아 발 반사를 잃었고, 복부 대동맥 혈액 채취를 통한 출혈로 안락사시켰습니다. 흉강은 즉시 열렸고, 온전한 양측 폐 조직을 조심스럽게 절제한 뒤, 얼음처럼 차가운 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 헹군 후 얼음 위에 올려놓았습니다. 기관지 폐조 세척액(BALF) 채취를 위해 기관을 캉네랴 후 차갑고 멸균된 PBS로 세척했으며, 이를 부드럽게 주입하고 반복적으로 빼내어 세척액을 수집하였습니다. 폐 조직과 BALF 샘플은 얼음 위에 보관된 후 후속 분석을 위해 처리되었습니다.

BEAS-2B 세포 배양

BEAS-2B 인간 기관지 상피 세포는 Dulbecco의 변형 이글 배지/F12(DMEM/F12)에서 유지되었으며, 이 배양체에는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 5% CO₂ 하에서 37°C에서 함유되어 있습니다.

CSE 준비 및 BEAS-2B 세포 노출

BEAS-2B 세포는 인산염 완충 식염수로 세척한 후, 웰당 5× 10⁴ 셀 밀도로 3중으로 24웰 플레이트에 시딩했습니다. 12시간 배양 후 세포는 약 60% 합류율에 도달했고, 이후 CSE에 노출되었습니다. CSE는 앞서 설명한 대로 신선하게 준비되었으며, 약간의^{수정이 있었습니다}. 간단히 말해, 여과되지 않은 상업용 담배 한 개가 연소되었고, 일반 연기를 진공 펌프를 이용해 1.05 L/min(약 −11 kPa 음압)의 일정 유량으로 약 5분 동안 세럼 무첨가 배지를 10mL에 담배가 완전히 타도록 만들었습니다. 얻은 용액은 먼저 큰 입자 불순물을 제거하기 위해 전여과를 거친 후, 0.22 μm 무균 미세다공성 필터를 통해 잔류 입자를 제거하여 멸균했습니다; 결과적으로 생성된 재고 용액은 100% CSE로 정의되었습니다. 신선하게 준비된 모든 CSE는 저장 없이 여과 직후 세포 처리에 사용되었습니다. 세포는 2.5% CSE를 함유한 배지로 자극하였습니다. CSE 처리 24시간 후, 배양 상청액을 -40 °C에서 수집하여 후속 분석을 위해 보관했다³⁴.

정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

총 RNA는 총 RNA 추출 키트를 사용해 BEAS-2B 세포에서 추출한 후, 제조사 지침에 따라 역전사 키트를 사용해 cDNA로 역전사했습니다. RT-qPCR은 이후 실시간 PCR 검출 시스템과 SYBR Green 기반 qPCR 마스터 믹스를 사용하여 수행되었습니다. 모든 RT-qPCR 실험은 샘플당 3회의 생물학적 복제와 3회의 기술적 복제를 사용하여 데이터 신뢰성을 보장하였습니다.

각 qPCR 반응은 총 20 μL 용량에서 수행되었으며, 이 중 10 μL SYBR Green qPCR 마스터 믹스, 0.4 μL 순방향 프라이머, 0.4 μL 역방향 프라이머, 2 μL 희석된 cDNA 주형, 7.2 μL RNase 무첨가 물이 포함되어 있었습니다. 증폭 조건은 다음과 같았습니다: 95 °C에서 초기 변성(3분), 95 °C에서 10초간 변성(40 사이클), 60 °C에서 어닐링/연장 30초. 상대 유전자 발현 수준은 2^−ΔΔCt 방법으로 계산되었으며, GAPDH가 내부 참조 유전자로 사용되었습니다. 본 연구에서 사용된 프라이머 서열은 보충표 1에 언급되어 있습니다.

세포 내 활성 산소종(ROS) 분석

BEAS-2B 세포에서 세포 내 ROS 생성은 플루오로형성 프로브 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 평가하고 유세포분석으로 분석하였습니다. 유세포 측정 획득 과정에서 표준 전방산란(FSC) 및 측면산란(SSC) 게이팅 전략이 적용되어 세포 잔해를 배제하고 온전한 단일 세포를 선택하였습니다. 각 샘플마다 총 10,000건의 유효한 세포 사건이 수집되었습니다. 여기 파장과 방출 파장은 각각 488 nm와 525 nm로 설정되었습니다. 이후 유세포 측정 데이터를 분석하여 세포 내 ROS 형광 강도를 정량화하였습니다.

말론디알데히드(MDA) 수준 결정

제조사 지침에 따라 세포 내 MDA 함량은 지질 과산화 분석 키트를 사용해 측정되었습니다. 간단히 처리된 BEAS-2B 세포를 채취하여 용해한 후, 저온에서 원심분리하여 상원액을 수집했습니다. 티오바르비투르산(TBA) 색도 반응이 수행되었고, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 532nm 깊이에서 흡수도를 측정했습니다. 상대적 MDA 수치는 표준 곡선에 따라 계산되었습니다.

세포 노화 평가

세포 노화는 노화 관련 β-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성을 기반으로 한 노화 검출 검사법을 사용하여 평가하였습니다. SA-β-gal 양성 세포는 유세포분석으로 정량되었습니다. 동시에 노화 관련 표지자 p53과 p21의 mRNA 발현 수준은 RT-qPCR을 통해 측정되었습니다.

세포 증식 분석

세포 증식은 색도 세포 생존성 검사 키트를 사용하여 평가하였습니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다.

GR 넉다운 분석

세포 형질전환은 지질 기반 형질염색 시약을 사용하여 수행되었습니다. 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드가 형질전환되었습니다: 글루코코르티코이드 수용체 표적형 소간섭 RNA(si-GR)와 음성 대조군 소간섭 RNA(si-NC). GR을 표적으로 하는 후보 siRNA 서열은 온라인 생물정보학 플랫폼 siDirect 2.0을 사용하여 설계되었습니다. 형질전환 후 세포는 48시간 배양되었고, 모든 siRNA는 최종 농도인 50 nM으로 사용되었습니다. 녹다운 효율은 RT-qPCR을 이용한 GR mRNA 발현을 측정하여 검증되었습니다.

차량 대조군은 β시토스테롤 처리 및 형질전환 실험 모두에 포함되었습니다. β-시토스테롤 개입에서는 차량 용매만 처리한 세포를 차량 대조군(CSE+0으로 표기)으로 사용하였습니다. 통계 분석 결과 차량 대조군과 빈 대조군 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다.

통계 분석

모든 정량적 결과는 세 건의 생물학적으로 독립적인 시험관 내 실험의 평균 ± 표준편차로 표현되었습니다. 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 샤피로-윌크 검정은 통계적 검정 전에 데이터셋 분포의 정규성을 평가하는 데 사용되었으며; 분산 분석 후 다중 비교에서 P 값을 조정하기 위해 Bonferroni 사후 보정법이 채택되었습니다(ANOVA). 두 그룹 간 비교는 비짝 학생 t-검정으로 평가했으며, 다그룹 비교에는 단원 또는 양측 ANOVA가 사용되었습니다. p 값 0.05≤ 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

β시토스테롤은 COPD 치료를 위한 잠재적 천연 산물이었습니다

보고된 치유 효과는 Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb.의 건조꽃, Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.의 말린 뿌리, 그리고 Adenophora stricta Miq의 결과로 인해, 폐질환 치료에서^{35, 36, 37, 38}번, 본 연구는 TCMSP 데이터베이스를 사용하여 이 전통 중의학(TCM) 약초들의 활성 성분을 체계적으로 확인했습니다 β 시토스테롤이 이 중의학 약초들이 공유하는 중요한 활성 성분으로 확인되었습니다 (그림 1A)). β-시토스테롤의 근본 분자 기전을 체계적으로 탐구하기 위해, SMILES 구조 정보를 PubChem 데이터베이스에서 가져와 SwissTargetPrediction 데이터베이스로 가져와 표적 예측에 사용하였으며; 예측 확률이 0을 초과하는 모든 예측 대상은 후속 분석을 위해 유지하였습니다. β-시토스테롤과 후보 표적 간의 성분-표적 상호작용 네트워크가 시각화되어 그림 1B에 제시되었습니다. SwissTargetPrediction 데이터베이스를 사용하여 총 43개의 추정 표적 유전자가 β시토스테롤을 예측했습니다. 이후 β-시토스테롤의 표적 유전자에 대해 GO 기능 풍부화 및 KEGG 경로 풍부화 분석을 수행하였으며, 모든 완전한 풍부화 데이터셋은 보충 파일 1에 보관되었습니다. 특히, 스테로이드 대사 과정이 유의미하게 풍부해진 경로 중 하나로 확인되었습니다. 축적된 문헌들은 COPD³⁹에서 비정상적인 스테로이드 대사와 글루코코르티코이드 내성 간의 밀접한 상관관계를 입증했습니다. 더불어, GR은 스테로이드 대사 관련 기능 군집에서 뚜렷하게 농축되었습니다. 이 발견은 β-시토스테롤이 DEX 민감도를 향상시키고 GR 발현 수준을 변화시키는 메커니즘을 조사하는 후속 세포 실험에 중요한 생물정보학적 근거를 제공합니다.

COPD와 관련된 유전자는 TTD 및 CTD 데이터베이스에서 수집되었습니다. 이후 Venn 교차 분석(그림 1C)에서는 β-시토스테롤 표적과 TTD 유래 COPD 관련 유전자 사이에 두 개의 중복 유전자가 있었고, β-시토스테롤 표적과 CTD 유전자 유전자 사이에 또 다른 두 개의 중복 유전자가 있으며, TTD와 CTD 데이터셋 사이에 다섯 개의 공유 COPD 유전자가 발견되었습니다. 결국 GR은 세 데이터셋 모두에 공통된 유일한 유전자였으며, COPD에 대한 β-시토스테롤의 핵심 표적으로 정의되었습니다. 벤 분석의 상세 수치 데이터는 보충 파일 2에 나열되어 있습니다. 결합 친화도를 추가로 검증하기 위해 β-시토스테롤과 GR의 분자 결합이 수행되었습니다(그림 1D). Vina 점수가 −7.0 kcal/mol 미만인 결합 주머니는 결합 친화력이 우호적으로 나타난 것으로 간주되었습니다. 포켓 C1과 C5의 비나 점수는 각각 −8.8과 −7.2 kcal/mol로, β-시토스테롤과 GR 간의 강한 상호작용이 예측되었음을 나타낸다.

β-시토스테롤은 BEAS-2B 세포를 CSE 손상으로부터 보호했으며, 이는 GR 발현 증가와 연관될 수 있습니다

β-시토스테롤은 CSE에 의해 유도된 BEAS-2B 세포 손상 모델에서 유의미한 보호 효과를 보였습니다. CSE + 0 그룹은 β-시토스테롤 없이 CSE와 같은 양의 약물 용매를 투여하는 차량 대조군으로 설계되었습니다. 예상대로 CSE와 CSE + 0 그룹 간 유의한 차이는 발견되지 않았습니다. 이 화합물은 농도에 따라 CSE에 의해 유도된 TNF-α와 IL-6 생성을 억제했습니다(그림 2A). 또한 세포 내 ROS 수치를 낮추었습니다(그림 2B). β-시토스테롤은 또한 MDA 함량을 유의미하게 감소시키고(그림 2C), CSE에 의한 세포 노화를 억제했으며(그림 2D), 노화 관련 마커 p53과 p21을 하향 조절했습니다(그림 2E). 이러한 효과는 GR mRNA 발현이 상향 조절된 것과 함께 나타나 (그림 2F), 그 보호 기능이 GR의 전사 상향 조절과 밀접하게 연관되어 있을 수 있음을 시사합니다. 검사된 농도 범위 내에서 β-시토스테롤은 BEAS-2B 세포 생존력에 명확한 세포독성을 보이지 않아 이 화합물에 대한 유리한 세포 내성을 나타냅니다. 20 μg/mL(약 48.2 μM)가 가장 강력한 억제 효과를 보였기 때문에, 이 용량이 이후 실험에 선택되었습니다. 10 μg/mL와 20 μg/mL 그룹 간 염증성 사이토카인 억제에 있어 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았으나, 20 μg/mL β-시토스테롤은 염증 인자 수치에서 경미한 감소 추세를 보였습니다. 더불어 10 μg/mL와 비교했을 때, 20 μg/mL는 CSE로 인한 ROS 및 MDA 축적을 억제하고, 세포 노화를 줄이며, GR mRNA 발현을 상향 조절하는 데 우수한 효능을 보였습니다. 이 연구는 추적 구조 분석의 최적 작동 농도로 20 μg/mL를 선택하는 것을 지지했습니다.

RT-qPCR 결과(그림 2H)는 GR 녹다운 성공을 확인했습니다. si-GR 그룹의 GR mRNA 수준은 si-NC 대조군에 비해 약 78% 감소하여, 이후 구조 분석에서 GR 침묵의 효율성을 검증하였습니다. GR 넉다운 후에는 β-시토스테롤이 염증 인자와 ROS에 미치는 억제 효과가 유의하게 역전되었습니다(그림 2I, J). 마찬가지로, β-시토스테롤에 의한 세포 노화 완화도 사라졌다(그림 2K). 이 결과를 종합해 보면, β-시토스테롤이 GR 매개 항염증, 항산화, 항노화 기전을 통해 CSE로 인한 기관지 상피 세포 손상으로부터 보호 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다.

β-시토스테롤은 COPD 마우스 모델에서 DEX의 폐 기능과 염증에 대한 치료 효과를 증진시켰습니다

담배 연기 노출로 확립된 COPD 마우스 모델에서, β시토스테롤, DEX 또는 이들의 조합 치료가 명백한 보호 효과를 보였습니다. 여러 그룹 간 통계적 비교는 일원 ANOVA를 사용한 후 Tukey의 사후 검정을 사용하였습니다. 실험 코호트를 구분하기 위해 다섯 가지 뚜렷한 기호 스타일이 적용되었습니다: 대조군은 원, 모델 그룹은 삼각형, 모델 + DEX 그룹은 별표, 모델 + β-시토스테롤 그룹은 정사각형, 모델 + DEX + β-시토스테롤 그룹은 다이아몬드 모양입니다. 각 가로 괄호는 두 개의 연결된 실험 그룹 간의 통계적 비교를 나타냅니다.

대조군과 비교했을 때, COPD 모델 그룹의 쥐들은 0.1초 내에 강제 인기량(FEV₀.₁), 강제 폐기량(FVC), 최고 호기 유량(PEF), 그리고 FEV₀.₁/FVC 비율에서 현저한 감소를 보였습니다. 그림 3A–D에 나타난 것처럼, FEV₀.₁/FVC 비율이 70% 미만일 경우 COPD 모델의 성공적인 확립이 확인되었습니다. DEX 또는 β-시토스테롤 단독 투여는 모델 마우스에 비해 이러한 폐 기능 장애를 유의미하게 개선했으며, 복합 치료는 단일 약물 투여에 비해 추가적인 개선을 가져왔습니다. 또한, MMP-9/TIMP-1 비율 변화는 기도 재형성의 특징적인 분자 표지자이며, MUC5AC 발현 증가는 점액 과분비를 나타냅니다^40,41. 또한 MMP-9, TIMP-1, 점액 표지자 MUC5AC의 mRNA 수준을 검출하고 MMP-9/TIMP-1 비율을 계산했습니다(그림 3E, F). 모델 그룹은 MMP-9/TIMP-1 비율이 현저히 증가하고 MUC5AC 발현이 상승하였습니다. DEX 또는 β-시토스테롤 단독으로 두 지표를 효과적으로 감소시켰으며, 병용 치료는 단독 요법에 비해 우수한 억제 효과를 보였습니다.

COPD 모델 마우스는 BALF TNF-α와 IL-6 수치가 뚜렷하게 상승했으며, 대조군 마우스에 비해 폐 ROS 함량도 증가했습니다. DEX 또는 β-시토스테롤 단독으로 염증성 사이토카인 수치와 산화 스트레스를 현저히 감소시켰으며, 병용 치료는 더 강한 억제 효과를 보였습니다(그림 3G, H). 더불어, COPD 모델 마우스에서 폐 GR mRNA 발현이 현저히 하향 조절되었습니다. DEX 또는 β-시토스테롤 단독으로 GR 발현을 유의미하게 상향 조절했으며, 병용 치료는 GR 수치를 더욱 높였습니다(그림 3I).

종합적으로 이 결과들은 β-시토스테롤이 폐 기능을 유지하고 염증을 억제하며 산화 스트레스를 완화하며 GR 발현을 높임으로써 쥐에서 COPD 관련 병리학적 변화로부터 보호한다는 것을 시사했다. 더 나아가, β시토스테롤의 병용 투여는 이 모델에서 DEX의 보호 효과를 강화했습니다.

β-시토스테롤은 CSE 유도 BEAS-2B 세포 모델에서 GR 경로 조절을 통해 DEX 치료 효능을 증대시켰습니다

CSE 유도 BEAS-2B 세포 모델에서 DEX 단일요법은 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 현저히 하향화시키고, 세포 내 ROS와 MDA 수치를 낮추며, 노화 세포 비율과 노화 마커 p53 및 p21의 발현을 감소시켰습니다. 이 결과는 DEX의 항염증, 항산화, 항노화 활성을 확인시켜 줍니다. 특히, β-시토스테롤 병용 투여는 DEX의 보호 효과를 더욱 강화하여 DEX 단독 요법에 비해 염증, 산화 스트레스, 세포 노화를 더 강력하게 억제했습니다. DEX + β-시토스테롤 공동 치료군에서 GR 넉다운(si-GR)이 이루어지면, 복합 요법에 대한 세포 반응이 현저히 둔화되었습니다. 그림 4A–E에서 보듯, DEX와 β-시토스테롤이 함께 매개한 염증, 산화 스트레스, 노화 억제가 유의미하게 역전되었으므로, GR 결핍이 DEX 효능에 미치는 β-시토스테롤의 유익한 효과를 약화시켰음을 나타냈다.

종합적으로 이 결과들은 β시토스테롤이 DEX 효능을 증진시키며, 이는 GR 관련 과정을 조절함으로써 DEX의 보호 효과를 증강시켰음을 보여주었다.

데이터 가용성:

이 연구 결과를 뒷받침하는 모든 원시 데이터는 보조 자료(보충 파일 1, 보조 파일 2)에 제공되어 있습니다.

그림 1: COPD 치료에서 β-시토스테롤의 핵심 역할. (A) Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb.의 말린 꽃, 그리고 Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq의 건조 뿌리의 활성 성분. 그리고 아데노포라 스트리크타 믹. TCMSP 데이터베이스를 통해 선별되었습니다. (B) β-시토스테롤의 잠재적 표적. (C) β-시토스테롤 하류 표적과 COPD 관련 유전자의 교차 분석. (D) β-시토스테롤과 GR 단백질 간의 분자 결합 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: β-시토스테롤 관련 보호에 대한 GR의 관여. (A) β-시토스테롤에 의한 CSE 유도 염증 매개체(TNF-α, IL-6)의 농도 의존적 조절. (B) β-시토스테롤 용량이 CSE 노출 세포의 ROS 수준에 미치는 영향. (C) β시토스테롤이 CSE 상향 조절된 MDA 함량에 미치는 영향. (D) β-시토스테롤이 CSE로 촉진하는 세포 노화에 미치는 영향. (E) CSE 자극 하에 β-시토스테롤에 의한 노화 관련 p53 및 p21의 조절. (F) CSE 자극 하에서 β-시토스테롤 농도 의존적 GR 발현 조절. (G) BEAS-2B 세포 내 검사 농도에서 β-시토스테롤의 세포 생존성. (H)GR 표적 siRNA 형질전환 후 녹다운 효율을 검증하기 위한 GR mRNA 발현의 RT-qPCR 검출. (I) CSE 유발 염증 인자에 대한 GR과 β-시토스테롤 간의 조절 연관성. (J) CSE로 인한 ROS 축적에 대한 GR과 β-시토스테롤 간의 조절 연관성. (K) CSE로 인한 세포 노화에 대한 GR과 β-시토스테롤 간의 조절 연관성. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001; 중요하지 않다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: COPD 모델 마우스에서 DEX와 β-시토스테롤 병용 시 폐 기능, 염증, 산화 스트레스 및 GR 발현에 미치는 영향. (A) COPD 마우스에서 0.1초 단위(FEV₀.₁) 단위의 강제 호기량 변화. (B) COPD 마우스의 강제 폐활량(FVC) 변화. (C) COPD 마우스의 최대 호기 유량(PEF)에 미치는 영향. (민주당)COPD 모델 마우스의 FEV₀.₁/FVC 비율. (E) 기도 재형성을 반영한 MMP-9/TIMP-1의 상대 mRNA 비율. (F) MUC5AC의 상대적 mRNA 발현은 마우스 폐 조직에서 점액 과분비를 나타냅니다. (G) 기관지 폐포 세척액(BALF) 내 TNF-α 및 IL-6 수치. (H)COPD 마우스의 폐 조직에서 ROS 생성. (I) 마우스 폐 조직에서 GR의 상대적 mRNA 발현. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: CSE 유도 BEAS-2B 세포에서 β-시토스테롤이 GR 매개 DEX 내성에 미치는 영향. (A) 각 그룹에서 염증 인자(TNF-α, IL-6)의 상대적 mRNA 발현. (B)각 그룹의 ROS 수준. (C)각 실험군의 MDA 함량. (D) 각 그룹에서 노화된 BEAS-2B 세포의 비율. (E) 노화 관련 표지자 p53과 p21의 상대적 mRNA 수준. **p < 0.01; p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 1: RT-qPCR 분석에 사용되는 프라이머 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 1: β-시토스테롤 표적 유전자에 대한 완전한 GO 및 KEGG 농축 분석 데이터셋. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: β-시토스테롤과 COPD 간 겹치는 표적을 식별하는 벤 분석의 상세 수치 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

COPD는 전 세계적으로 상당한 질병 부담을 주며, 전 세계 보건에 여전히 큰 도전 과제로 남아 있습니다^. 현재 COPD 관리는 약물 및 비약물학적 중재 모두를 포함합니다⁴². 약물 치료 중 글루코코르티코스테로이드(GC)는 만성 염증 질환에 널리 사용됩니다. 이들은 GR에 결합하여 히스톤 탈아세틸화 2를 전사 복합체에 유도하여 히스톤 아세틸화를 역전시킨다⁴³. 그러나 여러 연구에서 COPD 환자에서 GC 민감도가 감소하는 것으로 나타났으며(^44,45), 연구에서는 이 질환에서 GC 내성이 입증된 증거가 나타났습니다(⁴⁶). 이 결과는 GC 내성 극복이 임상적으로 중요한 도전임을 나타내며, 새로운 치료제의 필요성을 강조합니다. 따라서 COPD에 대한 보다 효과적인 치료 옵션을 찾는 것이 매우 중요합니다.

이전 연구들은 γ-시토스테롤이 COPD⁴⁷에서 기관지 상피 세포에 항증식 효과를 발휘한다는 것을 입증했습니다. γ-시토스테롤과 β-시토스테롤은 모두 식물성 스테롤의 일반적인 생리활성 성분이므로, 본 연구는 COPD에서 식물스테롤의 작용에 대한 최신 이해를 확장하고, β-시토스테롤이 질병 발병 기전에서 보호적 가치를 지닌다는 점을 강조합니다. 연구 결과는 β-시토스테롤이 염증 인자 방출을 유의미하게 억제하고 산화 스트레스를 줄이며 세포 노화를 억제한다는 것을 밝혔습니다. 이는 β-시토스테롤이 IL-6, 유도성 일산화질소 합성효소, TNF-α⁴⁸과 같은 지포다당에 의해 유도된 염증 매개체의 상향 조절을 효과적으로 억제한다는 이전 보고서와 일치합니다. 이 발견들은 이 식물의 항염증 활성을 확인시켜 주며, 다양한 염증 모델 전반에 걸쳐 일관성을 뒷받침합니다.

흡입된 GC는 기도 염증 조절에 효과적인 항염증제입니다. 이들은 주로^GR-49에 결합하여 활성화함으로써 작용합니다. 그러나 COPD의 주요 병리학적 특징은 GCs의 항염증 효과에 대한 세포의 민감도가 감소하는 점입니다⁴⁴. GR의 기능 저하 또는 기능 저하는 COPD 환자에서 GC 내성 발달의 주요 기전 중 하나로 간주됩니다⁵⁰. 이전 연구들은 특정 약물이 GC 민감도를 높일 수 있음을 보여주었습니다. 예를 들어, 아지트로마이신과 부데소나이드의 조합은 두 약물 단독 복용보다 IL-4와 CXCL8 생산에 유의미하게 더 강한 억제 효과를 보인다⁵¹.

특히, 본 연구에서는 담배 연기에 노출된 COPD 마우스 모델과 CSE 유도 BEAS-2B 세포 모델 모두에서 β-시토스테롤과 DEX의 조합이 DEX 단독보다 염증 인자, 산화 스트레스, 세포 노화에 대해 유의하게 강한 억제 효과를 보였다는 사실을 발견했습니다. 이 조합은 또한 쥐에서 COPD 관련 병리학적 변화 및 기관지 상피세포 손상에 대한 DEX의 보호 효과를 크게 향상시켰습니다. 이 결과는 β-시토스테롤이 기관지 상피세포의 DEX에 대한 감수성을 향상시켜 일부 COPD 환자에서 GC 민감성 저하 또는 내성을 다루는 새로운 접근법을 제시할 수 있음을 시사합니다. 시험 관 내 정량적 PCR 결과와 일치하게, β-시토스테롤은 GR mRNA 수치를 농도에 따라 상승시키며, 직접적인 GR 작용제나 길항제로 작용하지 않습니다. 검증된 si-GR 넉다운 효율과 이후 기능적 구조 분석은 β-시토스테롤이 GR을 직접 활성화하는 대신 총 세포 내 GR 반응성을 증가시켜 세포 GC 반응성을 향상시켜, 표준 GR 작용제인 DEX와 결합했을 때 치료 효과를 향상시킨다는 점을 추가로 확인시켜 줍니다. 따라서 GR 발현 변화는 β-시토스테롤의 작용과 연관될 수 있으며, 이는 COPD 환자의 기도 평활근 세포에서 GR과 그 활성 아이소폼 GRα가 유의미하게 감소한 이전 관찰과 일치한다⁵². 중요하게도, GR 녹다운 실험은 이 수용체가 β-시토스테롤 매개 세포보호에서 중심적 역할을 한다는 점을 추가로 밝혀내어, β-시토스테롤의 생물학적 기능 중 일부가 GR 경로의 무결성에 의존함을 시사했다.

종합적으로 본 연구는 GR이 COPD 중재에서 β-시토스테롤의 핵심 매개체일 수 있음을 밝힐 뿐만 아니라, DEX 내성이라는 임상적 도전을 극복할 수 있는 잠재적 새로운 접근법을 제시하여 GR 경로를 표적으로 하는 자연 보조 요법 개발의 실험적 토대를 마련합니다.

그러나 본 연구에는 몇 가지 한계가 있었습니다. 첫째, 폐 기능은 COPD 마우스 모델의 성공적인 확립을 확인하기 위해 평가되었으며, 폐기종, 기도 재형성, 점액 과분비 등 전형적인 병리학적 특징을 추가 검증하기 위해 헤마톡실린-에오신(HE) 및 마손 염색은 수행되지 않았습니다. 이전 실험에서 모든 고정 폐 표본이 소모되었기 때문에, 12주간의 담배 연기 유발 COPD 마우스 모델을 연구 기간 내에 재구성하는 것은 불가능했습니다. 이 한계를 부분적으로 해결하기 위해 보존된 폐 RNA 샘플을 사용하여 MMP-9/TIMP-1 비율과 MUC5AC mRNA 발현 수준을 정량화하였습니다. 둘째, β-시토스테롤과 DEX의 단일 복합 투여만 생체 내에서 평가되었으며, 용량-반응 또는 시너지 효과는 체계적으로 조사되지 않았습니다. 잠재적 시너지 상호작용을 특성화하기 위해 다중 용량 조합을 포함하는 추가 연구가 필요합니다. 셋째, 실험적 제약과 연구 비용으로 인해 각 그룹에는 단 6마리의 쥐만 포함되었습니다. 상대적으로 작은 표본 크기가 동물 간 변이에 대한 감수성을 높이고 통계적 견고성을 제한했을 수 있습니다. 현재 결과를 더욱 검증하기 위해 더 큰 표본 크기의 향후 연구가 필요합니다. 넷째, 안정적인 DEX 내성 세포주가 확립되지 않았다; 따라서 β-시토스테롤이 기존 글루코코르티코이드 내성을 되돌리는 능력은 직접 평가할 수 없었습니다. 이 잠재적 메커니즘을 더 깊이 조사하기 위해서는 검증된 글루코코르티코이드 저항성 모델을 이용한 추가 연구가 필요합니다.

결론적으로, 이 발견들은 GR 신호전달이 BEAS-2B 세포에서 CSE 유발 손상에 대한 β-시토스테롤의 보호 효과, 즉 염증 인자 방출 억제, 산화 스트레스, 세포 노화 억제, 폐 기능 및 폐 손상 바이오마커 개선에 관여할 수 있음을 시사합니다. 더 나아가, β-시토스테롤은 이 세포들의 DEX에 대한 치료 민감도를 높였습니다. 이 결과들은 β-시토스테롤을 COPD의 새로운 치료 전략 개발에 기여할 수 있는 잠재적인 자연 후보 분자임을 확인했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BEAS-2B 인간 기관지 상피 세포	SunnCell, 중국	SC-0218	인체 기관지 상피 세포 계통, 체외 연구용
C57BL/6 마우스	Vital River Laboratories, 중국	213	체내 COPD 실험을 위한 동물 모델
CB-DOCK2	중국	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	리간드와 수용체 단백질 간의 분자 도킹 시뮬레이션용
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, 중국	C0038	세포 생존율 및 증식 검출
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, 미국	C10851	세포 노화 검출
담배	홍타, 중국	제공되지 않음	연기 노출 및 CSE 제조용 담배
CTD	미국	https://ctdbase.org/	COPD 관련 유전자 검색용
DCFH-DA 형광 프로브	Sigma-Aldrich, 미국	D6883-50MG	세포 내 ROS 수준 검출
덱사메타손 (DEX)	Yeasen, 중국	40323ES03	복합 개입용 글루코코르티코이드
DMEM/F12 배양액	Gibco, 미국	11330032	BEAS-2B 세포 배양 기본 배양액
태아 우태 혈청 (FBS)	Gibco, 미국	10270106	세포 배양액 보충제
GraphPad Prism	GraphPad Software, 미국	9.3.1	데이터 통계 분석 및 그래프 작성
이소플루란	RWD Life Science, 중국	R510-22-10	동물 안락사용 흡입 마취제
지질 과산화 MDA 분석 키트	Beyotime Biotechnology, 중국	S0131S	세포 내 말론알데히드 (MDA) 함량 검출
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, 미국	11668030	siRNA 전달용 형질주입제
다용도 마이크로플레이트 리더	Thermo Fisher, 미국	VL0000D0	흡광도 및 형광 값 검출
Navios EX 유세포계	Beckman Coulter, 미국	B80912	ROS 및 노화 세포 분석
페니실린/스트렙토마이신	HyClone, 미국	SV30010	박테리아 오염 방지용 항생제
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, 미국	4367659	형광 정량 PCR 증폭
PrimeScript™ RT 시약 키트	Takara, 일본	RR037Q	cDNA 합성용 역전사
PubChem 데이터베이스	미국	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	베타-시토스테롤의 정칙적 SMILES 시퀀스 및 3D SDF 구조 정보 다운로드
QuantStudio Dx PCR 기기	Thermo Fisher, 미국	4479889	실시간 RT-qPCR 검출
RCSB PDB	미국	https://www.rcsb.org/	GR 결정 3D 구조 파일 획득
RNA/단백질 분리 키트	Beyotime Biotechnology, 중국	R0018S	세포 및 폐 조직에서 총 RNA 추출
si-GR	siDirect 2.1을 통한 silico 설계	맞춤 합성	가이드: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; 승객: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, GR 억제
si-NC	Thermo Fisher, 미국	4390843	세포 및 체내 분석용 음성 형질주입 대조로 사용
SwissTargetPrediction 데이터베이스	스위스	http://swisstargetprediction.ch/	잠재적 약물 관련 단백질 표적 예측용
TCMSP 데이터베이스	중국	https://www.tcmsp-e.com/	한약재 성분 스크리닝 및 표적 예측용
TTD	싱가포르	https://db.idrblab.net/ttd/	COPD 관련 유전자 검증 수집용
전신 연기 노출 챔버	Teague Enterprise, 미국	TE-2	담배 연기 유도 COPD 모델 설치
β-시토스테롤	ChemicalBook, 중국	83-46-5	약물 치료용 활성 식물 스테롤